Name: Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę indukcji bakteryjnego zapalenia płuc u myszy przez aspirację K. pneumoniae. Technika ta umożliwia badanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc w laboratoriach o ograniczonym doświadczeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt oraz Polityką Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych po przeglądzie przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIEHS.
1. Przygotowanie kultury K. pneumoniae
Uwaga: Wykonaj wszystkie kroki w kapturze poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) lub innym wyznaczonym obszarze BSL2 i wyrzuć odpady zgodnie z wytycznymi instytutu BSL2.
<ol>
	<li>W przypadku wzrostu zawiesiny K. pneumoniae należy rozmrozić glicerolowy zapas bakterii i zaszczepić roboczą kulturę, przenosząc 1 ml bulionu K. pneumoniae do 50 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w kolbie o pojemności 500 ml lub większej.</li>
	<li>Przygotować zapasy glicerolu, dodając 900 μl hodowanego K. pneumoniae w fazie logarytmicznej do 100 μl sterylnego glicerolu i zamrażając w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Do długotrwałego przechowywania zalecana jest temperatura -80 °C.</li>
	<li>Hodowlę bakterii z etapu 1.1 należy przeprowadzić przez wytrząsanie kolby przez noc (14-18 godzin) w temperaturze 37 °C przy 200-225 obr./min. W celu pobudzenia wzrostu w fazie logarytmicznej, rano rozcieńczyć 1-5 ml tej nocnej kultury do kolby zawierającej 50 ml TSB i umieścić z powrotem w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez ~2,5 godziny.</li>
	<li>Przenieść 1 ml kultury K. pneumoniae z ostatniego etapu do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 7 500 x g przez 2 minuty. Powinna być widoczna biała granulka. Usunąć supernatant bez naruszania osadu, delikatnie zawiesić bakterie pipetą w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i ponownie wirować z prędkością 7 500 x g przez 2 minuty.
	<ol>
		<li>Wykonaj ten etap prania 2x, podnosząc ostatni, umyty granul w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać logarytmiczne seryjne rozcieńczenia tego zgrabnego inokulum. Na przykład, dodać 400 μl inokulum do 3,6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej szeregowo, aby uzyskać serię rozcieńczeń 10-1-10-9.</li>
	<li>Oznaczyć OD600 umytych K. pneumoniae, umieszczając 1 ml rozcieńczeń 1:10 i 1:100 w jednorazowych kuwetach i odmierzając OD600, najpierw zaślepiając sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Mierz duplikaty, aby zapewnić dokładność. OD600 1,0 jest w przybliżeniu równoważne 4-7 x 108 CFU/ml. Należy pamiętać, że zależność między OD a CFU/ml może nie być liniowa.
	<ol>
		<li>Użyj OD600 z rozcieńczeń, aby obliczyć stężenie K. pneumoniae, stosując powyższą konwersję OD:CFU/ml i uwzględniając rozcieńczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj stężenia K. pneumoniae, aby przygotować pożądaną dawkę inokulum CFU w objętości <100 μl do podania myszom (patrz poniżej).</li>
	<li>Również 100 μl rozcieńczeń 10-6-10-9 i 100 μl sterylnego soli fizjologicznej na indywidualnych płytkach z tryptycznym agarem sojowym (TSA) w temperaturze pokojowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie bakterii w celu obliczenia dokładnego stężenia, które zostało użyte w doświadczeniu i kontroli zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Rzeczywiste stężenie bakterii w końcowym inokulum może wynosić ± 500 jtk/ml niż przewiduje się na podstawie absorbancji. Eksperymentatorzy powinni w idealnym przypadku potwierdzić zależność OD600:CFU/ml w badaniach pilotażowych przed użyciem in vivo u myszy, empirycznie dostosowując konwersję OD600:CFU/ml w oparciu o swoje osobiste doświadczenia.</li>
</ol>
2. Mysia dotchawicza (i.t.) Aspiracja K. pneumoniae z jamy ustnej i gardła
<ol>
	<li>Upewnij się, że myszy są jednoznacznie identyfikowane za pomocą znaku ogona, tatuażu lub innego zatwierdzonego identyfikatora.</li>
	<li>Sporządzić inokulum dozujące bakterie za pomocą pipety P200 przed usunięciem myszy z izofluranu w celu przyspieszenia procedury. Aby uzyskać najlepsze wyniki przy aspiracji IT, użyj objętości <100 μl, aby zapobiec przepełnieniu. W tym celu należy użyć 2000 CFU/50 μl K. pneumoniae.</li>
	<li>Znieczulenie myszy należy umieścić w przezroczystej komorze z gazem izofluranowym (np. 2% izofluranem przy natężeniu przepływu 1 l/min) lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Liczba myszy do znieczulenia razem zależy od poziomu komfortu eksperymentatora, zwykle 1-2 na raz. Obserwuj oddech i potwierdź poziom znieczulenia, gdy widoczne są głębokie oddechy i można policzyć 2-3 sekundy między oddechami. 
