Name: Pomiar aktywności enzymatycznej laktazy w laboratorium dydaktycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj kolorymetryczną metodę pomiaru aktywności laktazy w laboratorium dydaktycznym. Technika ta pozwala studentom obserwować kinetykę enzymatyczną i interpretować wyniki reakcji biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PAL został ufundowany przez stypendium badawcze Parkinsona w Wielkiej Brytanii (grant F1002). Prace te były wspierane przez MRC New Investigator Research Grant (MR/L010933/1) oraz przez grant MRC Programme MR/N026004/1 dla PAL oraz przez stypendium BBSRC BB/M017222/1 dla JET. Dziękujemy kohorcie 2014-15 studentów MPharm Part 1 na Uniwersytecie w Reading za udział w pierwszej iteracji tego praktycznego kursu, a kolejnym rocznikom za ich opinie i wkład.

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany tak, aby odbywał się w ciągu dwóch godzin (wliczając w to wypełnianie arkuszy w klasie) w specjalnie zbudowanym laboratorium dydaktycznym. Etapy eksperymentalne zostały celowo zestawione razem, aby wykluczyć bardziej szczegółową analizę kinetyki enzymów (przeprowadzoną w kontekście tego kursu przy użyciu danych modelowych); Jednak – jak zauważono w dyskusji – protokół zapewnia szablon dla bardziej zaawansowanych analiz w zależności od czasu, obiektów i poziomu osiągnięć uczniów.
BEZPIECZEŃSTWO: To ćwiczenie powinno być przeprowadzone zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratorium Chemicznego (GCLP) — środki ochrony osobistej, w tym zapinany fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne powinny być noszone przez cały czas w laboratorium.
1. Ekstrakcja enzymu
<ol>
	<li>Rozdrobnić jedną tabletkę laktazy, zawierającą 200 mg enzymu, na równy proszek za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Umieść otrzymany proszek w 15 ml probówce oznaczonej jako "zawiesina" i ponownie zawieś w 10 ml 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).</li>
	<li>Wiruj przez 1 minutę, aby zmaksymalizować ekstrakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Przenieść 1 ml z zawiesiny do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g do osadzających się cząstek stałych.</li>
	<li>Przenieść 500 μl supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako "Ekstrakt laktazy".</li>
</ol>
2. Obserwacja reakcji kolorymetrycznej
<ol>
	<li>Umieścić 390 μl 100 mM PBS w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Reakcja A".</li>
	<li>Dodać 100 μl 5 mM roztworu ONPG i dobrze wymieszać przez wirowanie. 
	UWAGA: W tym praktycznym zastosowaniu orto-nitrofenolu-beta-D-galaktopyranozydu (ONPG) jako substytutu laktozy. Ponieważ ONPG jest związkiem fenolowym, należy obchodzić się z nim ostrożnie. W przypadku kontaktu skóry z ONPG, odsłoniętą skórę należy natychmiast umyć. Wszelkie rozlane płyny należy natychmiast wytrzeć ręcznikami papierowymi i wyrzucić do odpowiedniego strumienia odpadów.</li>
	<li>Dodać 10 μl ekstraktu do probówki A i dobrze wymieszać przez wirowanie.</li>
	<li>Obserwuj mieszaninę reakcyjną przez 5 minut i zwróć uwagę na wszelkie zmiany kolorymetryczne w roztworze.</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności enzymu
<ol>
	<li>Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml: jedną oznaczoną "Reakcja B", drugą oznaczoną "Kontrola".</li>
	<li>Dodać 390 μl 100 mM PBS do probówki reakcyjnej B, 400 μL 100 mM PBS do probówki kontrolnej, a następnie dodać 100 μL 5 mM ONPG do każdej probówki.</li>
	<li>Wymieszaj zawartość przez wirowanie.</li>
	<li>Dodać 10 μl ekstraktu laktazy do probówki B do reakcji, wymieszać przez wirowanie i pozostawić reakcję do przebiegu przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po upływie 1 minuty dodać 500 μl 1 M węglanu sodu do obu probówek, aby zahamować enzym laktazę poprzez zwiększenie pH, kończąc w ten sposób reakcję.</li>
	<li>Przenieść 500 μl z każdej probówki do czystych kuwet spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 420 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Zanotować absorbancję dla reakcji B i próbek kontrolnych, a następnie odjąć wartość kontrolną od wartości reakcji, aby uzyskać zmianę absorbancji spowodowaną hydrolizą ONPG w obecności aktywnego enzymu.</li>
</ol>
4. Wpływ temperatury na aktywność enzymu
<ol>
	<li>Ustawić trzy probówki kontrolne i trzy probówki reakcyjne zgodnie z opisem w rozdziale 3 i oznaczyć je jako "4 °C", "Temperatura pokojowa" i "37 °C".</li>
	<li>Po dodaniu ekstraktu enzymatycznego inkubować jedną probówkę na lodzie, jedną w temperaturze pokojowej i jedną w temperaturze 37 °C (w podgrzanej łaźni wodnej).</li>
	<li>Pozostawić reakcje do zatoczenia przez 1 minutę, a następnie zakończyć reakcję, dodając 500 μl 1 M węglanu sodu do każdej probówki.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 420 nm dla każdej probówki, jak opisano w sekcji 3. Zapisz wartości, odejmując wartość kontrolną od wartości reakcji w każdym przypadku.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).</li>
<li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red%3A+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li>
<li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li>
<li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+%28lacZ%29+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li>
<li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li>
<li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li>
