Name: Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek guza: interakcje mikrośrodowiskowe, które wpływają na progresję nowotworu złośliwego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj techniki obrazowania 4D żywych komórek guza w modelach MAME do badania interakcji mikrośrodowiskowych wpływających na progresję nowotworu złośliwego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS i RRM). Obrazowanie żywych komórek zostało przeprowadzone w Microscopy, Imaging and Cytometry Resources Core, wspieranym częściowo przez grant NIH Center P30 CA22453 dla Karmanos Cancer Institute, Wayne State University oraz przez Perinatology Research Branch of the National Institutes of Child Health and Development, Wayne State University.

1. Przygotowanie substratów DQ
<ol>
	<li>Pozostaw liofilizowane substraty DQ do ogrzania się do temperatury pokojowej przed otwarciem fiolek, przygotuj roztwór zapasowy DQ-substratu o stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej, podziel go na aliquoty po 50 μl i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Może być konieczne poddanie substratu DQ działaniu kąpieli wodnej w myjce ultradźwiękowej przez ~5 min i podgrzanie do 50 °C w celu ułatwienia dyspersji.
<ol start="2">
	<li>Rozmrozić rBM na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C; rBM należy zawsze przechowywać i przetwarzać na lodzie.</li>
	<li>Aby przygotować 10X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), rozpuścić 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na2HPO4 (1 M) oraz 2,4 g KH2PO4 (0,02 M) w 800 ml wody ultrapure. Dostosować pH roztworu buforowego PBS do wartości 7,4 za pomocą 1,0 M HCl. Uzupełnić objętość do 1 litra i wysterylizować poprzez filtrację.</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenu I na lodzie: zmieszać 8 części schłodzonego kolagenu I z 1 częścią schłodzonego 10X PBS. Dostosować pH mieszaniny do wartości 7,2-7,6, używając sterylnego 0,1 M NaOH. Sprawdzić pH za pomocą pasków pomiarowych i uzupełnić objętość końcową do 10 części sterylną wodą.</li>
	<li>Przygotować macierz DQ-collagen I:collagen I poprzez rozcieńczenie DQ-collagen I w roztworze kolagenu I w uprzednio schłodzonej probówce do końcowych stężeń odpowiednio 25 μg/ml i 2,4 mg/ml.</li>
	<li>Przygotować macierz DQ-collagen IV:reconstituted basement membrane (rBM) poprzez rozcieńczenie DQ-collagen IV w rBM (Cultrex lub Matrigel) w uprzednio schłodzonej probówce do końcowych stężeń odpowiednio 25 μg/ml i 12-15 mg/ml. Mieszać na lodzie, delikatnie pipetując, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kokultur MAME
Schemat kokultur przedstawiono na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Umieść dwa prostokątne plastikowe szkiełka nakrywkowe (sterylizowane w 70% alkoholu przez 10 min i wysuszone na powietrzu) w 35-milimetrowej płytce hodowlanej lub użyj naczynia IbiTreat 35-mm μ-Dish. Poniższe instrukcje dotyczą zarówno szkiełek nakrywkowych, jak i naczyń μ-Dish, których używamy do badań pod mikroskopem prostym. Do badań pod mikroskopem odwróconym stosujemy wyłącznie naczynia μ-Dish.</li>
	<li>Wymieszaj pożądaną liczbę fibroblastów z matrycą DQ-collagen I:collagen I. W przypadku długoterminowych kokultur przedstawionych na Rysunkach 2 i 3 używamy 500 fibroblastów w 10 μl pożywki oraz 60 μl matrycy DQ-collagen I:collagen I.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety 100-μl ostrożnie nanieś i rozprowadź 70 μl mieszaniny fibroblasty:DQ-collagen I:collagen I na całej powierzchni każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie pozostaw w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem, bez CO2, przez 30 min w celu zestalenia.</li>
	<li>Przenieś 35-milimetrowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 10 min w celu equilibracji.</li>
	<li>Wyjmij z inkubatora i pozostaw 35-milimetrowe płytki pod dygestorium, aż osiągną temperaturę pokojową.</li>