	UWAGA: Jeśli istnieje obawa o możliwe zakłócające działanie lotnych (wziewnych) środków znieczulających, znieczulenie można uzyskać zamiast tego za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny. Przy metodzie opisanej powyżej znieczulenie głębokie trwa tylko kilka minut. W przypadku wywołania przedłużonego znieczulenia należy zastosować maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oka.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy umieść ją w pozycji półleżącej, zawieszonej na siekaczach szczęki na gumce rozciągniętej między kołkami na pochyłej płycie z pleksiglasu (ryc. 1).</li>
	<li>Delikatnie pociągnij język myszy na bok za pomocą, niepręgowanych kleszczy i wprowadź dawkę do jamy ustnej za pomocą pipety P200. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć urazu języka lub części ustnej gardła.</li>
	<li>Trzymając język schowany, delikatnie zasłaniaj nos palcem w rękawiczce, aż mysz weźmie wdech. Kontynuuj zakrywanie nosa, aż mysz weźmie dwie lub więcej inhalacji, a w jamie ustnej nie będzie widać płynu. Zakrycie nosa pomaga zapewnić, że mysz będzie wdychać bakterie do płuc, ponieważ myszy są obowiązkowymi oddychaczami przez nos.</li>
	<li>Wyjmij mysz z deski do szczepienia i wróć do klatki, kładąc mysz na plecach, aby zapobiec blokowaniu nozdrzy przez ściółkę lub zanieczyszczenia, podczas gdy mysz dochodzi do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Gdy wszystkie myszy zostaną podawkowane i obudzą się ze znieczulenia, trzymaj myszy w boksie/pomieszczeniu zawierającym tylko myszy, którym podano K. pneumoniae. Codziennie monitoruj myszy, w tym masę ciała, jeśli po zakażeniu minęło więcej niż 48 godzin.</li>
	<li>Używaj codziennego zacieru i/lub dodatkowego ciepła, jeśli pozwalasz myszom przetrwać dłużej niż 48 godzin.</li>
</ol>
3. Pobieranie i analiza płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)
<ol>
	<li>Eutanazja myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W tym przypadku należy zastosować śmiertelny zastrzyk 150 mg/kg pentobarbitalu sodu lub równoważną dawkę komercyjnego roztworu do eutanazji, a następnie wykrwawienie, ponieważ pozwala to uniknąć możliwych powikłań dla płuc związanych z wdychaniem CO2 i zwichnięciem szyjki macicy.</li>
	<li>Umieść mysz na plecach i wysterylizuj mysz, spryskując futro 70% etanolem, szczególnie w okolicy klatki piersiowej i szyi.</li>
	<li>Wykonaj podłużne cięcie tuż pod mostkiem, a następnie przytrzymując mostek kleszczami, naciąć przeponę, pozwalając płucu opaść z powrotem do jamy klatki piersiowej. Przeciąć przez klatkę piersiową po obu stronach układu krwionośnego, a następnie w górę przez szyję, odsłaniając tchawicę.</li>
