Opracowanie bardziej czułego i specyficznego chromogennego podłoża agarowego do wykrywania Vibrio parahaemolyticus i innych gatunków Vibrio

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena czułości i swoistości nowego podłoża chromogennego w wykrywaniu i izolacji Vibrio parahaemolyticus w porównaniu z podłożami konwencjonalnymi. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii żywności i środowiska, takie jak: jaka jest rozpowszechnienie gatunków Vibrio w żywności i środowiskach zbioru? Główną zaletą naszej procedury jest możliwość wykorzystania wielu izolatów bakteryjnych, w tym w obecności matrycy żywnościowej.

Przed hodowlą bakterii należy wysterylizować wszystkie pożywki agarowe w autoklawie. Następnie schłodzić agar do 45–50 °C w łaźni wodnej. Po przygotowaniu agaru ułożyć puste płytki Petriego w stosach po pięć lub sześć sztuk.

Następnie, zaczynając od dołu stosu, wlej stopiony agar do każdej płytki, aż będą wypełnione w połowie, nakładając pokrywki po nalaniu. Pozostaw agar do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin. Aby przygotować hodowle szczepów drobnoustrojów, gdy agar będzie gotowy, użyj sterylnej pętli do szczepienia, aby przenieść kultury na odpowiednie nieaselektywne płytki z agarem, wykonując posiew bakterii w sposób, który umożliwi obserwację odizolowanych kolonii.

Po wysianiu wszystkich kolonii inkubować hodowle w pozycji odwróconej w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie 48 godzin, z wyjątkiem gatunków Campylobacter, które należy inkubować w słoiku z zamkniętą pokrywką zawierającym worek z gazem w celu stworzenia środowiska mikroaerofilnego. Po zakończeniu inkubacji ocenić morfologię kolonii. Czyste hodowle powinny dawać kolonie o podobnej morfologii.

Aby namnożyć interesujące kolonie na podłożach selektywnych i różnicujących, przenieś kilka wyizolowanych kolonii do 5 mL odpowiedniego pożywki płynnej i ponownie inkubuj kultury w temperaturze 35 do 37 °C przez 16 do 24 godzin. Następnego dnia wyseij pętlą kulturę z inkubacji nocnej na co najmniej jedną płytkę z agarem Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose (TCBS) oraz na co najmniej jedną płytkę z agarem chromogenicznym, inkubując je do 96 godzin w temperaturze 35 do 37 °C. Po zakończeniu inkubacji oceń gęstość kultury na płytce oraz wielkość wyizolowanych kolonii, aby określić ogólny wzrost szczepów, zapisując kolor kolonii w świetle widzialnym lub UV, w zależności od potrzeb, oraz odnotowując wszelkie inne istotne cechy kolonii.

Aby przeprowadzić test regeneracji, należy zaszczepić młode kultury Vibrio parahaemolyticus w pięciu mililitrach bulionu sojowo-trypsynowego uzupełnionego o dwa procent chlorku sodu (TSBS) i inkubować probówki w temperaturze od 35 do 37 °C przez 16 do 24 godzin. Następnego dnia należy wymieszać kultury nocne na wortexie i przygotować rozcieńczenia bakterii w PBS w zakresie od 1 × 10⁻¹ do 1 × 10⁻⁷. Wykorzystując rozcieńczenia od 1 × 10⁻⁴ do 1 × 10⁻⁷, należy równomiernie wysiać 100 µL każdego rozcieńczenia na oddzielne płytki z agarem chromogenicznym, TCBS oraz agarem sojowo-trypsynowym uzupełnionym o dwa procent chlorku sodu (TSAS).

Inkubuj wszystkie płytki w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie 96 godzin. Następnie policz kolonie, pomijając płytki, na których znajduje się zbyt wiele kolonii do ich policzenia lub mniej niż 25 kolonii. Aby przeprowadzić test konkurencji, wybierz szczep V.Parahaemolyticus, który daje oczekiwane turkusowe kolonie na TCBS i cyjanowe kolonie na agarze chromogenicznym, oraz szczep nie-V.

Gatunki Parahaemolytius, które nie rosną na żadnym z pożywek lub wykazują inny kolor kolonii. Przenieść kilka wyizolowanych kolonii V.Parahaemolyticus i V.Metschnikovii z podłoża TSAS do pięciu mililitrów TSBS w celu inkubacji przez 16 do 24 godzin w temperaturze od 35 do 37 °C. Przenieść kilka wyizolowanych kolonii Shigella sonnei z agaru Brain Heart Infusion (BHI) do pięciu mililitrów bulionu BHI na 16 do 24 godzin w temperaturze od 35 do 37 °C.

