Name: Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji ekspresji genów oraz inwazyjności guza w modelu Drosophila przy użyciu mozaik genetycznych. Protokół umożliwia szczegółową analizę dynamiki klonalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirkowi Bohmannowi, Katji Brückner i Istvanowi Ando za zapasy much i przeciwciała. Dziękujemy Markowi Jindrze i Colinowi Donohoe za komentarze do manuskryptu. Praca ta została wsparta nagrodą Sofja Kovalevskaja Award dla M.U. od Fundacji Alexandra von Humboldta oraz projektem DFG UH243/1-1 dla M.U. od Niemieckiej Fundacji Badawczej.

UWAGA: W tej pracy wykorzystano eyFLP1; act>y+>Gal4, UAS-GFP; FRT82B, tuba-Gal80 MARCM 82B Zielona linia testera 11. Krzyżowanie dziewic testera MARCM 82B Green z samcami szczepów takich jak w; Bezzałogowy statek powietrzny-a; Genotyp mut UAS-bRNAi, FRT82B cda potomstwo, w którym rekombinacja mitotyczna zajdzie między prawymi ramionami 3. chromosomów homologicznych. W ten sposób w obrębie EAD i neuroepithelium mózgu zostaną wygenerowane klony homozygotycznego mutanta genu c zlokalizowanego dystalnie do miejsca FRT82B. Te klony będą eksprymować GFP, transgen a i dsRNA dla genu b (Figura 1A). Stworzono różne linie testerów eyFLP-MARCM do rekombinacji w modelach X, 2L, 2R, 3L i 3R, które są dostępne w społeczności muchowej.
1. Prowadzenie lotu, krzyżowanie i inscenizacja
<ol>
	<li>Rozszerz odpowiedni zapas testera MARCM w temperaturze pokojowej, napełniając wiele butelek w tym samym czasie. Dorosłe osobniki należy przerzucać do świeżych butelek co 2-3 dni, aby można było zebrać wystarczającą ilość dziewic do kolejnych krzyżówek. 
	UWAGA: Podczas zbierania dziewic należy unikać długotrwałego narażenia na CO2 , ponieważ zagraża to płodności kobiet.</li>
	<li>W zależności od skali eksperymentu, należy umieścić krzyżówki muchowe w fiolkach przy użyciu co najmniej 10 dziewic testowych MARCM i 4 samców (np. do obrazowania reporterów fluorescencyjnych i barwienia immunologicznego) lub w butelkach z co najmniej 30 dziewicami i 10 samcami (np. w celu izolacji RNA i ilościowego określenia inwazyjności).</li>
	<li>Wychowywać potomstwo w temperaturze 25 °C w długim dniu trwającym 16 godzin/8 godzin w cyklu jasno-ciemnym. Wkładaj rodziców do nowych fiolek/butelek co 24 godziny, aby ułatwić powtarzalne stadium larw i zapobiec przepełnieniu. 
	UWAGA: Począwszy od 6 dnia po złożeniu jaj (AEL), larwy kontrolne w późnym stadium trzecim przestają żerować, zaczynają wędrować i wchodzą w okres przepoczwarzania. W przeciwieństwie do tego, początek przejścia larwala-poczwarka może być opóźniony lub nie istnieć u larw z EAD z hiperplastycznymi lub złośliwymi guzami klonalnymi.</li>
</ol>
2. Zbieranie larw trzeciego stadium rozwojowego
<ol>
	<li>W celu barwienia immunologicznego zbierz około 20 larw w późnym stadium rozwoju (wędrujących po ścianie i tych o porównywalnej wielkości ciała z pożywienia). Za pomocą kleszczy delikatnie wybierz larwy z fiolki lub butelki i przenieś je do szklanego naczynia z zarodkami wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
	<ol>
		<li>W celu wyizolowania RNA i ilościowego określenia inwazyjności należy zebrać co najmniej 80 larw późnego stadium rozwojowego (wędrujących po ścianie i tych o porównywalnej wielkości ciała z pożywienia). Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby wstrzyknąć PBS do butelki na muchy zawierającej larwy, aż powierzchnia zostanie pokryta.</li>
		<li>Zmiękcz górne warstwy jedzenia szpatułką i wlej zacier spożywczy zawierający larwy na szalkę Petriego. Za pomocą kleszczy delikatnie wybierz larwy i przenieś je do szklanego naczynia z zarodkami wypełnionego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj larwy PBS, aż wszystkie resztki pokarmu zostaną usunięte. Sprawdź larwy pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu od 8 do 16x, aby odrzucić wszystkie "larwy lamparta", które mają losowe plamki GFP dodatnie w całym ciele larwy (Rysunek 2A, 2B i patrz sekcja Dyskusja). 
	UWAGA: W przypadku izolacji RNA należy wykonać przedostatni etap płukania w 70% EtOH przez 1 minutę.</li>
	<li>Umieścić naczynie zawierające wybrane larwy w PBS na lodzie do momentu rozbioru. Przetwarzaj larwy w ciągu 30 minut, aby uniknąć niepożądanych skutków zimna i głodu.</li>
</ol>
3. Sekcja larw
<ol>
	<li>Aby wypreparować EAD pod mikroskopem stereoskopowym, użyj jednej pary kleszczy, aby delikatnie docisnąć środkową część larwy do dna szklanego naczynia. Za pomocą drugich kleszczy chwyć haczyki do ust larw i odciągnij je od ciała (ryc. 2C). 
	UWAGA: Siła ciągnąca jest często wystarczająca do złamania łodyg wzrokowych łączących parę EAD z płatami mózgowymi. Jeśli mózg lub jego części pozostają przyczepione do EAD, a ich obecność nie jest pożądana do dalszych zastosowań, przetnij łodygi wzrokowe za pomocą dwóch par kleszczy. W przypadku nowotworów inwazyjnych (np. rasV12scrib1) związek między EAD a płatami mózgu staje się z czasem coraz bardziej zaciemniony przez przerost i migrację komórek klonalnych.
