Opracowanie bardziej czułego i specyficznego chromogennego podłoża agarowego do wykrywania Vibrio parahaemolyticus i innych gatunków Vibrio

Ogólnym celem tej procedury jest ocena czułości i swoistości nowego podłoża chromogenicznego pod kątem zdolności wykrywania i izolowania Vibrio parahaemolyticus w porównaniu z konwencjonalnymi pożywkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii żywności i środowiska, takie jak: jakie jest rozpowszechnienie gatunków Vibrio w środowisku żywności i zbiorów? Główną zaletą naszej procedury jest to, że można stosować wiele izolatów bakteryjnych, w tym w obecności matrycy pokarmowej.

Przed wyhodowaniem bakterii należy autoklawować wszystkie podłoża agarowe. Następnie schłodzić agar do 45 do 50 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Gdy agar będzie gotowy, ułóż puste płytki Petriego w stosach po pięć do sześciu płytek.

Następnie, zaczynając od dołu stosu, wlej stopiony agar do każdej płytki do około połowy pełnej, po nalaniu wymieniając pokrywki. Pozostaw agar do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin. Aby ustawić kultury szczepów drobnoustrojów, gdy agar jest gotowy, użyj sterylnej pętli zaszczepiającej, aby przenieść kultury na odpowiednie nieselektywne płytki agarowe, rozprowadzając bakterie we wzór, który pozwoli na obserwację izolowanych kolonii.

Po platerowaniu wszystkich kolonii należy inkubować kultury do góry nogami w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez okres do 48 godzin, z wyjątkiem gatunków Campylobacter, które powinny być inkubowane w słoiku z zamkniętą pokrywką zawierającym woreczek z gazem, aby wytworzyć środowisko mikroaerofilne. Obserwuj morfologię kolonii pod koniec inkubacji. Czyste kultury powinny dawać kolonie, które wykazują podobną morfologię kolonii.

Aby wyhodować interesujące nas kolonie na pożywkach selektywnych i różnicowych, przenieś kilka izolowanych kolonii do pięciu mililitrów odpowiedniego bulionu i ponownie inkubuj kultury w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Następnego dnia umieść pętlę nocnych kultur na co najmniej jednej płytce agarowej tiosiarczan-cytrynian-sole żółci-sacharoza lub TCBS i co najmniej jednej chromogennej płytce agarowej na okres do 96 godzin inkubacji w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy zbadać zarówno gęstość hodowli na płytce, jak i wielkość izolowanych kolonii, aby określić ogólny wzrost szczepów, rejestrując kolor kolonii w świetle otoczenia lub świetle UV, w zależności od przypadku, i zwracając uwagę na wszelkie inne ważne cechy kolonii.

Aby wykonać test regeneracji, zaszczepij młode kultury Vibrio parahaemolyticus w pięciu mililitrach tryptycznego bulionu sojowego, uzupełnionego dwuprocentowym chlorkiem sodu lub TSBS i umieść probówki w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza na 16 do 24 godzin. Następnego dnia należy zawirować nocne kultury i ustawić jeden razy 10 do ujemnego, do jednego razy 10 do ujemnych siedmiu rozcieńczeń bakterii w PBS. Używając rozcieńczeń jeden razy 10 do ujemnych cztery do jednego razy 10 do ujemnych siedmiu, równomiernie rozłóż 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na pojedynczym chromogenicznym, TCBS i tryptycznym agarze sojowym uzupełnionym dwuprocentowym agarem z chlorkiem sodu lub TSAS.

Inkubować wszystkie płytki w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez okres do 96 godzin. Następnie policz kolonie, ignorując tabliczki z koloniami zbyt licznymi, aby je zliczyć lub zawierającymi mniej niż 25 kolonii. Aby przeprowadzić test konkurencji, wybierz szczep V.Parahaemolyticus, który daje oczekiwane kolonie turkusu na TCBS i kolonie cyjanu na agarze chromogenicznym, oraz szczep inny niż V.

Gatunek Parahaemolytius, który nie rośnie na żadnym z pożywek lub wykazuje inny kolor kolonii. Przenieś kilka izolowanych kolonii V.Parahaemolyticus i V.Metschnikovii z rolnictwa TSAS do pięciu mililitrów TSBS na 16 do 24 godzin inkubacji w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza. Przenieś kilka izolowanych kolonii Shigella sonnei z agaru Brain Heart Infusion lub BHI do pięciu mililitrów bulionu BHI przez 16 do 24 godzin w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie dla każdego szczepu, rozsiewając rozcieńczenia na nieselektywnych płytkach agarowych w celu określenia jednostek tworzących kolonie na mililitr kultur nocnych. Następnie użyj nocnych kultur i probówek rozcieńczających, aby wymieszać różne objętości szczepu V.Parahaemolyticus i szczepu innego niż V. Parahaemolyticus i rozprowadzić 100 mikrolitrów mieszaniny bakteryjnej na poszczególnych płytkach chromogenicznych, TCBS i TSAS agarowych.

