Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Ogólnym celem tej zautomatyzowanej techniki dozowania zrobotyzowanego jest stworzenie powierzchni do topograficznego prowadzenia komórek, a następnie dostarczenie komórek do tych obiektów zgodnie z zaprogramowanym wzorcem, umożliwiając kontrolę nad zachowaniem i dystrybucją komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii biomedycznej, takie jak to, w jaki sposób topologie powierzchni mogą wpływać na zachowanie komórek, zarówno w monokulturze, jak i w kokulturze. Główną zaletą tej techniki jest to, że programowanie i drukowanie wzorca prowadzenia komórek jest mniej czasochłonne w porównaniu z bardziej uznanymi metodami.

Obejmuje również etap dostarczania komórek do kontrolowanego dozowania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że wzory 2D komórek zdeponowanych w hydrożelach mogą skorzystać na prowadzeniu powierzchniowym. W związku z tym opracowaliśmy tę technikę drukowania hydrożeli w sposób dopasowany do cech powierzchni.

Protokół ten opisuje zastosowanie zrobotyzowanego systemu dozowania wspomaganego ciśnieniem zwrotnym jako biodrukarki opartej na trawieniu powierzchni i wytłaczaniu. Aby przygotować powierzchnię styropianową do trawienia i nadruku, należy wybrać arkusz styropianu o grubości jednego milimetra. Grubsze arkusze będą się bardziej kłaniać.

Następnie potraktuj arkusz plazmą tlenową. Ustaw regulator tlenu gazowego na dwa bary. Następnie włącz maszynę plazmową i włącz pompę próżniową.

Kontynuuj programowanie maszyny na 150 watów i 30 standardowych centymetrów sześciennych na minutę przepływu tlenu gazowego i wystawiaj arkusz na działanie tych warunków przez 10 minut. Następnie opróżnij komorę, uszczelnij drzwi i rozpocznij cykl. Następnie zanurz potraktowany arkusz w czystej płodowej surowicy bydlęcej i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny z mieszaniem.

Po zabiegu serum umyj prześcieradło trzykrotnie 1X PBS i wysterylizuj prześcieradło. Po ostatnim praniu pozostaw prześcieradło w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza do wyschnięcia na noc przez około 12 godzin. Najpierw przygotuj rysik drukarski do wytrawiania.

Z dużą ostrożnością należy włożyć igłę tekstylną o średnicy 1,5 milimetra do dyszy strzykawki dozującej, aż zostanie zaklinowana i zabezpieczona. Próbując po raz pierwszy stworzyć układ bioprint, naszkicuj żądany wzór na papierze milimetrowym z ponumerowanymi osiami, aby wygenerować współrzędne x, y. Następnie wprowadź współrzędne wzoru do arkusza kalkulacyjnego.

Następnie w oprogramowaniu do drukowania wybierz Program, Dodaj program, a następnie Edytuj, Dodaj punkt, aby ustanowić program. Następnie skopiuj wartości współrzędnych x i y z arkusza kalkulacyjnego do oprogramowania do dozowania wydruków. Przed każdym uruchomieniem skalibruj wysokość z robota, aby ustawić pozycję styku rysika.

Najpierw wybierz opcję Robot. Następnie kliknij Zmiana trybu i włącz opcję Tryb nauczania. Umożliwia to działanie robota z funkcją JOG.

Aby uruchomić robota, najpierw ustaw robota w jego domyślnej pozycji, wybierając Robot, Meca Initialize. Następnie, Robot, JOG. Następnie w szczelinach x i y wprowadź odległość w milimetrach potrzebną do umieszczenia rysika dokładnie na początku wzoru.

Następnie, również w milimetrach, wprowadź wartość liczbową w szczelinie z, aby umieścić rysik lub dyszę w kontakcie z powierzchnią bez zginania lub wciskania powierzchni. Jest to oznaczone jako wartość początkowa z. Głębokość każdego rowka można zmieniać za pomocą wysokości z.

Na przykład wycięte rowki mogą mieć głębokość 40, 80 lub 170 mikronów. Potrzeba koncentracji i uważnej obserwacji, aby znaleźć punkt podparcia, tak aby nie było wygięcia rysika ani zauważalnego wgłębienia na powierzchni. Aby zapewnić sukces, zalecamy przygotowanie kilku arkuszy i uruchomienie programu na różnych wysokościach z, aby znaleźć idealną pozycję wyjściową.

