Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza
9 kwietnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.
Hodowla organoidów jelitowych 3D ogranicza badanie interakcji nabłonek-patogen gospodarza, ponieważ światło nie jest bezpośrednio dostępne dla bakterii lub czynników wirulencji. Ponadto wydzielane materiały, takie jak małe cząsteczki, białka lub śluz, nie mogą być łatwo pobrane z kultury 3D w celu dalszej analizy. Aby rozwiązać te ograniczenia, przedstawiamy zmodyfikowany protokół konwersji 3D ludzkich enteroidów lub kolonoidów w monowarstwę.
Monowarstwy kolkolnicy wydzielają grubą, wierzchołkową warstwę śluzu, co pozwala na badania ex vivo interakcji patogen-śluz. Metoda ta ma na celu zapewnienie wykonalnego modelu do badania najwcześniejszych interakcji między gospodarzem a patogenem w jelitach po zakażeniu. Monowarstwy kolonoidu pozwolą na nowy sposób badania biologii śluzu, która jest ważna w interakcji gospodarz-patogen, badaniach mikrobiomu i nieswoistych zapaleniach jelit.
Metodę tę można zastosować do innych narządów wydzielających śluz, takich jak górny odcinek przewodu pokarmowego, układ oddechowy i żeński układ rozrodczy. Demonstracja wizualna pomoże użytkownikowi w zachowaniu śluzu podczas wzrostu jednowarstwowego i podczas utrwalania do barwienia immunologicznego. Procedurę zademonstruje Karol Dokładny, pracownik naukowy naszego laboratorium.
Po inkubacji powlekanej hodowli komórkowej odessać pożywkę hodowlaną z 24-dołkowej płytki i zastąpić jednym mililitrem lodowatego roztworu do zbioru na studzienkę. Użyj mini skrobaka do komórek, aby usunąć i rozbić osad macierzy błony podstawnej. Zwróć szczególną uwagę na wszelkie materiały w pobliżu krawędzi studni.
Następnie mieszaj płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 200 obrotów na minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut. Użyj pipety jednokanałowej P200 wyposażonej w sterylne końcówki filtrujące, aby rozpleść zawiesinę komórek. Dostarczyć zawiesinę komórkową w 15-mililitrowej stożkowej fiolce.
Należy użyć wielu fiolek, jeśli całkowita objętość zawiesiny jest większa niż sześć mililitrów. Następnie dodać do fiolki równą objętość pożywki Advanced DMEM/F12 zawierającej 10 milimolowych HEPES, dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy i penicylinę-streptomycynę. To jest środek myjący.
Odwróć fiolkę trzy do czterech razy, aby wymieszać. Wirować 300 razy g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Przed posiewem komórek należy zrównoważyć powlekane wkładki w inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej 30 minut.
Dla każdej wkładki, która ma być powlekana, ogrzej jeden mililitr podłoża ekspandującego w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj dwa inhibitory. Następnie dodaj mieszaninę do studzienek. Odessać pożywkę płuczącą z probówki zawierającej osad komórkowy i zastąpić ją pożywką rozprężną o objętości wystarczającej do uzyskania co najmniej 100 mikrolitrów na wkładkę i ponownie zawiesić.
Następnie odessać roztwór kolagenu dożylnie z każdej wkładki i przemyć dwukrotnie 150 mikrolitrami medium myjącego na wkład. Odpipetować 600 mikrolitrów pożywki rozprężnej do przestrzeni pod każdą wkładką. Pobrać pipetą 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z fiolki do każdej wkładki.
Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i pozostawić w spokoju na co najmniej 12 godzin. Unikaj potrząsania lub gwałtownego przechylania talerza. Po inkubacji umieść płytkę na mikroskopie światła z kontrastem fazowym z soczewką obiektywową od 2,5 do 10 razy.
Odświeżyć pożywką hodowlaną bez inhibitorów, aby przerwać leczenie hamujące. Kontynuuj odświeżanie podłoża co dwa do trzech dni, aż do zlewania się. Wyjmij wkładki do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej za pomocą kleszczyków lub pęsety z cienką końcówką.
