Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek guza: interakcje mikrośrodowiskowe, które wpływają na progresję nowotworu złośliwego

Opracowaliśmy modele kokultury 3D do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym interakcji między komórkami guza piersi a innymi komórkami w ich mikrośrodowisku, które wpływają na postęp do fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przedkliniczne badania przesiewowe dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, chemokiny/cytokin i kinaz związane z inwazyjnością.

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie modeli 3D wspólnej hodowli zwanych architekturą sutka i inżynierią mikrośrodowiska lub MAM do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek interakcji między komórkami w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez pierwsze pokrycie szkiełek nakrywkowych fibroblastem hartowanym D lub kolagenem DQ. Kolagen jedna matryca.

Następnie D ugaszony kolagen. Cztery. Odtworzoną macierz błony podstawnej dodaje się na wierzch zestalonej macierzy kolagenowej DQ, matrycy kolagenowej z osadzonymi fibroblastami. W trzecim etapie zawiesinę nabłonka lub komórek nowotworowych nakłada się na szkiełka nakrywkowe, umożliwiając komórkom przyłączenie się do kolagenu DQ, czterech odtworzonych macierzy błony podstawnej, a następnie dodaje się pożywkę.

Wreszcie, mikroskopia konfokalna służy do wykonywania czterech obrazowań D, które analizują obraz w trzech wymiarach przestrzennych, plus czas żywych kultur współ. Ostatecznie obrazowanie czterowymiarowe umożliwia wizualizację i analizę dynamicznej interakcji między komórkami guza piersi a innymi komórkami mikrośrodowiska guza, które mogą wpływać na progresję do fenotypu inwazyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie wewnątrzżyciowe, jest to, że interakcje obserwowane w naszym modelu zachodzą między komórkami jednego gatunku, czyli ludzkimi komórkami nowotworowymi a ludzkimi komórkami związanymi z nowotworem, a nie na przykład między ludzkimi komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu myszy.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ zebranie głównych kultur rdzeniowych musi najpierw zostać zwizualizowane, a następnie wymaga umiarkowanych umiejętności i praktyki, aby odnieść sukces. Zacznij od umieszczenia jednej prostokątnej plastikowej osłony sterylizowanej alkoholem. Wsuń do 35-milimetrowej naczynia hodowlanej lub użyj drzewa IBI, 35-milimetrowej szalki mu.

Następnie wymieszaj żądaną liczbę fibroblastów z kolagenem DQ. Następnie, za pomocą mikropipetera o pojemności 100 mikrolitrów, ostrożnie odpipetować i rozprowadzić 70 mikrolitrów kolagenu fibroblastów DQ, jeden kolagen jedną matrycę na całej powierzchni szkiełka nakrywkowego i umieścić naczynie hodowlane w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla na 30 minut. Po zestaleniu się matryc pozostaw do zrównoważenia przez 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Następnie umieść naczynie pod okapem, aż osiągnie temperaturę pokojową. Dodaj 60 mikrolitrów kolagenu DQ, cztery odtworzone macierze błony podstawnej na wierzchu zestalonego kolagenu DQ, jeden, kolagen jedną matrycę z osadzonymi fibroblastami. Następnie za pomocą końcówki pipety ostrożnie rozprowadź kolagen DQ cztery odtworzone macierz błony podstawnej równomiernie, unikając zarysowania fibroblastów, kolagenu DQ jeden, kolagenu jednej matrycy.

Następnie przenieś naczynie i szkiełko nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 10 minut, podczas gdy odtworzona matryca błony podstawnej kolagenu DQ 4 zestala oczy trypsyny i policz komórki do hodowli CO. Teraz umieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na powlekanym szkiełku nakrywkowym i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 40 do 60 minut, aby komórki mogły przyłączyć się do kolagenu DQ. Po czwarte, rozpuść matrycę błony podstawnej po przyłączeniu komórek do matrycy, dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej zawierającej 2% odtworzoną błonę podstawną do 35-milimetrowej szalki.