Kolejnym krokiem jest zdefiniowanie instrukcji drukowania dla każdego z punktów współrzędnych. Użyj opcji Dozowanie początku linii, aby zdefiniować pierwszy punkt i inicjację drukowania. Użyj opcji Przekazywanie linii, aby wyznaczyć punkty pośrednie, a na koniec użyj dozowania na końcu linii, aby zasygnalizować robotowi, aby zakończył drukowanie.

Aby przekazać program robotowi, wybierz Robot, Wyślij dane C&T. Następnie zainicjuj uruchamianie, wybierając Robot, Zmiana trybu, Przełącz tryb pracy i przełączając ustawienie na Uruchom. Na koniec rozpocznij drukowanie.

Aby zrobić biotusz, rozpuść 2% żelatyny w Alpha MEM uzupełnionej 10% FBS i 2% antybiotykiem przeciwgrzybiczym. Umieść pożywkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza na dwie godziny, aby żelatyna rozpuściła się w podłożu. Hoduj komórki do biotuszu do 70% konfluencji w 10-centymetrowych szalkach.

Można użyć dowolnych komórek reagujących na funkcje prowadzenia powierzchniowego, które powinny wyrażać etykietę fluorescencyjną, aby można je było zobaczyć podczas procesu osadzania. Uwolnij przyłączone komórki do zawiesiny, usuwając pożywkę, myjąc komórki PBS i pokrywając komórki roztworem 1X Trypsin-EDTA przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zneutralizowaniu trypsyny pożywką, zebrać komórki w zawiesinie i granulować je w ilości 1 000 g przez pięć minut.

Opisz supernatant i ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra pożywki. Po zmierzeniu gęstości komórek wymieszaj zawiesinę ze schłodzonym roztworem biotuszu, aby uzyskać roztwór z pięcioma milionami komórek na milimetr. Następnie wlej biotusz zawierający komórki do przygotowanej strzykawki drukarskiej zablokowanej przez nasadkę przynęty.

Schłodzić załadowaną strzykawkę do czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać lepkość nadającą się do wydrukowania. Następnie wyjmij załadowaną i schłodzoną strzykawkę, zdejmij nasadkę strzykawki i załóż dyszę drukującą. Następnie podłącz załadowaną strzykawkę do systemu dozowania i podłącz ją do przewodów ciśnieniowych powietrza.

Aby wydrukować biotusz na wcześniej zaprojektowanym wzorze, krawędzie i linie muszą być wyraźne. Precyzyjny druk uzyskuje się poprzez optymalizację ciśnienia wstecznego dozownika i wskaźnika igieł dyszy drukującej. Ustaw ciśnienie wsteczne dozownika na 0,05 megapaskali dla 10-mililitrowej strzykawki ze stożkową igłą o rozmiarze 34.

Następnie w oprogramowaniu ustaw prędkość pisania na pięć milimetrów na sekundę na powierzchni folii polistyrenowej. Teraz, postępując zgodnie z zaprogramowanym wzorem, umieść komórkowy biotusz na wstępnie wytrawionych rowkach. Po zdeponowaniu komórek pozwól arkuszowi inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Później przykryj wydrukowane rusztowanie komórkowe odpowiednią pożywką wzrostową i inkubuj komórki przez 24 godziny, aby komórki przyczepiły się przed dalszymi eksperymentami. Komórki macierzyste wysiane przez biodruk w biotuszu ostatecznie osadzają się na powierzchni, a następnie są wyczuwane i wydłużane wzdłuż kierunku dyskretnie wytrawionych linii. Komórki wysiane w pożywce hodowlanej bez biodruku również wyrównane w kierunku cech.

Jednak pokrywały one również całą powierzchnię, w ten sposób biotusz ograniczał komórki do wydrukowanego śladu. Po umieszczeniu na arkuszach bez wytrawionych elementów, komórki nie wykazywały orientacji ani wyrównania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie wytrawić rowki na arkuszu styropianu, a następnie precyzyjnie biodrukować komórki w rowkach.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie do trzech godzin. Jest to bardzo przydatne dla naukowców zajmujących się bioinżynierią, aby ujawnić interakcje powierzchni komórek w modelach, w których wymagana jest anizotropia i pozycjonowanie komórek. Nie zapominaj, że biotusz zawiera żywe komórki i bardzo ważne jest, aby podczas drukowania arkuszy używać sterylnej techniki.