Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Ogólnym celem niniejszego protokołu eksperymentalnego jest przedstawienie nieinwazyjnej i technicznie niewymagającej procedury indukowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy oraz późniejszej kwantyfikacji odpowiedzi obronnej gospodarza in vivo w płucach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chorób zakaźnych i immunologii dotyczące genów i szlaków molekularnych kontrolujących odpowiedź gospodarza na zakażenie. Główną zaletą tej metody infekcji płuc jest jej prostota techniczna.

Dzięki temu nawet laboratoria z niewielkim doświadczeniem w procedurach płucnych mogą badać wrodzoną odpowiedź immunologiczną płuc. W placówce o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego rozmrozić stock glicerolowy K.pneumoniae i przenieść 1 ml bakterii do kolby hodowlanej o pojemności 500 ml zawierającej 50 ml bulionu sojowego z tryptonem (Tryptic Soy Broth). Inkubować kulturę w zawiesinie przez noc w temperaturze 37 °C przy 200 do 225 RPM.

Następnego dnia rano odmierzyć od jednego do pięciu mililitrów kultury bakteryjnej, rozcieńczyć je w nowej kolbie zawierającej 50 mililitrów Tryptic Soy Broth i inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez kolejne 2,5 godziny, aby osiągnąć fazę logarytmiczną. Po zakończeniu drugiej inkubacji przenieść jeden mililitr bakterii z drugiej kultury do probówki o pojemności 1,5 mililitra w celu odwirowania. Usunąć nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie delikatnie resuspendować bakterie w jednym mililitrze sterylnego roztworu soli fizjologicznej, powtarzając czynność płukania trzykrotnie.

Po trzecim przemyciu resuspenduj bakterie w kolejnym mililitrze sterylnego roztworu soli fizjologicznej i przygotuj logarytmiczne rozcieńczenia seryjne inokulum. Odmierz jeden mililitr rozcieńczeń 1:10 oraz 1:100 do jednorazowych kuwet, w dwóch powtórzeniach, aby wyznaczyć OD600 przemytych K.pneumoniae. Wartość OD600 równa 1,0 odpowiada w przybliżeniu od czterech do siedmiu razy 10⁸ CFU na mililitr.

Po obliczeniu stężenia bakterii w każdym rozcieńczeniu, resuspend pożądane dawki CFU inokulum w 50 do 60 µL jałowej soli fizjologicznej na każde zwierzę biorcę w wieku od 8 do 12 tygodni. Aby podać bakterie zwierzętom, pobierz dawkę inokulum do końcówki pipety P200, a znieczuczoną mysz umieść w półleżącej pozycji grzbietowej, zawieszonej za siekacze szczękowe na gumce rozciągniętej między kołkami nachylonej płyty z pleksiglasu. Używając tępych, gładkich pęsety, delikatnie odsunij język na bok i wprowadź dawkę do jamy ustnej zwierzęcia, dbając o to, aby nie spowodować urazu języka ani gardła.

Utrzymując język w pozycji wycofanej, delikatnie zatkaj nos palcem w rękawiczce, aż mysz weźmie dwa lub trzy oddechy. Gdy w jamie ustnej nie będzie widoczny żaden płyn, przenieś mysz z deski do inokulacji do klatki w pozycji grzbietnej, aby zapobiec zablokowaniu nozdrzy podczas rekonwalescencji zwierzęcia. Wykonaj cięcie wzdłużne tuż poniżej mostka.

Następnie, unosząc mostek pęsetą, nacinamy przeponę, aby płuco opadło z powrotem do jam klatki piersiowej. Kontynuujemy nacięcie w górę przez jamę klatki piersiowej po obu stronach naczyń krwionośnych i dalej przez szyję. Gdy tchawica stanie się widoczna, ostrożnie przecinamy środek szyi i odsuwamy tkanki na boki, aby uniknąć uszkodzenia otaczających naczyń krwionośnych.

Następnie wykonaj nacięcie tchawicy w odległości około jednej czwartej długości od głowy i wprowadź do niej w kierunku ogonowym kaniulę połączoną z strzykawką o pojemności 1 ml, uprzednio napełnioną 1 ml PBS. Powoli wtłocz płyn do płuc, doprowadzając do napompowania wszystkich płatów. Następnie odciągnij płyn za pomocą strzykawki i zbierz wszystkie wypłuczyny do probówki o pojemności 15 ml, umieszczonej w lodzie.

W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu pobrać krew z lewej komory i przenieść ją do probówki z heparyną, aby zapobiec krzepnięciu. Następnie pobrać wszystkie płaty płuc do probówki 15 ml zawierającej 5 ml PBS, a śledzionę do probówki 15 ml zawierającej 2 ml PBS. W dalszej kolejności, używając dla każdej próbki oddzielnego jednorazowego homogenizatora, rozetrzeć tkanki w lodzie, a następnie przeprowadzić rozcieńczenia seryjne zawiesin tkankowych.

Rozcieńczenia wysiej w dwóch powtórzeniach na przeciwległych stronach jednej płytki TSA i pozwól próbkom krótko wyschnąć. Następnie odwróć płytki i inkubuj próbki w statycznym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsius przez noc; następnego ranka oblicz średnią liczbę kolonii bakteryjnych z obu stron płytki dla każdego rozcieńczenia. Przy dawce 2000 CFU K.pneumoniae u myszy zazwyczaj zaczynają pojawiać się objawy kliniczne od 12 do 24 godzin po zakażeniu.

W ciągu 48 do 72 godzin u wielu zwierząt pojawiają się objawy choroby i zachorowalności, którym zazwyczaj towarzyszy średnia utrata masy ciała na poziomie 20%. Jednakże dawka LD50 pozwala na wykrycie zarówno względnego wzrostu, jak i spadku przeżywalności w grupie eksperymentalnej i może być preferowana w badaniach długoterminowych. Zakażenie dolnych dróg oddechowych przez K.pneumoniae charakteryzuje się silnym napływem leukocytów do dróg oddechowych w ciągu sześciu godzin od zakażenia, który osiąga szczyt po 24 godzinach i jest reprezentowany głównie przez neutrofile.

Cytokiny są wykrywalne w płycie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego zarówno 24, jak i 48 godzin po zakażeniu K.pneumoniae, co pozwala uzyskać wgląd w mikrośrodowisko płuc i ich immunologiczną autorekrutację w odpowiedzi na inwazję bakteryjną. Obciążenie bakteryjne w płucach, krwi i śledzionie również gwałtownie wzrasta między 24 a 48 godziną zakażenia. Po opanowaniu techniki, metoda aspiracji orofaringealnej w celu zakażenia płuc może zostać przeprowadzona w ciągu zaledwie jednej do dwóch minut na mysz, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie stosować zbyt dużej objętości aspiracji. W przypadku myszy w wieku od 8 do 12 tygodni zazwyczaj sprawdza się objętość od 50 do 60 µl. Po zakończeniu tej procedury można zastosować szereg metod analizy płuc i tkanek obwodowych, aby umożliwić ilościową ocenę odpowiedzi immunologicznej w procesie eliminacji patogenów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać eksperymentalne bakteryjne zapalenie płuc poprzez orofaringealną podaż patogenu oraz jak określić obciążenie patogenem u myszy. Należy pamiętać, że praca z drobnoustrojami może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać podstawowych środków ostrożności i praktyk BSL-2.