Name: Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Dowiedz się wykrywać endotoksyny w nanomateriałach za pomocą testów LAL w nanomedycynie. Ta metoda zapewnia niezawodną ocenę bezpieczeństwa nano-leków zgodnie ze standardami regulacyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez fundusze federalne z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianki o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznaczają poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

1. Przygotowanie próbek nanocząstek
<ol>
	<li>Przygotować badaną próbkę w wodzie o czystości LAL.</li>
	<li>Jeśli pH próbki wykracza poza zakres 6-8, dostosuj pH za pomocą wodorotlenku sodu lub kwasu solnego niezawierającego pirogenów.</li>
	<li>Używając wody klasy LAL należy przygotować kilka rozcieńczeń badanej próbki. Upewnij się, że najwyższe rozcieńczenie nie przekracza maksymalnego ważnego rozcieńczenia (MVD). Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat szacowania MVD.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników wspólnych dla formatów LAL
<ol>
	<li>Rozcieńczyć stężoną bazę wodorotlenku sodu za pomocą wody z odczynnikiem LAL wolnej od pirogenów, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,1 N.</li>
	<li>Rozcieńczyć stężony kwas solny wodą z odczynnikiem LAL i przygotować roztwór roboczy o końcowym stężeniu 0,1 N.</li>
	<li>Przygotowanie wzorca kontrolnego endotoksyny (CSE)
	<ol>
		<li>Odtworzyć CSE zgodnie z certyfikatem analizy dostarczonym przez producenta. 
		UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby zapoznać się z ważnymi uwagami dotyczącymi informacji zawartych w certyfikacie. Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat numeru katalogowego i zastosowania danego preparatu CSE w różnych formatach LAL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika LAL
	<ol>
		<li>Odczynnik LAL należy rozpuścić zgodnie z certyfikatem analizy dostarczonym przez producenta. 
		UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać ważne informacje dotyczące przygotowania odczynnika LAL. Szczegółowe informacje na temat numeru katalogowego i zastosowania danej formulacji odczynnika LAL w różnych formatach LAL można znaleźć w Tabeli Materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test zmętnienia LAL
<ol>
	<li>Przygotowanie wzorców kalibracyjnych
	<ol>
		<li>Używając 900 μl wody klasy LAL i 100 μl CSE, przygotuj tyle rozcieńczeń pośrednich, ile potrzeba, aby umożliwić przygotowanie wzorca kalibracyjnego o zakresie stężeń od 0,001 do 1 EU/ml.</li>
		<li>Najpierw oznacz probówki i dodaj 900 μl wody klasy LAL do każdej probówki. Następnie dodać 100 μl 10 EU/ml roztworu, aby przygotować wzorzec kalibracyjny o stężeniu 1EU/ml.</li>
		<li>Powtórzyć seryjne 10-krotne rozcieńczenie, jak opisano powyżej, aby przygotować trzy niższe wzorce kalibracyjne. Sprawdzić, czy przygotowano cztery wzorce kalibracyjne w zakresie od 0,001 do 1 EU/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kontroli jakości
	<ol>
		<li>Przygotuj kontrolę jakości 0,05 EU/ml, łącząc 50 μl roztworu 1 EU/ml CSE z 950 μl wody klasy LAL. 
		UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania kontroli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kontroli hamowania/wzmacniania (IEC)
	<ol>
		<li>Przygotować IEC o stężeniu 0,05 EU/ml, łącząc 25 μl 1 EU/ml roztworu CSE i 475 μl badanego nanomateriału w danym rozcieńczeniu. 
		UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać dodatkowe informacje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura doświadczalna
	<ol>
		<li>Pozwól instrumentowi się rozgrzać, włączając go około 30 minut wcześniej. Ustaw długość fali detekcji na 660 nm, ponieważ jest to odpowiednie dla zmętnienia LAL.</li>
		<li>Zaloguj się, wpisując nazwę użytkownika i hasło.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie (Spis materiałów), klikając odpowiednią ikonę na ekranie komputera.</li>
		<li>Wybierz opcję Zbieraj dane na ekranie głównym oprogramowania. Wprowadź identyfikator testu i informacje o grupie danych w odpowiednim miejscu na karcie Ogólne na ekranie głównym.</li>
		<li>Kliknij kartę Sprzęt. Wybierz typ instrumentu z menu rozwijanego.</li>
		<li>Ustaw długość fali detekcji na 660 nm, ponieważ jest to odpowiednie dla zmętnienia LAL, wybierając metodę zmętnienia RAL.</li>
		<li>Sprawdź, czy na ekranie pojawia się numer seryjny, identyfikator systemu i informacje o porcie szeregowym. Kliknij przycisk OK. Kliknij OK jeszcze raz, aby potwierdzić.</li>
		<li>Wprowadź identyfikator próbki w tej samej kolejności, w jakiej próbka jest testowana. Użyj domyślnych przycisków, aby wprowadzić kontrolę ujemną, krzywą wzorcową i próbki testowe. </li>
		<li>Przygotować zduplikowane probówki dla każdej próbki i dodać 200 μl (stosunek testowy 4:1) lub 100 μl (stosunek testowy 1:1) kontroli ujemnej (woda), wzorce kalibracyjne, kontrola jakości, IEC i nanocząstki testowe do wstępnie znakowanych szklanych probówek.</li>