Następnie inkubować przez żądany okres czasu przed obrazowaniem po umyciu PBS, inkubować kultury współistniejące z pięcioma pomarańczowymi mikromolowymi komórkami śledzącymi komórki w pożywce MEGM w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut po inkubacji, ponownie przemyć kultury współfermentacyjne PBS i inkubować je z podgrzaną pożywką MEGM przez 30 minut w inkubatorze z dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%. Kultury ko-kulturowe żyją w małym powiększeniu. Na przykład, przy powiększeniu 10x za pomocą soczewki zanurzeniowej w wodzie pod mikroskopem konfokalnym, uchwyć przekroje optyczne w odstępach 10 mikronów na całej głębokości struktur.

Użyj sekcji optycznych, aby zrekonstruować obrazy w 3D za pomocą oprogramowania do pomiaru prędkości lub podobnego programu. Twórz filmy z rekonstrukcji 3D, aby można było zobrazować struktury, interakcje komórkowe i interakcje z otaczającą matrycą. Na tym reprezentatywnym schemacie kokultury okaleczającej, danie mu z przysmakiem IBI zostało najpierw pokryte kolagenem, jedno zawierające kolagen DQ, drugie w fibroblastach, jak widać tutaj w kolorze magenta.

Następnie dodano drugą warstwę odtworzonej błony podstawnej zawierającej kolagen DQ cztery. Następnie komórki nowotworowe w kolorze czerwonym zostały posiane na wierzchu i w 2% odtworzono błonę podstawną. W kulturze.

Nośnik reprezentowany przez kremowe kropki był nakładany przy każdej zmianie nośnika. Fluorescencyjne produkty rozszczepienia kolagenu DQ jeden i cztery są reprezentowane na zielono. W ciągu 23 dni tej reprezentatywnej hodowli MCF 10 DCIS i WS 12 TI co nastąpiła proliferacja komórek obrazowanych tutaj i na poniższych rysunkach, czerwonych, a także degradacja kolagenu DQ cztery i jeden obserwowane tutaj, a na kolejnych rysunkach zielone i matryce kolagenowe, na co wskazuje zmniejszenie objętości kultur co.

Te same żywe kultury kologiczne obserwowano przez 23 dni z obrazami uchwyconymi za pomocą mikroskopii konfokalnej w trzecim, 16 i 23 dniu kohodowli. Interakcje w kulturach Mame są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Na przykład, jak widać na tym modelu 3D mamy komórki, wspólnej hodowli w trzecim dniu, komórki dopiero zaczynają się namnażać w matrycach w tym momencie, nadal dość stabilnie, o czym świadczy brak zielonej fluorescencji.

Jednak do 16 dnia, gdy komórki nadal się namnażają, zaczęły również degradować strukturę macierzy, co zaobserwowano tutaj przez kolagen DQ, jeden i cztery produkty rozszczepienia na zielono, oraz aktywny rozkład macierzy przez komórki, w których matryca i komórki współfluoryzują, jak obserwowano na żółto. Do 23 dnia prawie połowa macierzy została zdegradowana przez szybko proliferujące komórki w porównaniu z trzecim dniem, kiedy objętość kokultury wynosiła 110 000 mikrometrów sześciennych. Od 16 do 23 dnia objętość została zmniejszona do zaledwie 46 250 mikrometrów sześciennych w ciągu tego dnia.

16 kokultura, można zaobserwować proteolizę kolagenu DQ cztery na powierzchni komórek DCIS w kolorze czerwonym oraz rozproszoną proteolizę kolagenu DQ, jedną w obszarach w pobliżu fibroblastów w kolorze białym. Barwienie różnicowe stosowane w tej kokulturze pozwala również na obserwację różnych wzorców migracji i proliferacji dwóch typów komórek po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem piersi do zbadania wpływu makrośrodowiska guza na postęp nowotworu, utratę obrazowania żywych komórek dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymi a otaczającymi komórkami zrębu.