	<li>Ponieważ tchawica jest otoczona podłużnymi mięśniami po obu stronach, ostrożnie przeciąć środek i popchnąć tkankę na boki, ponieważ pozwala to uniknąć przecięcia otaczającego naczynia krwionośnego, co mogłoby wprowadzić krew do tchawicy. Jeśli układ krwionośny jest nacięty, oczyść okolice gazą przed uzyskaniem dostępu do światła tchawicy.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych lub igły, aby naciąć tchawicę około 1/4 drogi w dół od głowy i wprowadzić kaniulę przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml wstępnie załadowanej 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) doogonowo do tchawicy. W przypadku myszy w wieku <8 tygodni lub samic należy zmniejszyć objętość płukania do 600-800 μl.</li>
	<li>Powoli wciśnij objętość do płuc, pozwalając wszystkim płatom się napompować, a następnie wyciągnij objętość z powrotem za pomocą strzykawki, powtarzając 3 razy. Jeśli PBS wydostaje się z nozdrzy, kaniula nie została wepchnięta wystarczająco głęboko do tchawicy lub napompowanie następuje zbyt szybko. Alternatywnie, jeśli płuca nie są dobrze napompowane, kaniula została wepchnięta zbyt głęboko, więc lekko się wycofaj.</li>
	<li>Zebrać zebrane płyny do płukania w tubce o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Wirować płyn do płukania przestrzeni powietrznej o sile 1 200 x g przez 5 minut, zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C. Następnie użyj supernatantu (tj. BALF) do pomiaru białka, cytokin i do różnych innych testów biochemicznych. Osad reprezentuje komórki z przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowej.</li>
	<li>Jeśli czerwone krwinki (RBC) są widoczne w osadzie komórkowym na podstawie koloru, poddać lizie 1 ml buforu do lizy ACK przez 1 minutę, a następnie dodać 5 ml 1x PBS, aby zatrzymać reakcję lizy i rozcieńczyć bufor. Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się identycznie, zarówno potraktowanymi buforem do lizy ACK, jak i nie.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 1 200 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i umieścić komórki w 1 ml 1x PBS.</li>
	<li>Wiruj i policz komórki na hemocytometrze w celu zliczenia całkowitych komórek przestrzeni powietrznej.</li>
	<li>W zależności od gęstości komórek dodać około 80-150 μl (~80 μl dla zakażonej myszy i ~150 dla myszy naiwnej) do komory szkiełka na wirówce cytospinowej. Obracaj komórki na szkiełkach mikroskopowych w celu późniejszego barwienia w celu określenia różnic w populacjach komórek.</li>
	<li>Pozostaw komórki do wyschnięcia na szkiełkach przez noc. Zabarwić komórki potrójnym barwnikiem (np. Hema 3 [patrz tabela]), zanurzając szkiełka 7 razy w utrwalaczu, 9 razy w barwie 1 i 7 razy w barwie 2 (bez płukania między plamami) i pozostawić do wyschnięcia. Po wyschnięciu bejcy szkiełko nakrywkowe przesuwa się i ręcznie liczy różnice za pomocą mikroskopu. Ogólnie rzecz biorąc, neutrofile i monocyty/makrofagi można łatwo odróżnić po ich wielkości i morfologii jądrowej.</li>
</ol>
4. Określanie obciążenia bakteryjnego w tkankach płuc i obwodowych
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem: przygotować probówki z 900 μl 1x PBS dla płuc i śledziony oraz 90 μl 1x PBS dla krwi. Tabliczki znamionowe do hodowli bakterii i ustawione w temperaturze pokojowej; W związku z tym, po pobraniu tkanki, czas między homogenizacją a posiewem zostanie zminimalizowany w celu rozwoju bakterii. 