		<li>Dodaj 50 μl (stosunek testowy 4:1) lub 100 μl (stosunek testowy 1:1) odczynnika LAL do pierwszej fiolki testowej, krótko ją wymieszaj i włóż do szczeliny testowej w karuzeli instrumentów. Jeśli stosuje się stosunek 1:1, objętość odczynnika LAL wynosi 100 μL.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę opisaną powyżej dla innych próbek. Przetwarzaj próbki pojedynczo. 
		UWAGA: Więcej informacji można znaleźć w sekcji dyskusji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Chromogeniczny LAL
<ol>
	<li>Przygotowanie wzorców kalibracyjnych
	<ol>
		<li>Używając 900 μl wody klasy LAL i 100 μl CSE, należy przygotować tyle rozcieńczeń pośrednich, ile potrzeba, aby umożliwić przygotowanie wzorca kalibracyjnego o stężeniu 1 EU/ml.</li>
		<li>Używając 900 μl wody LAL i 100 μl wzorca kalibracyjnego 1 EU/ml, przygotuj drugi wzorzec kalibracyjny o stężeniu 0,1 EU/ml.</li>
		<li>Powtórzyć seryjne 10-krotne rozcieńczenie, jak opisano powyżej, aby przygotować dwa niższe wzorce kalibracyjne. Sprawdzić, czy przygotowano cztery wzorce kalibracyjne w zakresie od 0,001 do 1 EU/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kontroli jakości.
	<ol>
		<li>Przygotuj kontrolę jakości 0,05 EU/ml, łącząc 50 μl roztworu 1 EU/ml CSE z 950 μl wody klasy LAL. 
		UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania kontroli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kontroli hamowania/wzmacniania (IEC)
	<ol>
		<li>Przygotować 0,05 EU/ml, łącząc 25 μl 1 EU/ml roztworu CSE z 475 μl badanego nanomateriału. 
		UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać dodatkowe informacje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura doświadczalna
	<ol>
		<li>Pozwól instrumentowi się rozgrzać, włączając go około 30 minut wcześniej. Ustaw długość fali detekcji na 405 nm, ponieważ jest to odpowiednie dla zmętnienia LAL.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie, klikając odpowiednią ikonę na ekranie komputera. Zaloguj się, wpisując nazwę użytkownika i hasło.</li>
		<li>Wybierz opcję Zbieraj dane na ekranie głównym oprogramowania. Wprowadź identyfikator testu i informacje o grupie danych w odpowiednim miejscu na karcie Ogólne na ekranie głównym.</li>
		<li>Kliknij kartę Sprzęt. Wybierz typ instrumentu z menu rozwijanego. Wybierz instrument.</li>
		<li>Sprawdź, czy na ekranie pojawia się numer seryjny, identyfikator systemu i informacje o porcie szeregowym. Kliknij przycisk OK. Kliknij OK jeszcze raz, aby potwierdzić.</li>
		<li>Wprowadź identyfikator próbki w tej samej kolejności, w jakiej próbka jest testowana. Użyj domyślnych przycisków, aby wprowadzić kontrolę ujemną, krzywą standardową i próbki testowe.</li>
		<li>Przygotować zduplikowane probówki dla każdej próbki i dodać 200 μl (stosunek testowy 4:1) lub 100 μl (stosunek testowy 1:1) kontroli ujemnej (woda), wzorce kalibracyjne, kontrola jakości, IEC i nanocząstki testowe do wstępnie znakowanych szklanych probówek.</li>
		<li>Dodaj 50 μl (stosunek testowy 4:1) lub 100 μl (stosunek testowy 1:1) odczynnika LAL do pierwszej fiolki testowej, krótko ją wymieszaj i włóż do szczeliny testowej w karuzeli instrumentów. Jeśli stosuje się stosunek 1:1, objętość odczynnika LAL wynosi 100 μL.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę opisaną powyżej dla innych próbek. Przetwarzaj próbki pojedynczo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Żel-skrzep LAL
UWAGA: Ten test identyfikuje obecność endotoksyn w próbce na podstawie obserwacji wizualnej i wykrycia skrzepu w probówce reakcyjnej. Kroki eksperymentalne opisano poniżej. Użyj arkusza stołu, aby zapisać wyniki. Arkusz ten nie jest obowiązkowy i dopuszczalne są również inne sposoby zapisywania wyników testu. Przykład takiego arkusza ławki znajduje się w materiałach uzupełniających dla wygody czytelnika. Lambda (l) jest czułością testu żelowo-skrzepowego i wynosi 0,03 EU/ml.
<ol>
	<li>Oznacz tyle probówek reakcyjnych, ile potrzeba, aby pomieścić liczbę analizowanych próbek testowych. Szczegółowe informacje na temat liczby kontrprób użytych w kroku 1, kroku 2 i kroku 3 testu można znaleźć w arkuszu laboratoryjnym.</li>
	<li>Podwielokrotność 100 μl wody, próbki kontrolnej lub próbki testowej na probówkę.</li>
	<li>Przygotować CSE tak, aby końcowe stężenie było równe 4λ.</li>
	<li>Połączyć 100 μl wyżej wymienionego wzorca ze 100 μl wody lub badanej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie CSE 2λ. Powtórz jeszcze trzy razy, aby uzyskać lambda i pół-lambda oraz ćwiartkę lambda.</li>
	<li>Upewnij się, że temperatura w łaźni wodnej wynosi 37 °C.</li>
	<li>Dodać 100 μl lizatu do probówki, krótko wymieszać i umieścić stojak ze wszystkimi probówkami w łaźni wodnej na 1 godzinę.</li>
	<li>Odwróć rurkę płynnym ruchem.</li>
	<li>Ręcznie zapisuj wyniki za pomocą "+" (twardy skrzep) lub "-" (brak skrzepu lub luźny skrzep) na arkuszu ławki.</li>
	<li>Kontynuuj analizę zgodnie z USP BET 854; Użyj arkusza ławki jako materiału nośnego</li>
</ol>

