3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

Opracowaliśmy system trójwymiarowej kokultury, który naśladuje środowisko śluzowe jelita do badania seryjnego przesłuchu oraz oceny odpowiedzi leków, które mogą być wykorzystane do badań lekowych oraz do zrozumienia interakcji komórkowych błony śluzowej. Różne grupy opracowały kilka różnych systemów hodowli modelujących środowisko śluzowe jelita za pomocą bardzo złożonych technik bioinżynierii. Zamiast tego opracowaliśmy system kokultury, który jest znacznie łatwiejszy do stworzenia z tańszych materiałów.

Nasz system współhodowli wykazał, że lek białkowy wywołuje skoordynowane odpowiedzi między bakteriami jelitowymi, komórkami nabłonkowymi i układem odpornościowym, aktywując odporność gospodarza prawdopodobnie wraz z naszymi metabolitami bakterii i pośrednicząc w komunikacji międzygatunkowej. Naszym celem jest badanie zarówno szczepów bakteryjnych tlenowych, jak i anerobowych oraz ich metabolitów, aby odkryć efekty modulujące immunologię, torując drogę nowym strategiom immunoterapeutycznym opartym na metabolitach bakterii. Na początek otwórz pokrywkę na miskę Petriego i odstaw ją na bok.

Połóż ostrze skalpela na krawędzi dna szalki Petriego. Weź zestaw sterylnych pęsety i delikatnie chwyć wkładkę od dołu do góry, aby wyjąć ją z opakowania. Drugą ręką weź sterylne ostrze skalpela i przynieś je do wkładu.

Ruchem w kształcie litery C przebij membranę na krawędzi i delikatnie przesuwaj ostrze skalpela wokół dna wkładki, pozostając blisko plastikowej ściany. Wytnij membranę PET i użyj drugiego zestawu pęset, żeby ją usunąć. Następnie użyj ostrza skalpela, aby zeskrobać białe wióry błonowe, aby oczyścić krawędź i krawędź wkładki.

Następnie delikatnie rozłóż 2-3 milimetrowe krołki silikonu wokół dna wkładu, uważając, by nie dotknąć membrany. Weź drugi zestaw sterylnych kleszczy i ostrożnie wyjmij pierwszą wkładkę bez membrany z ochronnego opakowania. Złóż dwie wkładki razem od dołu do dołu, aby dolne obręcze się wyrównywały.

Gdy stos Flipwella zostanie sklejony, umieść go w oryginalnym sterylnym opakowaniu lub głębokiej misce Petriego, aby wyschła przez 72 godziny. Użyj pokrywki z określonych szalek Petriego, aby przykryć zespół stosu. Aby sterylizować zespoły stosu, użyj sterylnych kleszczy, aby zawiesić stos Flipwella na krawędzi określonej głębokiej krawędzi szalki Petriego.

Następnie zamknij szklaną oczkę szafki biosafety i włącz światło ultrafioletowe. Aby sprawdzić wyciek przed powlekaniem kolagenu, najpierw dodaj 500 mikrolitrów sterylnego PBS lub sterylnej wody dejonizowanej. Następnego dnia zasysaj płyn użyty do testów przed suszeniem stosów przez 1-2 godziny wewnątrz szafki biobezpieczeństwa.

Aby pokryć membranę kolagenem, otwórz pokrywkę szalki Petriego i pozwól, by Flipwell zawisł na krawędzi szalki Petriego. Ostrożnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu kolagenu na jedną stronę stosu wkładów. Po godzinie zasysaj roztwór kolagenu, a następnie pipetuj 200 mikrolitrów sterylnego PBS. Po zasysaniu PBS przykryj szalkę Petriego pokrywką i pozwól błonie wyschnąć przez 60 minut wewnątrz szafki.

Gdy błona wyschnie, użyj sterylnych kleszczy lub pęset, odwróć Flipwella na przeciwną stronę i pozwól mu zwisać z krawędzi szalki Petriego. Aby przygotować wkład bakteryjny, umieść dwa zestawy sterylnych kleszczy oraz wkładki z 24 dołkami wewnątrz szafki bioasekuracyjnej. Sterylną pęsetą wyjmij wkładkę z jej sterylnego opakowania.

Drugim zestawem pęsety lub kleszczy oderwaj małe plastikowe nóżki na dole wkładki. Testuj wkład z 24 dołkami, umieszczając go w jednym ze sterylnych stosów wkładów ko-kultury Flipwella lub w oryginalnych wkładach 12-dołkowych. Aby rozpocząć zasiewanie komórek Flipwellów, należy zasiać 500 mikrolitrów linii komórek nabłonkowych po obu stronach wierzchołkowej Flipwella.

