Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Protokół ten umożliwia proste, szybsze i niezawodne monitorowanie i charakteryzowanie każdego etapu cyklu odporności nowotworowej, a tym samym doprowadził do identyfikacji mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymanie równowagi między nadzorem immunologicznym nad rakiem a unikaniem odporności. Interakcja i koewolucja komórek nowotworowych i odpornościowych w mikrośrodowisku guza okazały się kluczowymi czynnikami decydującymi o wynikach leczenia. Obecnie kilka technologii naprzód badania w naszej dziedzinie, w tym cytometria przepływowa, transkryptomika pojedynczych komórek, transkryptomika specjalna, proteomika, modele guza na chipie i modele in vivo.

Nasz protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi technikami, ponieważ zapewnia prostą, szybką, niezawodną i tanią metodę monitorowania i charakteryzowania każdego etapu cyklu odporności na raka. W przyszłości chcemy badać dynamikę mikrośrodowiska nowotworu w ramach terapii immunogennych i immunologicznych. Na początek płytka trzy razy 10 do mocy sześciu komórek włókniakomięsaka MCA 205 w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej na 100-milimetrowej szalce Petriego.

Naświetl komórki światłem ultrafioletowym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej sześć godzin, aby mogły umrzeć. Przemyć in vitro zróżnicowane komórki dendrytyczne lub DC dwukrotnie w temperaturze 1,100 G przez cztery minuty w kompletnej pożywce wzrostowej. Policz MDDC pochodzące ze szpiku kostnego za pomocą testu wykluczenia barwnika błękitu trypanowego.

Odwirować napromieniowane komórki rakowe w stężeniu 1,100 G przez pięć minut. Ustaw kokulturę MDDC z napromieniowanymi komórkami apoptozy w stosunku 2:1 na 12-dołkowej płytce na 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj komórki dwukrotnie w temperaturze 1,100 G przez pięć minut w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej w 15-mililitrowych probówkach.

W celu barwienia powierzchni komórek ponownie zawieś DC pochodzące ze szpiku kostnego w 20 mikrolitrach zimnego buforu FACS i inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po umyciu komórek buforem FACS dodaj 100 mikrolitrów PBS zawierającego utrwalany w bliskiej podczerwieni barwnik utrwalający witalność przez 30 minut. Umyj ogniwa raz PBS przed ponownym ich wymieszaniem w buforze FACS.

Zidentyfikuj interesujące komórki na podstawie ich właściwości FSCA i SSCA. Następnie wykreśl FSCA i FSCH, aby wykluczyć z analizy dublety i grudki komórek. Wykreślić obszar filtra pasma emisyjnego od 780 do 60 nanometrów i SSCA w celu usunięcia martwych komórek.

Używając filtrów pasma emisji od 575 do 26 i od 530 do 30 nanometrów, wykryj dodatniość komórek dla markera CD11c i fluorescencyjnego łącznika komórek PKH67 na dwuparametrowych wykresach gęstości Po zliczeniu hoduj limfocyty T CD8 z DCS pochodzącym ze szpiku kostnego, który wchłonął apoptotyczne komórki MCA 205 w stosunku 2:5:1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Dodać EdU do pożywki kokulturowej o końcowym stężeniu 10 mikromolowym i inkubować przez 16 do 20 godzin. Odwirować CD8 krzyżowo zagruntować dwukrotnie w temperaturze 1,100 G przez pięć minut i wybarwić na markery powierzchniowe w zimnym buforze FACS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Po dwukrotnym umyciu komórek w buforze FACS, zawieś je ponownie w 100 mikrolitrach PBS zawierających utrwalany barwnik wodny o żywotności na 30 minut. Przemyć zawiesiny komórek raz trzema mililitrami 1% BSA w PBS w probówkach przepływowych. Dodaj 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez 15 minut w celu utrwalenia komórek.

Inkubować komórki w 100 mikrolitrach przepuszczalności na bazie saponin i myć odczynnikiem przez 15 minut. Dodaj 500 mikrolitrów koktajlu reakcyjnego i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Po umyciu ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach odczynnika do przemywania na bazie saponin.

Zidentyfikuj interesujące komórki na podstawie ich właściwości FSCA i SSCA. Następnie wykreśl FSCA i FSCH, aby wykluczyć z analizy dublety i grudki komórek. Wykreślić obszar filtra pasma emisyjnego od 525 do 50 nanometrów i SSCA w celu usunięcia martwych komórek.

Korzystając z wykresów gęstości filtrów pasma emisyjnego od 530 do 30 i od 575 do 26 nanometrów, wykryj dodatnią wartość komórek dla CD8a i CD3. Analizuj komórki pod kątem włączenia Alexa fluor 647 EdU do histogramu z jednym parametrem przy użyciu filtra emisyjnego pasmowego od 660 do 620 nanometrów. Komórki dendrytyczne CD11c dodatnie skutecznie pochłonęły apoptotyczne komórki rakowe MCA 205 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wykazując zależną od temperatury fagocytozę we wczesnych stadiach cyklu odporności nowotworowej.