	<ol>
		<li>Aby przygotować kompleks EAD/mózg z nienaruszonym brzusznym rdzeniem nerwowym (VNC) (ryc. 2D), użyj kleszczy, aby przeciąć larwę w środku ciała. Wyrzuć tylną połowę.</li>
		<li>Przytrzymaj przednią połowę ciała larwy między końcami jednego kleszcza, odwróć larwę na lewą stronę, wciskając haczyki w usta końcówką drugiego kleszcza i tocząc po nim naskórek pierwszą parą kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń wszystkie obce tkanki (np. gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita), pozostawiając parę EAD lub kompleks EAD/mózg połączony z haczykami ustnymi. Rozplątać haczyki ust z leżącego nad nimi naskórka. Uwolnij VNC, przecinając wypustki aksonalne rozciągające się na mięśnie ciała i naskórek (ryc. 1B, 2C, 2D). 
	UWAGA: Haczyki do ust pozwalają na bezpieczne manipulowanie tkanką za pomocą kleszczy oraz ułatwiają sprawniejsze topienie i łatwe rozpoznanie chusteczki podczas mycia. Wypreparowany EAD zmienia morfologię stosunkowo szybko, gdy nie jest utrwalony w PBS. Ogranicz czas preparacji do 20-30 minut.</li>
	<li>Aby przenieść tkankę, pokryj końcówkę mikropipety P20, pipetując pozostałe tusze ciała kilka razy w górę i w dół. Aby przenieść większe kompleksy EAD/mózg, odetnij końcówkę mikropipety P20 nożyczkami. 
	UWAGA: Procedura powlekania ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec przywieraniu i utracie wypreparowanej tkanki podczas transferu. Zastosowanie mikropipety P20 minimalizuje przenoszenie PBS do roztworu utrwalającego, ograniczając niepożądane rozcieńczenie.
	<ol>
		<li>W celu barwienia immunologicznego przenieś wypreparowany EAD do 0,5 ml probówki wypełnionej 400 μl 4% utrwalaczem paraformaldehydu (PFA). Użyj probówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml PFA w przypadku większych kompleksów EAD/mózg przeznaczonych do oceny inwazyjności. 
		UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny. Nosić rękawice i odzież ochronną. Unikać kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi.</li>
		<li>W celu izolacji RNA przenieś wypreparowany EAD do nowego szklanego naczynia wypełnionego zimnym PBS. Użyj kleszczy, aby oczyścić EAD z pierścienia i gruczołów limfatycznych, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbki.</li>
		<li>Odłącz EAD od haczyków do ust, przecinając połączenie między tarczami anteny a haczykami do ust za pomocą kleszczy (Rysunek 2E). Aby uniknąć degradacji RNA i artefaktów ekspresji genów, ogranicz czas sekcji do 30 minut. Przejdź do kroku 7. 
		UWAGA: Doświadczony badacz może wypreparować około 60 larw w ciągu 30 minut, nie licząc czasu potrzebnego na zebranie larw i umycie. Całkowita wydajność RNA zależy od wielkości EAD, która różni się w zależności od genotypu i etapów rozwoju. Rozbior 80-100 par kontrolnych EAD z larw późnego stadium rozwojowego powinien dać 5-8 μg całkowitego RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalanie, barwienie immunologiczne i montaż
<ol>
	<li>Utrwalać próbki w utrwalaczu PFA przez 25 minut, podczas nutowania w temperaturze pokojowej. Czas utrwalenia można wydłużyć do 60 minut bez zmiany morfologii tkanek i antygenowości białek.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć próbki PBST (PBS z 0,1% Triton X-100) trzy razy przez 10 minut za pomocą nutatora. Użyć wystarczającej objętości PBST na każdy etap płukania (tubka 400 μl/0,5 ml). 
	UWAGA: Stałe kompleksy EAD/mózg przeznaczone do oceny inwazyjności nie wymagają barwienia immunologicznego. Sygnał GFP pozostaje dobrze widoczny po fiksacji. Przejdź do kroku 4.4, aby przeprowadzić ostateczną sekcję.
	<ol>
		<li>W celu barwienia immunologicznego należy zablokować tkankę w 200 μl roztworu blokującego (PBST z 0,3% BSA) na 20 minut z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 100 μl roztworu blokującego przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Zapoznaj się z arkuszem danych przeciwciał pierwszorzędowych lub opublikowaną literaturą, aby uzyskać informacje na temat zalecanego rozcieńczania przeciwciał. 
			UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych może wymagać optymalizacji.</li>
			<li>Po pięciu 10-minutowych płukaniach w PBST wybarwić tkankę fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym, delikatnie wstrząsając przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
			<li>Umyć próbki trzy razy po 10 minut w PBST.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp PBST 500 μl roztworu barwiącego DAPI. Aby oznaczyć F-aktynę, dodaj falloidynę sprzężoną z barwnikiem fluorescencyjnym do roztworu barwiącego DAPI. Po 15 minutach nutacji w ciemności myj chusteczkę raz przez 10 minut PBST. 
	UWAGA: Znakowanie F-aktyną można przeprowadzić niezależnie od barwienia DAPI.</li>
	<li>Na ostatnim etapie sekcji przenieś tkankę z powrotem do szklanego naczynia wypełnionego PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Za pomocą dwóch par kleszczy odetnij haczyki do ust.
	<ol>
		<li>Oddziel mózgi, które zostaną użyte do ilościowego określenia inwazyjności, od EAD poprzez przecięcie łodygi wzrokowej, ponieważ przerośnięte EAD może utrudnić analizę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kroplę podłoża montażowego (15 μl dla szkiełka nakrywkowego 22 mm x 22 mm) na szkiełku obiektywowym. Za pomocą końcówek kleszczy rozprowadź podłoże cienką warstwą. Przenieść EAD, mózgi lub kompleksy EAD/mózg do podłoża mocującego za pomocą mikropipety P20.</li>
	<li>Użyj końcówek kleszczy lub pręta wolframowego, aby rozprowadzić tkankę i wyprostować VNC na szkiełku.</li>
	<li>Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas montażu, należy najpierw przyłożyć jedną krawędź szkiełka nakrywkowego do podłoża montażowego, a następnie powoli opuścić na podłoże montażowe za pomocą kleszczy. Użyj małych kawałków bibuły filtracyjnej lub chusteczki higienicznej, aby wchłonąć nadmiar materiału montażowego wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA: Podłoże montażowe DABCO/Polis (alkohol winylowy) 4-88 twardnieje w temperaturze 4 °C w ciągu godziny. Szkiełka można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Uzyskuj pojedyncze sekcje i stosy konfokalne za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy olejowe 20X, 40X i 60X.</li>
	<li>Zapobiegaj nasyceniu pikseli. Użyj tych samych parametrów akwizycji obrazu, w tym rozdzielczości obrazu, mocy wejściowej lasera, wzmocnienia, przesunięcia, uśredniania klatek, rozmiaru kroku w serii Z i zachowaj te ustawienia dla wszystkich genotypów, aby umożliwić porównanie intensywności pikseli między różnymi genotypami 21,22. 
