Name: Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę tworzenia płynnych żeli agarozowych przez obróbkę ścinającą do zawieszonego biodruku 3D. Technika umożliwia drukowanie struktur z różnymi bioatramentami i zachowaniem wysokiej żywotności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować EPSRC (EP/L016346/1), MRC oraz Doctoral Training Alliance Biosciences for Health za finansowanie i wsparcie tej pracy.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.
1. Przygotowanie łoża zawiesinowego z płynnego żelu
<ol>
	<li>Przygotuj 1,000 ml rozproszonej agarozy (0,5% w/v), dodając 5 g proszku agarozy do 1,000 ml ultraczystej wody (typ 1, >18 mΩ·cm-1) w szklanej butelce o pojemności 2,000 ml.</li>
	<li>Dodać mieszadło magnetyczne o średnicy 70 mm do mieszaniny wodnej i zabezpieczyć nakrętkę butelki, najpierw całkowicie dokrętając, a następnie odkręcając o ćwierć obrotu.</li>
	<li>Rozpuścić i wysterylizować mieszaninę, umieszczając szklaną butelkę w koszu autoklawu, zamykając pokrywę i uruchamiając cykl przez 15 minut w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 1 bar. 
	UWAGA: Ten protokół jest zawsze używany do autoklawowania roztworów w dalszych krokach.</li>
	<li>Wyjąć butelkę z autoklawu, gdy autoklaw ostygnie do 80 °C i umieścić ją na mieszadle magnetycznym (nieogrzewanym), z mieszadłem ustawionym na 800 obr./min. 
	UWAGA: Butelka i płyn pozostają gorące.</li>
	<li>Schłodzić zol w warunkach otoczenia, ciągle mieszając, aż temperatura będzie niższa niż jego Tżel (punkt żelowania), 32 °C.</li>
	<li>Wyjąć butelkę z mieszadła i przechowywać ją w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Płynny żel można przechowywać do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biotuszów
<ol>
	<li>Przygotuj biotusz na bazie gellanu, używając 1% (w/w) zolu gumy gellan o niskiej acylowości w wodzie ultraczystej (typ 1, >18 mΩ·cm-1).
	<ol>
		<li>Odważyć 0,5 g proszku gellan do łódki wagowej.</li>
		<li>Dodaj 49,5 g ultraczystej wody do szklanej butelki o pojemności 100 ml wraz z mieszadłem magnetycznym.</li>
		<li>Złóż łódkę ważącą zawierającą gellan power na pół i powoli dodawaj proszek do wody, cały czas mieszając.</li>
		<li>Rozpuścić i wysterylizować zol w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia do 20 °C.</li>
		<li>Przechowywać biotusz w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj biotusz z mieszanką pektyny i kolagenu w ultraczystej wodzie (typ 1, >18 mΩ·cm-1).
	<ol>
		<li>Przygotować podstawowe 5% (w/v) roztwory pektyn o niskiej zawartości metoksy, ważąc 2,5 g proszku pektynowego do łodzi wagowej.</li>
		<li>Dodaj 50 ml ultraczystej wody do szklanej butelki o pojemności 100 ml wraz z mieszadłem magnetycznym.</li>
		<li>Złóż łódkę ważącą zawierającą moc pektyn na pół i powoli dodawaj proszek do wody, cały czas mieszając.</li>
		<li>Mieszaninę wodną należy sterylizować w autoklawie i schłodzić do temperatury 20 °C.</li>
		<li>Przygotuj mieszanki pektynowo-kolagenowe w proporcjach 1:1 i 2:1, dodając odpowiednio 3 ml roztworu pektyny do 3 ml roztworu kolagenu lub dodając 4 ml roztworu pektyny do 2 ml roztworu kolagenu. Delikatnie wymieszać mieszanki za pomocą pipety, wyjmując i dozując mieszaninę 10x. 
		UWAGA: Tę procedurę najlepiej wykonywać przy użyciu zimnych materiałów na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu kolagenu. Wstępne chłodzenie pektyn i kolagenu można osiągnąć poprzez przechowywanie w temperaturze 4 °C przed zmieszaniem.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj biotusz z domieszką alginianu i kolagenu w ultraczystej wodzie (typ 1, >18 mΩ·cm-1).
	<ol>
		<li>Odważyć 2 g proszku alginianowego do łódki wagowej.</li>
		<li>Dodaj 50 ml ultraczystej wody do szklanej butelki o pojemności 100 ml wraz z mieszadłem magnetycznym.</li>
		<li>Złóż łódkę ważącą zawierającą moc alginianu na pół i powoli dodawaj proszek do wody, cały czas mieszając.</li>
		<li>Podgrzać dyspersję do temperatury 60 °C, ciągle mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia alginianu (klarowna, lekko brązowa ciecz), a następnie schłodzić do temperatury 20 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór alginianu pożywką do hodowli komórkowych, taką jak zmodyfikowana pożywka orła (DMEM) firmy Dulbecco, dodając 25 ml roztworu alginianu do 25 ml DMEM.</li>
		<li>Przygotuj mieszanki alginianowo-kolagenowe (1:1), dodając 3 ml roztworu alginian/DMEM do 3 ml roztworu kolagenu. Delikatnie wymieszać mieszanki za pomocą pipety, pobierając i dozując mieszaninę 10x i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Tę procedurę najlepiej wykonywać przy użyciu zimnych materiałów na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu kolagenu. Wstępne chłodzenie pektyn i kolagenu można osiągnąć poprzez przechowywanie w temperaturze 4 °C przed zmieszaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka reologiczna biotuszy
<ol>
	<li>Włącz reometr, włóż ząbkowaną geometrię 40 mm i odstaw na 30 minut.</li>
	<li>Wyzeruj wysokość szczeliny reometru za pomocą funkcji wysokości zerowej szczeliny.</li>
	<li>Dodaj ~ 2 ml próbki na dolną płytkę i opuść górną geometrię, aby uzyskać szczelinę o wysokości 1 mm.</li>
	<li>Przyciąć próbkę, usuwając nadmiar materiału wyrzuconego spomiędzy płytek. Aby to zrobić, użyj płaskiej, nieściernej krawędzi, aby odciągnąć nadmiar płynu od szczeliny i zanurzyć go w bibułce. 