<li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li>
<li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li>
<li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li>
<li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li>
<li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Laboratory+Technology%22%5BJournal%5D)">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li>
<li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed063p242">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242(1986).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Szczegółowa wiedza i zrozumienie enzymów, reakcji enzymatycznych i kinetyki enzymów jest wymagana w szerokim zakresie tematów obejmujących biologię, biomedycynę i farmakologię. Opisany powyżej protokół wykorzystuje laktazę jako przykład enzymu istotnego dla zdrowia ludzkiego do demonstrowania reakcji enzymatycznych, zapewniając kluczowe umiejętności, które można wykorzystać w bardziej zaawansowanych eksperymentach laboratoryjnych.
Protokół ten został celowo zaprojektowany tak, aby był jak najbardziej solidny, umożliwiając studentom z niewielkim lub zerowym doświadczeniem w mokrych laboratoriach uzyskanie możliwych do zinterpretowania wyników w krótkim czasie. W roku akademickim 2014/2015 w Szkole Farmacji Uniwersytetu w Reading łącznie 144 studentów, podzielonych na 3-osobowe grupy, przeprowadziło eksperyment "pomiaru laktazy", przy czym wszystkie grupy były w stanie wykryć pewien poziom aktywności enzymatycznej ekstraktów z tabletek laktazy.
W protokole tym składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby początkowa ekstrakcja była wydajna, co pozwala na rozpuszczenie wystarczającej ilości aktywnego enzymu do późniejszych analiz. Z naszego doświadczenia wynika, że studenci pierwszego roku studiów licencjackich mogą to osiągnąć, postępując zgodnie z opisanym protokołem; Jednak w tym momencie potrzebne były pewne wskazówki ze strony demonstratorów laboratoryjnych. Chociaż wydawałoby się to oczywiste, kluczowym czynnikiem sukcesu tego protokołu jest możliwość dokładnego odmierzania objętości, prawidłowego etykietowania probówek i postępowania zgodnie z instrukcjami. Podczas gdy w przypadku wielu uczniów można założyć pewien poziom biegłości, uważne monitorowanie i wyraźna prośba do uczniów, aby poprosili o pomoc w przypadku, gdy nie są pewni, co robić dalej, zapewnia największe prawdopodobieństwo pomyślnego testu.
Ocena ucznia może być przeprowadzona za pomocą arkusza roboczego w klasie (dostępnego jako materiał uzupełniający), w którym prosi się uczniów o zanotowanie danych z eksperymentów, skomentowanie ich wyników i zamieszczenie linku do informacji ogólnych/lektur z materiału wykładowego lub poprzez bardziej szczegółową ocenę poza klasą z dostarczonymi danymi modelowymi umożliwiającymi podjęcie i ocenę analiz kinetycznych.
Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół jest prostym przykładem testu aktywności laktazy w warunkach laboratoryjnych i istnieje wiele możliwości zwiększenia złożoności eksperymentu, aby umożliwić bardziej zaawansowane analizy. W szczególności przedstawiony protokół stanowi wprowadzenie do koncepcji kinetyki enzymów, ale nie pozwala na analizę kinetyczną danych doświadczalnych. W związku z tym zalecamy zapoznanie się z opisanym protokołem jako wstępnym szablonem dla zajęć, z dokładnymi szczegółami dostosowanymi do konkretnych celów i talentów kohorty studentów podejmujących eksperymenty. Przykłady rozszerzonych eksperymentów mogą obejmować: powtarzające się pomiary w różnych temperaturach, przy użyciu różnych stężeń substratów w celu umożliwienia analizy statystycznej, analizę kinetyczną danych (odpowiednią dla studentów/kierunków biochemii), zaczynając od kilku różnych tabletek i pozwalając studentom ocenić różną aktywność enzymu w każdej z nich (z dodatkiem tabletek kontrolnych, odpowiednich dla studentów/kierunków kryminalistycznych), ocena wpływu denaturacji cieplnej lub przeprowadzenie eksperymentów konkursowych przez dodanie laktozy lub inhibitorów laktazy (tab. 1). Szczegółowy protokół analizy kinetycznej laktazy został wcześniej opublikowany12.
Ważną zaletą tego protokołu jest to, że łączy on podstawowe wprowadzenie do enzymologii i kinetyki enzymów z rzeczywistym studium przypadku enzymologii w medycynie. To sprawia, że ten eksperyment laboratoryjny ma szczególne znaczenie dla studentów medycyny, farmacji, nauk biomedycznych i kierunków pokrewnych. Co ważne, fakt, że istnieje zarówno poważny stan chorobowy, jak i bardziej powszechny problem dietetyczny związany z katabolizmem laktozy, daje możliwość poruszenia ze studentami szerokiego zakresu kwestii medycznych i etycznych. Może to obejmować kwestie związane z badaniami genetycznymi w kierunku schorzeń oraz związane z nimi dyskusje związane z terapią genową i poradnictwem genetycznym, a także stosowaniem i sprzedażą suplementów leczniczych. Jednym z głównych ograniczeń jest to, że protokół nie pozwala na precyzyjne oszacowanie stężenia enzymu, ze względu na materiał wyjściowy użyty do ekstrakcji. Modyfikacja mająca na celu uwzględnienie tego faktu polegałaby jednak na użyciu enzymu klasy odczynnikowej do testu. Co ważne, pozwoliłoby to również na dokładniejsze obliczenia kinetyki enzymu laktazy.
Podsumowując, badanie aktywności laktazy w środowisku laboratoryjnym stanowi solidne, wciągające i interesujące wprowadzenie do dziedziny biologii enzymów dla początkujących studentów uniwersytetów.