	Uwaga: Ze względu na niejednorodne odkładanie się bakterii w płucach, które może wystąpić podczas aspiracji, zaleca się wykorzystanie poszczególnych myszy do analizy całkowitej komórkowości dróg oddechowych lub całkowitego (obustronnego) obciążenia bakteryjnego płuc.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zgodnie z krokiem 3.1, a następnie pobierz krew z lewej komory, umieszczając ją w rurki heparynizowanej, aby uniknąć zakrzepów. Usunąć wszystkie płaty płuc i umieścić w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml 1x PBS, a następnie usunąć śledzionę i umieścić w 2 ml 1x PBS. Umieść probówki na lodzie. Uważaj, aby czyścić narzędzia etanolem między każdą chusteczką/myszką.</li>
	<li>Homogenizować tkankę na lodzie, najlepiej za pomocą jednorazowych homogenizatorów, które można wymieniać między każdą próbką. Jednorazowe końcówki homogenizatora można sterylizować w autoklawie w celu ponownego użycia między eksperymentami.</li>
	<li>Po homogenizacji tkanki należy wykonać seryjne rozcieńczenia i płytkę. Próbki danej tkanki/rozcieńczenia należy umieścić w dwóch egzemplarzach na pojedynczej płytce TSA, rysując linię podziału na tworzywie sztucznym. Sugestie dotyczące posiewu i rozcieńczania przedstawiono poniżej (we wszystkich przypadkach 10 μl próbki rozprowadza się na płytce) i opierają się na 24-godzinnej sekcji zwłok po zakażeniu. W przypadku analizy próbek w ciągu 48-72 godzin może być konieczne posiew większej liczby rozcieńczeń ze względu na zwiększone obciążenie bakteryjne w późniejszych punktach czasowych.
	<ol>
		<li>Dla krwi - rozcieńczyć w stosunku 1:10, dodając 10 μl krwi do 90 μl sterylnego 1x PBS. Płytka schludna i próbki rozcieńczone w stosunku 1:10 w dwóch egzemplarzach. Po pokryciu krwi należy odwirować pozostałą krew o sile 9 300 x g przez 10 minut, aby pobrać osocze do pomiaru cytokin i chemokin.</li>
		<li>Dla płuc - rozcieńczyć 1:10 - 1:100, dodając 100 μl homogenizowanego płuca do 900 μl sterylnego 1x PBS szeregowo. Płytka jest czystym homogenatem i wszystkie rozcieńczenia w dwóch egzemplarzach.</li>
		<li>W przypadku śledziony - rozcieńczyć 1:10-1:100, dodając 100 μl homogenizowanej śledziony do 900 μl sterylnego 1x PBS szeregowo. Płytka czystej jednorodności i oba rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić rozsiane próbki do krótkiego wyschnięcia.</li>
	<li>Odwrócić płytki TSA i umieścić na noc w statycznym inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Określ liczbę bakterii kolonizujących, uśredniając kolonie bakteryjne z obu stron płytki i z każdego rozcieńczenia. Uwzględnij początkowe rozcieńczenia 5 ml dla płuc i 2 ml dla śledziony, aby określić całkowite tkankowe CFU.</li>
</ol>

<ol><li>Mizgerd, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lower+respiratory+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Acute lower respiratory tract infection.</a> N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).</li>
<li>Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+community-acquired+pneumonia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Management of community-acquired pneumonia in adults.</a> Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).</li>
<li>Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of human pneumonia.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).</li>
<li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).</li>
<li>Morales-Nebreda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+administration+of+influenza+virus+is+superior+to+intranasal+administration+as+a+model+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury.</a> J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).</li>
<li>Aujla, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+mediates+mucosal+host+defense+against+Gram-negative+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia.</a> Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+mediate+clade-specific%2C+serotype-independent+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity.</a> Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).</li>
<li>Draper, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+G1+deficiency+dysregulates+host+defense+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung.</a> Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+exacerbates+Staphylococcus+aureus+pneumonia+by+attenuating+IL-1beta+production+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice.</a> J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).</li>
<li>Mizgerd, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+elicited+by+bacteria+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs.</a> Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).</li>
<li>Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+accumulation+in+the+lungs+against+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).</li>
<li>Quinton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-specific+mutation+of+both+NF-kappaB+RelA+and+STAT3+abrogates+the+acute+phase+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice.</a> J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).</li>
<li>Gowdy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+for+scavenger+receptor+B-I+in+the+integrative+physiology+of+host+defense+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia.</a> Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).</li>
<li>Madenspacher, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Integrates+host+defense+and+cell+fate+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia.</a> J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).</li>
<li>Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+distribution+of+particles+given+by+intratracheal+instillation+or+by+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation.</a> Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).</li>
<li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc, w połączeniu z celowaniem genowym oraz interwencjami biologicznymi i farmakologicznymi in vivo , dostarczyły kluczowych informacji na temat odpowiedzi obronnej gospodarza płucnego. Ogromny postęp dokonał się w szczególności w naszym zrozumieniu chemokin i cząsteczek adhezyjnych, które regulują rekrutację neutrofili do zainfekowanej przestrzeni powietrznej10,11. Modele zapalenia płuc in vivo , w przeciwieństwie do metod opartych na komórkach lub altern...

