Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Ogólnym celem tej metodologii ELISpot jest umożliwienie ilościowego określenia komórek B wydzielających ludzkie przeciwciała z krwi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny dotyczące immunologii limfocytów B i badań nad szczepionkami. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wykrywanie i pomiar limfocytów B wydzielających przeciwciała na poziomie pojedynczej komórki.

Procedurę zademonstruje Tsung-Chih Tseng, doktorant z mojego laboratorium. Natychmiast po pobraniu 10 ml próbki krwi z środkowej żyły łokciowej do 15 ml probówki zawierającej EDTA uzupełniony potasem, należy kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów. Następnie dodać 35 ml autoklawowanego buforu do lizy czerwonych krwinek do komórek na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Gdy przez probówkę można zaobserwować światło, odwiruj krew i potwierdź obecność białego osadu. Usunąć resztki buforu do lizy za pomocą 10 ml autoklawowanego PBS i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki RPMI 1640. Umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla.

Następnie delikatnie zakręć naczyniem hodowlanym kilka razy i przenieś pływające komórki do plastikowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Po dwóch płukaniach przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad na poziomie od pięciu do 10 razy dziesiątej z sześciu komórek na ml stężenia w 200 mikrolitrach zimnego buforu PBS i dodać 5 mikrolitrów biotynylowanego anty-ludzkiego koktajlu przeciwciał specyficznego dla komórek krwi na jedną dziesiątą szóstej komórki. Po 30-minutowej inkubacji na lodzie umyć komórki w 10-krotnym nadmiarze sterylnego PBS i ponownie zawiesić osad w pięciu mikrolitrach mikrokulek sprzężonych ze streptawidyną na jedną dziesiątą z sześciu komórek na 30-minutową inkubację na lodzie.

Pod koniec inkubacji dodać do komórek dwie ml buforu PBS i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na osiem minut w temperaturze pokojowej. Gdy mikrokulki przyczepią się do ścianki probówki, ostrożnie przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki i dodaj 2 dodatkowe ml buforu PBS do komórek. Po drugim pobraniu sklarowanego sklarowanego osadu, zebrać połączone komórki przez odwirowanie i przenieść komórki do probówki z polistyrenu o pojemności pięciu ml i świeżego buforu PBS w stężeniu jednej dziesiątej z siedmiu komórek na ml.

Po uformowaniu niespecyficznego blokowania, dodać jeden mikrogram każdego przeciwciała selekcyjnego na jedną dziesiątą z sześciu komórek do probówki, delikatnie mieszając przez 30 minut inkubacji na lodzie. W ciągu ostatnich pięciu minut inkubacji dodaj do komórek pięć mikrolitrów 7-AAD. Następnie dodaj dwa mililitry świeżego PBS do komórek i wiruj przed odwirowaniem.

Ponownie zawiesić granulat w świeżym buforze do sortowania w stężeniu od jednej do pięciu dziesiątych z siedmiu komórek na mililitr i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do nowej pięciomililitrowej rurki polistyrenowej. Następnie posortuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej do trzech probówek o pojemności 15 ml zawierających 5 ml świeżej pożywki RPI, aby zebrać naiwne komórki B, komórki B pamięci i komórki plazmatyczne plazmablastów. Po zebraniu wszystkich komórek należy zasiać podzbiory w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w stężeniu od jednej do dziesięciu dziesiątych piątej komórki na mililitr w świeżej pożywce RPMI.

Następnie aktywuj limfocyty B pięcioma mikrogramami CPG ODN 2006 na jedną dziesiątą szóstej komórki na mililitr na studzienkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez pięć dni. Pod koniec aktywacji dodaj 30 mikrolitrów 35% etanolu i wody destylowanej do każdej studzienki płytek ELISpot na 30 sekund. Następnie zastąp etanol w każdej studzience 150 mikrolitrami autoklawowanej podwójnie destylowanej wody i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby usunąć resztki etanolu.

Wykonaj płukanie PBS, a następnie dodaj 50 mikrolitrów poliklonalnego fragmentu FAB2 anty-ludzkiego IG do każdej studzienki. Umyj płytki dwa razy PBS, jak pokazano. Zablokuj niespecyficzne wiązanie w każdym dołku za pomocą 200 mikrolitrów świeżego PBS z BSA przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Po kolejnej serii płukania PBS inkubuj studzienki w 100 mikrolitrach świeżej pożywki RPMI 1640 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zastąp pożywkę w każdym dołku ELISpot odpowiednią liczbą aktywowanych limfocytów B. Doprowadź końcową objętość każdej studzienki do 150 mikrolitrów świeżą pożywką RPMI, a następnie umieść płytkę ELISpot w inkubatorze do hodowli komórkowych na osiem do 14 godzin.

Pod koniec okresu inkubacji wyrzuć pożywkę i umyj studzienki 200 mikrolitrami PBS plus tween20 przez pięć, trzy minuty płukania. Po ostatnim przemyciu dodać odpowiednie przeciwciała wykrywające do odpowiednich studzienek i inkubować płytki przez dwie godziny w ciemności. Po kolejnej serii mycia PBS dodaj 50 mikrolitrów podłoża BCIPMBT do każdej studzienki przez pięć do 15 minut w temperaturze pokojowej.

Gdy pojawią się fioletowe plamy, zatrzymaj reakcję 100 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody na studzienkę i przepłucz płytkę bieżącą wodą z kranu. Następnie wysuszyć na powietrzu membranę ELISpot chronioną przed światłem. W tej próbce PBMC dawcy, po lizie czerwonych krwinek i wyczerpaniu komórek adherentnych, około 10 procent limfocytów było limfocytami B CD19-dodatnimi.

W przedziale komórek B około 50 procent komórek było naiwnymi komórkami B CD27, a 50 procent miało komórki B pamięci z ekspresją CD27. Leczenie CPG oczyszczonymi ludzkimi komórkami B i CD19 + CD27 + przez pięć dni, jak właśnie wykazano, zwykle powoduje wytworzenie od 50 do 200 komórek wydzielających przeciwciała IgM i 10 do 50 IgG od jednego razy dziesięć do czwartego aktywowanego limfocytu B. Po opanowaniu tej techniki ELISpot można ukończyć w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy pamiętać o zakodowaniu miejsca odpowiednimi odczynnikami wychwytującymi do wykrywania komórek wydzielających przeciwciała. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się wakcynologią do zbadania skuteczności szczepionek w badaniach na dużą skalę i podłużnych badaniach kontrolnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić ludzkie limfocyty B z krwi.

Oddziel naiwne i pamięciowe komórki B w celu ich różnicowania i wykonaj esej ELISpot, aby zakwalifikować komórki wydzielające przeciwciała. Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.