	UWAGA: Aby zobrazować kompleks EAD/mózg, wygeneruj maksymalne projekcje i zszyj odpowiednie, sąsiednie obrazy. Aby uzyskać ostateczny obraz przygotowany, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu końcowego do montażu paneli oraz do regulacji jasności i kontrastu.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja inwazyjności nowotworów
<ol>
	<li>Zdefiniuj system punktacji, który scharakteryzuje różne poziomy inwazyjności guza, biorąc pod uwagę przestrzenny wzorzec inwazji i ilość komórek GFP-dodatnich rozprzestrzeniających się do mózgu i VNC. Przygotuj arkusze oceny do dokumentacji (rysunek 3A).</li>
	<li>Na jednym szkiełku podstawowym zamontować co najmniej 80 nienaruszonych mózgów dla każdego genotypu, używając 40 μl podłoża mocującego na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm.
	<ol>
		<li>Aby umożliwić bezstronną ocenę, poproś neutralną stronę o anonimizację slajdów, tak aby procedura punktacji była bezstronna. Oceniaj anonimowe slajdy przez dwóch członków laboratorium niezależnie. Genotypy należy ujawnić dopiero po zakończeniu liczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń stopień złośliwości poprzez ślepą ocenę zamontowanych mózgów pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w zestaw filtrów GFP. Użyj markera, aby oznaczyć mózgi, które zostały już obejrzane, aby uniknąć podwójnego liczenia (Rysunek 3B).</li>
	<li>Oblicz odsetek mózgów należących do każdej ze zdefiniowanych kategorii inwazyjnych na genotyp. Określ istotność statystyczną za pomocą testu chi-kwadrat (rysunek 3C).</li>
</ol>
7. Izolacja RNA, obróbka DNaza i kontrola jakości
UWAGA: Wszystkie odczynniki (roztwory, tworzywa sztuczne) użyte w poniższych krokach powinny być wolne od aktywności RNazy. Zawsze noś rękawice i używaj kaptura chemicznego do pracy z rozpuszczalnikami organicznymi.
<ol>
	<li>Przenieś czysty EAD z powlekaną końcówką do mikropipety P20 do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Pozwól tkance opaść na dno probówki, ostrożnie usuń PBS i zastąp go 100 μl odczynnikiem do lizy RNA (wystarczającym do 140 EAD).</li>
	<li>Lizuj tkankę przez wirowanie. Na tym etapie próbki mogą być głęboko zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przetworzone przy użyciu standardowego protokołu izolacji RNA. 
	UWAGA: Próbki podobnych genotypów z wielu rund preparacyjnych można jednorazowo połączyć w odczynniku do lizy RNA.</li>
	<li>Wypełnić objętość próbki do 0,9 ml odczynnikiem do lizy RNA. Dodać 0,2 ml chloroformu i energicznie mieszać próbki przez 15-20 sek.</li>
	<li>Po 2-3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść bezbarwną górną górną fazę wodną zawierającą RNA do świeżej probówki bez zakłócania interfazy. Trzymaj się z dala od interfazy, ponieważ zawiera ona białka i genomowe DNA. 
	UWAGA: Odzyskana objętość powinna wynosić około 60% objętości odczynnika do lizy RNA użytego do homogenizacji.</li>
	<li>Wytrącić RNA, dodając 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Wirować i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA jednorazowo 600 μl 75% etanolu. Po krótkim wirowaniu i odwirowaniu (10 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C) wyrzuć cały etanol i pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu przez 5-10 minut, umieszczając otwartą probówkę na czystej chusteczce. 
	UWAGA: Osad RNA może być widoczny jako mały nieprzezroczysty/biały pasek na dnie probówki lub niewidoczny. Pozostałe krople etanolu można ostrożnie usunąć za pomocą końcówki do mikropipet P10.</li>
	<li>Rozpuść RNA w 50 μl wody uzdatnionej DEPC, kilkakrotnie przepuszczając roztwór przez końcówkę pipety.</li>
	<li>Aby zminimalizować zanieczyszczenie genomowym DNA, należy potraktować całkowite RNA DNazą, dodając 50 μl mieszaniny zawierającej 1 μl DNazy (2 U/μl) i 10 μl 10-krotnego buforu DNazy w wodzie uzdatnionej DEPC. Wiruj i zakręć w dół.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym przez 30–40 minut. Po inkubacji dodać 100 μl wody uzdatnionej DEPC do każdej próbki.</li>
	<li>Aby dezaktywować aktywność enzymatyczną i oczyścić RNA z DNazy, dodać 200 μl roztworu fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1), wirować przez 1 minutę i odwirować próbki przy 10 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś górną fazę wodną zawierającą RNA do świeżej probówki. Dodać równą objętość (200 μl) chloroformu, wymieszać i powtórzyć etap wirowania od góry.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać górną fazę i wytrącić RNA, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 przygotowanym w DEPCH2Oi 2,5 objętości 100% etanolu. Dokładnie wymieszać przez wirowanie. 
	UWAGA: Dodanie 0,5 μl glikogenu (20 μg/μl) do mieszanki strącającej pomaga uwidocznić osad RNA. Aby zminimalizować utratę RNA, należy używać silikonowanych, słabo wiążących probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wytrącać RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godz. 
	UWAGA: Inkubację można przeprowadzić przez noc. Próbki można również umieszczać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Osad RNA przez odwirowanie w stężeniu 10 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Umyć i wysuszyć osad zgodnie z opisem w ppkt 7.9.</li>
	<li>Rozpuść RNA w 10-15 μl wody uzdatnionej DEPC. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określić ilość i czystość RNA, mierząc OD przy 230 nm, 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru. Obliczyć stężenie RNA, stosując konwencję, że 1 OD przy 260 nm równa się 40 μg/ml RNA. 