	<li>Dodaj 60 μl matrycy DQ-collagen IV:rBM na wierzch zestalonej matrycy DQ-collagen I:collagen I z zatopionymi fibroblastami. Za pomocą końcówki pipety ostrożnie i równomiernie rozprowadź matrycę DQ-collagen IV:rBM, unikając porysowania matrycy fibroblasty:DQ-collagen I:collagen I.</li>
	<li>Przenieś 35-milimetrowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 10 min w celu zestalenia. Podczas zestalania się matrycy DQ-collagen IV:rBM przeprowadź trypsynizację i zliczenie komórek nabłonkowych.</li>
	<li>Nanieś 50 μl zawiesiny komórek nabłonkowych/nowotworowych na szkiełka nakrywkowe pokryte matrycą DQ-collagen IV:rBM. Umieść 35-milimetrowe płytki zawierające szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pozostaw na 40 do 60 min, aby komórki przywarły do matrycy DQ-collagen IV:rBM. W przypadku długoterminowych kokultur przedstawionych na Rysunkach 2 i 3 używamy 2500 komórek nabłonkowych lub nowotworowych.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej 2% rBM do każdej 35-milimetrowej płytki. Jeśli planowane są zabiegi z użyciem leków, należy je dodać na tym etapie.</li>
	<li>Inkubuj przez pożądany czas przed obrazowaniem. W przypadku kultur długoterminowych pożywkę należy wymieniać co 3-4 dni. Komórki można utrzymywać w ich standardowej pożywce hodowlanej. Dla kokultur MAME linii komórkowych piersi używamy pożywki podstawowej dla komórek nabłonkowych (MEBM-PRF) suplementowanej MEGM SingleQuots.</li>
</ol>
3. Przeprowadzenie obrazowania 4D (3D + czas) żywych kokultur MAME przy użyciu mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia przedstawionych badań dowodzących zasady działania, kokultury MAME znakowano fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek zgodnie z naszą opublikowaną procedurą1. Po przemyciu PBS, kokultury inkubowano z 5 μM CellTracker Orange w medium MEGM przez 45 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C, ponownie przemyto PBS, a następnie inkubowano w uprzednio ogrzanym medium MEGM przez 30 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przed obrazowaniem.</li>
	<li>Należy wykonać obrazy żywych kokultur MAME przy małym powiększeniu (10X, obiektyw immersyjny wodny) na konfokalnym mikroskopie Zeiss LSM-510 META.</li>
	<li>Przekroje optyczne są rejestrowane w odstępach w całej głębokości struktur. W naszych badaniach rejestrujemy przekroje optyczne w odstępach 10 μm.</li>
	<li>Należy wykorzystać przekroje optyczne do rekonstrukcji obrazów w 3D. Do generowania rekonstrukcji 3D wykorzystujemy oprogramowanie Volocity.</li>
	<li>Należy przygotować filmy z rekonstrukcji 3D, aby umożliwić wizualizację struktur, oddziaływań międzykomórkowych oraz interakcji z otaczającymi macierzami. Filmy przygotowaliśmy za pomocą programu QuikTime Player 7.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Opracowane przez nas kokultury MAME stanowią przystępny model eksperymentalny do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, pozwalający na badanie oddziaływań między różnymi składnikami komórkowymi tworzącymi nowotwór piersi i jego mikrośrodowisko. Tutaj demonstrujemy zdolność modeli MAME do odtworzenia oddziaływań komórka-komórka podczas progresji raka piersi oraz możliwość wykorzystania obrazowania żywych komórek do śledzenia tych oddziaływań w czasie. Ilustrujemy możliwość obrazowania interakcji między przedinwazyjną ludzką linią komórkową raka piersi MCF10.DCIS a ludzką linią fibroblastów związanych z rakiem piersi, WS-12Ti, przez okres ponad trzech tygodni hodowli. Obrazowanie kokultur przeprowadzono w 3., 16. i 23. dniu. Przekroje optyczne przez całą objętość kokultur zrekonstruowano w 3D, a reprezentatywne przykłady dla każdego z trzech punktów czasowych przedstawiono na Rysunku 2. Czerwona fluorescencja na Rysunku 2 reprezentuje komórki MCF10.DCIS i WS-12Ti. Aby odróżnić oba typy komórek w przypadku długoterminowych kokultur, można przed ustanowieniem hodowli przeprowadzić transfekcję lub transdukcję poszczególnych typów komórek białkami fluorescencyjnymi. Kokulturę MAME z komórkami MCF10.DCIS i WS-12Ti, które zostały różnie znakowane białkami fluorescencyjnymi w celu ich identyfikacji, przedstawiono na Rysunku 3.
