Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL)

Wykrywanie endotoksyn w nanomateriałach inżynieryjnych stanowi jedno z największych wyzwań w dziedzinie nanomedycyny. W tym miejscu przedstawiamy studium przypadku, które opisuje ramy składające się z trzech różnych formatów LAL w celu oszacowania potencjalnego zanieczyszczenia endotoksynami w nanocząstkach.

Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi w dziedzinie medycyny na temat bezpieczeństwa nanoleków. Zaletą tej techniki jest to, że jest ona standardowa i jest stosowana na całym świecie do oceny produktów, do nanoleków. Demonstracją procedury będzie Barry Neun z Laboratorium Charakterystyki Nanotechnologii.

Do przygotowania wzorca kalibracyjnego użyj 900 mikrolitrów lizatu amebocytów limulusa lub wody klasy LAL. I 100 mikrolitrów kontrolnej wzorcowej endotoksyny, aby przygotować tyle rozcieńczeń pośrednich, ile potrzeba, aby umożliwić przygotowanie wzorca kalibracyjnego o stężeniu jednej jednostki endotoksyny na mililitr. Następnie, używając 900 mikrolitrów wody klasy LAL i 100 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr wzorca kalibracyjnego, przygotuj drugi wzorzec kalibracyjny o stężeniu 0,1 jednostki endotoksyny na mililitr.

Następnie powtórzyć seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenie, aby przygotować dwa niższe wzorce kalibracyjne. Aby uzyskać w sumie cztery wzorce kalibracyjne, w zakresie od 0001 do jednej jednostki endotoksyny na mililitr. Aby przygotować jednostkę endotoksyny 05 na mililitr kontroli jakości, połącz 50 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr standardowego roztworu endotoksyny kontrolnej z 950 mikrolitrami wody klasy LAL.

Następnie w oprogramowaniu wybierz ustawienia instrumentu i utwórz szablon. Wybierz opcję zbierania danych, a następnie wprowadź identyfikator testu i grupę danych na karcie ogólne. Na karcie sprzętu wybierz typ instrumentu i metodę LAL, a następnie sprawdź, czy na ekranie pojawia się numer seryjny, identyfikator systemu i informacje o porcie szeregowym.

Kliknij przycisk OK dwa razy, aby potwierdzić wybór urządzenia i komunikację z urządzeniem, a następnie wprowadź identyfikatory próbek w tej samej kolejności, w jakiej próbki będą testowane. Następnie użyj domyślnych przycisków, aby wprowadzić krzywą wzorcową kontroli ujemnej i przetestuj próbki. Dodaj odpowiednią objętość wzorców kalibracji kontroli ujemnej i kontroli jakości do zduplikowanych, wstępnie oznakowanych szklanych probówek.

I dodaj odpowiednią ilość LAL do pierwszego podłego testu. Krótko przekręć podłość i umieść fiolkę w odpowiednich szczelinach testowych w karuzeli instrumentów. Przed załadowaniem próbek należy wykonać kilka rozcieńczeń badanego nanomateriału w maksymalnym dopuszczalnym rozcieńczeniu, jak pokazano.

Aby przygotować jednostkę 05 endotoksyn na mililitr kontroli hamowania, należy połączyć 25 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr kontrolnego standardowego roztworu endotoksyny z 475 mikrolitrami badanego nanomateriału w danym rozcieńczeniu. Po wirowaniu załaduj do instrumentu odpowiednie kontrolki poprawy innowacyjności i próbki badawcze bez wzbogaceń. Następnie podwielokrotność niewzbogaconych i wzbogaconych nanomateriałów w określonym rozcieńczeniu do wstępnie oznakowanych probówek.

Przed wirowaniem i załadowaniem do karuzeli instrumentów. Aby wykonać Gel-Clot LAL, przygotuj kontrolną standardową endotoksynę do końcowego stężenia czterech lambda i połącz 100 mikrolitrów wzorca ze 100 mikrolitrami wody lub próbki testowej, aby uzyskać końcowe stężenie kontrolnej standardowej endotoksyny dwie lambda. Dodaj 100 mikrolitrów lizyny do każdego rozcieńczenia lambda.

Krótko wymieszaj rurki i umieść stojak z rurkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Pod koniec inkubacji odwróć probówki płynnym ruchem i ręcznie zapisz wyniki, używając plus dla twardego skrzepu i minus dla braku skrzepu lub luźnego skrzepu. W tej reprezentatywnej analizie pegylowana liposomalna doksorubicyna zakłócała działanie chromogennego LAL w rozcieńczeniu piątym, jednak interferencja ta została przezwyciężona przy wyższych rozcieńczeniach.

Odzysk kolców wynosił od 50 do 200%, gdy preparat testowano w rozcieńczeniach 50 i 500 w mętności i chromogennym LAL, a także w rozcieńczeniu piątym, w mętności LAL. Po skorygowaniu o współczynnik rozcieńczenia, wyniki były zgodne między urojeniami w obu esejach. Co więcej, wyniki były spójne między trzema formatami esejów.

Pamiętaj, że każda próbka ma swój własny zakres rozcieńczeń, każdy format LAL wykorzystuje swój standard kontrolny w doksynie i lizacie, a probówki używane do przygotowania rozcieńczeń i przeprowadzania reakcji są różne dla każdego eseju LAR. W przypadku tej procedury można zastosować inne metody, takie jak Można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące materiału Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę szwom i dziedzinie nanomedycyny, do zbadania medycznych zastosowań leków sformułowanych w nanotechnologii u ludzi i modeli klinicznych, w tym między innymi naczelnych innych niż ludzie, królików, psy i szczury. Nie zapominaj, że praca z Doxin może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.