<ol><li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li>
<li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll+receptors%2C+CD14%2C+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li>
<li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+Endotoxins+Test%22">Bacterial Endotoxins Test</a>. , (2011).</li>
<li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFDA%2C+U+%22Guidance+for+Industry%3A+Pyrogen+and+Endotoxins+Testing%3A+Questions+and+Answers%22">Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers</a>. , (2012).</li>
<li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFDA%2C+U+%22Endotoxin+Testing+Recommendations+for+Single-Use+Intraocular+Ophthalmic+Devices%22">Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices</a>. , (2015).</li>
<li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+70+years+of+pyrogen+detection%3A+Current+state+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li>
<li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li>
<li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms%3A+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+%28LAL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li>
<li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Food+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li>
<li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs%3A+Challenges%2C+considerations+and+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li>
<li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li>
<li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li>
<li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li>
<li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li>
<li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin%3A+evaluation+of+different+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41(2012).</li>
<li>NCL. NCL assay cascade. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li>
<li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices%3A+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li>
<li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+pyrogenicity+testing%3A+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+%28MAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li>
<li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxil%28R%29--the+first+FDA-approved+nano-drug%3A+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li>
<li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li>
<li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFDA%2C+U+%22Guidance+for+Industry%3A+Estimating+the+Maximum+Safe+Starting+Dose+in+Initial+Clinical+Trials+for+Therapeutics+in+Adult+Healthy+Volunteers%22">Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers</a>. , (2005).</li>
<li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent%3A+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li>
<li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hyperthermia%22%5BJournal%5D)">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin+%28lipopolysaccharide%29+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles%2C+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Informacje zawarte w niniejszym protokole zostały opisane przed15,26 i opierają się na kilku dokumentach regulacyjnych opublikowanych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (US FDA lub FDA) oraz Farmakopeę Stanów Zjednoczonych (USP)4,5,6,27, a także są dostępne na stronie internetowej NCL20 w protokołach STE1.2 (zmętnienie LAL),...

