Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić sekcję dysków imaginalnych i mózgów drosophila z czułkami ocznymi, przenoszących genetycznie zdefiniowane klony oznaczone fluorescencyjnie oraz jak je przetwarzać w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności komórek. Opisane procedury mogą pomóc w dostarczeniu nowych informacji na temat roli genów i rozwoju nabłonka, homeostazy lub choroby oraz w analizie mechanizmów leżących u podstaw ich konkurencji, proliferacji kompensacyjnej lub korporacji międzyklonalnej. Główną zaletą badania jest to, że zapewniamy cały zestaw protokołów dostosowanych do dogłębnej analizy ilościowej i jakościowej mozaiki genetycznej drosophila.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby po raz pierwszy pracujące z modelem drosophila mają trudności, ponieważ nie mogą odróżnić dysku imaginalnego oka i czułka od drugiego dysku imaginalnego. Aby ułatwić rozpoznanie wyimaginowanego dysku oczno-czułkowego z fluorescencyjnie oznaczonymi klonami w ciele larwy, zaleca się wykonanie wstępnych sekcji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Analiza mozaiki za pomocą represyjnego markera komórkowego lub MARCM umożliwia generowanie genetycznie zdefiniowanych plam klonalnych w kontekście fenotypowo dzikiego typu.

FLP napędzany przez bezoki promotor katalizuje rekombinację między dwoma elementami FRT otaczającymi kasetę stop oznaczoną żółtym genem. Po replikacji DNA FLP katalizuje wymianę chromatyd niesiostrzanych między chromosomami homologicznymi, tworząc chromatydy siostrzane. Jeden z nich jest nosicielem allelu typu dzikiego i represora Gal80, a drugi mutantem.

W mitozie segregują się, tworząc dwie komórki potomne, z których jedna jest homozygotycznym mutantem, a druga dzikim typem. Utrata represora Gal80 umożliwia ekspresję GFP w mutancie, podczas gdy komórki typu dzikiego pozostają GFP ujemne. Aby rozpocząć eksperyment, zbierz larwy mozaiki, wstrzykując PBS do butelki na muchy, aby pokryć powierzchnię pokarmu.

Następnie zmiękcz wierzchnią warstwę szpatułką i wlej zawiesinę spożywczą zawierającą larwy na szalkę Petriego. Delikatnie zbierz larwy i przenieś je do naczynia na zarodki wypełnione PBS. Zbierz co najmniej 20 larw do barwienia immunologicznego i 80 larw do ilościowego określenia inwazyjności guza.

Umyj larwy PBS, aby usunąć wszystkie resztki pokarmu. Używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego w powiększeniu 8:16x, zidentyfikuj i odrzuć wszystkie larwy lamparta, które wykazują losowe dodatnie plamy GFP w całym ciele. Umieścić naczynie zawierające pozostałe larwy w PBS na lodzie do momentu rozbioru.

Aby wypreparować dysk imaginalny oka i czułka pod mikroskopem stereoskopowym, użyj jednej pary kleszczy i delikatnie chwyć larwę w odległości około 2/3 długości ciała za głową. Drugą parą kleszczy chwyć haczyki do ust larw i odciągnij je od ciała. Za pomocą kleszczy rozplątuj haczyki ustne z nakładającego się naskórka i obcych tkanek, takich jak gruczoły ślinowe i ciało tłuszczowe.

Alternatywnie, aby przygotować kompleks oczno-antenowo-mózgowy, utrzymując nienaruszony brzuszny rdzeń nerwowy, użyj kleszczy, aby przeciąć larwę w środku ciała. Wyrzuć tylną połowę. Przytrzymaj przednią połowę ciała larwy za czubki jednej pary kleszczy, a następnie odwróć larwę na lewą stronę, wciskając haczyki ustne do wewnątrz końcówką drugiej pary i tocząc po niej naskórek za pomocą pierwszej pary kleszczy.

Ostrożnie usuń wszystkie obce tkanki, w tym jelita, ciało tłuszczowe i gruczoły ślinowe. Delikatnie odciągnij haczyki do ust od naskórka. Uwolnij kompleks mózgowo-tarczowy oczko-czułkowy przyczepiony do haczyków ustnych, przecinając wypustki aksonalne rozciągające się od brzusznego rdzenia nerwowego do mięśni i naskórka.

Aby przenieść tkankę, najpierw pokryj końcówkę mikropipety P20, odpipetowując pozostałe tusze ciała w górę i w dół, a następnie użyj tej samej końcówki do przeniesienia wypreparowanej tkanki. Aby przenieść większe kompleksy krążka oczkowo-czułkowego mózgu, należy wstępnie przyciąć końcówkę P20, aby powiększyć otwór. Utrwal próbki w 400 mikrolitrach utrwalacza 4% PFA przez 25 minut w temperaturze pokojowej podczas nutowania.