Enzymy to wyspecjalizowany rodzaj białka, które działają jako biologiczne katalizatory reakcji chemicznych w organizmach żywych1. Działanie enzymów ma kluczowe znaczenie dla życia, dostarczając energii, usuwając odpady i umożliwiając funkcjonowanie organizmów. Zrozumienie enzymów ma zatem kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia życia. Taka wiedza jest niezbędna w szerokiej gamie programów studiów uniwersyteckich, od nauk medycznych po biologię. Podczas gdy szczegółowe tło, począwszy od zasad katalizy, a skończywszy na teoretycznych modelach aktywności enzymów, można zapewnić studentom za pomocą wykładów i materiałów do czytania, właściwości reakcji enzymatycznych są najlepiej zrozumiane przez praktyczne doświadczenie enzymów w działaniu, jak pokazano wcześniej2. Protokół ten zapewnia prosty do naśladowania paradygmat eksperymentalny do pomiaru aktywności enzymu w warunkach laboratoryjnych, wykorzystując laktazę jako przykład enzymu o aktywności istotnej dla żywienia i zdrowia człowieka.
Laktaza hydrolazy glikozydowej (EC 3.2.1.23/26) jest enzymem o kluczowym znaczeniu żywieniowym dla ssaków3. Aktywność laktazy jest wysoce konserwatywna w procesie ewolucji i wywodzi się z rodziny enzymów beta-galaktozydazy - rodziny obecnej od Escherichia coli do Homo sapiens (ryc. 1, PDB 1JZ8)4. Krytyczne znaczenie laktazy w żywieniu człowieka wynika z jej roli w umożliwianiu rozkładu laktozy na składniki monosacharydowe, które mogą być następnie wykorzystane do wytwarzania energii w organizmie. Laktaza katalizuje hydrolizę wiązania glikozydowego w dwucucharydzie laktozie, uwalniając galaktozę i glukozę (ryc. 2)5. Te monosacharydy są następnie wykorzystywane głównie do wytwarzania trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez cykl kwasu cytrynowego i fosforylację oksydacyjną6. Podczas rozwoju noworodków i niemowląt laktaza ulega silnej ekspresji w ludzkim układzie pokarmowym, rozkładając laktozę otrzymywaną z mleka matki, którego laktoza jest głównym składnikiem węglowodanów i jednym z kluczowych źródeł pożywienia we wczesnych latach życia7. Medyczne znaczenie laktazy podkreśla wrodzony niedobór laktazy (CLD), rzadki autosomalny recesywny stan spowodowany mutacjami w genie laktazy (LCT) kodującym enzym laktazę8. Noworodki z CLD wykazują bardzo małą aktywność laktazy, dlatego nie mogą być karmione mlekiem matki, żadnym innym rodzajem mleka ani mlekiem modyfikowanym zawierającym laktozę.
Podczas dzieciństwa ekspresja laktazy jest zwykle zmniejszona; jednak ta redukcja po odsadzeniu różni się geograficznie, przy czym około 35% dorosłych na całym świecie kontynuuje ekspresję enzymu9. Utrzymująca się ekspresja laktazy, znana jako trwałość laktazy, pozwala pacjentom na dalsze trawienie mleka i produktów mlecznych z różnych źródeł. I odwrotnie, utrata ekspresji laktazy może prowadzić do nietolerancji laktozy, znanej również jako hipolaktazja typu dorosłego (ATH), wynikającej z niezdolności do rozkładu laktozy w