Endotoksyna jest budulcem ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych1,2. Może aktywować komórki odpornościowe w bardzo niskich (pikogramach) stężeniach1,2. Mediatory prozapalne (cytokiny, leukotrieny, eikozanoidy itp.) wytwarzane przez komórki w odpowiedzi na endotoksynę są odpowiedzialne za gorączkę, niedociśnienie, nadciśnienie i poważniejsze problemy zdrowotne, w tym niewydolność wielonarządową1,2,3. Nasilenie skutków ubocznych o podłożu immunologicznym wywołanych przez endotoksynę zależy od jej siły działania określonej przez skład i strukturę endotoksyny i mierzonej w międzynarodowych jednostkach endotoksyny (IU lub EU)3. Liczba tych jednostek na kilogram masy ciała służy do ustalenia progowej dawki pirogennej endotoksyny. Dawka ta wynosi 5 j./kg mc. w przypadku produktów leczniczych podawanych wszystkimi drogami z wyjątkiem drogi dokanałowej. Leki podawane na metr kwadratowy powierzchni ciała, płyny wewnątrzgałkowe, radiofarmaceutyki i produkty podawane drogą dokanałową mają różną progową dawkę pirogenną, która wynosi odpowiednio 100 EU/m2, 0,2 EU/ml, 175 EU/V (gdzie V jest objętością produktu przeznaczonego do podawania) i 0,2 EU/kg4. Więcej szczegółów na temat progowej dawki pirogennej dla różnych produktów leczniczych i urządzeń znajduje się w innym miejscu4,5,6.
Zwierzęta różnią się znacznie pod względem wrażliwości na reakcje wywołane przez endotoksyny. Ludzie, naczelne i króliki należą do gatunków najbardziej wrażliwych na endotoksyny3. Aby uniknąć skutków ubocznych związanych z endotoksynami u pacjentów i zapobiec niedokładnym wnioskom z przedklinicznych badań toksyczności i skuteczności, konieczne jest dokładne wykrywanie i ilościowe określanie endotoksyn zarówno w preparatach klinicznych, jak i przedklinicznych. Kilka obecnie dostępnych metod może osiągnąć to zadanie. Jednym z nich jest test Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), który jest powszechnie stosowany na całym świecie do badań przesiewowych produktów biomedycznych pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia endotoksynami, a także do wykrywania infekcji bakteryjnych7,8,9. Lizat jest wytwarzany z amebocytów, komórek obecnych we krwi krabów podkowiastych Limulus polyphemus zamieszkujących wschodnie wybrzeże kontynentu Ameryki Północnej7. Co ciekawe, istnieje kilka różnych gatunków krabów podkowiastych (Tachypleus gigas i Tachypleus tridentatus) w Asia10. Lizat amoebocytów Tachypleus (TAL) jest używany w kilku krajach azjatyckich do wykrywania endotoksyn, podobnie jak LAL jest używany w innych10. Lizaty (LAL i TAL) zawierają grupę białek, które po aktywacji nadają aktywność proteazy. Jedno z tych białek, tak zwany czynnik C, jest aktywowane w kontakcie z endotoksyną. Aktywowany czynnik C rozszczepia czynnik B, który z kolei staje się również proteazą i rozszczepia enzym prokrzepnięcia, wytwarzając enzym krzepnięcia. Wynikiem tego łańcucha reakcji jest utworzenie żelu, wzrost zmętnienia próbki oraz, w obecności substratu chromogenicznego, pojawienie się kolorowego produktu, który służy jako podstawa odpowiednio do testów żelowo-skrzepowych, mętności i chromogennych. Chociaż nie ma obowiązkowego formatu LAL, amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) wyjaśnia w dokumencie zawierającym wytyczne dla przemysłu, że w przypadku rozbieżności w wynikach testów między różnymi formatami LAL decyzja jest podejmowana na podstawie testu żelowo-skrzepowego5.
Wiele powszechnie używanych chemikaliów laboratoryjnych (np. EDTA) i znanych produktów leczniczych (np. penicyliny) zakłóca testy LAL11. Interferencję zwykle identyfikuje się poprzez ocenę odzysku wzorca endotoksyny wzbogaconego o znane stężenie do roztworu zawierającego badany materiał. Jeśli odzysk spajków jest mniejszy niż 50% lub większy niż 200%, to wynik testu LAL dla danego badanego materiału jest nieważny z powodu odpowiednio zahamowania lub wzmocnienia4. Preparaty oparte na nanotechnologii są często złożone i zakłócają działanie LAL poprzez różne mechanizmy12,13,14. Opisano wiele podejść mających na celu przezwyciężenie zakłóceń: rekonstytucja próbki w określonych i środkach powierzchniowo czynnych, inaktywacja białek przez ogrzewanie, niszczenie pustych materiałów na bazie lipidów przez ogrzewanie i uzupełnianie próbki nadmiarem kationów dwuwartościowych5,12,13,14,15. Opisano również alternatywne metody w sytuacjach, w których nie można przezwyciężyć interferencji LAL: ELISA, test reporterowej linii komórkowej HEK-TLR4 oraz spektrometria mas16,17,18,19.
Tutaj opisane są eksperymentalne procedury przeprowadzania testów żelowo-skrzepowych, mętności i chromogennych LAL. Testy te są również dostępne na stronie internetowej Nanotechnology Characterization Lab (NCL) 20 w protokołach STE1.2 (zmętnienie LAL), STE1.3 (LAL żelowo-skrzepowe) i STE1.4 (chromogenne LAL). Zaleca się przeprowadzenie co najmniej dwóch różnych formatów w celu scharakteryzowania tego samego nanopreparatu. Jeśli wyniki zmętnienia i chromogennego LAL nie są zgodne, brane są pod uwagę wyniki zakrzepów żelowych5. Gdy wyniki dwóch formatów LAL nie są zgodne, przeprowadza się dodatkowe badania z użyciem testu aktywacji monocytów (MAT) lub testu pirogenów królika (RPT) w celu zweryfikowania wyników LAL21. Ważne jest, aby pamiętać, że każda metoda stosowana do wykrywania endotoksyn i oceny pirogenności ma zalety i ograniczenia21,22,23,24. Rozpoznanie ograniczeń procedury stosowanej do scharakteryzowania danej postaci użytkowej w technologii nanotechnologicznej jest niezbędne do uzyskania naukowego uzasadnienia dla zastosowania procedury optymalnej dla tej nanoformulacji.
W tym badaniu, pegylowana liposomalna doksorubicyna została użyta jako modelowy preparat nanocząsteczkowy. Ten preparat został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w 1995 roku i jest stosowany w leczeniu pacjentów z rakiem na całym świecie25.