Poprzez wprowadzenie substratów, w tym przypadku kolagenów DQ, do kokultur MAME, możemy oceniać i ilościowo określać zmiany w czasie proteolizy związanej z przejściem w fenotyp inwazyjny. Opracowaliśmy metody ilościowego oznaczania fluorescencyjnych produktów rozszczepienia powstałych w wyniku degradacji kolagenu DQ2,3. Normalizujemy ilość produktów degradacji w całej objętości 3D kokultur MAME w przeliczeniu na jedną komórkę poprzez znakowanie i liczenie jąder komórkowych. Ponadto możemy zlokalizować degradację w przedziałach zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych oraz ilościowo określić całkowitą ilość produktów degradacji wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, zgodnie z naszym wcześniejszym opisem2. Zielona fluorescencja na Rysunkach 2 i 3 reprezentuje produkty rozszczepienia dwóch substratów kolagenu DQ. Obecnie niedostępne są kolageny z różnymi znacznikami, które pozwoliłyby nam odróżnić degradację kolagenu typu IV od degradacji kolagenu typu I.
Interakcje w kokulturach MAME są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Aby uzyskać informacje temporalne i dynamiczne, można wielokrotnie obrazować to samo pole widzenia i wykonywać przekroje optyczne przez cały preparat w określonym przedziale czasowym – od minut do tygodni – gromadząc w ten sposób dane w 4D. Na Rysunku 2 przedstawiamy dość gwałtowne zmiany zachodzące w ciągu 23 dni: zmiany w liczbie komórek, migrację komórek i interakcje międzykomórkowe, objętości struktur, kształty struktur, odchylenia struktur od sferyczności, przerosty inwazyjne oraz proteolizę. Ponadto demonstrujemy ogólną zmianę objętości wynikającą z degradacji otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej przez kokultury MAME w tym okresie. W trzeciej dobie, jak pokazano na Rysunku 2A, objętość wynosi 110 000 μm3. W przeciwieństwie do tego, objętość kokultur MAME w 16. i 23. dobie wynosi zaledwie 46 250 μm3, co zilustrowano na Rysunkach 2B i C.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej przedstawiający etapy dodawania pożywki i techniki hodowli." src="/files/ftp_upload/3661/3661fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny rysunek kokultur MAME. Plastikowy szkiełko nakrywki jest powlekane kolagenem I, zawierającym DQ-collagen I oraz fibroblasty (kolor magenta). Następnie dodawana jest druga warstwa zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM) zawierająca DQ-collagen IV. Na wierzchu wysiewane są komórki nowotworowe (kolor czerwony), a przy każdej zmianie pożywki nakłada się 2% rBM w pożywce hodowlanej (białe kropki). Kolor zielony reprezentuje fluorescencyjne produkty rozszczepienia DQ-collagen I i IV.
<img alt="Wzrost komórek 3D w czasie, schemat: 3, 16, 23 dni, obraz mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/3661/3661fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kokultury MAME ludzkich komórek piersi MCF10.DCIS i ludzkich fibroblastów piersi WS-12Ti. Fibroblasty osadzono w kolagenie I/DQ-kolagenie I i przykryto rBM zawierającym DQ-kolagen IV. Następnie na rBM wysiano komórki DCIS i przykryto je pożywką zawierającą 2% rBM. W ciągu 23 dni kokultury przedstawionej na rysunku nastąpiła proliferacja komórek, degradacja DQ-kolagenu IV i I (kolor zielony) oraz macierzy kolagenowych, co objawiło się zmniejszeniem objętości kokultur. Komórki zlokalizowano poprzez znakowanie CellTracker Orange in situ przed obrazowaniem (kolor czerwony). Te same żywe kokultury obserwowano przez 23 dni, wykonując obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej w 3., 16. i 23. dniu kokultury. Uzyskane przekroje optyczne zrekonstruowano w 3D przy użyciu oprogramowania Volocity. Powiększenie, 10X.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej 3D; struktura komórkowa zwizualizowana w kolorze zielonym i czerwonym; analiza przestrzenna." src="/files/ftp_upload/3661/3661fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. 16-dniowe kokultury MAME ludzkich komórek piersi MCF10.DCIS oraz ludzkich fibroblastów piersi WS-12Ti, które wykazują ekspresję odpowiednio RFP (czerwony) i YFP (biały). Kokultury przygotowano i analizowano analogicznie jak na Rysunku 2. Przedstawione tutaj dwa typy komórek zostały jednak odmiennie oznakowane, aby umożliwić ich rozróżnienie. Obrazy przy wyższym powiększeniu na tym rysunku, w porównaniu z obrazami na Rysunku 2, ilustrują proteolizę DQ-kolagenu IV na powierzchni komórek DCIS oraz dyfuzyjną proteolizę DQ-kolagenu I w obszarach sąsiadujących z fibroblastami. Powiększenie, 20X.