jelitach. ATH charakteryzuje się nagromadzeniem laktozy w okrężnicy po spożyciu produktów spożywczych zawierających laktozę. W okrężnicy nagromadzona laktoza jest fermentowana przez faunę mikrobiologiczną jelit, uwalniając gazy, w tym wodór, metan i dwutlenek węgla. Produkcja tych gazów u osób z niedoborem enzymu laktazy sprzyja wzdęciom brzucha, zwiększonym wzdęciom, bólowi, nudnościom i borborygmi (burczeniu w brzuchu)7. Zwiększony poziom laktozy w przewodzie pokarmowym może również prowadzić do luźnych stolców.
Kontrola ekspresji genu LCT jest modulowana przez polimorfizmy zlokalizowane w intronach pobliskiego genu MCM6. Osoby z utrzymującą się ekspresją laktazy są nosicielami polimorfizmów, które działają jako silne dystalne wzmacniacze ekspresji genu LCT, kompensując w ten sposób normalną regulację transkrypcji LCT w dół podczas odsadzania, a w konsekwencji utrzymując ekspresję laktazy w wieku dorosłym3. Sugeruje się, że polimorfizmy wzmacniaczy zostały pozytywnie wyselekcjonowane po udomowieniu bydła i wielbłądów na Bliskim Wschodzie ponad pięć tysięcy lat temu9,10.
Objawy wynikające z ATH można opanować poprzez zmniejszenie spożycia laktozy, na przykład poprzez usunięcie produktów mlecznych z diety. Alternatywnym podejściem do ATH, a także podejściem z wyboru w przypadku CLD, jest stosowanie suplementów laktazy, powszechnie dostępnych w aptekach. Suplementy te dostarczają laktazę wyizolowaną z różnych źródeł, w tym drożdży i bakterii, w postaci płynnej lub na bazie tabletek, którą można przyjmować z jedzeniem zawierającym laktozę lub dodawać do niej. Suplement będzie hydrolizował część laktozy obecnej w żywności do produktów glukozy i galaktozy, umożliwiając w ten sposób ich wchłanianie i zapobiegając gromadzeniu się niestrawionego substratu laktozy w jelitach.
Opierając się na zastosowaniu suplementów laktazy jako pomocy dietetycznej, opracowaliśmy prosty eksperyment laboratoryjny enzymologiczny odpowiedni dla studentów pierwszego roku nauk biomedycznych lub farmacji. Ten eksperyment laboratoryjny wykorzystuje dostępne na rynku suplementy laktazy i wykorzystuje orto-nitrofenol-beta-D-galaktopyranozyd (ONPG) w celu zapewnienia kolorymetrycznego punktu końcowego do pomiaru rozszczepienia wiązań glikozydowych przez laktazę (ryc. 3)11. ONPG działa jak sztuczny substrat dla laktazy, która poddana hydrolizie przez ten enzym wytwarza D-galaktozę i ortonitrofenol. Ten ostatni produkt ma żółty kolor, pochłaniając światło o długości fali 420 nm. Określając ilościowo wszelkie zmiany absorbancji przy 420 nm po ekspozycji ONPG na laktazę, możliwe jest oszacowanie aktywności tego enzymu. Ten eksperyment laboratoryjny zapewnia demonstrację aktywności hydrolazy enzymatycznej. Dzięki wbudowaniu dodatkowych powtórzeń i przeprowadzeniu testów w różnych warunkach, możliwe jest włączenie bardziej zaawansowanych analiz kinetyki enzymów, dostarczając cennego przykładu działania enzymów w praktyce, istotnych dla zdrowia ludzkiego.

