Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowych modeli kokultury, określanych jako inżynieria architektury i mikrośrodowiska gruczołu piersiowego (mammary architecture and microenvironment engineering, lub MAM), do zastosowania w obrazowaniu żywych komórek w celu analizy oddziaływań międzykomórkowych w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez wstępne pokrycie szkiełek podstawkowych macierzą z kolagenu typu I w wersji DQ (fibroblast D quenched collagen one).

Następnie zastosowano DQ-kolagen. Po czwarte, na powierzchni utwardzonego DQ-kolagenu I, czyli macierzy kolagenowej z zatopionymi fibroblastami, naniesiono zrekonstytuowaną macierz błony podstawnej. W trzecim kroku na powierzchni szkiełek podstawkowych naniesiono warstwę zawiesiny komórek nabłonkowych lub komórek nowotworowych, umożliwiając ich przyczepienie do DQ-kolagenu IV oraz zrekonstytuowanej macierzy błony podstawnej, a następnie dodano pożywkę.

Na koniec, mikroskopia konfokalna jest wykorzystywana do obrazowania 4D, które analizuje obraz w trzech wymiarach przestrzennych oraz w czasie dla żywych kokultur mammy. Ostatecznie obrazowanie 4D umożliwia wizualizację i analizę dynamicznych interakcji między komórkami nowotworu piersi a innymi komórkami mikrośrodowiska guza, które mogą wpływać na progresję do fenotypu inwazyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie intravitalne, jest fakt, że obserwowane w naszym modelu interakcje zachodzą między komórkami jednego gatunku, czyli między ludzkimi komórkami nowotworowymi a ludzkimi komórkami towarzyszącymi nowotworowi, a nie na przykład między ludzkimi komórkami nowotworowymi a mysimi komórkami zrębu.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ przygotowanie głównych kultur rdzeniowych wymaga najpierw wizualizacji, a następnie umiarkowanych umiejętności i praktyki, aby osiągnąć sukces. Rozpocznij od umieszczenia jednej zdezynfekowanych alkoholem prostokątnych osłon plastikowych. Wsuń ją do 35 mm szalki Petriego lub użyj szalki mu 35 mm marki IBI tree.

Następnie wymieszaj pożądaną liczbę fibroblastów z kolagenem DQ. Dalej, używając mikropipety 100 µl, ostrożnie nanieś i rozprowadź 70 µl mieszaniny fibroblastów z kolagenem DQ (jedna matryca kolagenowa) na całej powierzchni szkiełka podstawowego, a następnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla na 30 minut. Po zastygnięciu matryc pozostaw je do equilibracji na 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.

Następnie umieść szalkę pod dygestorium, aż osiągnie temperaturę pokojową. Na powierzchnię zestalonego kolagenu DQ dodaj 60 µL DQ collagen, four reconstituted basement membrane matrix, a następnie collagen one matrix z zatopionymi fibroblastami. Za pomocą końcówki pipety ostrożnie i równomiernie rozprowadź DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix, unikając porysowania warstwy fibroblastów w DQ collagen one, collagen one matrix.

Następnie przenieś szalkę i szkiełko nakrywkowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide na 10 minut, aby zrekonstytuowana matryca błony podstawnej DQ collagen four uległa zestaleniu; w tym czasie potraktuj oczy trypsyną i policz komórki do kokultury. Teraz nanieś 50 µL zawiesiny komórek na pokryte szkiełko nakrywkowe i umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide na 40 do 60 minut, aby umożliwić przyleganie komórek do zrekonstytuowanej matrycy błony podstawnej DQ collagen four. Po przylegnięciu komórek do matrycy dodaj do szalki 35 mm dwa mL pożywki hodowlanej zawierającej 2% zrekonstytuowanej błony podstawnej.

Następnie inkubuj przez pożądany czas przed obrazowaniem; po przemyciu roztworem PBS inkubuj kokultury z 5 µM Cell Tracker Orange w medium MEGM w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut. Po inkubacji ponownie przemyj kokultury roztworem PBS i inkubuj je w uprzednio ogrzanym medium MEGM przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wykonaj obrazowanie żywych kokultur przy niskim powiększeniu, na przykład 10x, używając obiektywu imersyjnego wodnego w mikroskopie konfokalnym, rejestrując przekroje optyczne w odstępach 10 µm przez całą głębokość struktur.

Wykorzystaj przekroje optyczne do rekonstrukcji obrazów w 3D przy użyciu oprogramowania Velocity lub podobnego programu. Utwórz filmy z rekonstrukcji 3D, aby umożliwić wizualizację struktur, oddziaływań międzykomórkowych oraz interakcji z otaczającą macierzą. Na tym reprezentatywnym schemacie kokultury, szalkę IBI treat mu pokryto najpierw kolagenem, w której jednej znajduje się kolagen DQ, a w drugiej fibroblasty, widoczne tutaj na kolor magenta.

Następnie dodano drugą warstwę zrekonstytuowanej błony podstawnej zawierającą kolagen czterty DQ. Kolejno na wierzchu wysiano komórki nowotworowe zaznaczone na czerwono i 2% zrekonstytuowanej błony podstawnej. W kulturze.

Pożywka, reprezentowana przez kremowe kropki, była nakładana przy każdej zmianie medium. Fluorescencyjne produkty rozkładu kolagenu DQ typu I i IV są przedstawione na zielono. W ciągu 23 dni w tej reprezentatywnej kokulturze MCF 10 DCIS i WS 12 TI zaobserwowano proliferację komórek obrazowanych tutaj oraz na kolejnych rysunkach (kolor czerwony), a także degradację kolagenu DQ typu IV i I, widoczną tutaj i na kolejnych rysunkach (kolor zielony), oraz macierzy kolagenowych, na co wskazywało zmniejszenie objętości kokultur.

Te same żywe kokultury obserwowano przez 23 dni, wykonując zdjęcia za pomocą mikroskopii konfokalnej w trzecim, szesnastym i dwudziestym trzecim dniu kokultury. Interakcje w kokulturach Mame są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Na przykład, jak widać na tym modelu 3D kokultury komórek mam w trzecim dniu, w tym momencie komórki dopiero zaczynają proliferować w macierzach, pozostając nadal dość stabilne, co potwierdza brak zielonej fluorescencji.

Jednak do 16. dnia, w miarę dalszej proliferacji komórek, zaczęły one również degradować strukturę macierzy, co zaobserwowano tutaj za pomocą produktów rozszczepienia DQ collagen 1 i 4 w kolorze zielonym, a także aktywny rozkład macierzy przez komórki, gdzie macierz i komórki wykazują ko-fluorescencję widoczną w kolorze żółtym. Do 23. dnia prawie połowa macierzy została zdegradowana przez szybko proliferujące komórki w porównaniu z dniem trzecim, kiedy objętość kokultury wynosiła 110 000 µm³. Między 16. a 23. dniem objętość ta została zredukowana do zaledwie 46 250 µm³.

W co-kulturze 16 można zaobserwować proteolizę kolagenu DQ 4 na powierzchni komórek DCIS zaznaczonych na czerwono oraz rozproszoną proteolizę kolagenu DQ 1 w obszarach w pobliżu fibroblastów zaznaczonych na biało. Zastosowane w tej co-kulturze różnicowe barwienie pozwala również na obserwację odmiennych wzorców migracji i proliferacji obu typów komórek po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka piersi do zgłębiania wpływu makrośrodowiska guza na progresję nowotworu, umożliwiając obrazowanie żywych komórek i dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymi a otaczającymi je komórkami z gleby.