Ostrożnie odwróć na bibułce laboratoryjnej, aby usunąć wierzchołkowe podłoże i zetrzyj zewnętrzny płyn przylegający do wkładki. W nowej 24-dołkowej płytce zanurzyć wkładki w roztworze jednego do trzech lodowatych kwasów octowych i absolutnego etanolu na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie na ławce odwróć wkładkę na bibułę, aby usunąć utrwalacz.
Umieść wkładki w plastikowym pojemniku wypełnionym 1X PBS na 10 minut, aby ponownie nawodnić komórki przed przystąpieniem do standardowych protokołów barwienia immunologicznego. Aby zachować, użyj żyletki, aby przeciąć na obwodzie wkładki membranowej. Za pomocą kleszczy przenieś membranę na szklane szkiełko mikroskopowe.
Następnie dodaj podłoże montażowe i przymocuj szkło nakrywkowe. W tym eksperymencie ludzkie kultury enteroidów i kolonoidów są hodowane jako struktury 3D, a następnie dysocjowane i rozdrobnione w celu posiewu na wkładkach do hodowli komórkowych pokrytych ludzkim kolagenem IV. Postęp tworzenia monowarstw jest codziennie monitorowany za pomocą mikroskopii jasnego pola i barwienia immunofluorescencyjnego.
Fragmenty kolonoidu osadzone na filtrach pokrytych ludzkim kolagenem IV tworzą wiele jednowarstwowych wysp dwa do czterech dni po wysiewie. Zarówno projekcja o maksymalnej intensywności, jak i konfokalny optyczny przekrój Z z odpowiadającymi mu projekcjami ortogonalnymi pokazują, że obszary wolne od komórek można zidentyfikować po braku zarówno jądrowego, jak i wierzchołkowego barwienia F-aktyną. Zlewającą się monowarstwę kolonoidu z ciągłą powierzchnią wierzchołkową wykryto za pomocą barwienia immunologicznego F-aktyny około tygodnia po wysiewie.
Duże powiększenie reprezentatywnej projekcji o maksymalnej intensywności i konfokalnego przekroju optycznego z odpowiednimi projekcjami ortogonalnymi pokazuje, że komórki w zlewających się monowarstwach kolonoidu tworzą pierścienie peryzłączowe F-aktyny i niedojrzałą wierzchołkową granicę szczotki. Włączenie EdU wykazuje postępującą utratę proliferacji podczas różnicowania monowarstwy jelita czczego. Niezróżnicowane monowarstwy jelita czczego mają szersze, krótsze komórki i mniej dojrzałą wierzchołkową obwódkę szczoteczki na bazie aktyny w porównaniu z monowarstwami jelita czczego po pięciu dniach różnicowania.
Fragmentacja kolonoidów ma kluczowe znaczenie. Jeśli fragmenty są zbyt duże, nie przyczepią się do powlekanego filtra, ale zamiast tego przekształcą się w kolonoid 3D. Przedstawiono zmodyfikowaną metodę badania biologii śluzu na monowarstwach okrężnicy.
Można przeprowadzić inne badania gospodarz-patogen, aby przyjrzeć się interakcji między patogenem a powierzchnią wierzchołkową jelita.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zmodyfikowany protokół uprawy ludzkich monowarstw enteroidioidów lub kolonoidów, które zachowują integralną funkcję barierową. Ten model pozwala na badanie interakcji gospodarza epitel-mikrobiota na poziomie komórkowym i biochemicznym.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
Tło
- 3D organizmy jelitowe ograniczają badania interakcji gospodarz-patogen.
- Dostęp do światła światła jelita dla bakterii lub czynników wirulencji jest ograniczony.
- Pobieranie próbek wydzielanych materiałów z 3D kultur jest trudne.
- Monowarstwy kolonoidów mogą zapewnić nowy model do badania biologii śluzu.