Następnego dnia należy przeprowadzić rozcieńczenia seryjne dla każdego szczepu, wysiewając rozcieńczenia na nieaselektywne szaletki z agarem w celu określenia liczby jednostek tworzących kolonie na mililitr kultur nocnych. Następnie, wykorzystując kultury nocne i probówki z rozcieńczeniami, należy zmieszać różne objętości szczepu V. Parahaemolyticus oraz gatunku innego niż V. Parahaemolyticus i wysiać 100 µL mieszaniny bakteryjnej na poszczególne szaletki z agarem chromogenicznym, TCBS oraz TSAS.

Po inkubacji trwającej do 96 godzin w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza, należy policzyć kolonie na podstawie różnic w ich wzroście i morfologii na płytkach chromogennych oraz TCBS. Aby ocenić wpływ homogenizatów ostryg na wzrost bakterii na podłożach selektywnych i różnicujących, najpierw odważ co najmniej 50 gramów mięsa ostryg z co najmniej 12 mięczaków, wliczając w to mięso oraz płyn. Następnie dodaj do tkanek ostryg równą masę PBS i blenduj mieszaninę z dużą prędkością przez 90 sekund.

Następnie dodaj 100 g rozcieńczonego homogenatu ostryg do 400 g PBS i mieszaj miksturę z dużą prędkością przez jedną minutę. Następnie poddaj homogenat autoklawowaniu. Po ochłodzeniu dodaj 100 µl każdego nocnego V.Parahaemolyticus oraz non-V.

Dodaj kulturę Parahaemolyticus do zawiesiny ostryg i użyj homogenizatora, aby wymieszać komórki bakteryjne z homogenatem ostryg. Przygotuj rozcieńczenia wzbogaconego homogenatu ostryg w PBS w zakresie od 10⁻¹ do 10⁻³, zgodnie z instrukcją, i wysiaj 100 µL każdego rozcieńczenia na oddzielne płytki chromogenne, TCBS oraz TSAS. Po 96 godzinach w temperaturze od 35 do 37 °C porównaj rzeczywistą liczbę kolonii na agarach chromogennych i TCBS z oczekiwaną liczbą kolonii wyliczoną na podstawie standardowego przelicznika płytkowego wykonanego na kulturach nocnych.

Aby określić wzrost i morfologię kolonii szczepów użytych w niniejszym badaniu, bakterie hodowano na podłożach selektywnych i różnicujących. TCBS jest konwencjonalnym podłożem stosowanym do izolacji niektórych gatunków Vibrio, w tym turkusowych V.Parahaemolyticus i żółtych V.Cholerae. Zastosowanie podłoża chromogennego do selekcji klinicznie istotnych gatunków Vibrio z próbek żywności i środowiska prowadzi do powstania cyjanowych V.Parahaemolyticus i magenta V.Cholerae.

Liczba kolonii V.Parahaemolyticus wyhodowanych na chromogennych płytkach agarowych w obecności homogenatu ostryg jest zbliżona do liczby kolonii na pożywkach nieselektywnych, co sugeruje, że granica wykrywalności podłoża chromogennego jest podobna do granicy wykrywalności pożywek nieselektywnych, nawet w obecności matrycy spożywczej. Wzrost i odzysk V.Parahaemolyticus nie są również wpływane przez obecność gatunków innych niż V. Parahaemolyticus, co jest kluczową cechą pożywek różnicujących i selektywnych, ponieważ próbki środowiskowe zawierają liczne gatunki Vibrio w dużych ilościach, szczególnie po procedurze namnażania.

Ponadto porównanie agaru TCBS i agarów chromogennych za pomocą PCR w kierunku termolabilnej hemolizyny wykazuje wyższą czułość i swoistość agaru chromogennego, co wskazuje na lepszą ogólną wydajność tego podłoża różnicującego i selektywnego w wykrywaniu i identyfikacji V.Parahaemolyticus. Po opanowaniu metody cały proces, obejmujący badanie i inkubację około 50 szczepów, może zostać zakończony w ciągu 30 dni przy prawidłowym wykonaniu. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o starannym etykietowaniu wszystkich kultur oraz o stałym stosowaniu technik aseptycznych.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak PCR kolonii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy ten konkretny izolat posiada gen wirulencji? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie bezpieczeństwa żywności i zdrowia publicznego do badania wykrywania gatunków Vibrio w skorupiakach i mięczakach oraz w środowisku estuarijnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić standardowe liczenie płyt oraz jak ocenić czułość, swoistość i granicę wykrywalności pożywki wzrostowej.

Należy pamiętać, że praca z patogenami i gorącymi pożywkami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odzieży ochronnej, zakrywanie wszelkich otwartych ran oraz oddzielanie odpadów biologicznie niebezpiecznych.