Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest zapewnienie nieinwazyjnej i technicznie nieintensywnej procedury wywoływania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy, a następnie ilościowego określenia odpowiedzi obronnej gospodarza in vivo w płucach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób zakaźnych i immunologii, dotyczące genów i szlaków molekularnych, które kontrolują odpowiedź gospodarza na zakażenie. Główną zaletą tej metody infekcji płuc jest jej techniczna prostota.

Dzięki temu nawet laboratoria z niewielkim doświadczeniem w zabiegach płucnych mogą badać wrodzoną odpowiedź immunologiczną płuc. W obiekcie o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego rozmrozić zapas glicerolu K. pneumoniae i przenieść jeden mililitr bakterii do 500-mililitrowej kolby hodowlanej zawierającej 50 mililitrów tryptycznego bulionu sojowego. Inkubuj kulturę zawiesiny przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od 200 do 225 obr./min.

Następnego ranka rozcieńczyć od jednego do pięciu mililitrów kultury bakteryjnej w nowej kolbie zawierającej 50 mililitrów tryptycznego bulionu sojowego i inkubować kulturę w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 2,5 godziny, aby osiągnąć fazę logarytmiczną. Pod koniec drugiej inkubacji przenieś jeden mililitr bakterii z drugiej kultury do 1,5 mililitrowej probówki w celu odwirowania. Usuń supernatant bez naruszania palety i delikatnie zawieś bakterie w jednym mililitrze sterylnej soli fizjologicznej do trzech oddzielnych prań.

Po trzecim myciu ponownie zawieś bakterie w kolejnym mililitrze sterylnego roztworu soli fizjologicznej i ustaw logarytmiczne seryjne rozcieńczenia inokulum. Zmierzyć jeden mililitr rozcieńczeń od jednego do 10 i od jednego do 100 w jednorazowych kuwetach, w dwóch egzemplarzach, aby określić OD600 w umytym K.pneumoniae. OD600 równy 1,0 jest w przybliżeniu równoważny od czterech do siedmiu razy 10 do ósmych CFU na mililitr.

Po obliczeniu stężenia bakterii w każdym rozcieńczeniu, należy ponownie zawiesić żądaną dawkę inokulum CFU w 50 do 60 mikrolitrach sterylnej soli fizjologicznej na zwierzę biorcy w wieku od 8 do 12 tygodni. Aby dostarczyć bakterie zwierzętom, należy pobrać inokulum dozujące do końcówki pipety P200 i umieścić znieczuloną mysz w pozycji półleżącej, zawieszonej na siekaczach szczęki, na gumce rozciągniętej między kołkami pochyłej płyty z pleksiglasu. Używając pary, niepręgowanych kleszczy, delikatnie odciągnij język na bok i włóż dawkę do jamy ustnej zwierzęcia, uważając, aby nie wywołać urazu języka lub gardła ustnego.

Trzymając język schowany, delikatnie zasłaniaj nos palcem w rękawiczce, aż dom weźmie powietrze dwa do trzech razy. Gdy w jamie ustnej nie widać płynu, przenieś mysz z deski do szczepienia do klatki, w pozycji leżącej, aby zapobiec zablokowaniu nozdrzy podczas rekonwalescencji myszy. Wykonaj podłużne cięcie tuż pod mostkiem.

Następnie, unosząc mostek kleszczami, naciąć przeponę, pozwalając płucu opaść z powrotem do jamy klatki piersiowej. Kontynuuj nacięcie w górę przez jamę klatki piersiowej po obu stronach układu krwionośnego i w górę przez szyję. Kiedy tchawica jest widoczna, ostrożnie przeciąć środek szyi i popchnąć tkankę na boki, aby uniknąć uszkodzenia otaczającego układu krwionośnego.

Teraz naciąć tchawicę około jednej czwartej długości w dół od głowy i doogonowo włożyć kaniulę przymocowaną do jednomililitrowej strzykawki wstępnie załadowanej jednym mililitrem PBS do tchawicy. Wepchnij objętość do płuc, powoli, pozwalając wszystkim płatom się napompować. Następnie wyciągnij objętość z powrotem za pomocą strzykawki i zbierz zebrane płyny do płukania w 15-mililitrowej tubce na lodzie.

W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym zebrać krew z lewej komory i przenieść ją do rurki heparynizowanej, aby uniknąć zakrzepów. Następnie zbierz wszystkie płaty płuc w 15-mililitrowej probówce zawierającej pięć mililitrów PBS, a śledzionę w 15-mililitrowej probówce zawierającej dwa mililitry PBS. Następnie należy użyć indywidualnych, jednorazowych homogenizatorów na próbkę, aby macerować tkanki na lodzie, a następnie seryjnie rozcieńczać zawiesiny tkanek.

Rozcieńczenia należy rozłożyć, dwukrotnie, na oddzielnych bokach pojedynczej płytki TSA i pozostawić próbki do krótkiego wyschnięcia. Następnie odwróć płytki i pohoduj próbki w statycznym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, uśredniając kolonie bakteryjne z obu stron płytki i z każdego rozcieńczenia następnego ranka. Przy 2000 CFU K. pneumoniae myszy zazwyczaj zaczynają wykazywać objawy kliniczne od 12 do 24 godzin po zakażeniu.

W ciągu 48 do 72 godzin wiele zwierząt wykazuje objawy choroby i zachorowalności, które zwykle poprzedza średnio 20-procentowa utrata masy ciała. Dawka LD50 pozwala jednak na wykrycie zarówno stosunkowo zwiększonego, jak i zmniejszonego przeżycia w grupie eksperymentalnej i może być preferowana w badaniach długoterminowych. Zakażenie dolnych dróg oddechowych K. pneumoniae charakteryzuje się silnym napływem leukocytów do dróg oddechowych w ciągu sześciu godzin od zakażenia, który osiąga szczyt po 24 godzinach i jest reprezentowany głównie przez neutrofile.

Cytokiny są wykrywalne w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego zarówno po 24, jak i 48 godzinach od zakażenia K. pneumoniae i zapewniają wgląd w mikrośrodowisko płuc i ich samorekrutację immunologiczną w odpowiedzi na inwazję bakterii. Obciążenie bakteryjne w płucach, krwi i śledzionie również dramatycznie wzrasta między 24 a 48 godziną infekcji. Po opanowaniu, metoda aspiracji ustno-gardłowej infekcji płuc może być wykonana w ciągu zaledwie jednej do dwóch minut na mysz, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby nie używać nadmiernej objętości aspiracji. Objętość od 50 do 60 mikrolitrów zazwyczaj dobrze sprawdza się w przypadku myszy w wieku od ośmiu do 12 tygodni. Po tej procedurze można zastosować różne metody na płucach i tkankach obwodowych, aby umożliwić ilościowe określenie odpowiedzi immunologicznej w usuwaniu patogenu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać eksperymentalne bakteryjne zapalenie płuc poprzez dostarczanie patogenów do jamy ustnej i gardła oraz określić obciążenie patogenami u myszy. Nie zapominaj, że praca z drobnoustrojami może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać podstawowych środków ostrożności i praktyk BSL-2.