<ol><li>Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+proteolysis%3A+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+protease+activity+in+living+cells%3A+from+two+dimensions+to+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).</li>
<li>Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+hepatocyte+growth+factor+promotes+invasion+of+human+mammary+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ.</a> Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).</li>
<li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+live-cell+imaging+demonstrates+that+beta1-integrin+promotes+type+IV+collagen+degradation+by+breast+and+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells.</a> Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> Neoplasia. 10, 314-328 (2008).</li>
<li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+quantifying+the+dynamics+of+tumor+associated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).</li>
<li>Cavallo-Medved, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+demonstrates+that+proteases+in+caveolae+of+endothelial+cells+degrade+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix.</a> Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Jak wykazano, kokultury MAME mogą być wykorzystywane do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu analizy oddziaływań między różnymi składnikami komórkowymi tworzącymi guz piersi i jego mikrośrodowisko. W prowadzonych w naszym laboratorium badaniach wykorzystaliśmy kokultury MAME do identyfikacji szlaków proteolitycznych związanych z przejściem z DCIS do naciekającego raka przewodowego, a także do analizy oddziaływań między szlakami proteolitycznymi a innymi szlakami zaangażowanymi w ten proces, takimi jak ...

<table><tbody><tr><td>Rekonstruowana błona podstawna (Cultrex)</td><td>Trevigen Inc.</td><td>3445-005-01</td><td>Porównywalna z Matrigel (BD Biosciences)</td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Cohesion Laboratories</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Substraty DQ (kolagen I, IV)</td><td>Invitrogen</td><td>DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szkiełka nakrywkowe 22-mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Przeciąć na pół, pozostawić w 70% etanolu na 10 min i wysuszyć na powietrzu przed użyciem.</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowej</td><td>Lonza Inc.</td><td>MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136</td><td>Bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>ibiTreat &amp;mu;-Dish</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Volocity</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>Wersja 5.5</td><td>Do generowania rekonstrukcji 3D i filmów można użyć oprogramowania do obrazowania innych marek.</td></tr></tbody></table>

modele mame do obrazowania 4d żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury, które nazwaliśmy MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), i wykorzystaliśmy je do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu badania interakcji komórka-komórka. Naszym nadrzędnym celem było opracowanie modeli odtwarzających architekturę przedinwazyjnych zmian w piersi, aby zbadać ich progresję do fenotypu inwazyjnego. W szczególności opracowaliśmy modele do analizy interakcji między wariantami przednowotworowych komórek nabłonkowych piersi a innymi typami komórek mikrośrodowiska guza, które są zaangażowane w przyspieszanie lub hamowanie progresji przedinwazyjnych komórek nabłonkowych piersi do inwazyjnego raka przewodowego. Innymi badanymi do tej pory typami komórek są komórki mioepitelialne, fibroblasty, makrofagi oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego krwi i limfy. Oprócz modeli MAME, zaprojektowanych w celu odtworzenia interakcji komórkowych w piersi podczas progresji nowotworu, opracowaliśmy analogiczne modele dla progresji raka prostaty.
W niniejszym materiale przedstawiamy procedury tworzenia 3D kokultur wraz z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz funkcjonalnego testu proteolizy w celu śledzenia przejścia kokultur komórek raka przewodowego piersi in situ (DCIS) i fibroblastów w fenotyp inwazyjny w czasie, w tym przypadku przez dwadzieścia trzy dni hodowli. Kokultury MAME składają się z wielu warstw. Fibroblasty są zatopione w dolnej warstwie kolagenu typu I. Na niej umieszcza się warstwę zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM), na której wysiewa się komórki DCIS. Ostatnią, górną warstwę stanowi 2% rBM, która jest uzupełniana przy każdej wymianie pożywki. Aby zobrazować proteolizę związaną z progresją do fenotypu inwazyjnego, stosujemy fluorescencyjne białka macierzy z wygaszonym sygnałem (DQ) (DQ-collagen I zmieszany z warstwą kolagenu I oraz DQ-collagen IV zmieszany z middle layer rBM) i obserwujemy żywe kultury za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przekroje optyczne są rejestrowane, przetwarzane i rekonstruowane w 3D za pomocą oprogramowania do wizualizacji Volocity. W ciągu 23 dni w kokulturach MAME komórki DCIS proliferują i zlewają się w duże struktury inwazyjne. Fibroblasty migrują i zostają włączone w te struktury inwazyjne. Fluorescencyjne fragmenty proteolityczne kolagenów znajdują się w sąsiedztwie powierzchni struktur DCIS, wewnątrzkomórkowo, a także są rozproszone w całej otaczającej macierzy. Leki celowane w szlaki proteolityczne, chemokinowe/cytokinowe i kinazowe lub modyfikacje w składzie komórkowym kokultur mogą zmniejszać inwazyjność, co sugeruje, że modele MAME mogą być wykorzystywane jako badania przesiewowe w fazie przedklinicznej dla nowych podejść terapeutycznych.