<table><tbody><tr><td>Tabletka laktazy</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (sproszkowana)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Rozpuszczona w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 100 mM</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>Rozpuszczona w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 5 mM</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>Rozpuszczona w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 1 M</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek i moździerz</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Probówki Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Kuwety</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Wirówka Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Thermo-Scientific Wagi Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności enzymatycznej laktazy w laboratorium dydaktycznym

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Zrozumienie, jak działają enzymy, i odniesienie tego do przykładów z życia wziętych, jest kluczowe dla szerokiego zakresu studiów licencjackich w naukach biologicznych i biomedycznych. Ten łatwy do naśladowania protokół został opracowany dla studentów pierwszego roku studiów licencjackich farmacji i stanowi wprowadzenie na poziomie podstawowym do reakcji enzymatycznych i procedur analitycznych do analizy enzymów. Enzymem z wyboru jest laktaza, ponieważ stanowi ona przykład dostępnego na rynku enzymu istotnego dla chorób u ludzi/praktyki farmaceutycznej. Laktaza jest ekstrahowana z tabletek suplementu diety i oceniana za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na hydrolizie sztucznego substratu dla laktazy (orto-nitrofenol-beta-D-galaktopyranozyd, ONPG). Uwalnianie ortonitrofenolu po hydrolitycznym rozszczepieniu ONPG przez laktazę mierzy się poprzez zmianę absorbancji przy 420 nm, a wpływ temperatury na reakcję enzymatyczną ocenia się, przeprowadzając reakcję na lodzie, w temperaturze pokojowej i w temperaturze 37 °C. Bardziej zaawansowana analiza może być realizowana przy użyciu tego protokołu, oceniając aktywność enzymu w różnych warunkach i przy użyciu różnych odczynników.

Reprezentatywne wyniki dla Sekcji 2 protokołu przedstawiono na Ryc. 4A. Reakcja kontrolna, w przypadku braku enzymu laktazy, pozostaje przejrzysta, podczas gdy roztwór reakcyjny zawierający ekstrakt z tabletki laktazy zmienia barwę na żółtą w wyniku hydrolizy ONPG i uwalniania ortho-nitrofenolu. Ryc. 4B przedstawia kwantyfikację w jednostkach umownych z Sekcji 4 protokołu, przeprowadzoną po analizie próbek przy użyciu spektrofotometru. Produkcja ortho-nitrofenolu jest najniższa, gdy reakcja jest inkubowana w lodzie, i najwyższa, gdy reakcja jest prowadzona w 37 °C.
<img alt="Analiza struktury białka z kolorowymi podjednostkami; powiększenie miejsca wiązania; oddziaływania molekularne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: E. coli beta-galaktozydaza. (A) Struktura krystaliczna beta-galaktozydazy z Escherichia coli, przedstawiająca tetramericzną strukturę kompleksu aktywnego. (B) Allolaktoza (zaznaczona na czerwono) związana z centrum aktywnym beta-galaktozydazy. Obrazy wygenerowane na podstawie PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat reakcji hydrolizy laktozy przedstawiający przekształcanie laktozy w D-galaktozę i D-glukozę przez enzym laktazę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Działanie enzymatyczne laktazy. Hydroliza laktozy przez laktazę w celu wytworzenia beta-D-galaktozy i beta-D-glukozy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat reakcji chemicznej: laktaza hydrolizująca ONPG do D-galaktozy i orto-nitrofenolu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Hydroliza orto-nitrofenylo-beta-D-galaktopiranozydu. Hydroliza ONPG przez laktazę w celu wytworzenia beta-D-galaktozy i orto-nitrofenolu (który ma żółty kolor), co umożliwia oznaczenie aktywności laktazy poprzez pomiar absorbancji przy 420 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie absorpcji w kuwetach; układ eksperymentalny i dane: reakcja względem kontroli w różnych temperaturach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Hydroliza ONPG. Reprezentatywne wyniki hydrolizy ONPG, przedstawiające probówki kontrolne i reakcyjne (A) oraz reprezentatywne dane z sekcji 4 protokołu zapisane w arkuszach ćwiczeń, pokazujące surową absorbancję w jednostkach arbitralnych przy 420 nm, skorygowaną o tło i w trzech różnych temperaturach (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Warunki eksperymentalne</td>
			<td>Zmienne eksperymentalne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura</td>
			<td>0 °C, 10 °C, 20 °C, 30 °C, 50 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie substratu</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamowanie konkurencyjne</td>
			<td>5 mM ONPG oraz 0 mM, 1 mM, 5 mM lub 10 mM laktozy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zależność od czasu</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja termiczna</td>
			<td>Ekstrakt laktazy podgrzany do 100 °C przez 10 min przed analizą</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Potencjalne rozszerzone warunki eksperymentalne. Sugerowane rozszerzone eksperymenty, które należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach, badające specyficzne aspekty biologii laktazy.
Materiały uzupełniające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377_SupplementalFiles.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Aktywność enzymatyczna laktazy jest niezbędna do katabolicznego przetwarzania disacharydu laktozy. W tym przypadku aktywność laktazy znajdującej się w suplementach diety jest oznaczana za pomocą testu kolorymetrycznego. Daje to studentom eksperymentalną platformę do zrozumienia aktywności laktazy i kinetyki enzymów.