Pozaszpitalne zapalenie płuc pozostaje główną przyczyną zgonów z powodu infekcji w USA, z niewielką ogólną zmianą wskaźników śmiertelności w ciągu ostatnich 40 lat, pomimo poprawy w strategiach szczepień i antybiotyków1,2. Pomimo braku zauważalnego postępu na poziomie zdrowia publicznego, w ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w naszym zrozumieniu molekularnej i komórkowej patogenezy zapalenia płuc, a wiele z tych kroków naprzód stało się możliwe dzięki zastosowaniu mysich modeli infekcji płuc. Genetyczna podatność myszy, podobieństwo mysiego i ludzkiego układu odpornościowego oraz szeroki wachlarz mysich odczynników immunologicznych, które stały się dostępne na rynku, ułatwiły szybki postęp w tej dziedzinie.
Mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc opisane w literaturze zazwyczaj polegały na jednej z czterech technicznych dróg inokulacji patogenów: i) aerozolizacji; ii) podawanie donosowe; iii) przekaz ustny; oraz iv) chirurgiczne wstrzyknięcie dotchawicze (tj. tracheotomia)3. Wszystkie drogi infekcji mają zalety i wady3. W szczególności względne narażenie górnych dróg oddechowych, możliwość domieszki flory ustnej nosa, wymagania dotyczące znieczulenia ogólnego, zmienność inokulum podawanego do dystalnego płuca, rozmieszczenie płatowe dostarczonych patogenów, wymagania dotyczące wiedzy technicznej i chorobowość zabiegowa różnią się znacznie w przypadku tych podejść.
Powszechnie stosowane techniki infekcji ustnej obejmują kaniulację dotchawiczą (przezkrtaniową) za pomocą "ślepego" (niewizualnego) podejścia lub pod bezpośrednią wizualizacją krtani3-5. Obie metody, choć solidne, wymagają znacznego szkolenia, a także niosą ze sobą ryzyko urazu górnych dróg oddechowych. W niniejszym raporcie opisujemy technicznie nieintensywną, nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę infekcji przezustnej, za pomocą której bakterie (Klebsiella pneumoniae w podanym przykładzie) pipetowane do jamy ustnej i gardła znieczulonej myszy są dostarczane do płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie). My i inni z powodzeniem zastosowaliśmy technikę zachłystowego zapalenia płuc6-9. Ta wszechstronna i łatwa do opanowania metoda dostarczania do płuc może być rozszerzona o dostarczanie do płuc wielu dodatkowych czynników nieżrących, w tym cytokin i innych białek, cząsteczek związanych z patogenami (np. lipopolisacharydu), komórek (tj. transfer adoptywny) i toksyn (np. bleomycyna). Oprócz omówienia ważnych kwestii technicznych, opisujemy również zintegrowane, ilościowe podejście do oceny późniejszej odpowiedzi gospodarza na zapalenie płuc, w tym dalszy pomiar klirensu bakteryjnego (tj. ilościowego oznaczania jednostki tworzącej kolonie [CFU] w płucach i narządach obwodowych) oraz akumulacji leukocytów w przestrzeni powietrznej.