	UWAGA: Kroki 3.2-3.4 są powtarzane w celu zmiany próbki przed każdym z poniższych kroków.</li>
	<li>Wykonaj profile wiskozymetryczne, aby określić wstrzykiwalność biotuszu.
	<ol>
		<li>Wybierz test wiskozymetryczny z opcji użytkownika.</li>
		<li>Wprowadź parametry testu rampy z kontrolowaną szybkością ścinania: od 0,1 do 500 s-1, z czasem narastania 1 min.</li>
		<li>Powtórzyć badanie z rampą wiskozymetryczną na nowych próbkach pod kontrolą naprężeń, stosując górne i dolne naprężenia określone na podstawie badania rampy z kontrolowaną szybkością ścinania w kroku 3.5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj testy małych odkształceń, aby określić charakterystykę żelowania biotuszu.
	<ol>
		<li>Wybierz testowanie oscylacyjne z opcji użytkownika.</li>
		<li>Wprowadź parametry do testu pojedynczej częstotliwości przy stałym obciążeniu: częstotliwość 1 Hz, odkształcenie 0,5% w ciągu 1 godziny, podczas gdy tusz żeluje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać pomiary amplitudy i częstotliwości in situ na próbkach żelowych.
	<ol>
		<li>Wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika.</li>
		<li>Wybierz przemiatanie amplitudy i wprowadź parametry dla testu przemiatania amplitudy, który jest sterowany odkształceniem: od 0,01 do 500%, przy stałej częstotliwości 1 Hz.</li>
		<li>Załaduj nową próbkę i wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika. Następnie wybierz test częstotliwości i wprowadź parametry częstotliwości od 0,01 do 10 Hz oraz odkształcenie, które znajduje się w liniowym obszarze lepkosprężystym (LVR) widm określonych na podstawie danych amplitudy uzyskanych w kroku 3.7.2 (zwykle wartość między 50% a 80% LVR).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Projektowanie i drukowanie struktur 3D za pomocą biodrukarki 3D
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie CAD, aby rozpocząć generowanie modelu CAD.
	<ol>
		<li>Wybierz punkt menu Narzędzia | Materiały w oprogramowaniu CAD do definiowania parametrów druku dla wybranego biotuszu.</li>
		<li>Wprowadź parametry drukowania odpowiednie dla używanej drukarki; na przykład w przypadku 3D Discovery wprowadź szacowaną średnicę filamentu (~200-500 μm dla większości biotuszów) w zakładce grubości, aby określić grubość Z każdej warstwy. 
		UWAGA: Rozwarstwienie końcowej konstrukcji wskazuje na potrzebę zwiększenia wartości grubości, podczas gdy utrata rozdzielczości podkreśla potrzebę zmniejszenia grubości.</li>
		<li>Zaprojektuj żądaną strukturę warstwa po warstwie, korzystając z zakładek Warstwy w oprogramowaniu. Grupuj warstwy za pomocą karty Grupuj i przypisz każdą warstwę do poziomu na płaszczyźnie Z za pomocą karty Poziom.
		<ol>
			<li>Na przykład, aby wygenerować strukturę sieciową (przy użyciu biotuszu z domieszką alginianu i kolagenu przygotowanego w kroku 2.3), utwórz jedną warstwę z włóknami wzdłuż osi x i drugą warstwę z włóknami wzdłuż osi y. Przypisz oba do osobnego poziomu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na karcie Grupuj określ wysokość budowy, wybierając liczbę powtarzających się jednostek w konstrukcji.</li>
		<li>Kliknij narzędzie Generuj, aby utworzyć kod G dla projektu i wyświetlić render 3D konstrukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij program BioCAD i uruchom oprogramowanie interfejsu człowiek-maszyna (HMI) 3D Discovery, aby rozpocząć proces drukowania.
	<ol>
		<li>Zmontuj głowicę drukującą zgodnie z instrukcjami producenta. Zamontuj mikrozawór do głowicy drukującej i wkręć wybraną dyszę do wytłaczania.</li>
		<li>Kliknij funkcję Pomiar długości igły, aby skalibrować głowicę drukującą.</li>
		<li>Załaduj naczynie hodowlane (np. płytkę 6-dołkową) na platformę drukującą.</li>
		<li>Porcjuj biotusz do wkładu drukującego i wkręć w głowicę drukującą nad mikrozaworem.</li>
		<li>Podłącz zmontowaną głowicę drukującą do pneumatycznego systemu dociskowego i wybierz głowicę drukującą w interfejsie HMI, aby się załączyć.</li>
		<li>Kliknij przycisk Sprawdź ciśnienie, aby umożliwić dostrojenie ciśnienia wytłaczania.</li>
		<li>Po wybraniu odpowiedniego ciśnienia (~30-120 kPa w zależności od żądanej rozdzielczości) otwórz wygenerowany wcześniej G-code i kliknij Uruchom, aby rozpocząć proces drukowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie analogów skóry
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) i komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) w DMEM uzupełnionych płodową surowicą bydlęcą (FBS) (10%), buforem HEPES (2,5%) i penicyliną/streptomycyną (1%) w kolbach T75 aż do osiągnięcia 90% zbieżności. Hodowla ludzkich keratynocytów naskórka (HEK) w pożywkach wzrostowych keratynocytów (KGM) aż do osiągnięcia 70%-80% konfluencji. Podczas hodowli wszystkie komórki należy przechowywać w inkubatorze w warunkach 37 °C, 5% CO2 i 95% powietrza.</li>
	<li>W celu przygotowania HDF i ADSC do biotuszów skórnych i tłuszczowych, należy przemyć komórki, delikatnie pipetując 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kolb, przechylić kolbę, aby zawirować PBS nad komórkami i aspirować, uważając, aby nie naruszyć przyłączonych komórek.
	<ol>
		<li>Aby podnieść komórki, należy odpipetować 3 ml enzymu dysocjacji komórek 1x do kolby, aby przykryć komórki i umieścić kolbę w inkubatorze na 3 minuty, mocno stukając kolbą o dłoń w celu usunięcia komórek. Zneutralizować działanie enzymu za pomocą 6 ml kompletnego DMEM. 
