Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Protokół ten przedstawia metodę wielopoziomową, zarówno do wykrywania EST, jak i figury faga. Wprowadzono również duży indeks zapisów w celu porównania poziomów EMR różnych technologii sterowania. Ta ekonomiczna technika jest inteligentna, wysokowydajna i wielofunkcyjna.

Umożliwiło to utworzenie VAMS, weterynaryjnej sieci monitorującej, która zebrała 20 000 genów epidemicznych i fagów analitycznych. Metoda ta może być również stosowana do monitorowania i zwalczania bakterii chorobotwórczych w medycynie, rolnictwie, bateriach serca zwierząt i rybołówstwie. Niniejszy protokół i niniejszy dokument firmowy powinny przewidywać, że są.

Korzystamy z przewodnika po szkoleniach technicznych. Podążanie za nim pomogłoby każdemu opanować technikę w krótkim czasie. Rozpocząć od inkubacji organizmu kontroli jakości E. coli i 93 testowych szczepów salmonelli na płytkach agarowych Muellera-Hintona.

Następnie rozcieńczyć przygotowane inokulum każdego szczepu 10 razy. Przenieś 200 mikrolitrów sterylnej normalnej soli fizjologicznej do dołka a-1 na 96-dołkowej płytce jako kontrolę ujemną. Następnie pipetować dwie zawiesiny E. coli do studzienek a-2 i a-3 jako odpowiednio kontrolę dodatnią i kontrolną jakości.

Do pozostałych 93 dołków dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonego szczepu testowego. Do przygotowania przeciwbakteryjnych płytek agarowych. Najpierw ustal zakresy stężeń dla różnych testowanych środków przeciwbakteryjnych, zgodnie ze wskaźnikiem LAR.

Wykonać schemat podwojenia logarytmu dwa dla roztworu antybiotyku zgodnie z metodą standardowego rozcieńczania agaru CLSI. Teraz dodaj dwa mililitry roztworu przeciwdrobnoustrojowego do wysterylizowanej szklanej butelki zawierającej 18 mililitrów stopionego podłoża agarowego Muellera-Hintona. Po dokładnym wymieszaniu przelać do talerzy znajdujących się w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że pod pokrywką płytek jest pozostawiona szczelina, aby umożliwić wysuszenie powierzchni agaru. Oznaczyć rodzaje środków przeciwdrobnoustrojowych i ich odpowiednie stężenia na spodniej stronie inkubowanych płytek.

Ułożyć wiele inkubowanych płytek dla każdego środka przeciwdrobnoustrojowego w stosie ułożonym w logarytmie drugim w kolejności podwajania rozcieńczeń. Na koniec przygotuj dwie wolne od leków płytki agarowe, które będą pełnić rolę kontrolną dla każdego środka. Zainstaluj wysterylizowaną płytkę szpilki do zaszczepiania na wsporniku inokulatora z matrycą 96 punktów w szafie bezpieczeństwa biologicznego.

Następnie ułóż przygotowany blok nasienny z przetestowanymi szczepami i inkubowaną płytką agarową na nośniku ruchomym. Popchnij nośnik mobilny, aż blok wysiewu znajdzie się poniżej płytki kołka zaszczepiającego. Teraz naciśnij uchwyt roboczy i opuść płytkę kołka do zaszczepiania, prowadząc 96 kołków w kierunku inokulum w 96 dołkach bloku nasiennego.

Zwolnij uchwyt operacyjny w kontrolowany sposób i automatycznie zresetuj płytkę kołka do zaszczepiania, aby dobrze wymieszać każdy inokulum i zanurzyć, popchnąć uchwyt operacyjny dwa do trzech razy. Następnie przesunąć i ustawić płytkę nośną tak, aby płytka inkubacyjna znajdowała się pod płytką kołka do zaszczepiania. Naciśnij uchwyt roboczy, opuszczając płytkę szpilki do zaszczepiania i pozostawiając ją na jedną do dwóch sekund, aby zapewnić pełny kontakt z powierzchnią inkubowanej płytki.

Zwolnij uchwyt operacyjny, aby zakończyć jedną rundę inokulacji. Wymień inkubowaną płytkę i powtarzaj proces, aż partia przeciwbakteryjnych płytek agarowych zostanie skompletowana. Przełącz się na nową płytkę szpilki inokulacyjnej i blok nasienny, aby zaszczepić kolejną grupę badanych szczepów.