<table><tbody><tr><td>Test LAL <silny> mętności</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>W razie potrzeby służy do dostosowania pH próbki do poziomu 6-8</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>W razie potrzeby służy do dostosowania pH próbki do poziomu 6-8</td></tr><tr><td>Odczynnik LAL</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>T0051</td><td>Ten odczynnik może być stosowany przy zmętnieniu tylko test</td></tr><tr><td>Kontrolny Endotoksyna Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>Ten odczynnik może być stosowany do testów zmętnienia i zakrzepów żelowych</td></tr><tr><td>Woda klasy LAL</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>Ten odczynnik może być używany z dowolnym formatem LAL</td></tr><tr><td>Glucashield</td><td>Buffer Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>Służy do zapobiegania fałszywie dodatniej odpowiedzi na beta-glukany</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane probówki do rozcieńczania bez endotoksyn 12 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>Probówki te mogą być używane ze wszystkimi trzema testami</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane probówki reakcyjne wolne od endotoksyn 8 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>Probówki te mogą być używane do oznaczania zmętnienia i chromogenów</td></tr><tr><td>Wolne od pirogenów końcówki o objętościach 0,25 i 1,0 ml</td><td>RAININ</td><td>PPT25, Końcówki i pipety PPT10</td><td>mogą adsorbować endotoksyny i uwalniać substancje wymywalne, które zakłócają test LAL. Te końcówki RAININ są używane, ponieważ ich optymalna wydajność w teście LAL została zweryfikowana i potwierdzona</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek bez pirogenów, 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów</td></tr><tr><td>eksploatacyjnych Końcówki combitip z opłatą pirogenową, 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów</td></tr> eksploatacyjnych <tr><td>Powtórz pipetę</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych</td></tr><tr><td>Mikrocetrifuza</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Lodówka, 2-8 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Zamrażarka, -20 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Czytnik Pyros Kinetix lub Pyros Kinetix Flex</td><td>Współpracownicy Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>Można użyć innych instrumentów. Jednak odczynniki LAL i wzorce endotoksyn stosowane w tym teście mogą wymagać optymalizacji. W przypadku korzystania z innego oprzyrządowania należy zapoznać się z instrukcjami producentów przyrządów i zestawów LAL</td></tr> <tr><td>Chromogenic LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrochrome LAL Reagents</td><td>of Cape Cod</td><td>CG1500-5</td><td>Ten odczynnik jest specyficzny dla testu chromogenicznego</td></tr><tr><td>Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>EC010</td><td>Norma ta różni się od normy stosowanej w przypadku zmętnienia i LAL powodujących zmętnienie; Jest zoptymalizowany pod kątem optymalnej wydajności w teście chromogenicznym</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki do poziomu 6-8</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>W razie potrzeby służy do dostosowania pH próbki do poziomu 6-8</td></tr><tr><td>Woda klasy LAL</td><td>Współpracownicy Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>Ten odczynnik może być używany z dowolnym formatem LAL</td></tr><tr><td>Bufor Glucashield</td><td>Współpracownicy Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>Służy do zapobiegania fałszywie dodatniej odpowiedzi na beta-glukany</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane probówki do rozcieńczania bez endotoksyn 12 x 75 mm</td><td>Współpracownicy Cape Cod</td><td>TB240</td><td>Probówki te mogą być używane ze wszystkimi trzema testami</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane probówki reakcyjne wolne od endotoksyn 8 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>Probówki te mogą być używane do testów</td></tr> <tr><td>zmętnienia i chromogennychNiezawierające pirogenów końcówki i pipety o pojemności 0,25 i 1,0 ml</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>mogą adsorbować endotoksyny i uwalniać substancje wymywalne, które zakłócają test LAL. Te końcówki RAININ są używane, ponieważ ich optymalna wydajność w teście LAL została zweryfikowana i potwierdzona</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek bez pirogenów, 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów</td></tr><tr><td>eksploatacyjnych Końcówki combitip z opłatą pirogenową, 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów</td></tr> eksploatacyjnych <tr><td>Powtórz pipetę</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych</td></tr><tr><td>Mikrocetrifuza</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Lodówka, 2-8 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Zamrażarka, -20 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Czytnik Pyros Kinetix lub Pyros Kinetix Flex</td><td>Współpracownicy Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>Można użyć innych instrumentów. Jednak odczynniki LAL i wzorce endotoksyn stosowane w tym teście mogą wymagać optymalizacji. W przypadku korzystania z innego oprzyrządowania należy zapoznać się z instrukcjami producentów przyrządu i zestawu</td></tr> <tr><td>LALGel-Clot LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAL</td><td>Reagent Associates of Cape Cod</td><td>G5003</td><td>Ten odczynnik jest specyficzny dla testu żelowo-skrzepowego</td></tr><tr><td>Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>Ten odczynnik może być stosowany do testów zmętnienia i zakrzepów żelowych</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki do poziomu 6-8</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>W razie potrzeby służy do regulacji pH próbki do poziomu 6-8</td></tr><tr><td>Woda klasy LAL</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>Ten odczynnik może być używany z dowolnym formatem LAL</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>Służy do zapobiegania fałszywie dodatniej odpowiedzi na beta-glukany</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane probówki do rozcieńczania bez endotoksyn 12 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>Probówki te mogą być używane ze wszystkimi trzema testami</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane probówki reakcyjne wolne od endotoksyn 10 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TS050</td><td>Probówki te są przeznaczone do stosowania z testem żelowo-skrzepowym</td></tr><tr><td>Wolne od pirogenów końcówki o objętościach 0,25 i 1 ml</td><td>RAININ</td><td>Końcówki i pipety PPT25, PPT10</td><td>mogą adsorbować endotoksyny i uwalniać substancje wymywalne, które zakłócają test LAL. Te końcówki RAININ są używane, ponieważ ich optymalna wydajność w teście LAL została zweryfikowana i potwierdzona</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek bez pirogenów, 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów</td></tr><tr><td>eksploatacyjnych Końcówki combitip z opłatą pirogenową, 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów</td></tr> eksploatacyjnych <tr><td>Powtórz pipetę</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>Można użyć innych równoważnych materiałów eksploatacyjnych</td></tr><tr><td>Mikrocetrifuza</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Lodówka, 2-8 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Zamrażarka, -20 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna, 37 C</td><td>dowolna marka</td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki, jednak ważne jest, aby wyłączyć cyrkulację wody lub użyć niecyrkulacyjnej kąpieli wodnej, ponieważ przepływ wody wpłynie na tworzenie się skrzepów i doprowadzi do wyników fałszywie ujemnych</td></tr></tbody></table>

wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (lal)

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Obecność w produktach farmaceutycznych endotoksyny Gram-ujemnej bakteryjnej ściany komórkowej (często nazywanej również lipopolisacharydem) może powodować stan zapalny, gorączkę, niedociśnienie lub nadciśnienie, a w skrajnych przypadkach może prowadzić do uszkodzenia tkanek i narządów, które może stać się śmiertelne. Ilości endotoksyn w produktach farmaceutycznych są zatem ściśle regulowane. Wśród dostępnych metod wykrywania i oznaczania ilościowego endotoksyn powszechnie stosowany na całym świecie jest test lizatu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Podczas gdy każdy produkt farmaceutyczny może zakłócać test LAL, nanopreparaty stanowią szczególne wyzwanie ze względu na ich złożoność. Celem tego artykułu jest dostarczenie praktycznego przewodnika dla badaczy niemających doświadczenia w szacowaniu endotoksyn w zmodyfikowanych nanomateriałach i lekach formułowanych przez nanocząsteczki. W niniejszym artykule omówiono praktyczne zalecenia dotyczące wykonywania trzech formatów LAL, w tym testów zmętnienia, chromogennych i żelowo-skrzepowych. Testy te można wykorzystać do określenia zanieczyszczenia endotoksynami w produktach leczniczych, szczepionkach i adiuwantach opartych na nanotechnologii.