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury, które nazwaliśmy MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), i wykorzystaliśmy je do obrazowania żywych komórek w ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie trójwymiarowych modeli współhodowlanych, określanych jako inżynieria architektury i mikrośrodowiska gruczołu mlekowego (MAM), do zastosowania w obrazowaniu żywych komórek w celu obserwacji interakcji międzykomórkowych w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie szkiełek podstawowych kolagenem typu I w wersji DQ (fibroblast DQ quenched).Następnie zastosowano DQ collagen.Four. Na powierzchni zestalonej macierzy DQ collagen one, czyli macierzy kolagenowej z zatopionymi fibroblastami, naniesiono zrekonstytuowaną macierz błony podstawnej. W trzecim kroku na wierzch szkiełek nakrywkowych nałożono zawiesinę komórek nabłonkowych lub nowotworowych, umożliwiając im przyczepienie się do DQ collagen, zrekonstytuowanej macierzy błony podstawnej typu four, a następnie dodano pożywkę.W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do obrazowania 4D, które pozwala na analizę obrazu w trzech wymiarach przestrzennych oraz w czasie dla żywych hodowli współpleszczowych mammarystycznych. Ostatecznie obrazowanie 4D umożliwia wizualizację i analizę dynamicznych interakcji pomiędzy komórkami nowotworu piersi a innymi komórkami mikrośrodowiska guza, które mogą wpływać na progresję do fenotypu inwazyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie intravitalne, jest fakt, że obserwowane w naszym modelu interakcje zachodzą między komórkami jednego gatunku – ludzkimi komórkami nowotworowymi i ludzkimi komórkami towarzyszącymi nowotworowi, a nie na przykład między ludzkimi komórkami nowotworowymi a mysimi komórkami zrębu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ przygotowanie głównych kultur rdzeniowych wymaga najpierw wizualizacji, a następnie umiarkowanych umiejętności i praktyki w celu osiągnięcia sukcesu. Należy zacząć od umieszczenia jednej wysterylizowanej alkoholem prostokątnej plastikowej pokrywy. Wsuń ją do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm lub użyj szalki mu 35 mm marki IBI tree.Następnie zmieszaj pożądaną liczbę fibroblastów z kolagenem DQ. Dalej, używając mikropipety 100 µL, ostrożnie nanieś i rozprowadź 70 µL mieszaniny fibroblastów z kolagenem DQ (jedna macierz kolagenowa) na całej powierzchni szkiełka podstawowego, a następnie umieść szalkę hodowlaną w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla na 30 minut. Po zestaleniu się macierzy pozostaw je do równowagi na 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.Następnie umieść płytkę pod dygestorium, aż osiągnie temperaturę pokojową. Na powierzchnię zestalonego kolagenu DQ nanieś 60 µL zrekonstytuowanej macierzy błony podstawnej DQ collagen four, a następnie macierz collagen one z zatopionymi fibroblastami. Następnie, używając końcówki pipety, ostrożnie i równomiernie rozprowadź zrekonstytuowaną macierz błony podstawnej DQ collagen four, unikając uszkodzenia macierzy fibroblastów DQ collagen one, collagen one matrix.Następnie przenieś szalkę i szkiełko podstawowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide na 10 minut, aby umożliwić zestalenie się macierzy błony podstawnej DQ collagen four. Przetraw trypsyną oczy i policz komórki do kokultury. Teraz nanieś 50 µL zawiesiny komórkowej na powlekane szkiełko podstawowe i umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide na 40 do 60 minut, aby komórki mogły przytwierdzić się do macierzy błony podstawnej DQ collagen four. Po przytwierdzeniu się komórek do macierzy, dodaj 2 mL pożywki hodowlanej zawierającej 2% zrekonstytuowaną błonę podstawną do szalki 35 mm.Następnie inkubować przez pożądany czas przed obrazowaniem; po przemyciu buforem PBS inkubować kokultury z 5 µM cell tracker orange w medium MEGM w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut. Po inkubacji ponownie przemyć kokultury buforem PBS i inkubować je w podgrzanym medium MEGM przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wykonać