Pomiar aktywności enzymatycznej laktazy w laboratorium dydaktycznym

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Metoda ta jest użytecznym narzędziem do zapoznania uczniów z pojęciami rządzącymi reakcjami enzymatycznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona odpowiednia dla studentów z bardzo małym doświadczeniem w mokrym laboratorium, zapewniając uczniom solidne wyniki do obserwacji i interpretacji. Aby rozpocząć protokół, oznacz zawiesinę z rurką o pojemności 15 mililitrów.Zmiażdżyć jedną tabletkę laktazy zawierającą 200 miligramów enzymu na równy proszek za pomocą moździerza i tłuczka. Umieść powstały proszek w oznakowanej probówce i ponownie zawieś go w 10 mililitrach 100-milimolowego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Wiruj roztwór przez jedną minutę, aby zmaksymalizować ekstrakcję enzymatyczną.Następnie przenieś jeden mililitr z zawiesiny do rurki o pojemności 1,5 mililitra i wiruj próbkę przez jedną minutę z prędkością 10 000 razy G, aby osadzać cząstki stałe. Przenieść 500 mikrolitrów supernatantu do czystej 1,5 mililitrowej probówki z ekstraktem laktazy. Umieść 390 mikrolitrów 100 milimolowych PBS w 1,5 mililitrowej probówce oznaczonej jako reakcja A. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pięciomilimolowego roztworu ONPG i dobrze wymieszaj, wirując.Dodaj 10 mikrolitrów ekstraktu do probówki A i wymieszaj zawartość. Obserwuj mieszaninę reakcyjną często przez pięć minut i odnotowuj wszelkie zmiany kolorymetryczne roztworu. Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 mililitra, jedną oznaczoną reakcją B, jedną oznaczoną kontrolą.Dodać 390 mikrolitrów 100 milimolowych PBS do probówki reakcyjnej B, 400 mikrolitrów 100 milimolowych PBS do probówki kontrolnej, a następnie dodać 100 mikrolitrów pięciomilimolowego PBS do każdej probówki. Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Dodać 10 mikrolitrów ekstraktu laktazy do probówki B do reakcji, wymieszać przez wirowanie i pozostawić reakcję na jedną minutę w temperaturze pokojowej.Po upływie jednej minuty dodaj 500 mikrolitrów jednego molowego węglanu sodu do obu probówek, aby zahamować enzym laktazę poprzez zwiększenie pH, zatrzymując reakcję. Przenieś 500 mikrolitrów z każdej probówki do czystych kuwet spektrofotometru i zmierz absorbancję przy 420 nanometrach. Ustaw trzy probówki kontrolne i trzy probówki reakcyjne i oznacz je czterema stopniami Celsjusza, temperaturą pokojową i 37 stopniami Celsjusza.Po dodaniu ekstraktu enzymatycznego inkubować jedną probówkę na lodzie, jedną w temperaturze pokojowej i jedną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w podgrzanej łaźni wodnej przez jedną minutę. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając 500 mikrolitrów jednego molowego węglanu sodu do każdej probówki. Zmierz absorbancję przy 420 nanometrach dla każdej probówki.Zapisz wartości, odejmując wartość kontrolną od wartości reakcji w każdym przypadku. Korzystając z protokołu, kontrola pozostaje czysta, podczas gdy roztwór reakcyjny zawierający ekstrakt z tabletki laktazy zmienia kolor na żółty w wyniku hydrolizy ONPG, uwalniając ortonitrofenol. Po analizie próbek za pomocą spektrofotometru produkcja ortonitrofenolu jest najniższa, gdy reakcja jest inkubowana na lodzie, a największa, gdy reakcja przeprowadzana jest w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby reakcje zachodziły w odpowiedniej temperaturze przed dodaniem ekstraktu enzymatycznego.