Następnie usunąć utrwalacz i przemyć próbki PBST trzy razy przez 10 minut z nutacją. Następnie zastąp PBST 500 mikrolitrami roztworu barwiącego DAPI i nutuj przez 15 minut w ciemności. Umyj chusteczkę raz przez 10 minut za pomocą PBST.

Aby zakończyć sekcję, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść tkankę z powrotem do szklanego naczynia wypełnionego PBS. Za pomocą dwóch par kleszczy oddziel mózgi, które mają być użyte do ilościowego określenia inwazyjności, od krążków oczno-czułkowych, przecinając łodygi wzrokowe. Uwolnij krążki oczkowo-czułkowe, odcinając je od haczyków do ust.

Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku odwodzącym i za pomocą kleszczy rozprowadź płyn cienką warstwą. Aby określić ilościowo inwazyjność, umieść co najmniej 80 nienaruszonych mózgów dla każdego genotypu na jednym szkiełku. Wyprostuj i ułóż tkankę zgodnie z potrzebami.

Delikatnie przyłóż jedną krawędź szkiełka nakrywkowego do podłoża i powoli opuść je za pomocą kleszczy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonąć nadmiar medium montażowego na krawędziach. Tkankę można teraz badać za pomocą obrazowania konfokalnego.

Poproś neutralną stronę o anonimizację slajdów, aby ocena była bezstronna. I mieć slajdy oceniane niezależnie przez co najmniej dwóch badaczy. Ujawnianie genotypów następuje dopiero po zakończeniu punktacji.

Oceń stopień złośliwości pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w zestaw filtrów GFP. Za pomocą markera oznacz mózgi, które zostały już obejrzane, aby uniknąć podwójnego liczenia. Fluorescencyjne obrazy konfokalne pokazują mózgi wypreparowane z larw zawierających złośliwe, zmutowane, znakowane GFP zmutowane guzy klonalne RAS V12 wybarwione DAPI.

Panele reprezentują cztery różne stopnie inwazyjności guza. Bezstronna kwantyfikacja wykazała, że hamowanie sygnalizacji JNK i RAS V12 bazgrało jeden klon tłumił inwazyjność guza. W kontrolnych dyskach oczno-czułych reporter TRE-DsRED JNK oznacza tylko wąski pasek komórek biegnący od anteny do części oka.

W przeciwieństwie do tego, aktywność TRE-DsRED była znacznie zwiększona w złośliwych nowotworach klonalnych GFP-dodatnich. W 8 dniu komórki nowotworowe przerosły krążki oczkowo-czułkowe i rozprzestrzeniły się do brzusznego rdzenia nerwowego. Atakujące komórki nowotworowe wykazywały również zwiększoną aktywację JNK w porównaniu z otaczającą tkanką.

Podczas gdy blokowanie JNK wyraźnie zmniejszyło aktywność TRE-DsRED w klonach guza, zwiększenie intensywności lasera ujawniło poprawę w komórkach nabłonka sąsiadujących z klonami. Dodatkowo, reporter hemolektyny delta DsRED wykazał, że w przeciwieństwie do kilku klastrów hemocytów znajdujących się we wgłębieniach kontrolnego nabłonka wzrokowo-czułkowego, hemocyty nagromadziły się w tkance ocznej, czułkowej i mózgowej składającej się z nowotworów złośliwych. Po zahamowaniu JNK liczba powiązanych komórek odpornościowych dramatycznie się zmniejszyła.

Zwiększonej inwazyjności guza, aktywności JNK i infiltracji hemocytów towarzyszyła znaczna regulacja w górę mNRA MMP1, określona za pomocą QRTPCR przy użyciu całkowitego RNA wyizolowanego z wypreparowanych mozaikowych krążków oczno-czułkowych. Po opanowaniu ponad 60 par oczu, dysków i mózgów można wypreparować w ciągu 30 minut. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o wytworzeniu wystarczającej liczby larw o pożądanych genotypach.

Bądź szybki, ale precyzyjny podczas sekcji, aby próbki przeznaczone do izolacji RNA były wolne od RNS. Po procedurze rozbioru, western blot może być stosowany jako alternatywa dla barwienia immunologicznego w celu oceny zmian w ekspresji białek między różnymi genotypami. Tworzenie mozaik genetycznych i analizowanie ich za pomocą opisanych procedur umożliwia badania nad mutacjami śmiertelnymi oraz nad mechanizmami korporacji onkogenów i Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować tkanki mozaiki dysku oczkowo-czułkowego i mózgu od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetwarzać pod kątem barwienia immunologicznego, wizualizacji aktywności transgenicznej i portowej, Ekstrakcja RNA i kwantyfikacja inwazyjności.

Należy pamiętać, że PFA, a także fenol-chloroform i DAPI są wysoce toksyczne i że podczas pracy z tymi środkami należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic i odzieży ochronnej.