<table><tbody><tr><td>Klebsiella pneumoniae, serotyp 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Cewniki Becton Dickenson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Excel Safelet IV, 18 G x 1 1/4"</td> <td>Claflin Sprzęt medyczny</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Roztwór 1</td><td>Fisher</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Roztwór 2</td><td>Fisher</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Fixative</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; strzykawki tuberkulinowe</td><td>Fisher</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>Kolektory osocza heparyny litowej</td><td></td><td>Jednorazowe</td> rozsiewacze Fisher 2675187 <td></td></tr> w <tr><td>kształcie litery L</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7,4</td><td>przygotowany we własnym zakresie</td><td>nie dotyczy</td><td>Woda destylowana (5 l), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor do lizy ACK</td><td>przygotowany we własnym zakresie</td><td>nie dotyczy</td><td>NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), uzupełnić do 500 ml wodą destylowaną i pH do 7,4</td></tr></tbody></table>

nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Chociaż pozaszpitalne zapalenie płuc pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego, mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc ostatnio ułatwiły znaczący postęp przedkliniczny w naszym zrozumieniu leżącej u podstaw patogenezy komórkowej i molekularnej. Mysie modele in vivo ujmują zintegrowaną fizjologię i odporność odpowiedzi obronnej gospodarza w sposób, który nie został ujawniony przez alternatywne, uproszczone podejścia ex vivo. W literaturze opisano kilka metod dopłucnej inokulacji bakterii u myszy, w tym aerozolizację, podawanie donosowe, przezustną kaniulację dotchawiczą w warunkach "ślepych" i wizualnych oraz przezskórną kaniulację dotchawiczą. Wszystkie metody mają względne zalety i ograniczenia. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy nieinwazyjną, technicznie nieintensywną, niedrogą i szybką metodę dotchawniczego dostarczania bakterii, która polega na aspiracji (tj. Wdychaniu) przez mysz zakaźnego inokulum pipetowanego do jamy ustnej gardła w znieczuleniu ogólnym. Metoda ta może być stosowana do dostarczania płucnego szerokiej gamy nieżrących środków biologicznych i chemicznych i jest stosunkowo łatwa do nauczenia, nawet dla laboratoriów z minimalnym wcześniejszym doświadczeniem w zabiegach płucnych. Oprócz opisania metody zachłystowego zapalenia płuc, przedstawiamy również procedury krok po kroku do oznaczania późniejszej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc in vivo myszy, w szczególności metody ilościowego określania klirensu bakteryjnego i komórkowej odpowiedzi immunologicznej zakażonych dróg oddechowych. To zintegrowane i proste podejście do oceny zapalenia płuc pozwala na szybką i solidną ocenę wpływu manipulacji genetycznych i środowiskowych na wrodzoną odporność płuc.

Myszy C57BL/6 zostały zainfekowane 2000 CFU K. pneumoniae 43816 (serotyp 2) poprzez aspirację orofaringealną do płuc. Przy tej dawce u myszy typowo zaczynają pojawiać się objawy kliniczne 12-24 h po infekcji, w tym letarg, zjeżona sierść oraz utrata masy ciała o 5-10% (Rycina 2A). W ciągu 48-72 h po infekcji u wielu myszy występują objawy choroby i zachorowalności, którym zazwyczaj poprzedza średnia utrata masy ciała o 20%, a które skutkują przygarbioną postawą, ...