	UWAGA: Stosunek A260/280 "czystego" RNA wynosi 2,0, podczas gdy stosunek A260/230 powinien mieścić się w zakresie 2,0-2,2. Próbki RNA o stosunku A260/280 między 1,7 a 2,0 nadają się do dalszych zastosowań, takich jak synteza cDNA. W celu przygotowania bibliotek sekwencyjnych mRNA, jakość i ilość RNA powinna być sprawdzana za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy. Stosunek 28S/18S powinien wynosić powyżej 1,8.</li>
</ol>

<ol><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%3A+a+bold+past%2C+a+bright+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+How+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPagliarini%2C+RA+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22">Science (New York, NY)</a>. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).</li>
<li>Turkel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BTB-zinc+finger+transcription+factor+abrupt+acts+as+an+epithelial+oncogene+in+Drosophila+melanogaster+through+maintaining+a+progenitor-like+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state.</a> PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+Diverts+a+Host+TNF+Tumor+Suppressor+Activity+into+Tumor+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Drosophila%2C+RhoGEF2+cooperates+with+activated+Ras+in+tumorigenesis+through+a+pathway+involving+Rho1-Rok-Myosin-II+and+JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling.</a> Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).</li>
<li>Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sds22%2FPP1+links+epithelial+integrity+and+tumor+suppression+via+regulation+of+myosin+II+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling.</a> Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Drosophila+Tumors+Interrupt+Insulin+Signaling+to+Induce+Cachexia-like+Wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting.</a> Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127 (4), 851-860 (2000).</li>
<li>Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+of+the+eyeless+gene+of+Drosophila+to+the+Small+eye+gene+in+mice+and+Aniridia+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans.</a> Science. 265 (5173), 785-789 (1994).</li>
<li>Külshammer, E., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cross-linker+Filamin%2FCheerio+mediates+tumor+malignancy+downstream+of+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).</li>
<li>Külshammer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+among+Drosophila+transcription+factors+Ets21c%2C+Fos+and+Ftz-F1+drives+JNK-mediated+tumor+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).</li>
<li>Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+immune+response+of+blood+cells+to+tumors+and+tissue+damage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).</li>
<li>Chatterjee, N., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+%CE%A6C31+based+reporter+system+for+measuring+AP-1+and+Nrf2+signaling+in+Drosophila+and+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture.</a> PloS One. 7 (4), e34063(2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Andersen, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TNF+receptor+Grindelwald+couples+loss+of+cell+polarity+and+neoplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth.</a> Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).</li>
<li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).</li>
<li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).</li>
<li>Mirth, C. K., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+body+and+organ+size+in+Drosophila%3A+recent+advances+and+outstanding+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems.</a> Front Endocrinol. 3 (49), (2012).</li>
<li>French, V., Feast, M., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+size+and+cell+size+in+Drosophila%3A+the+developmental+response+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature.</a> J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).</li>
<li>Ashburner, M., Bonner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+gene+activity+in+drosophila+by+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of gene activity in drosophila by heat shock.</a> Cell. 17 (2), 241-254 (1979).</li>
<li>Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effects+of+rearing+temperature+and+oxygen+on+the+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Biochem+Zool%22%5BJournal%5D)">Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster.</a> Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li>
<li>Rynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Transcription+Factor+3+Regulates+Immune+and+Metabolic+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis.</a> Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).</li>
<li>Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Techniki generowania mozaik genetycznych u Drosophila należą do najbardziej wyrafinowanych narzędzi do analizy i manipulowania funkcją genów 33. System eyFLP-MARCM okazał się skuteczny i wytrzymały, ponieważ umożliwia indukcję wizualnie oznaczonych, zdefiniowanych genetycznie klonów w sposób ograniczony przestrzennie, tj. w tkankach, w których aktywny jest wzmacniacz bezoczny 9,18. Jest to szczególnie ważne, gdy wiele zmian genetycznych jest połączonych w tych samych komór...

Rak stanowi jedną z najbardziej genetycznie niejednorodnych grup chorób, której częstość występowania i śmiertelność dramatycznie wzrasta, szczególnie wśród osób starszych na całym świecie. Rak powstaje klonalnie z komórki inicjującej nowotwór, która wymyka się nieodłącznym mechanizmom supresorowym guza i dzieli się w sposób niekontrolowany. Stopniowa akumulacja zmian genetycznych, które wspólnie promują wzrost, proliferację i ruchliwość, jednocześnie hamując śmierć i różnicowanie, przekształca początkowy łagodny przerost w wysoce złośliwy, przerzutowy i śmiertelny nowotwór. Stało się oczywiste, że oprócz zmian genetycznych, progresja guza wymaga zmian w otaczającym zrębie i przesłuchu między guzem a wieloma typami komórek (np. fibroblastami, komórkami odpornościowymi i śródbłonka) w jego mikrośrodowisku. Zrozumienie zasad molekularnych leżących u podstaw przemian nowotworowych, w tym interakcji między nowotworem a zrębem, ma ogromne znaczenie dla opracowania strategii profilaktyki i wczesnych badań przesiewowych, a także nowych i skutecznych metod leczenia przerzutów raka i oporności na leki.
Muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się atrakcyjnym systemem do badań nad rakiem 1-4 dzięki szybkiemu czasowi generacji, niezwykłemu zachowaniu węzłów sygnałowych między muchami a ludźmi, ograniczonej redundancji genetycznej i bogactwu zaawansowanych narzędzi genetycznych, które ułatwiają manipulację prawie każdym genem w sposób tymczasowo i przestrzennie ograniczony. Genetycznie zdefiniowane nowotwory o różnym złośliwym stopniu złośliwości mogą być odtwarzalnie modyfikowane u Drosophila poprzez wprowadzenie mutacji powodujących przyrost i utratę funkcji w podzbiorze komórek progenitorowych w tkance typu dzikiego przy użyciu techniki MARCM 5. Narzędzie MARCM łączy rekombinację mitotyczną za pośrednictwem FLP/FRT (rekombinaza FLP/FLP Recognition Target) 6 z docelowymi systemami ekspresji genów FLP-out 7 i Gal4/UAS (Upstream Activation Sequence) 8 9. Dzięki tej metodzie ekspresja dowolnego transgenu opartego na UAS, w tym onkogenu lub białka fluorescencyjnego cDNA lub powtórzeń odwróconego DNA w celu wyciszenia genów indukowanego przez dsRNA, zostanie ograniczona do klonu komórek, które utraciły określone locus genetyczne i represor Gal4 w wyniku rekombinacji (Figura 1A). Plamy klonalne oznaczone białkami zielonej fluorescencji (GFP) lub czerwonej fluorescencji (np. RFP, DsRed, mCherry) można łatwo śledzić przez cały okres rozwoju, izolować i analizować. Co ważne, ich zachowanie można bezpośrednio porównać do sąsiedniej tkanki typu dzikiego. W ten sposób można wygodnie badać pytania dotyczące autonomicznych i nieautonomicznych skutków zmian genetycznych w komórkach. Podobnie jak w przypadku ssaków, tylko klony, w których łączy się wiele zmian onkogennych, stają się złośliwe u Drosophila i przypominają kluczowe cechy raka ssaków. Nadmiernie się namnażają, unikają apoptozy, wywołują stany zapalne, stają się nieśmiertelne i inwazyjne, ostatecznie zabijając gospodarza 10-17.
Tutaj opisujemy protokół generowania genetycznie zdefiniowanych guzów klonalnych w tkance oka/czułka i mózgu larw Drosophila za pomocą techniki MARCM. Metoda opiera się na wyrobie testera MARCM, który wyraża drożdżową rekombinazę FLP pod kontrolą wzmacniacza bezocznego (eyFLP) 18,19. W ten sposób klony znakowane GFP są generowane zarówno w nabłonku okołopodniowym, jak i walcowatym EAD oraz w neuroepithelium mózgu w stadiach embrionalnych i larwalnych (ryc. 1A, B i odniesienie 20). Klony można łatwo śledzić aż do osiągnięcia dorosłości, ponieważ EAD rozwija się w dorosłe oko, antenę i torebkę głowy, podczas gdy nabłonek nerwowy powoduje powstawanie neuroblastów, które wytwarzają zróżnicowane neurony płata wzrokowego.
Aby ułatwić obszerną molekularną, funkcjonalną i fenotypową charakterystykę tkanki mozaiki, opisujemy protokół preparacji EAD i mózgu od larw trzeciego stadium rozwojowego i nakreślamy, jak je przetwarzać dla trzech różnych zastosowań: (i) wykrywanie transgenicznych reporterów fluorescencyjnych i barwienie immunologiczne, (ii) kwantyfikacja inwazyjności guza oraz (iii) analiza zmian ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) lub wysokoprzepustowe sekwencjonowanie mRNA (sekwencjonowanie mRNA) (Figura 1C).
Protokół barwienia immunologicznego może być wykorzystany do wizualizacji dowolnego interesującego białka z określonym przeciwciałem. Transgeniczne fluorescencyjne reportery transkrypcyjne dostarczają wygodnych i precyzyjnych informacji czasoprzestrzennych na temat aktywności określonego szlaku sygnałowego. Z drugiej strony reportery specyficzne dla linii komórkowej odzwierciedlają jakościowe i ilościowe zmiany w populacjach komórek w tkance mozaiki i wśród nowotworów o różnych genotypach. Kwantyfikacja zachowań inwazyjnych ułatwia porównanie złośliwości nowotworu między genotypami. Wreszcie, protokół opisujący pobieranie i przetwarzanie mozaikowego EAD do izolacji RNA jest odpowiedni zarówno do małych, jak i dużych zastosowań downstream, takich jak odwrotna transkrypcja, a następnie qRT-PCR i sekwencjonowanie mRNA całego genomu. Dane jakościowe i ilościowe uzyskane z tych testów dostarczają nowych informacji na temat zachowań społecznych nowotworów klonalnych. Co więcej, stanowią one solidną podstawę do badań funkcjonalnych nad rolą poszczególnych genów, sieci genetycznych i mikrośrodowiska nowotworu w różnych stadiach i aspektach nowotworzenia.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&uuml; rzm&uuml; hle, Eggenstein, Niemcy</td><td>00262-0500</td><td>Przepis na pokarm dla much: Przygotuj 20 l pokarmu na muchy ze 160 g agaru, 360 g drożdży, 200 g mąki sojowej, 1,6 kg żółtej mąki kukurydzianej, 1,2 l ekstraktu słodowego, 300 ml jasnego syropu kukurydzianego, 130 ml kwasu propionowego i 200 ml 15% nipaginy. Pokarm dla much powinien być gotowany przez 1 godzinę w temperaturze 85&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Syrop kukurydziany</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Niemcy</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Reforma mąki kukurydzianejKontor</td><td>GmbH, Zarrentin, Niemcy</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt słodowy</td><td>CSM Deutschland GmbH, Brema, Niemcy</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Mąka sojowa</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Niemcy</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Niemcy</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-4-benzoesan / Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>H5501</td><td>Przygotuj 15% roztwór podstawowy z 70% EtOH</td></tr><tr><td>Fiolki z pokarmem dla much Drosophila</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Niemcy</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczki do fiolek</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Niemcy</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Butelki na pokarm dla muchy Drosophila</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Korki do butelek</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Niemcy</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy) 4-88/[-CH2CHOH-]n</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>81381</td><td>Przepis na podłoże montażowe: Rozpuść 6 g poli(alkoholu winylowego) 4-88 w 39&nbsp; ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) i 12,5 ml glicerolu. Mieszać przez noc w temperaturze 50&nbsp; &deg; C i wirówka 20&nbsp; min przy 5,000 obr./min. Dodaj DABCO do supernatantu, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5%. Przechowuj porcje na poziomie -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan/ DABCO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 oraz 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 w Millipore H2O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Triton X-100 w PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd / PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>158127</td><td>Przepis utrwalacza 4% PFA: Rozpuścić 4&nbsp; g PFA w 80 ml Millipore H2O na mieszadle magnetycznym podgrzanym do 55&nbsp; &deg;C. Dodawać kroplami 1 M NaOH, aż wszystkie cząstki PFA się rozpuszczą. Dodać 10 ml 10x PBS i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl. Wymieszać w 100 &mikro; l Triton X-100 i napełnić Millipore H2O do 100 ml. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Unikać wielokrotnego rozmrażania. (UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny. Przygotuj utrwalacz PFA w dygestorium. Nosić niezależny aparat oddechowy, rękawice i odzież. Unikać kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi.)