obrazowanie żywych kokultur przy niskim powiększeniu, na przykład 10x, przy użyciu obiektywu imersyjnego w wodzie na mikroskopie konfokalnym, rejestrując przekroje optyczne w odstępach 10 µm przez całą głębokość struktur.Wykorzystaj przekroje optyczne do rekonstrukcji obrazów w 3D przy użyciu oprogramowania Velocity lub podobnego programu. Przygotuj filmy z rekonstrukcji 3D, aby umożliwić wizualizację struktur, interakcji międzykomórkowych oraz oddziaływań z otaczającą macierzą. Na tym reprezentatywnym schemacie ko-kultury, naczynie IBI treat mu zostało najpierw pokryte kolagenem, jedno zawierało kolagen DQ, a drugie fibroblasty, widoczne tutaj na kolor magenta.Następnie dodano drugą warstwę zrekonstruowanej błony podstawnej zawierającą kolagen IV DQ. W dalszej kolejności na wierzchu wysiano komórki nowotworowe (zaznaczone na czerwono) w 2% zrekonstruowanej błonie podstawnej. W hodowli.Media reprezentowane przez kremowe kropki były nakładane przy każdej zmianie pożywki. Fluorescencyjne produkty rozkładu DQ collagen one i four są przedstawione w kolorze zielonym. W ciągu 23 dni tej reprezentatywnej kokultury MCF 10 DCIS i WS 12 TI zaobserwowano proliferację komórek przedstawionych tutaj oraz na kolejnych rysunkach (kolor czerwony), a także degradację DQ collagen four i one widoczną tutaj i na kolejnych rysunkach (kolor zielony) oraz macierzy kolagenowych, co wskazuje redukcja objętości kokultur.Te same żywe kokultury obserwowano przez 23 dni, wykonując obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej w trzecim, szesnastym i dwudziestym trzecim dniu kokultury. Interakcje w kokulturach Mame są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Na przykład, jak widać na tym modelu 3D kokultury komórek mam z trzeciego dnia, w tym momencie komórki dopiero zaczynają proliferować w macierzach, pozostając wciąż dość stabilne, co potwierdza brak zielonej fluorescencji.Jednak do 16. dnia, w miarę dalszej proliferacji komórek, zaczęły one również degradować strukturę macierzy, co obserwujemy tutaj dzięki produktom rozszczepienia kolagenu DQ typu 1 i 4 w kolorze zielonym oraz aktywnemu rozkładowi macierzy przez komórki, gdzie macierz i komórki wykazują współfluorescencję widoczną w kolorze żółtym. Do 23. dnia prawie połowa macierzy została zdegradowana przez szybko proliferujące komórki w porównaniu do trzeciego dnia, kiedy objętość kokultury wynosiła 110 000 µm³. Między 16. a 23. dniem objętość została zredukowana do zaledwie 46 250 µm³ w tym dniu.W co-kulturze 16 można zaobserwować proteolizę kolagenu DQ cztery na powierzchni komórek DCIS zaznaczonych na czerwono oraz rozproszoną proteolizę kolagenu DQ jeden w obszarach sąsiadujących z fibroblastami zaznaczonymi na biało. Zróżnicowane barwienie zastosowane w tej ko-kulturze pozwala również na obserwację odrębnych wzorców migracji i proliferacji dwóch typów komórek po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka piersi do zgłębiania wpływu makrośrodowiska guza na progresję nowotworu, umożliwiając obrazowanie żywych komórek i dynamicznych interakcji między komórkami rakowymi a otaczającymi je komórkami zrębu.

mame-models-for-4d-live-cell-imaging-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modele MAME do 4D obrazowania komórek in vivo w celu przedstawienia interakcji mikrośrodowiska nowotworu, które mają wpływ na złośliwy rozwój

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i hodowli mikrośrodowiska przerzutowego guza bariery krew-mózg, a następnie ilościowego określenia jego stanu za pomocą obrazowania konfokalnego i sztucznej inteligencji (uczenia maszynowego).

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Poznaj techniki obrazowania 4D żywych komórek guza w modelach MAME do badania interakcji mikrośrodowiskowych wpływających na progresję nowotworu złośliwego.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek guza: interakcje mikrośrodowiskowe, które wpływają na progresję nowotworu złośliwego (Wideo) | JoVE Journal

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Przeglądaj więcej filmów