Po maksymalnie 96 godzinach w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza policz kolonie na podstawie ich różnic we wzroście i morfologii na płytkach chromogennych i TCBS. Aby ocenić wpływ homogenatów ostryg na wzrost bakterii na pożywkach selektywnych i różnicujących, należy najpierw zważyć co najmniej 50 gramów mięsa ostryg z co najmniej 12, w tym mięsa i likieru. Następnie dodaj równą masę PBS do tkanek ostryg i mieszaj mieszaninę z dużą prędkością przez 90 sekund.

Następnie dodaj 100 gramów rozcieńczonego homogenatu ostryg do 400 gramów PBS i mieszaj mieszaninę na wysokich obrotach przez jedną minutę. Następnie homogenat należy sterylizować w autoklawie. Po schłodzeniu dodać 100 mikrolitrów każdego na noc V.Parahaemolyticus i non-V.

Parahaemolyticus do zawiesiny ostryg i użyć homogenizatora do wymieszania komórek bakteryjnych z homogenatem ostryg. Wykonać jeden razy 10 do ujemnego jeden do jednego razy 10 do ujemnego trzy rozcieńczenia homogenatu ostryg z dodatkiem kolczastych w PBS, jak pokazano, rozprowadzając 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na poszczególnych płytkach chromogenicznych, TCBS i TSAS. Po 96 godzinach w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza porównaj rzeczywistą liczbę kolonii na agarach chromogenicznych i TCBS z oczekiwaną liczbą kolonii wydedukowaną ze standardowej liczby kolonii przeprowadzonej na nocnych kulturach.

Aby określić wzrost i morfologię kolonii szczepów użytych w tym badaniu, bakterie hodowano na pożywkach selektywnych i różnicowych. TCBS jest konwencjonalnym podłożem używanym do izolacji niektórych gatunków Vibrio, w tym turkusowego V.Parahaemolyticus i żółtego V.Cholerae. Zastosowanie pożywki chromogennej do selekcji klinicznie istotnych gatunków Vibrio z próbek żywności i środowiska powoduje powstanie cyjanu V.Parahaemolyticus i magenta V.Cholerae.

Kolonie V.Parahaemolyticus hodowane na chromogennych płytkach agarowych w obecności homogenatu ostryg obserwuje się w podobnej liczbie jak na pożywkach nieselektywnych, co sugeruje, że granica wykrywalności pożywki chromogennej jest podobna do granicy pożywki nieselektywnej, nawet w obecności matrycy pokarmowej. Na wzrost i regenerację V.Parahaemolyticus nie ma również wpływu obecność nie-V. Gatunki Parahaemolyticus są istotną cechą pożywek różnicowych i selektywnych, ponieważ próbki środowiskowe zawierają różne gatunki Vibrio w dużych ilościach, zwłaszcza po procedurze wzbogacania.

Co więcej, porównanie TCBS i agarów chromogennych za pomocą termolabilnego PCR hemolizyny ujawnia wyższą czułość i swoistość dla agaru chromogenicznego, co wskazuje na lepszą ogólną wydajność tego zróżnicowanego i selektywnego podłoża do wykrywania i identyfikacji V.Parahaemolyticus. Po opanowaniu, cała procedura, w tym czas testowania i inkubacji około 50 szczepów, może zostać zakończona w ciągu 30 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o starannym oznakowaniu wszystkich kultur i zawsze stosowaniu techniki aseptycznej.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak PCR kolonii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Czy ten konkretny izolat zawiera gen wirulencji? Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się bezpieczeństwem żywności i zdrowiem publicznym do zbadania wykrywania gatunków Vibrio w skorupiakach i środowisku ujścia rzeki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić standardowe liczenie płytek i jak ocenić czułość, swoistość i granicę wykrywalności pożywki wzrostowej.

Nie zapominaj, że praca z patogenami i gorącym podłożem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odzieży ochronnej, zakrywanie otwartych ran i segregacja odpadów niebezpiecznych biologicznie.