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej / BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>A3059</td><td>Przepis na roztwór blokujący: Rozpuść 0,3% BSA w PBST</td></tr><tr><td>Fluorescencyjnie znakowana falloidyna</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy, Sondy molekularne</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Roztwór podstawowy falloidyny: Rozpuść proszek (300 U) w 1,5 ml metanolu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Do barwienia stosować w rozcieńczeniu 1:250 (A12379, A22283) i 1:100 (A22284) w PBST.</td></tr><tr><td>Dihydrochlord 4',6-dimidino-2-fenylindoldol/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6335</td><td>Roztwór barwiący DAPI: Przygotować roztwór podstawowy 5 mg/ml w Millipore H2O i przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C. Stosowany w rozcieńczeniu 1:1 000 w PBST.</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-H2</td><td>Kurucz i wsp., 2003</td><td></td><td>Stosowane w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Wielka Brytania</td><td>715-175-151</td><td>Stosowane w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynie na zarodki (30&nbsp; mm)</td> <td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt na szpilki</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 50 mm (0,13-0,16&nbsp; mm)</td> <td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne Kimtech Science</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Preparacyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus, Hamburg, Niemcy</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japonia)</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny</td><td>Olympus, Hamburg, Niemcy</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0,8X Japonia) z kamerą</td> <td>CCD DP72Wyposażony w zestaw filtrów wąskopasmowo-przepustowych niebieskich do wzbudzania GFP, innych fluorochromów pobudliwych na niebiesko (filtr wzbudzenia BP460-480 nm, filtr barierowy BA495-540 nm) oraz wąski zielony filtr barierowy wzbudzenia i długoprzepustowego dla RFP i innych fluorochromów pobudliwych na zielono (filtr wzbudzenia BP530-550, filtr barierowy BA575IF). Oprogramowanie: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus, Hamburg, Niemcy</td><td>FV1000</td><td>Wyposażony w odwrócony mikroskop IX81. Cele: 20 razy; UPlan S-Apo (NA 0,85), 40 i razy; UPlanFL (NA 1.30) oraz 60& razy; UPlanApo (NA 1.35). Lasery: Laser UV Dioda LD405 (50&nbsp; mW), Laser argonowy, wieloliniowy 457/(476)/ 488/515 (40&nbsp; mW), żółto-zielona dioda laserowa LD560 (15&nbsp; mW) i czerwoną diodą laserową 635 (20&nbsp; mW). Oprogramowanie: Fluoview 2.1c Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Inkubator z chłodzeniem Drosophila</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Niemcy</td><td>&nbsp; Butelka Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Squirt</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>Mikser nutatorów BD Clay Adams</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa wytrząsarka kołysana ELMI</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Odczynnik do lizy izol-RNA</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>2302700</td><td>Protokół jest kompatybilny z innymi odczynnikami na bazie TRIzolu, np. , TRIreagent firmy Sigma (Cat. Nr.T9424), odczynnik TRIzol firmy Thermofisher (nr kat. 15596).</td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu / DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>D5758</td><td>Rozcieńczyć DEPC 1:1,000 w miliporze H2O, mieszać przez noc i autoklawować.</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNaza (2 U/&mikro; l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodny octan sodu</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>27652.232</td><td>Przygotować 3 M roztwór octanu sodu z DEPC-H2O i dostosować pH do 5,2</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td></td><td></td>109634</tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>100983</td><td>Przygotować 75% rozcieńczenie EtOH za pomocą DEPC-H2O.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf (z chłodzeniem)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowana stacja elektroforezy Experion</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgia</td><td></td><td>Prepare 100 &micro; M roztwory podstawowe w DEPC-H2O i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>dNTP Mieszanina</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Francja</td><td>4030</td><td>Przechowuj porcje po 25 &mikro; l przy -20&deg; C</td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Płytki PCR z twardą skorupą 96-dołkowe, cienkościenne</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Film</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>rp49 Starter do przodu</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgia</td><td></td><td>5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'</td></tr><tr><td>rp49 Podkład odwrotny</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgia</td><td></td><td>5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Starter do przodu</td><td>Zintegrowane technologie DNA, Leuven, Belgia</td><td></td><td>5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Podkład odwrotny</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgia</td><td></td><td>5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'</td></tr></tbody></table>

model guza dysku imaginalnego drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster pojawiła się jako potężny eksperymentalny system do funkcjonalnych i mechanistycznych badań rozwoju i progresji guza w kontekście całego organizmu. Zaawansowane techniki generowania mozaik genetycznych ułatwiają indukcję wizualnie oznaczonych, genetycznie zdefiniowanych klonów otoczonych normalną tkanką. Klony mogą być analizowane za pomocą różnych podejść molekularnych, komórkowych i omicznych. W badaniu tym opisano, w jaki sposób generować znakowane fluorescencyjnie guzy klonalne o różnym złośliwym nachyleniu w krążkach imaginalnych oka/czułków (EAD) larw Drosophila przy użyciu techniki analizy mozaikowej z represyjnym markerem komórkowym (MARCM). Opisano w nim procedury, w jaki sposób odzyskać mozaikę EAD i mózg od larw oraz jak je przetworzyć w celu jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnych reporterów transgenicznych i barwienia przeciwciałami. Aby ułatwić charakterystykę molekularną tkanki mozaikowej, opisujemy protokół izolacji całkowitego RNA z EAD. Procedura preparacji jest odpowiednia do odzyskania EAD i mózgu z dowolnego stadium larwalnego. Protokół utrwalania i barwienia dysków wyobrażeniowych współpracuje z wieloma transgenicznymi reporterami i przeciwciałami, które rozpoznają białka Drosophila. Protokół izolacji RNA można zastosować do różnych narządów larwalnych, całych larw i dorosłych much. Całkowite RNA można wykorzystać do profilowania zmian ekspresji genów przy użyciu metod kandydujących lub obejmujących cały genom. Na koniec szczegółowo opisujemy metodę ilościowego określania inwazyjności guzów klonalnych. Chociaż metoda ta ma ograniczone zastosowanie, jej podstawowa koncepcja ma szerokie zastosowanie w innych badaniach ilościowych, w których należy unikać błędów poznawczych.