Po fagocytozie komórki dendrytyczne wykazywały podwyższony poziom CD86 i MHC2-II, wraz z obniżonym poziomem PDL1. Klonalna ekspansja limfocytów T CD8 +, niegdyś aktywowanych przez dojrzałe komórki dendrytyczne, była widoczna przy około 20% szybkości proliferacji. Korzystając z modeli guza na chipie, zaobserwowano chemotaktyczną odpowiedź tych limfocytów T na alarminy uwalniane przez komórki rakowe.

Po odzyskaniu CD8 cross prime z kokultury, odwirować je w 1,100 G przez 10 minut. w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej. Zawiesić jeden razy 10 do mocy siedmiu całkowitych komórek w 100 mikrolitrach mikrokulek do usuwania martwych komórek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Umieść kolumny separacyjne w separatorze magnetycznym i przepłucz je buforem wiążącym. Przenieść zawiesiny komórek do kolumn separacyjnych i zebrać przepływ. Po umyciu kolumny zbierz nieoznakowane komórki, które przez nią przechodzą i połącz je z wcześniej zebranym przepływem.

Wirówka wzbogacona żywym CD8 zagruntowanym w stężeniu 1,100 G przez pięć minut w kompletnym pożywce wzrostowej. Po zliczeniu hodować komórki CD8 krzyżowe ze świeżymi komórkami MCA 205 w stosunku 2:1 na płytkach 12-dołkowych i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Przed odzyskaniem efektora CD8 dodaj monenzynę i brefeldynę do kokultur komórek odpornościowych raka przez sześć godzin.

Następnie odzyskać efektor CD8 i odwirować dwukrotnie przy stężeniu 1,100 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w trzech różnych mieszaninach przeciwciał pierwszorzędowych przygotowanych w zimnym buforze FACS i inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do podniebienia komórkowego z mieszanki C i inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Ponownie zawiesić komórki w buforze do płukania na zimno i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwukrotnym umyciu komórek w buforze FACS, dodaj 100 mikrolitrów PBS zawierającego utrwalający się barwnik wodny o żywotności do granulek komórek przez 30 minut. Zidentyfikuj interesujące komórki na podstawie ich właściwości FSCA i SSCA.

Następnie wykreśl FSCA i FSCH, aby wykluczyć z analizy dublety i grudki komórek. Wykreślić filtr pasmowy emisji od 525 do 50 nanometrów i SSCA w celu usunięcia martwych komórek. Korzystając z filtrów pasma emisji od 660 do 20 i od 780 do 60 nanometrów, wykryj dodatniość komórek dla CD8a i CD3 na dwuparametrowych wykresach gęstości.

Dalsza analiza komórek pod kątem markerów CD44, CD25 i CD69 dla markera CD137 oraz dla interferonu gamma dodatniego i granzymu B odpowiednio dla mieszaniny A, B i C. W przypadku testu zabijania nowotworów należy uzupełnić pożywkę współhodowlaną barwnikiem kwantyfikacyjnym śmierci komórki w czasie rzeczywistym. Po podgrzaniu płytki do 37 stopni Celsjusza w systemie analizy żywych komórek, wykonuj skanowanie danych co dwie godziny przez okres do 72 godzin.

Odwirować komórki dwukrotnie w temperaturze 1 000 G przez pięć minut. Wybarwić komórki na markery powierzchniowe 20 mikrolitrami zimnego buforu FACS i inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnie dodaj barwnik witalności jodek propidyny, aby zabarwić komórki w celu opracowania strategii bramkowania.

Zidentyfikuj interesujące komórki na podstawie ich właściwości FSCA i SSCA. Następnie wykreśl FSCA i FSCH, aby wykluczyć z analizy dublety i grudki komórek. Użyj filtra pasmowego emisji od 450 do 50 nanometrów, aby wykryć komórki rakowe ujemne dla CD45.

Na histogramie jednoparametrowym, przy użyciu filtra emisyjnego pasmowego od 610 do 620 nanometrów, przeanalizuj komórki pod kątem włączenia jodku propidyny jako średniej intensywności fluorescencji. Za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej zwiększono powierzchniowe poziomy ekspresji markera wczesnej aktywacji CD69, markerów późnej aktywacji CD44 i CD25, ekspresję błonową CD137 i markery reaktywności guza CD107a. Wewnątrzkomórkowe poziomy cytotoksycznych cząsteczek granzymu B i interferonu gamma dodatniego były stopniowo i znacząco zwiększane, osiągając szczyt ekspresji po 72 godzinach wspólnej hodowli.

Pokrewne, współhodowane komórki MCA 205 przeszły znaczny poziom śmierci za pośrednictwem efektora CD8.