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu eksperymentalnego jest przedstawienie nieinwazyjnej i technicznie niewymagającej procedury indukowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy oraz późniejszej kwantyfikacji odpowiedzi obronnej gospodarza in vivo w płucach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chorób zakaźnych i immunologii dotyczące genów i szlaków molekularnych kontrolujących odpowiedź gospodarza na zakażenie. Główną zaletą tej metody infekcji płuc jest jej prostota techniczna.Dzięki temu nawet laboratoria z niewielkim doświadczeniem w procedurach płucnych mogą badać wrodzoną odpowiedź immunologiczną płuc. W placówce o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego rozmrozić stock glicerolowy K.pneumoniae i przenieść 1 ml bakterii do kolby hodowlanej o pojemności 500 ml zawierającej 50 ml bulionu sojowego z tryptonem (Tryptic Soy Broth). Inkubować kulturę w zawiesinie przez noc w temperaturze 37 °C przy 200 do 225 RPM.Następnego dnia rano odmierzyć od jednego do pięciu mililitrów kultury bakteryjnej, rozcieńczyć je w nowej kolbie zawierającej 50 mililitrów Tryptic Soy Broth i inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez kolejne 2,5 godziny, aby osiągnąć fazę logarytmiczną. Po zakończeniu drugiej inkubacji przenieść jeden mililitr bakterii z drugiej kultury do probówki o pojemności 1,5 mililitra w celu odwirowania. Usunąć nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie delikatnie resuspendować bakterie w jednym mililitrze sterylnego roztworu soli fizjologicznej, powtarzając czynność płukania trzykrotnie.Po trzecim przemyciu resuspenduj bakterie w kolejnym mililitrze sterylnego roztworu soli fizjologicznej i przygotuj logarytmiczne rozcieńczenia seryjne inokulum. Odmierz jeden mililitr rozcieńczeń 1:10 oraz 1:100 do jednorazowych kuwet, w dwóch powtórzeniach, aby wyznaczyć OD600 przemytych K.pneumoniae. Wartość OD600 równa 1,0 odpowiada w przybliżeniu od czterech do siedmiu razy 10⁸ CFU na mililitr.Po obliczeniu stężenia bakterii w każdym rozcieńczeniu, resuspend pożądane dawki CFU inokulum w 50 do 60 µL jałowej soli fizjologicznej na każde zwierzę biorcę w wieku od 8 do 12 tygodni. Aby podać bakterie zwierzętom, pobierz dawkę inokulum do końcówki pipety P200, a znieczuczoną mysz umieść w półleżącej pozycji grzbietowej, zawieszonej za siekacze szczękowe na gumce rozciągniętej między kołkami nachylonej płyty z pleksiglasu. Używając tępych, gładkich pęsety, delikatnie odsunij język na bok i wprowadź dawkę do jamy ustnej zwierzęcia, dbając o to, aby nie spowodować urazu języka ani gardła.Utrzymując język w pozycji wycofanej, delikatnie zatkaj nos palcem w rękawiczce, aż mysz weźmie dwa lub trzy oddechy. Gdy w jamie ustnej nie będzie widoczny żaden płyn, przenieś mysz z deski do inokulacji do klatki w pozycji grzbietnej, aby zapobiec zablokowaniu nozdrzy podczas rekonwalescencji zwierzęcia. Wykonaj cięcie wzdłużne tuż poniżej mostka.Następnie, unosząc mostek pęsetą, nacinamy przeponę, aby płuco opadło z powrotem do jam klatki piersiowej. Kontynuujemy nacięcie w górę przez jamę klatki piersiowej po obu stronach naczyń krwionośnych i dalej przez szyję. Gdy tchawica stanie się widoczna, ostrożnie przecinamy środek szyi i odsuwamy tkanki na boki, aby uniknąć uszkodzenia otaczających naczyń krwionośnych.Następnie wykonaj nacięcie tchawicy w odległości około jednej czwartej długości od głowy i wprowadź do niej w kierunku ogonowym kaniulę połączoną z strzykawką o pojemności 1 ml, uprzednio napełnioną 1 ml PBS. Powoli wtłocz płyn do płuc, doprowadzając do napompowania wszystkich płatów. Następnie odciągnij płyn za pomocą strzykawki i zbierz wszystkie wypłuczyny do probówki o pojemności 15 ml, umieszczonej w lodzie.W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu pobrać krew z lewej komory i przenieść ją do probówki z heparyną, aby