Aby zademonstrować potencjał techniki eyFLP-MARCM w generowaniu oznakowanych GFP obszarów o określonych genotypach w EAD Drosophila, indukowano trzy typy klonów: (1) kontrolne wykazujące ekspresję wyłącznie GFP, (2) guzy złośliwe wykazujące ekspresję onkogennej formy małego białka G Ras (RasV12) na tle homozygotycznej utraty genu supresora nowotworowego scribble (scrib1) oraz (3) klony rasV12scrib1jnkDN ...

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zademonstrowanie sposobu preparowania tarczek imaginalnych oka i czułka oraz mózgów muszki owocówki drosophila, zawierających genetycznie zdefiniowane, znakowane fluorescencyjnie klony, a także metod ich przetwarzania w celu wizualizacji i kwantyfikacji zmian w ekspresji genów oraz inwazyjności komórek. Opisane procedury mogą pomóc w uzyskaniu nowych informacji na temat roli genów w rozwoju nabłonkowym, homeostazie lub chorobach, a także w analizie mechanizmów leżących u podstaw konkurencji komórkowej, proliferacji kompensacyjnej lub współpracy międzyklonalnej. Główną zaletą niniejszego opracowania jest dostarczenie pełnego zestawu protokołów dostosowanych do szczegółowej analizy ilościowej i jakościowej mozaik genetycznych drosophila.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z modelem Drosophila mają trudności z odróżnieniem oczno-antenalnego krążka przeciwstawnego od innych krążków przeciwstawnych. Aby ułatwić rozpoznanie oczno-antenalnego krążka przeciwstawnego z fluorescencyjnie znakowanymi klonami w ciele larwy, zaleca się przeprowadzanie wstępnych sekcji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Analiza mozaikowa z represyjnym markerem komórkowym (MARCM) umożliwia generowanie genetycznie określonych płatów klonalnych w kontekście fenotypowo w innym przypadku typu dzikiego.FLP pod wpływem promotora eyeless katalizuje rekombinację między dwoma elementami FRT flankującymi kasetę stop oznakowaną genem yellow. Po replikacji DNA FLP katalizuje wymianę chromatyd niesiostrzanych między chromosomami homologicznymi, tworząc chromatydy siostrzane: jedna niesie allel typu dzikiego oraz represor Gal80, a druga allel zmutowany.W procesie mitozy rozdzielają się one, tworząc dwie komórki potomne: jedną homozygotyczną mutant i drugą typu dzikiego. Utrata represora Gal80 umożliwia ekspresję GFP w mutancie, podczas gdy komórki typu dzikiego pozostają negatywne pod kątem GFP. Aby rozpocząć eksperyment, należy zebrać mozaikowe larwy, wtryskując PBS do butelki z muchami tak, aby pokryć powierzchnię pożywki.Następnie rozluźnij wierzchnią warstwę za pomocą szpatułki i przelej zawiesinę pokarmową zawierającą larwy do szalki Petriego. Delikatnie wyłów larwy i przenieś je do naczynia do embrionów wypełnionego roztworem PBS. Zbierz co najmniej 20 larw do immunostainingu oraz 80 larw do ilościowego oznaczenia inwazyjności guza.Przemyj larwy roztworem PBS, aby usunąć wszelkie resztki pokarmu. Używając fluorescencyjnego stereomikroskopu przy powiększeniu 8,16x, zidentyfikuj i odrzuć wszystkie larwy typu „leopard” – są to te wykazujące przypadkowe plamki GFP-dodatnie w całym ciele. Umieść płytkę zawierającą pozostałe larwy w PBS na lodzie do czasu przeprowadzenia sekcji.Aby wypreparować tarczę imaginalną oka i czułki pod mikroskopem stereoskopowym, należy użyć jednej pary pęsety i delikatnie chwycić larwę w odległości około 2/3 długości ciała od strony tylnej względem głowy. Drugą parą pęsety należy uchwycić haczyki gębowe larwy i odciągnąć je od ciała. Za pomocą pęsety należy oddzielić haczyki gębowe od nakładającej się kutykuli oraz tkanek zbędnych, takich jak gruczoły ślinowe i ciało tłuszczowe.Alternatywnie, aby przygotować kompleks mózgu i krążków oka i anteny, zachowując nienaruszony brzuszny sznur nerwowy, należy za pomocą pęsety przeciąć larwę w połowie ciała. Odrzuć tylną część. Przytrzymaj przednią część ciała larwy końcówkami jednej pęsety, a następnie wywiń larwę na drugą stronę, wpychając haczyki gębowe do wewnątrz końcówką drugiej pęsety i przetaczając kutykulę za pomocą pierwszej pęsety.Ostrożnie usuń wszystkie zbędne tkanki, w tym jelito, ciało tłuszczowe i gruczoły ślinowe. Delikatnie odsuń haczyki gębowe od kutykuli. Uwolnij kompleks mózgu i krążka oczno-antenalnego przytwierdzony do haczyków gębowych poprzez przecięcie projekcji aksonalnych biegnących od brzusznego sznura nerwowego do mięśni i naskórka.Aby przenieść tkankę, najpierw pokryj końcówkę mikropipety P20, pipetując pozostałe kadłuby ciał kilkukrotnie w górę i w dół, a następnie użyj tej samej końcówki do przeniesienia wypreparowanej tkanki. W celu przeniesienia większych kompleksów mózgu i dysków oczno-antenalnych, wcześniej przytnij końcówkę P20, aby powiększyć otwór. Utrwal próbki w 400 µL utrwalacza 4% PFA przez 25 minut w temperaturze pokojowej podczas nutacji.Następnie usunąć utrwalacz i przemyć próbki PBST trzy razy po 10 minut w warunkach nutacji. Kolejno zastąpić PBST 500 µL roztworu barwiącego DAPI i inkubować przez 15 minut w ciemności w warunkach nutacji. Przemyć tkankę raz przez 10 minut przy użyciu PBST.Aby zakończyć sekcję, należy użyć pipety o objętości 1 ml, aby przenieść tkankę z powrotem do szklanego naczynia wypełnionego PBS. Używając dwóch par pęset, należy oddzielić mózgi przeznaczone do kwantyfikacji inwazyjności od dysków oczno-antenalnych poprzez odcięcie szypułek optycznych. Dyski oczno-antenalne należy uwolnić, odcinając je od haczyków gębowych.Nanieś kroplę medium montażowego na szkiełko przedmiotowe i za pomocą pęsety rozprowadź