Przykład danych wygenerowanych po przetestowaniu tego preparatu w testach LAL jest pokazany w Tabeli 1. Pegylowana liposomalna doksorubicyna zakłócała chromogenny LAL w rozcieńczeniu 5. Jednak ta interferencja została przezwyciężona przez większe rozcieńczenia. Odzysk kolców wynosił od 50 do 200%, gdy ten preparat był testowany w rozcieńczeniach 50 i 500 w mętności i chromogennym LAL, a także przy rozcieńczeniu 5 w mętności LAL. Po skorygowaniu o współczynnik rozcieńczeni...

Wykrywanie endotoksyn w nanomateriałach inżynieryjnych stanowi jedno z największych wyzwań w dziedzinie nanomedycyny. W tym miejscu przedstawiamy studium przypadku, które opisuje ramy składające się z trzech różnych formatów LAL w celu oszacowania potencjalnego zanieczyszczenia endotoksynami w nanocząstkach.

Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi w dziedzinie medycyny na temat bezpieczeństwa nanoleków. Zaletą tej techniki jest to, że jest ona standardowa i jest stosowana na całym świecie do oceny produktów, do nanoleków. Demonstracją procedury będzie Barry Neun z Laboratorium Charakterystyki Nanotechnologii.Do przygotowania wzorca kalibracyjnego użyj 900 mikrolitrów lizatu amebocytów limulusa lub wody klasy LAL. I 100 mikrolitrów kontrolnej wzorcowej endotoksyny, aby przygotować tyle rozcieńczeń pośrednich, ile potrzeba, aby umożliwić przygotowanie wzorca kalibracyjnego o stężeniu jednej jednostki endotoksyny na mililitr. Następnie, używając 900 mikrolitrów wody klasy LAL i 100 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr wzorca kalibracyjnego, przygotuj drugi wzorzec kalibracyjny o stężeniu 0,1 jednostki endotoksyny na mililitr.Następnie powtórzyć seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenie, aby przygotować dwa niższe wzorce kalibracyjne. Aby uzyskać w sumie cztery wzorce kalibracyjne, w zakresie od 0001 do jednej jednostki endotoksyny na mililitr. Aby przygotować jednostkę endotoksyny 05 na mililitr kontroli jakości, połącz 50 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr standardowego roztworu endotoksyny kontrolnej z 950 mikrolitrami wody klasy LAL.Następnie w oprogramowaniu wybierz ustawienia instrumentu i utwórz szablon. Wybierz opcję zbierania danych, a następnie wprowadź identyfikator testu i grupę danych na karcie ogólne. Na karcie sprzętu wybierz typ instrumentu i metodę LAL, a następnie sprawdź, czy na ekranie pojawia się numer seryjny, identyfikator systemu i informacje o porcie szeregowym.Kliknij przycisk OK dwa razy, aby potwierdzić wybór urządzenia i komunikację z urządzeniem, a następnie wprowadź identyfikatory próbek w tej samej kolejności, w jakiej próbki będą testowane. Następnie użyj domyślnych przycisków, aby wprowadzić krzywą wzorcową kontroli ujemnej i przetestuj próbki. Dodaj odpowiednią objętość wzorców kalibracji kontroli ujemnej i kontroli jakości do zduplikowanych, wstępnie oznakowanych szklanych probówek.I dodaj odpowiednią ilość LAL do pierwszego podłego testu. Krótko przekręć podłość i umieść fiolkę w odpowiednich szczelinach testowych w karuzeli instrumentów. Przed załadowaniem próbek należy wykonać kilka rozcieńczeń badanego nanomateriału w maksymalnym dopuszczalnym rozcieńczeniu, jak pokazano.Aby przygotować jednostkę 05 endotoksyn na mililitr kontroli hamowania, należy połączyć 25 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr kontrolnego standardowego roztworu endotoksyny z 475 mikrolitrami badanego nanomateriału w danym rozcieńczeniu. Po wirowaniu załaduj do instrumentu odpowiednie kontrolki poprawy innowacyjności i próbki badawcze bez wzbogaceń. Następnie podwielokrotność niewzbogaconych i wzbogaconych nanomateriałów w określonym rozcieńczeniu do wstępnie oznakowanych probówek.Przed wirowaniem i załadowaniem do karuzeli instrumentów. Aby wykonać Gel-Clot LAL, przygotuj kontrolną standardową endotoksynę do końcowego stężenia czterech lambda i połącz 100 mikrolitrów wzorca ze 100 mikrolitrami wody lub próbki testowej, aby uzyskać końcowe stężenie kontrolnej standardowej endotoksyny dwie lambda. Dodaj 100 mikrolitrów lizyny do każdego rozcieńczenia lambda.Krótko wymieszaj rurki i umieść stojak z rurkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Pod koniec inkubacji odwróć probówki płynnym ruchem i ręcznie zapisz wyniki, używając plus dla twardego skrzepu i minus dla braku skrzepu lub luźnego skrzepu. W tej reprezentatywnej analizie pegylowana liposomalna doksorubicyna zakłócała działanie chromogennego LAL w rozcieńczeniu piątym, jednak interferencja ta została przezwyciężona przy wyższych rozcieńczeniach.Odzysk kolców wynosił od 50 do 200%, gdy preparat testowano w rozcieńczeniach 50 i 500 w mętności i chromogennym LAL, a także w rozcieńczeniu piątym, w mętności LAL. Po skorygowaniu o współczynnik rozcieńczenia, wyniki były zgodne między urojeniami w obu esejach. Co więcej, wyniki były spójne między trzema formatami esejów.Pamiętaj, że każda próbka ma swój własny zakres rozcieńczeń, każdy format LAL wykorzystuje swój standard kontrolny w doksynie i lizacie, a probówki używane do przygotowania rozcieńczeń i przeprowadzania reakcji są różne dla każdego eseju LAR. W przypadku tej procedury można zastosować inne metody, takie jak Można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące materiału Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę szwom i dziedzinie nanomedycyny, do zbadania medycznych zastosowań leków sformułowanych w nanotechnologii u ludzi i modeli klinicznych, w tym między innymi naczelnych innych niż ludzie, królików, psy i szczury. Nie zapominaj, że praca z Doxin może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.