zapobiec krzepnięciu. Następnie pobrać wszystkie płaty płuc do probówki 15 ml zawierającej 5 ml PBS, a śledzionę do probówki 15 ml zawierającej 2 ml PBS. W dalszej kolejności, używając dla każdej próbki oddzielnego jednorazowego homogenizatora, rozetrzeć tkanki w lodzie, a następnie przeprowadzić rozcieńczenia seryjne zawiesin tkankowych.Rozcieńczenia wysiej w dwóch powtórzeniach na przeciwległych stronach jednej płytki TSA i pozwól próbkom krótko wyschnąć. Następnie odwróć płytki i inkubuj próbki w statycznym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsius przez noc; następnego ranka oblicz średnią liczbę kolonii bakteryjnych z obu stron płytki dla każdego rozcieńczenia. Przy dawce 2000 CFU K.pneumoniae u myszy zazwyczaj zaczynają pojawiać się objawy kliniczne od 12 do 24 godzin po zakażeniu.W ciągu 48 do 72 godzin u wielu zwierząt pojawiają się objawy choroby i zachorowalności, którym zazwyczaj towarzyszy średnia utrata masy ciała na poziomie 20%. Jednakże dawka LD50 pozwala na wykrycie zarówno względnego wzrostu, jak i spadku przeżywalności w grupie eksperymentalnej i może być preferowana w badaniach długoterminowych. Zakażenie dolnych dróg oddechowych przez K.pneumoniae charakteryzuje się silnym napływem leukocytów do dróg oddechowych w ciągu sześciu godzin od zakażenia, który osiąga szczyt po 24 godzinach i jest reprezentowany głównie przez neutrofile.Cytokiny są wykrywalne w płycie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego zarówno 24, jak i 48 godzin po zakażeniu K.pneumoniae, co pozwala uzyskać wgląd w mikrośrodowisko płuc i ich immunologiczną autorekrutację w odpowiedzi na inwazję bakteryjną. Obciążenie bakteryjne w płucach, krwi i śledzionie również gwałtownie wzrasta między 24 a 48 godziną zakażenia. Po opanowaniu techniki, metoda aspiracji orofaringealnej w celu zakażenia płuc może zostać przeprowadzona w ciągu zaledwie jednej do dwóch minut na mysz, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie stosować zbyt dużej objętości aspiracji. W przypadku myszy w wieku od 8 do 12 tygodni zazwyczaj sprawdza się objętość od 50 do 60 µl. Po zakończeniu tej procedury można zastosować szereg metod analizy płuc i tkanek obwodowych, aby umożliwić ilościową ocenę odpowiedzi immunologicznej w procesie eliminacji patogenów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać eksperymentalne bakteryjne zapalenie płuc poprzez orofaringealną podaż patogenu oraz jak określić obciążenie patogenem u myszy. Należy pamiętać, że praca z drobnoustrojami może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać podstawowych środków ostrożności i praktyk BSL-2.

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Źródło: Madenspacher, J. H. i Fessler, M. B. Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje proces ilościowego określania obciążenia bakteryjnego śledziony u zakażonej myszy w celu oceny stopnia zakażenia. Zhomogenizowana śledziona jest rozcieńczana seryjnie i pokryta płytami, aby określić całkowite obciążenie bakteriami. Uzyskane dane dostarczają informacji o interakcjach...

Ocena obciążenia bakteryjnym śledziony myszy w badaniach infekcji

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Zakaźne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych infekcji u ludzi. Odpowiedni model in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii. Dzięki temu mysiemu modelowi aspiracyjnego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle można zbadać patogenezę i nowe metody leczenia tych śmiertelnych infekcji.

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Poznaj nieinwazyjną metodę indukcji bakteryjnego zapalenia płuc u myszy przez aspirację K. pneumoniae. Technika ta umożliwia badanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc w laboratoriach o ograniczonym doświadczeniu.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Przeglądaj więcej filmów