		UWAGA: Inkubować przez kolejne 2 minuty, jeśli komórki pozostają przyczepione po stuknięciu.</li>
		<li>W celu przygotowania biotuszów skórnych i tłuszczowych należy pipetować zawiesiny komórek do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml i pobrać 10 μl z każdej z nich do zliczania komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować pozostałe zawiesiny komórkowe o masie 300 × g przez 5 minut w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, dodać odpowiedni roztwór polimeru (przygotowany w kroku 2.2) i wymieszać, delikatnie stymulując, pipetując do następujących gęstości:
		<ol>
			<li>W przypadku warstwy tłuszczowej pipeta 5 × 105 ADSC mL-1 na 1:1 kolagen do mieszanki pektyn.</li>
			<li>W przypadku warstwy brodawkowatej pipetę 3 × 106 HDF mL-1 na mieszankę kolagenu i pektyn w proporcji 2:1.</li>
			<li>W przypadku warstwy siateczkowatej pipetą 1,5 × 106 HDF mL-1 na mieszankę kolagenu do pektyn w proporcji 2:1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wydrukować, załaduj każdy biotusz do osobnego wkładu i wydrukuj konstrukt w płynnym żelu podtrzymującym na szklanej szalce Petriego zgodnie z instrukcjami w sekcji 4.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu drukowania wstrzyknąć 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2O wokół konstruktu i 3 ml pożywki adipogennej (kompletny DMEM uzupełniony 500 μM izobutylometyloksyny [IBMX], 50 μM indometacyny i 1 μM deksametazonu) do płynnego żelu za pomocą strzykawki i igły. Umieść na noc w inkubatorze.</li>
		<li>Następnego dnia usuń konstrukt z kąpieli podporowej za pomocą szpatułki, delikatnie umyj w PBS i hoduj przez 14 dni w pożywce adipogennej na płytce 6-dołkowej.</li>
		<li>Po 14 dniach usuń wystarczającą ilość pożywki, aby utworzyć granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni konstruktu i umieść 2 × 106 keratynocytów na wierzchu konstruktu, aby utworzyć warstwę naskórka.</li>
		<li>Hodowla przez 1 tydzień przed analizą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie modelu tętnicy szyjnej
<ol>
	<li>Załaduj roztwór biotuszu z gumy gellan (przygotowany w kroku 2.1) do wkładu do drukarki.</li>
	<li>Wydrukować model tętnicy szyjnej na szalce Petriego zawierającej materiał nośny z płynnego żelu zgodnie z instrukcjami drukowania w sekcji 4.</li>
	<li>Po zakończeniu drukowania wstrzyknij 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2O wokół konstrukcji za pomocą strzykawki i igły.</li>
	<li>Po upływie minimum 3 godzin należy wyjąć konstrukt z kąpieli podporowej za pomocą szpatułki i delikatnie umyć w PBS.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).</li>
<li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+tissue+engineering%3A+scaffold+design+variables+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li>
<li>Iordachescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+the+development+of+mature+bone+containing+an+osteocyte+network%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network.</a> Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156(2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+cryopreservation+system%3A+an+effective+method+for+cell+storage%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330(2018).</li>
<li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+in+suspension+baths%3A+keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li>
<li>Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels+for+3D+bioprinting+applications%5BTitle%5D)+AND+%22View%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels for 3D bioprinting applications.</a> View. 1 (3), 20200060(2020).</li>
<li>Lieben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+3D+printing+of+human+tissues+is+taking+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The future of 3D printing of human tissues is taking shape.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191(2016).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+in+the+granular+gel+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655(2015).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).</li>
<li>Zarrintaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-based+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Agarose-based biomaterials for tissue engineering.</a> Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).</li>
<li>te Nijenhuis, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ate+Nijenhuis%2C+K+%22Thermoreversible+Networks%3A+Viscoelastic+Properties+and+Structure+of+Gels%22">Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels</a>. , Springer. Berlin. 194-202 (1997).</li>
<li>Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+model+for+the+formation+and+properties+of+fluid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A molecular model for the formation and properties of fluid gels.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).</li>
<li>Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+biopolymer+fluid+gels%3A+A+microstructural+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach.</a> Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).</li>
<li>Cooke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structuring+of+hydrogels+across+multiple+length+scales+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1705013(2018).</li>
<li>Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+therapeutic+responses+via+engineering+microenvironments+with+a+novel+synthetic+fluid+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622(2021).</li>
<li>Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilisation+of+foams+by+agar+gel+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Stabilisation of foams by agar gel particles.</a> Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).</li>
<li>Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+of+agarose+fluid+gels%3A+Rheological+properties+and+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure.</a> Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).</li>
<li>Garrec, D. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+fluid+gel+formation+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Understanding fluid gel formation and properties.</a> Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).</li>
<li>Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kappa+carrageenan+fluid+gel+material+properties.+Part+1%3A+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology.</a> Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).</li>
<li>Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+modulus+on+the+rheological+properties+of+agar+microgel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions.</a> Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).</li>
<li>Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+complex+hydrogel+structures+using+suspended+layer+additive+manufacturing+%28SLAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM).</a> Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845(2019).</li>
<li>Moakes, R. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suspended+layer+additive+manufacturing+approach+to+the+bioprinting+of+tri-layered+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents.</a> APL Bioengineering. 5 (4), 046103(2021).</li>
<li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+manufacture+of+biological+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Suspended manufacture of biological structures.</a> Advanced Materials. 29 (13), 1605594(2017).</li>
<li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344(2019).</li>
<li>Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gellan+fluid+gel+as+a+versatile+support+bath+material+for+fluid+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).</li>
<li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blended+alginate%2Fcollagen+hydrogels+promote+neurogenesis+and+neuronal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation.</a> Materials Science and Engineering: C. 104, 109904(2019).</li>
<li>Hölzl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioink+properties+before%2C+during+and+after+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).</li>
<li>Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+bioinks+for+3D+printing%3A+a+materials+science+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).</li>
<li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li>
<li>Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+next-generation+bioinks%3A+Tuning+material+properties+pre-+and+post-printing+to+optimize+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability.</a> MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).</li>
<li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomedical Materials. 10 (3), 034002(2015).</li>
<li>Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+3D+embedded+bioprinting%3A+a+focused+review+on+bioinks+and+support+baths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths.</a> Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li>
<li>Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printability%27+of+candidate+biomaterials+for+extrusion+based+3D+printing%3A+state-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264(2017).</li>
<li>Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+from+the+micrometer+to+millimeter+length+scales%3A+Size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).</li>
<li>Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+3D+printed+pharmaceuticals%3A+From+hype+to+real-world+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).</li>
<li>Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+and+the+future+of+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Surgery%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting and the future of surgery.</a> Frontiers in Surgery. 7, 609836(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Rozważenie doboru materiałów użytych do wykonania łóżka nośnego Na etapie projektowania wymagano różnych cech łóżka nośnego. Cechy te obejmowały: i) utrzymanie wystarczającej struktury do zawieszenia wytłaczanego materiału; ii) zdolność rozrzedzania przy ścinaniu, aby umożliwić głowicy drukującej swobodne poruszanie się po materiale nośnym; iii) szybka restrukturyzacja (właściwości samoregenerujące), tworząca podparcie wokół osadzonego biotuszu; iv) stabilny termicznie zarówno w temperaturze pokojowej, jak i w temperaturach fizjologicznych; v) neutralny (tj. nienaładowany) materiał, który jest stosunkowo bioobojętny, w zakresie pH i elektrolitów (formy i stężenia jonów), zapobiegając interakcjom z komórkami i naładowanymi biotuszami; vi) nietoksyczny; oraz vii) najlepiej ze źródła innego niż zwierzęce.