płyn w cienką warstwę. Aby określić stopień inwazyjności, umieść co najmniej 80 utrwalonych, nienaruszonych mózgów dla każdego genotypu na jednym szkiełku. Wyprostuj i ustaw tkankę według uznania.Delikatnie dotknij jedną krawędzią szkiełka nakrywkowego medium i powoli opuść je za pomocą pęsety, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonąć nadmiar medium montażowego z krawędzi. Tkankę można teraz badać za pomocą obrazowania konfokalnego.Poproś neutralną osobę o zanonimizowanie preparatów, aby ocena była bezstronna. Następnie poddaj preparaty niezależnej ocenie przeprowadzanej przez co najmniej dwóch badaczy. Genotypy ujawnij dopiero po zakończeniu oceny.Oceń stopień złośliwości pod fluorescencyjnym stereomikroskopem wyposażonym w zestaw filtrów GFP. Użyj znacznika do oznaczenia mózgów, które zostały już obejrzane, aby uniknąć podwójnego liczenia. Fluorescencyjne obrazy konfokalne przedstawiają mózgi wypreparowane z larw z złośliwymi, GFP-znakowanymi guzami klonalnymi mutantu scribble RAS V12, barwionymi DAPI.Panele przedstawiają cztery różne stopnie inwazyjności guza. Obiektywna kwantyfikacja wykazała, że hamowanie sygnalizacji JNK oraz klony RAS V12 scribbled one tłumiły inwazyjność guza. W kontrolnych tarczach oczno-antenalnych reporter TRE-DsRED, wrażliwy na JNK, znakuje jedynie wąski pas komórek biegnący od części antenalnej do części ocznej.W przeciwieństwie do tego, aktywność TRE-DsRED była wyraźnie zwiększona w złośliwych guzach klonalnych wykazujących pozytywny wynik dla GFP. W 8. dniu komórki nowotworowe przerosły krążki oko-antenalne i rozprzestrzeniły się na brzuszny sznur nerwowy. Infiltrujące komórki nowotworowe wykazywały również zwiększoną aktywację JNK w porównaniu z otaczającą tkanką.Podczas gdy blokowanie JNK wyraźnie zmniejszyło aktywność TRE-DsRED w klonach nowotworowych, zwiększenie intensywności lasera ujawniło nasilenie sygnału w komórkach nabłonkowych sąsiadujących z klonami. Dodatkowo reporter hemolectin delta DsRED wykazał, że w przeciwieństwie do kilku skupisk hemocyt znajdujących się w wgłębieniach nabłonka oka i anteny w grupie kontrolnej, hemocyty gromadziły się w tkance oka, anteny i mózgu składającej się z nowotworów złośliwych. Po zahamowaniu JNK liczba powiązanych komórek odpornościowych gwałtownie spadła.Zwiększona inwazyjność guza, aktywność JNK oraz naciek hemocytów były z towarzyszącą im znaczną nadekspresją mRNA MMP1, co określono za pomocą QRTPCR z wykorzystaniem całkowitego RNA wyizolowanego z wypreparowanych mozaikowych krążków oko-antenalnych. Po opanowaniu techniki, w ciągu 30 minut można wypreparować ponad 60 par krążków ocznych i mózgów. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wyhodowaniu odpowiedniej liczby larw o pożądanych genotypach.Podczas przeprowadzania sekcji należy działać szybko, lecz precyzyjnie, aby próbki przeznaczone do izolacji RNA pozostały wolne od RNaz. Po przeprowadzeniu procedury sekcji można zastosować western blot jako alternatywę dla immunobarwienia w celu oceny zmian w ekspresji białek pomiędzy różnymi genotypami. Tworzenie mozaik genetycznych i analiza z zastosowaniem opisanych procedur umożliwia badania nad mutacjami, które w innym przypadku byłyby letalne, a także nad mechanizmami współpracy onkogenów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić sekcję tkanek mozaikowych krążka oko-antenalnego oraz mózgu larw trzeciego stadium oraz jak przygotować je do immunobarwienia, wizualizacji aktywności transgenicznej i reporterowej, ekstrakcji RNA oraz ilościowej oceny inwazyjności.Należy pamiętać, że PFA, fenol-chloroform oraz DAPI są wysoce toksyczne i podczas pracy z tymi odczynnikami zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic ochronnych i odzieży ochronnej.

the-drosophila-imaginal-disc-tumor-model-visualization-quantification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Współpraca między aktywowanym onkogenem, takim jak RASV12, a mutacjami w genach polaryzacji komórek, takimi jak bazgroły, powoduje wzrost guza u Drosophila, gdzie komórki nowotworowe również wykazują inwazyjne zachowania. W tym miejscu przedstawiono prosty protokół indukcji i obserwacji nowotworów łagodnych i inwazyjnych.

Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

Analiza klonów mozaiki w nabłonku dysku imaginalnego Drosophila to potężny system modelowy do badania genetycznych i komórkowych mechanizmów nowotworzenia. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji guzów w dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS i wprowadzamy metodę diagnozy w celu klasyfikacji fenotypów guza.

Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Ten protokół dostarcza szczegółowych wskazówek dotyczących początkowej i kontynuowanej pokoleniowej allotransplantacji guzów Drosophila do brzucha dorosłych gospodarzy w celu zbadania różnych aspektów nowotworu. Korzystając z aparatu do automatycznego wstrzykiwania, naukowcy mogą osiągnąć lepszą wydajność i wydajność guza w porównaniu z tymi osiąganymi tradycyjnymi, ręcznymi metodami.

Allotransplantacja guza u Drosophila melanogaster za pomocą programowalnego wtryskiwacza Auto-Nanolitr

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji ekspresji genów oraz inwazyjności guza w modelu Drosophila przy użyciu mozaik genetycznych. Protokół umożliwia szczegółową analizę dynamiki klonalnej.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych (Wideo) | JoVE Journal

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Przeglądaj więcej filmów