Inkubować zaszczepione przeciwbakteryjne płytki agarowe w temperaturze pokojowej, aż wilgoć z plamek inokulum zostanie całkowicie wchłonięta przez agar. Po inkubacji odwróć płytki i kontynuuj inkubację, aby umożliwić niezahamowanym bakteriom utworzenie kolonii. Aby przeprowadzić akwizycję obrazu i statystykę danych, zacznij od kliknięcia systemu akwizycji obrazu AST z matrycą punktową 96, aby uruchomić program.

Na pasku zadań wybierz pozycję Informacje o teście. Kliknij przycisk Nowy, aby utworzyć nowe zadanie testowe i uzupełnić wymagane szczegóły. Następnie naciśnij zbieranie danych, a następnie zdjęcie i element testowy, aby wybrać nowo utworzone zadanie.

Wybierz antybiotyki, aby wybrać nazwę antybiotyku i gradient, aby wybrać początkowe stężenie antybiotyku. Na koniec kliknij Połącz, aby nawiązać połączenie z konwerterem pozyskiwania obrazów. Następnie umieść inkubowane płytki na podstawie płytki detekcyjnej i włóż je do konwertera akwizycji obrazu.

Kliknij na kolekcję, aby zrobić zdjęcia płyt. Naciśnij antybiotyki i wybierz następny zestaw płytek. Wybierz gradient, aby zidentyfikować gradient początkowy, a następnie przejdź do następnej rundy zbierania obrazów.

Zakończ procedurę, klikając przycisk Prześlij, aby określić tworzenie kolonii i przekonwertować obrazy na minimalne stężenia hamujące, czyli wartości MIC. Kliknij zapytanie, aby uzyskać dostęp do wszystkich wyników MIC. Zacznij od wykorzystania metody agaru dwuwarstwowego do produkcji różnych fagów.

Rozcieńczyć fagi do odpowiedniego równoległego stężenia i dodać 200 mikrolitrów inokulum fagowego do 96-dołkowego bloku nasiennego. Następnie przygotuj dwuwarstwową płytkę inkubacyjną dla każdego szczepu, który ma być badany. Pozostaw szczelinę pod pokrywką dwuwarstwowej płytki, aby umożliwić wyschnięcie.

Umieścić przygotowany blok nasienny faga i dwuwarstwową płytkę na ruchomym nośniku inokulatora z matrycą punktową 96. Przenieś całą innockularną fagę na powierzchnię półagaru. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej, aż cała wilgoć z wnętrza zostanie wchłonięta przez półagar.

Teraz inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza dla badanych szczepów przez cztery do sześciu godzin. Użyj konwertera akwizycji obrazu, aby uzyskać i zapisać obraz wyniku eksperymentu każdej płytki dwuwarstwowej. Zapisz liczbę i morfologie różnych kształtów plamek w arkuszu kalkulacyjnym na podstawie uzyskanych obrazów i oblicz odpowiednie proporcje różnych typów fagów.

Badanie morfologiczne wzrostu salmonelli na płytkach z ampicyliną wykazało, że kontrola ujemna w a-1 nie wykazała wzrostu. Wartość MIC szczepu salmonelli w a-4 wynosiła 64 mikrogramy na mililitr, podczas gdy w przypadku a-5 wynosiła 16 mikrogramów na mililitr. Procentowe wartości oporności ampicyliny, cyprofloksacyny i kwasu amoksycylinowo-klawulanowego były wyższe niż 50%, podczas gdy wartości doksycykliny, florfenikolu, cefotaksymu i enrofloksacyny wynosiły od 30% do 50%Gentamycyna, amikacyna i meropenem wykazywały procentowe wartości oporności mniejsze niż 30%Wskaźniki LAR cyprofloksacyny i kwasu amoksycylino-klawulanowego znacznie się opóźniły.

Analizy morfologiczne wzrostu salmonelli na płytkach dwuwarstwowych wykazały, że zaobserwowano cztery główne morfologie plamek fagów. Okrągła, przezroczysta plamka lityczna pochodziła od faga, który mógł niezawodnie zabić gospodarza na płytce, ale który może, ale nie musi, skutecznie replikować się kosztem tego gospodarza. Zbiór tabliczek został utworzony przez prawdziwe tablice.

Mętna plamka lityczna powstała w wyniku faga, który nie zabił niezawodnie gospodarza na płytce i który może, ale nie musi, skutecznie replikować się kosztem tego gospodarza. Brak plamki litycznej wskazywał na nielityczny charakter. Ta technika z łatwością i skutecznie przenosi 96 soczewek agarowych na raz, a instrumenty automatycznie rozpoznają obrazy, a następnie obliczają kostkę linii.

Oczekuje się, że technologia ta będzie promować badania i uprzemysłowienie fagów, a zastosowanie fagów jest jednym z niesamowitych sposobów na zmniejszenie i rozwiązanie problemu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.