Chociaż istnieje wiele materiałów biopolimerowych, które zachowują kilka z tych nieodłącznych cech, ze zdolnością do wykonywania zawieszonej produkcji addytywnej 3D bez spełniania wszystkich tych cech 11,26,27, intencją było wyprodukowanie łoża nośnego, które przezwyciężyłoby pewne praktyczne problemy związane z innymi materiałami nośnymi. Ze względu na właściwości chemiczne agarozy, a w szczególności w postaci płynnego żelu w postaci cząstek stałych, można uzyskać wszystkie te cechy. Umożliwiło to stworzenie łoża nośnego, które można było stosować w szerokiej gamie biotuszy 23,24,25,28. Rzeczywiście, bioobojętny charakter materiału zapewnił potencjał do utrzymania wydrukowanej struktury in situ przez cały okres hodowli, co pozwoliło na wystarczający okres pełnego rozwoju wielu różnych biotuszów, bez zmian w biologii. Co więcej, rozrzedzający się charakter cząstek stałych pozwolił na łatwe usunięcie z końcowego wydrukowanego konstruktu, podczas gdy nietoksyczne, niezwierzęce pochodzenie daje potencjał do szybkiego przeniesienia do kliniki, pokonując bariery związane z wymogami etycznymi i regulacyjnymi.
Rozważania przy doborze materiałów do produkcji biotuszów W biodruku z wytłaczaniem bezpośrednim biotusze są osadzane na stole do druku 2D. Korzystne jest, aby roztwory monomerów biotuszu miały właściwości rozrzedzające przy ścinaniu; Jednak, aby wytworzyć konstrukcje o wysokiej wierności i fizjologicznie istotnych wymiarach, muszą one mieć niską tiksotropię i powrócić do wystarczająco wysokiej lepkości, aby po osadzeniu tworzyły stałe włókna 29,30,31. Przy zwiększonej lepkości ciśnienie wymagane do wytłaczania jest znacznie wyższe, co często negatywnie wpływa na żywotność zamkniętego ogniwa31,32. Bioprinting zawiesinowy usuwa to ograniczenie, ponieważ wytłaczany materiał jest podtrzymywany przez kąpiel zawiesinową podczas sieciowania. To osiągnięcie znacznie zwiększa zakres preparatów biotuszów, które można stosować. Na przykład, ostatnie prace wykazały zastosowanie roztworów kolagenu o niskim stężeniu drukowanych w bardzo złożonych geometriach analogicznych do wewnętrznej struktury serca 33,34,35. W zastosowaniach wymienionych w tej metodzie, druk wbudowany pozwolił na wybór farb biomateriałowych tak, aby jak najlepiej odwzorowywały środowisko fizjologiczne, do którego były przeznaczone, a nie ze względu na ich zdolność do drukowania.
Ograniczenia w wielkości konstrukcji W literaturze dotyczącej biofabrykacji wykazano, że różne rodzaje biodrukarek, napędzane alternatywnymi technologiami głowic drukujących, mogą być włączane do wbudowanych technik produkcyjnych. Nie inaczej jest w przypadku zademonstrowanej tutaj technologii, której przykładami są pneumatyczna biodrukarka oparta na mikrowytłaczaniu (INKREDIBLE), jak zademonstrowali Senior i wsp., oraz biodrukarki oparte na wytłaczaniu z kontrolowanymi mikrozaworami (3D Discovery)23. Chociaż sprawia to, że technologia jest dostępna dla wielu użytkowników, którzy mogą już posiadać biodrukarkę, ograniczenia dotyczące osiągalnego rozmiaru konstrukcji są ostatecznie zależne od specyfikacji danej biodrukarki. Początkowo głównym ograniczeniem w generowaniu dużych struktur jest rozmiar stołu drukującego, granice trajektorii X, Y i Z, a także rozmiar naczynia, w którym znajduje się płynny żel nośny.
Ograniczenia w rozdzielczości Podczas wytwarzania skomplikowanych struktur o rozmiarach mikrometrów, uzyskana rozdzielczość jest w dużym stopniu zależna od precyzji drukarki (kontrola nad rozmiarem kroku, stopniem wytłaczania), wewnętrznej średnicy dyszy drukującej i szeregu regulowanych parametrów oprogramowania, w tym prędkości drukowania, ciśnienia drukowania i prędkości przepływu36. Ponadto kontrola nad wielkością kropli wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla ułatwienia generowania struktur o wysokiej rozdzielczości, przy czym najlepsze wyniki zaobserwowano w drukarkach ekstruzyjnych z kontrolowanym mikrozaworem. Ostatecznie, gdy wszystkie parametry są zoptymalizowane, można osiągnąć rozdzielczość druku odpowiadającą lub nawet mniejszą niż wewnętrzna średnica dysz wytłaczających, z osadzonym filamentem rzęduskali mikrometrycznej 37. Jest to jednak uzależnione od optymalizacji wszystkich wspomnianych wcześniej parametrów druku, a rozdzielczość może być znacznie ograniczona przez mechanizm drukowania i precyzję. Na przykład wytłaczanie pneumatyczne nie wydaje się pozwalać na uzyskanie takiej samej rozdzielczości drukowania, jak wytłaczanie za pomocą kontrolowanego mikrozaworu. W związku z tym osiągnięcie maksymalnej rozdzielczości drukowania wiąże się z potencjalnymi kosztami, ponieważ takie systemy wiążą się ze znacznie zwiększonymi kosztami dla użytkownika.