detection-endotoxin-nano-formulations-using-limulus-amoebocyte-lysate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje mętny format testu lizatu amebocytów Limulus (LAL) do oszacowania zanieczyszczenia endotoksynami w pegylowanych liposomalnych nanopreparatach doksorubicyny. Zmętnienie roztworu po reakcji endotoksyny z odczynnikiem LAL pomaga oszacować endotoksynę w próbce.

Turbidymetryczny test lizatu amoebocytów limulusowych: technika wykrywania i ilościowego określania zanieczyszczenia endotoksynami w lekach o nanoformach

Ten film opisuje test żelowo-skrzepowy w celu określenia obecności endotoksyn bakteryjnych w nanopreparatach przy użyciu lizatu lizatu lizatu lizatu pochodzącego z komórek krwi krabów podkowiastych. Test pomaga w testowaniu pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami produktów farmaceutycznych, w tym preparatów na bazie nano.

Test lizatu amebocytów żelowo-skrzepowych limulus: metoda wykrywania endotoksyn bakteryjnych w preparatach nanocząsteczkowych

Ten film demonstruje test do zbadania zależnej od receptora toll-like (TLR) aktywności czynników transkrypcyjnych: czynnika jądrowego-kappa-B (NF-κB) i białka aktywatora-1 (AP-1) w makrofagach. TLR uruchamiają prozapalną kaskadę sygnalizacyjną po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP), aktywując NF-κB i AP-1. Zmodyfikowane makrofagi reporterowe wytwarzają embrionalny enzym fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji NF-κB i AP-1, który jest wykrywany w reakcji...

Test sygnalizacji czynnika transkrypcyjnego NF-&kcy;B/AP-1 zależnego od TLR w makrofagach

Ten film demonstruje test oparty na komórkach reporterowych do badania potencjalnych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację receptora Toll-podobnego (TLR). Test polega na wprowadzeniu lipopolisacharydów (LPS) zmieszanych z hybrydami nanocząstek peptydu i złota do makrofagów reporterowych eksprymujących białka reporterowe - wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) i lucyferazę. Redukcja sygnału TLR indukowanego przez LPS, w którym pośredniczą hybrydy, jest określana przez...

Test do badań przesiewowych bioaktywnych nanocząstek pod kątem hamowania sygnalizacji receptora toll-podobnego

Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Niniejszym przedstawiamy protokół do pomiaru przy łóżku pacjenta aktywności endotoksyn w próbkach ludzkiej krwi pełnej. Test aktywności endotoksyn jest prostym do wykonania testem i może być użytecznym biomarkerem u krytycznie chorych pacjentów z sepsą.

Test aktywności endotoksyn w celu wykrycia endotoksemii krwi pełnej u pacjentów w stanie krytycznym

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Dowiedz się wykrywać endotoksyny w nanomateriałach za pomocą testów LAL w nanomedycynie. Ta metoda zapewnia niezawodną ocenę bezpieczeństwa nano-leków zgodnie ze standardami regulacyjnymi.

Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL)

Przeglądaj więcej filmów