Cel badania
- Rozwój łatwego do obsługi modelu do badania interakcji gospodarz-patogen jelitowy.
- Ułatwienie badań ex vivo interakcji patogen-śluz.
- Zbadanie biologii śluzu istotnej dla badań nad chorobami zapalnymi jelit i mikrobiomem.
Stosowane metody
- Konwersja 3D ludzkich enteroidioidów lub kolonoidów do monowarstw.
- Użycie mini skrobaczka do komórek i mieszadła orbitalnego do odessania komórek.
- Protokoły immunobarwienia do monitorowania formowania się monowarstwy.
- Mikroskopia świetlna i obrazowanie konfokalne do analizy.
Główne wyniki
- Monowarstwy kolonoidów wydziela grube warstwy śluzu wierzchołkowego.
- Przepływowe monowarstwy wykazują ciągłe wierzchołkowe powierzchnie i pierścienie F-aktiny okołozłączeniowe.
- Obserwowano progresywną utratę proliferacji podczas różnicowania monowarstw jelita krętego.
- Fragmentacja kolonoidów jest krytyczna dla udanego przyczepienia do filtrów.
Wnioski
- Zmodyfikowany protokół pozwala na efektywne badanie biologii śluzu.
- Monowarstwy kolonoidów dostarczają wglądu w interakcje gospodarz-patogen.
- Ta metoda może być zastosowana do innych narządów wydzielanych śluz.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Human colonoid monolayers provide a physiologically relevant ex vivo model for studying host-pathogen interactions at the intestinal epithelium, addressing limitations of 3D organoid systems in accessing luminal surfaces and sampling secreted factors. This platform enables mechanistic de-risking of therapeutic targets by modeling early mucosal barrier interactions relevant to infectious disease and inflammatory bowel disease pipelines. The system supports predictive confidence in target validation through quantifiable outputs like transepithelial resistance and mucus layer formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling pathogen-mucus interactions and epithelial barrier function under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through measurable outputs such as transepithelial electrical resistance and apical mucus secretion, facilitating biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing confluent, differentiated monolayers with intact barrier function suitable for compound screening.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through defined monolayer formation metrics and quantifiable readouts like F-actin staining and EdU incorporation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by modeling mucus biology implicated in inflammatory bowel disease and host-microbiome interactions.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling evaluation of pathogenic or commensal microbiota effects on specific intestinal cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification to preclinical evaluation, supporting iterative assessment of host-targeted and microbiota-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking by enabling direct observation of pathogen interactions with the apical epithelial surface and mucus layer.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article through daily monitoring of confluence via bright field microscopy and endpoint analysis via immunofluorescence for F-actin and mucus markers.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions including transepithelial electrical resistance to monitor barrier integrity and EdU incorporation to assess differentiation-dependent proliferation loss.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by linking mucus secretion patterns to pathophysiological processes in inflammatory bowel disease and infectious colitis models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through its applicability across mucus-secreting organs and adaptability to diverse pathogen-commensal-host interaction studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in host-pathogen engagement mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of monolayer formation across inserts and experimental replicates.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying ineffective mucosal-targeting interventions early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative barrier function and mucus layer integrity data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in stem cell culture, tissue dissociation, and epithelial cell biology.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including orbital shakers, phase contrast and confocal microscopes, and equipment for transepithelial resistance measurement.
- Cross-team standardization requirements for monolayer quality control using defined morphological and molecular markers.
- Adaptation considerations across model systems including upper GI, respiratory, and female reproductive tract applications as noted in the source.
- Practical limitations supported by source material including the critical requirement for adequate colonoid fragmentation to prevent 3D re-formation and ensure monolayer attachment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:22
Isolation and Dissociation of Enteroids/Colonoids from 3D Culture
2:39
Plating the Enteroid/Colonoid Suspension
4:10
Fixation to Preserve and Immunostain Mucus
5:16
Results: Establishment and Evaluation of Human Enteroid/Colonoid Monolayers
6:51
Conclusion