Perspektywy na przyszłość i potencjał W chwili obecnej istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem zawieszonych procesów produkcyjnych, aby umożliwić produkcję złożonych miękkich struktur zawierających osadzone ogniwa, a w nadchodzących latach niewątpliwie nastąpi znaczny postęp. Zapewniony jest ciągły postęp w poprawie rozdzielczości druku, chociaż dopiero się okaże, jak bardzo będzie to konieczne, biorąc pod uwagę, że większość systemów biologicznych jest w stanie przeorganizować się na poziomie molekularnym. Podczas gdy zainteresowanie mediów skupia się na wykorzystaniu tkanek drukowanych w 3D do bezpośredniego zastępowania tkanek ludzkich po urazie lub chorobie, wszelkie solidne procedury medyczne możliwe dzięki tym procesom są odległe o kilka lat 38,39. Bardziej prawdopodobne jest, że wpływ tych złożonych systemów hodowlanych będzie dotyczył badań przesiewowych leków, a nawet będzie wykorzystywany jako narzędzia, aby lepiej zrozumieć procesy biologiczne38. W szczególności wiele może przynieść tu biologia rozwojowa, w której precyzyjna kontrola nad specjalnym osadzaniem się cząsteczek pozwoli naukowcom zbadać rolę układów wieloczynnikowych w procesach rozwoju tkanek.

Hydrożele są idealnymi materiałami do wykorzystania jako wsparcie dla wzrostu komórek1. W zależności od użytego materiału, żelują one za pomocą delikatnych mechanizmów, które nie zagrażają żywotności komórek2,3. Wysoka zawartość wody (zwykle >90%) oznacza, że składniki odżywcze i tlen mogą łatwo dyfundować do materiału, a produkty przemiany materii komórkowej dyfundują na zewnątrz4. W związku z tym wykazano, że żywotność komórek jest zachowana przez okresy przekraczające 1 rok5, a obecnie istnieją przykłady użycia hydrożeli do przechowywania lub "pauzy" komórek do przyszłego użytku terapeutycznego6. Są one szeroko stosowane w inżynierii tkankowej do produkcji struktur podobnych do tkanek, ale ich zastosowanie jest zwykle ograniczone przez trudności w kontrolowaniu zarówno struktury, jak i składu materiału. Historycznie rzecz biorąc, wytrzymałość hydrożelu jest stosunkowo niska (w stosunku do wielu tkanek twardych), ze względu na wysoką zawartość wody i małe objętości zajmowane przez matrycę polimerową tworzącą strukturę. Co więcej, wiele dróg żelowania (termiczna, jonotropowa, fibrylogeneza) oferuje dość powolną kinetykę, co oznacza, że ich właściwości mechaniczne mają tendencję do stabilnego rozwoju w czasie. Z wyjątkiem przenikających się sieci, niska sztywność mechaniczna i powolny czas utwardzania często powodują, że biotusze nie są w stanie swobodnie stać podczas osadzania, mają tendencję do "opadania" i utraty rozdzielczości podczas początkowego wytłaczania.
W próbie przezwyciężenia tego kluczowego problemu, opracowano techniki drukowania wbudowanego, które zapewniają wsparcie podczas drukowania, podczas gdy właściwości mechaniczne konstrukcji są rozwijane7,8. Gdy mikrostruktura żelu w pełni się rozwinie, a właściwości mechaniczne osiągną optymalność, matryca podporowa może zostać usunięta, zwykle poprzez delikatne mycie lub stopienie fazy podporowej. Początkowe prace nad tym podejściem wykorzystywały lepką dyspersję pluroniczną, w której rozłożyła się faza drugorzędowa9. Niedawno Bhattacharjee i in. użyli żeli w postaci granulowanego karbopolu, aby zademonstrować, że macierze komórek mogą być zawieszone w podtrzymującym żelu10. Następnie Hinton i in. poinformowali o wytłaczaniu materiałów na bazie żelu zawierających komórki do podłoża nośnego, które składało się z zawiesiny mikrożelu utworzonej z granulowanej żelatyny11. Po wytłoczeniu hydrożelu zawierającego komórkę i jego późniejszym utwardzeniu, żelatyna została usunięta poprzez delikatne podgrzanie kąpieli podporowej, co umożliwiło stopienie żelatyny. Niestety, proces ten nadal wiąże się z kilkoma ograniczeniami. Na przykład struktura chemiczna żelatyny w porównaniu z kolagenem (w konsekwencji to, że jest to hydrolizowana forma kolagenu) jest taka, że wiele cząstek chemicznych w jej szkielecie może wchodzić w interakcje z jednostkami biologicznymi; W związku z tym resztkowa matryca nośna może zakłócać dalsze procesy biologiczne. Co więcej, produkty pochodzenia zwierzęcego mają ograniczone zastosowanie, jeśli chodzi o przekładalność technologii. Stwarza to wyzwania, jeśli wyprodukowana część jest przeznaczona do użytku klinicznego, a nawet jeśli ma być używana do odpowiedzi na podstawowe pytania biologiczne, gdzie to zanieczyszczenie powierzchni może powodować poważny problem.