measuring-lactase-enzymatic-activity-in-the-teaching-lab

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru mleczanu w lizatach komórkowych przy użyciu enzymu dehydrogenazy mleczanowej. Enzym ten przekształca mleczan w pirogronian, wraz z konwersją NAD do NADH, który reaguje z barwnikami tetrazolowymi i daje kolorowy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie w celu ilościowego określenia mleczanu.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego mleczanu w próbkach badanych

Film demonstruje test do oceny masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Wykorzystuje elektroporację do uwalniania białek cytozolowych, w tym dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Sekwestrowane LDH i całkowite komórkowe frakcje LDH są oznaczane w celu oceny sekwestracji LDH, dostarczając wglądu w ogólną aktywność sekwestracji masowej.

Kwantyfikacja masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Ten film pokazuje pomiar in vitro aktywności enzymu dla α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy w próbkach używających syntetycznych substratów 4-metylulumbelliferylu.

Pomiar in vitro aktywności enzymów α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

Opisujemy powtarzalną metodę przygotowania komórek groniastych trzustki myszy od myszy w celu zbadania sygnałów wapniowych komórek groniastych i uszkodzeń komórkowych za pomocą fizjologicznie i patologicznie istotnych bodźców. Podano również metodę infekcji adenowirusowej tych komórek.

Przygotowanie komórek groniastych trzustki do celów obrazowania wapnia, pomiarów uszkodzeń komórek i infekcji adenowirusowej

Opisujemy protokół mapowania przestrzennego rozkładu aktywności enzymatycznej dla enzymów, które generują fosforan dinukleotydu nikotynoatmidadeninowego (NAD(P)H) + H+ bezpośrednio w próbkach tkanek.

Mapowanie metabolizmu: monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w tkance

Wykrywanie endotoksyn w nanomateriałach inżynieryjnych stanowi jedno z największych wyzwań w dziedzinie nanomedycyny. W tym miejscu przedstawiamy studium przypadku, które opisuje ramy składające się z trzech różnych formatów LAL w celu oszacowania potencjalnego zanieczyszczenia endotoksynami w nanocząstkach.

Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL)

Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Rozwój soczewki wiąże się z interakcjami z innymi tkankami. Kilka mutantów oka u danio pręgowanego charakteryzuje się nienaturalnie małym rozmiarem soczewki. W niniejszym opracowaniu prezentujemy eksperyment z transplantacji soczewki, mający na celu ustalenie, czy fenotyp ten wynika z przyczyn wewnętrznych, czy z wadliwych interakcji z tkankami otaczającymi soczewkę.

Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Projekt Inteligentnego Wieloczujnikowego Systemu Rzeczywistości Wirtualnej do Leczenia Zaburzeń Lękowych (INTREPID) ma na celu opracowanie wieloczujnikowego systemu rzeczywistości wirtualnej, świadomego kontekstu, przeznaczonego do leczenia zaburzeń związanych z lękiem.

Zastosowanie biofeedbacku w klinicznej rzeczywistości wirtualnej: Projekt INTREPID

Poznaj kolorymetryczną metodę pomiaru aktywności laktazy w laboratorium dydaktycznym. Technika ta pozwala studentom obserwować kinetykę enzymatyczną i interpretować wyniki reakcji biochemicznych.

Pomiar aktywności enzymatycznej laktazy w laboratorium dydaktycznym

Przeglądaj więcej filmów