Przykryj zespoły pokrywką z szalki Petriego, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez noc, aż komórki się przyłączą. Otwórz pokrywkę szalki Petriego i zasysaj medium DMEM od strony wierzchołkowej stosu Flipwella. Sterylnymi kleszczemi ostrożnie podnieś Flipwella za haczyk i obróć go o 180 stopni.

Drugim zestawem sterylnych kleszczy chwyć stos Flipwella za drugi hak, teraz skierowany do góry. Następnie opuszczam zespół z powrotem do szalki Petriego i zawieszam hak na jej krawędzi. Dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny ogniwa THP-1 do wierzchołkowej strony stosu wkładu ko-kultury.

Dostosuj ośrodek HT-29 dla komórek nabłonka jelita grubego, dodając medium do głębokiej szalki Petriego. Aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, trzymaj stos Flipwella za ramię sterylnymi kleszczemi. Ostrożnie opuść igłę gavage do i pod zespół wkładu i bardzo delikatnie umieść miękką końcówkę do pęcherzyka powietrza.

Ostrożnie i bardzo powoli pociągnij tłok strzykawki i obserwuj, jak pęcherzyk powietrza powoli znika. Następnie ostrożnie wyjmij igłę i strzykawkę z Flipwella. Po usunięciu pęcherzyków powietrza igłą gavage, należy hodować oba typy komórek w inkubatorze hodowli komórek.

Za pomocą kleszczy umieść wkładkę w sterylnej misce Petriego i przykryj pokrywką. Przenieś szalkę Petriego z Flipwellami do szafki na zabezpieczenia biologicznego i odłóż ją po przeciwnej stronie naczynia z wkładkami bakteryjnymi. Pipetą wyjmij 300 mikrolitrów podłoża DMEM z wierzchołkowej strony Flipwella, aby umożliwić włożenie bakteryjnego, a następnie przykryj pokrywką z szalki Petriego.

Następnie dodaj od 50 do 100 mikrolitrów hodowli Bacillus subtilis do 24-dołkowych wkładów bakteryjnych i wstaw je do górnej części Flipwella. Obróć ramię i zawieś je na krawędzi stosu wkładek Flipwell co-culture. Przytrzymaj stos drugim zestawem sterylnych kleszczy.

Po trzygodzinnej inkubacji użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć wkład bakteryjny z Flipwella. Umieść Flipwell w stożkowej rurze 50-milimetrowej bez rozkładania. Aby rozebrać Flipwell do mikroskopii elektronowej, trzymaj go obiema rękami i odkręcaj każdą sklejoną część stosu.

Obróć wkład membraną i postaw ją tak, że membrana jest skierowana do góry. Trzymaj wkładkę, ostrożnie wytnij membranę ostrzem skalpela, a następnie umieść ją w rurce o pojemności 1,7 mililitra zawierającej roztwór aldehydu paraformowego. Do mikroskopii konfokalnej dodaj 300 mikrolitrów bezpłodnego PBS po stronie wierzchołkowej.

Ostrożnie wyjmij stos z szalki Petriego po wycięciu PBS. Teraz odwróć Flipwella i dodaj 300 mikrolitrów PBS do teraz skierowanej do góry strony RPMI stosu wkładu ko-kultury Flipwella, a następnie zasysaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami. Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów, wytworz dużą kroplę PBS.

Odkręć zespół wkładek, aby rozdzielić je na wkładki. Następnie ostrożnie ustawij stos Flipwella z ogniwami THP-1 na kropli 200-mikrolitrowej PBS. Dodaj 200 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego na górną stronę z komórkami nabłonkowymi jelita grubego i odstaw na 10 minut.

W barwieniu immunofluorescencyjnym pipetuję 300 mikrolitrów przeciwciał pierwotnych na górę wkładki. Dodaj 300 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała do dołku płytki z 12 dołkami, a następnie umieść wkład wewnątrz dołka na kroplę. Dobrze zakryj przeciwciało.

Barwienie wykazało dramatyczny wzrost wydzielania śluzu w przedziale nabłonkowym jelit po leczeniu sepiapteriną, co potwierdzają wzrosty białka markerowego nabłonka CK20 oraz białka śluzowego MUC2. W monokulturach THP-1 leczenie sepiapteriną znacząco zwiększyło ekspresję markera makrofagów M1 CD80, jednocześnie modulując marker makrofagów M2 CD163, co wskazuje na polaryzację M1. Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała zwiększone wydzielanie śluzu z komórek nabłonkowych w kokulturach leczonych sep.

Leczenie sepiapteriną wywołało morfologię makrofagów przypominającą fenotyp M1 zarówno w monokulturach, jak i współkulturach. Komórki bakteryjne w monokulturach objętych sepiapteriną wykazywały pomarszczone powierzchnie charakterystyczne dla tworzenia biofilmu.