Następnie stworzyliśmy wyrafinowany proces, który pozwala na zawieszenie produkcji hydrożeli w matrycy nośnej, która nie ma ładunku w warunkach fizjologicznych i jest utworzona z materiałów niezwierzęcych. Chociaż proces ten może być stosowany z wieloma nośnikami biopolimerowymi, agaroza zapewnia materiał, który jest obojętny na interakcje biologiczne, ponieważ jest oparty na cukrze i neutralnie naładowany przy fizjologicznym pH 12,13. Zamiast rozdrabniać już istniejący żel, materiał podporowy jest formowany przez zastosowanie ścinania podczas żelowania14,15,16. W ten sposób powstaje matryca cząstek, które wykazują na swojej powierzchni cechy podobne do dendronów i są rozproszone w wtórnej matrycy niezżelowanego polimeru17,18. Rezultatem jest materiał o interesujących właściwościach materiału19,20,21,22 który może rozrzedzać się jak ścinanie w podobny sposób jak wcześniej zgłaszane granulowane żele, ale ma tendencję do szybszego odzyskiwania lepkości po usunięciu ścinania23. Gdy materiał zawierający komórki wytłaczany do matrycy nośnej w pełni dojrzeje, matryca nośna może zostać usunięta przez delikatne mieszanie przed umieszczeniem w hodowli. Wykazano, że możliwe jest wykorzystanie tego procesu do wytwarzania materiałów o złożonej strukturze i rekapitulacji struktur biologicznych zarówno skóry, jak i obszaru kostno-chrzęstnego23,24,25. W tym artykule opisano szczegółowo, jak wytworzyć materiał nośny i zwrócono uwagę na odpowiednie biotusze stosowane w różnych złożonych strukturach.

<table><tbody><tr><td>3D Discovery Bioprinter</td><td>RegenHU</td><td>BIOFACTORY</td><td>Biodrukarka do wytłaczania mikrozaworów</td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Merck</td><td>9012-36-6</td><td>Materiał używany do tworzenia płynnych żelowych wanien podtrzymujących&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoklaw stołowy</td><td>Prestige Medical</td><td>B8L75814</td><td>Classic</td></tr><tr><td>Brilliant Blue G</td><td>Merck</td><td>6104-58-1</td><td>Barwnik stosowany do barwienia struktur&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Merck&nbsp;</td><td>10035-04-8</td><td>Służy do siatkowania struktur drukowanych&nbsp;</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D4902-25MG</td><td>Stosowany w podłożach adipogennych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck</td><td>D6429</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Duran&nbsp; butelka&nbsp;</td><td>Szklana butelka</td> <td>Merck</td><td>Z305219</td>&nbsp;</tr><tr><td>Podstawowy system obrazowania EVOS XL EVOS</td><td>&handel;</td><td>AMEX1000</td><td>Mikroskop jasnego pola z kontrastem</td></tr><tr><td>fazowym FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>10500-064</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Guma gellanowa</td><td>Składniki specjalne</td><td>5060341112638</td><td>Guma o niskiej zawartości acylo-gellanu używana do produkcji biotuszu do modelu tętnicy kokardydowej</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Merck</td><td>H9897-10PAK</td><td>Bufor do pożywek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Merck</td><td>I7378</td><td>Stosowany w podłożach adipogennych</td></tr><tr><td>Izobutylometyloksantyna (IBMX)</td><td>Merck</td><td>I7018-100MG</td><td>Stosowany w podłożach adipogennych</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa keratynocytów</td><td>Lonza</td><td>00192060</td><td>Stosowana jako pożywka do hodowli keratynocytów</td></tr><tr><td>Pektyna o niskiej zawartości metoksy</td><td>CP Kelco</td><td>LM-5CS</td><td>Pektyna stosowana do wytwarzania mieszanek pektynowo-kolagenowych</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Merck</td><td>P4333-100ML</td><td>Służy do hamowania rozwoju bakterii</td></tr><tr><td>PureCol EZ Roztwór żelowy</td><td>Merck</td><td>5074</td><td>Roztwór kolagenu stosowany do wytwarzania mieszanek alginian/kolagen</td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>Merck</td><td>9005-38-3</td><td>Proszek alginianowy używany do produkcji mieszanek alginian/kolagen&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE select&nbsp;</td><td>Fisher Scientific 12563011</td><td></td><td>enzym dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>T75 Kolby</td><td>StarLab</td><td>CC7682-4175</td><td>Używany do hodowli komórek</td></tr></tbody></table>

płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3d

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Użycie matryc ziarnistych do podparcia części podczas procesu biodruku zostało po raz pierwszy zgłoszone przez Bhattacharjee et al. w 2015 roku, a od tego czasu opracowano kilka podejść do przygotowania i wykorzystania podtrzymujących łóżek żelowych w biodruku 3D. W artykule opisano proces wytwarzania zawiesin mikrożelowych przy użyciu agarozy (znanych jako żele płynne), w którym tworzenie cząstek jest regulowane przez zastosowanie ścinania podczas żelowania. W wyniku takiego przetwarzania powstają starannie zdefiniowane mikrostruktury, a następnie właściwości materiału, które nadają mu wyraźne korzyści jako zatapianie nośników druku, zarówno pod względem chemicznym, jak i mechanicznym. Obejmują one zachowywanie się jak lepkosprężyste materiały podobne do ciał stałych przy zerowym ścinaniu, ograniczanie dyfuzji na duże odległości i demonstrowanie charakterystycznego zachowania systemów flokulowanych przy ścinaniu. 
Jednak po usunięciu naprężeń ścinających, płynne żele mają zdolność do szybkiego odzyskiwania swoich elastycznych właściwości. Ten brak histerezy jest bezpośrednio związany ze zdefiniowanymi mikrostrukturami, o których wcześniej wspomniano; ze względu na przetwarzanie, reaktywne, nieżelowane łańcuchy polimerowe na granicy faz cząstek ułatwiają interakcje międzycząsteczkowe - podobne do efektu rzepu. To szybkie odzyskiwanie właściwości elastycznych umożliwia biodrukowanie części o wysokiej rozdzielczości z biomateriałów o niskiej lepkości, ponieważ szybkie odtworzenie łoża nośnego zatrzymuje biotusz na miejscu, zachowując jego kształt. Ponadto zaletą płynnych żeli agarozowych jest asymetryczne przemiany żelowania/topnienia (temperatura żelowania ~30 °C i temperatura topnienia ~90 °C). Ta histereza termiczna agarozy umożliwia drukowanie i hodowlę części biodrukowanej in situ bez topienia się płynu nośnego. Protokół ten pokazuje, jak wytwarzać płynne żele z agarozy i demonstruje ich zastosowanie do wspomagania produkcji szeregu złożonych części hydrożelowych w ramach produkcji addytywnej z warstwą zawieszoną (SLAM).

Bioatrament z alginianu i kolagenu typu I 
Zaobserwowano, że rozdzielczość druku (zapisana jako funkcja średnicy filamentu) była bezpośrednio regulowana poprzez zmiany ciśnienia ekstruzji (Rycina 1A-C). Ciśnienie ekstruzji oraz rozdzielczość druku były bezpośrednio powiązane z najmniejszymi uzyskanymi średnicami włókien. poprzez drukowanie przy ciśnieniu ekstruzji 30 kPa. Co ciekawe, przy ciśnieniu ekstruzji 30 kPa można było uzyskać filamenty o średnicy odpowiadającej średnicy wewnętrznej dyszy ekstruzyjnej (średnia średnica filamentu: 323 µm ± 50 µm; średnica dyszy: 300 µm), co sugeruje, że możliwe jest osiągnięcie „maksymalnej rozdzielczości”. Co więcej, parametry druku dla tej rozdzielczości można z powodzeniem zastosować do wytworzenia alginianowo-kolagenowej rurki naczyniowej, którą można wyekstrahować i poddać perfuzji (Rycina 1D).
<img alt="Eksperyment fotopolimeryzacji hydrożelu; obrazy mikroskopowe pokazują wzory kratowe i szczegóły strukturalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Generowanie wydruków o wysokiej rozdzielczości przy użyciu SLAM. Dostosowanie rozdzielczości wydruku sieci alginian/kolagen w funkcji średnicy włókna poprzez ekstruzję przy (A) 30 kPa, (B) 60 kPa i (C) 120 kPa. (D) Generowanie naczyniowej rurki alginian/kolagen. Paski skali = 400 µm (A-C), 10 mm (D). Skrót: SLAM = suspended-layer additive manufacture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Analogi skóry 
SLAM został również wykorzystany do stworzenia struktury przypominającej skórę (Rysunek 2A) z użyciem bioatramentu utworzonego z mieszaniny kolagenu I i pektyny. Aby uzyskać gradient właściwości mechanicznych zbliżony do tych występujących w skórze, w warstwie skóry właściwej (5% w/w pektyny zmieszanej w stosunku 2:1 ze stężeniem zapasowym kolagenu 5 mg∙mL−1) oraz w warstwie podskórnej (5% w/w pektyny zmieszanej w stosunku 1:1 ze stężeniem zapasowym kolagenu 5 mg∙mL−1) zastosowano różne proporcje pektyny i kolagenu. Powstała struktura (Rysunek 2Bi-Bii) była dobrze zintegrowana po zanurzeniu w DMEM, bez oznak delaminacji. Co istotne, po 14-dniowym okresie hodowli w całej strukturze odnotowano wysoki poziom żywotności komórek (Rysunek 2Biii). Co ciekawe, w czasie hodowli materiały uległy utwardzeniu24, co wskazuje na przebudowę materiału.
<img alt="Układ hodowli komórkowej z komórkami widocznymi pod mikroskopem. Obrazy mikroskopowe przekroju tkanki i analiza macierzy 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Produkcja struktury przypominającej skórę. (A) Schemat przedstawiający wykorzystanie procesu SLAM do produkcji warstwowej struktury z zatopionymi ludzkimi fibroblastami skóry właściwej. Złoże podtrzymujące zostało tutaj wykonane z cząsteczek agarozy, natomiast warstwy hipodermy i skóry właściwej utworzono z różnych proporcji pektyny i kolagenu I. (B) Warstwowa struktura miała reprezentować trójwarstwową budowę skóry (i). Po pomyślnym odtworzeniu tej struktury (ii) odnotowano wysoką żywotność komórek w całych próbkach, co wykazano za pomocą barwienia kalceiną-AM (iii). Pasek skali = 5 mm (Bii). Skrót: SLAM = suspended-layer additive manufacture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tętnica szyjna 
W celu przetestowania granic możliwości tej metody wykonano zestaw bardziej złożonych wydruków. W jednym z takich przykładów wydrukowano rozwidloną tętnicę szyjną przy użyciu 1% bioatramentu z gellanem (Ryc. 3A), który następnie sieciowano poprzez ekstruzję 200 mM CaCl2 wewnątrz łoża z żelu płynnego (Ryc. 3B), a po żelowaniu po prostu uniesiono z podłoża (Ryc. 3C>). Mimo niskiej lepkości roztworów prekursorowych użytych do druku, podtrzymujące łoże skutecznie umożliwiło wytworzenie złożonej geometrii. Tętnica zachowała swoją strukturę podczas osadzania, sieciowania i wyjmowania (Ryc. 3>), bez konieczności modyfikowania kodów druku w celu wprowadzenia dodatkowych rusztowań.
<img alt="Proces inżynierii tkankowej: rusztowanie żelatynowe w szalce Petriego, zanurzenie w roztworze, decelularyzacja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Proces wytwarzania tętnicy szyjnej z gellanu przy użyciu metody SLAM. (A) Ekstruzja gellanu w obrębie łoża z żelu płynnego podczas drukowania, (B) ukończony wydruk tętnicy szyjnej w żelu płynnym podczas sieciowania oraz (C) końcowy model tętnicy szyjnej po wyjęciu z podparcia w żelu płynnym. Paski skali = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

Możliwość stosowania różnych biotuszy ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego rozwoju struktur biodrukowanych, a technologia ta ułatwia stosowanie materiałów, które są na ogół niekompatybilne z konwencjonalnymi technikami druku. Podłoże zawieszające zapobiega zapadaniu się biotuszy o niskiej lepkości po osadzeniu i umożliwia integrację różnych biotuszów w jednym konstrukcie w celu stworzenia regionalnych różnic we właściwościach chemicznych i mechanicznych, które są bardziej zbliżone do tkanki rodzimej. Procedurę zademonstrują dr Tom Robertson, pracownik naukowy z Uniwersytetu w Birmingham oraz dr Jessica Senior, pracownik naukowy z Uniwersytetu w Huddersfield.Aby rozpocząć, włącz reometr i włóż 40-milimetrową ząbkowaną geometrię, pozwalając mu stać przez 30 minut. Wyzeruj wysokość szczeliny reometru za pomocą funkcji wysokości zerowej szczeliny. Dodaj około dwóch mililitrów próbki na dolną płytkę i opuść górną geometrię, aby utworzyć szczelinę o wysokości jednego milimetra.Przyciąć próbkę, usuwając nadmiar materiału wyrzuconego spomiędzy płytek za pomocą płaskiej, nieściernej krawędzi, aby odciągnąć nadmiar płynu od szczeliny, i zanurzyć ją w bibułce. Aby określić możliwość wstrzykiwania biotuszu, wykonaj profile wiskozymetryczne, wybierając Test wiskozymetrii z opcji użytkownika. Wprowadź parametry testu rampy z kontrolowaną szybkością ścinania przy prędkości od 0,1 do 500 na sekundę z jednominutowym czasem narastania.Załaduj nową próbkę i powtórz proces, aby zapewnić odtwarzalność. Aby określić charakterystykę żelowania biotuszu, przeprowadzono testy małych odkształceń, wybierając testy oscylacyjne z opcji użytkownika. Wprowadź parametry do testu pojedynczej częstotliwości pod stałym obciążeniem, jako częstotliwość jednego herca, odkształcenie 0,5% w ciągu jednej godziny, podczas gdy atrament żeluje.Powtórzyć badanie rampy wiskozymetrycznej na nowych próbkach pod kontrolą naprężeń, stosując górne i dolne naprężenia określone na podstawie badania rampy z kontrolowaną szybkością ścinania w kroku, jak pokazano wcześniej. Aby wykonać pomiary amplitudy i częstotliwości in situ na próbkach żelowych, wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika. Po wybraniu przemiatania amplitudy wprowadź parametry testu przemiatania amplitudy, który jest kontrolowany odkształceniem w zakresie od 0,01 do 500% przy stałej częstotliwości jednego herca.Po zakończeniu testu przeanalizuj widma, aby określić liniowy obszar lepkosprężysty. Załaduj nową próbkę do reometru i pozwól jej się zżelować. Następnie wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika.Wybierz test częstotliwości i parametry częstotliwości wejściowej w zakresie od 0,01 do 10 Hz oraz odkształcenie w liniowym obszarze lepkosprężystym widm wyznaczone na podstawie uzyskanych wcześniej danych amplitudy. Aby uruchomić oprogramowanie CAD i rozpocząć generowanie modelu CAD, należy wybrać opcję Narzędzia, a następnie kliknąć na Materiały w oprogramowaniu CAD, aby zdefiniować parametry druku dla wybranego biotuszu. Wprowadź szacowaną średnicę filamentu w zakładce Grubość, aby określić grubość z każdej warstwy.Aby zaprojektować strukturę warstwa po warstwie, użyj zakładek Warstwy w oprogramowaniu, pogrupuj warstwy za pomocą karty Grupuj i przypisz każdą warstwę do poziomu na płaszczyźnie z za pomocą zakładki Poziom. Wygeneruj strukturę kratową, tworząc jedną warstwę z włóknami wzdłuż osi x i drugą warstwę wzdłuż osi y i przypisz obie do osobnego poziomu. Na karcie Grupuj określ wysokość budowy, wybierając liczbę powtarzających się jednostek w konstrukcji.Następnie kliknij narzędzie Generuj, aby utworzyć kod G dla projektu i wyświetlić render 3D konstrukcji. W biodrukarce wlej biotusz do wkładu drukującego i wkręć go w głowicę drukującą nad mikrozaworem. Następnie kliknij funkcję pomiaru długości igły, aby skalibrować głowicę drukującą.Następnie podłącz zmontowaną głowicę drukującą do pneumatycznego układu ciśnieniowego i załaduj naczynie do hodowli na platformę drukującą. Po wybraniu odpowiedniego nacisku otwórz wygenerowany wcześniej kod G i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć proces drukowania. Po zakończeniu drukowania tętnicy szyjnej użyj strzykawki i igły, aby wstrzyknąć dwa mililitry 200-milimolowego dwuwodzianu chlorku wapnia wokół konstruktu.Po upływie co najmniej trzech godzin usuń podłoże z płynnego żelu z okolic konstrukcji i delikatnie umyj je w PBS. Następnie usuń konstrukcję z kąpieli podtrzymującej za pomocą szpatułki. Zaobserwowano dostosowanie rozdzielczości druku sieci alginianowych i kolagenowych w funkcji średnicy filamentu poprzez wytłaczanie przy 30, 60 i 120 kilopaskalach, a wyniki wykazały, że rozdzielczość można bezpośrednio dostroić do zmian ciśnienia wytłaczania.Aby uzyskać gradient właściwości mechanicznych podobny do tych, które występują w skórze, zastosowano różne proporcje pektyn i kolagenu w warstwie skórnej i podskórnej, w wyniku czego uzyskano strukturę bez oznak rozwarstwienia. Po 14 dniach hodowli, podczas których materiały usztywniały się, zaobserwowano wysoki poziom żywotności komórek w całej strukturze, co wskazuje na przebudowę materiału. W przypadku reologii ważne jest, aby próbka była prawidłowo załadowana, aby zapewnić powtarzalne dane, a w przypadku biodruku ważne jest, aby struktura była w pełni usieciowana przed usunięciem jej ze złoża nośnego.Hodowla konstruktów tkankowych na dużą skalę przez dłuższy czas pomaga zbadać reakcję osadzonych komórek na bodźce fizyczne i chemiczne.

agarose-fluid-gels-formed-shear-processing-during-gelation-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Tutaj opracowaliśmy nową, wielowarstwową, zmodyfikowaną strategię dla płynnych biotuszy (żelatyna metakryloyl o niskiej lepkości), aby zapobiec sedymentacji zamkniętych komórek.

Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

Ten artykuł opisuje protokoły wysokoprzepustowej produkcji mikrożelu żelowego z żelatyny metakryloylowej za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, przekształcania mikrożeli w proszek do resuspensable (mikroaerożele), chemicznego łączenia mikrożeli w celu utworzenia granulowanych rusztowań hydrożelowych oraz opracowywania granulowanych biotuszy hydrożelowych o zachowanej mikroporowatości do biodruku 3D.

Rusztowania hydrożelowe żelatynowo-metakryloilowe granulowane: wysokoprzepustowa produkcja mikrożeli, liofilizacja, montaż chemiczny i biodruk 3D

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Poznaj metodę tworzenia płynnych żeli agarozowych przez obróbkę ścinającą do zawieszonego biodruku 3D. Technika umożliwia drukowanie struktur z różnymi bioatramentami i zachowaniem wysokiej żywotności komórek.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

Przeglądaj więcej filmów