Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D
26 maja 2023
Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.
Możliwość stosowania różnych biotuszy ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego rozwoju struktur biodrukowanych, a technologia ta ułatwia stosowanie materiałów, które są na ogół niekompatybilne z konwencjonalnymi technikami druku. Podłoże zawieszające zapobiega zapadaniu się biotuszy o niskiej lepkości po osadzeniu i umożliwia integrację różnych biotuszów w jednym konstrukcie w celu stworzenia regionalnych różnic we właściwościach chemicznych i mechanicznych, które są bardziej zbliżone do tkanki rodzimej. Procedurę zademonstrują dr Tom Robertson, pracownik naukowy z Uniwersytetu w Birmingham oraz dr Jessica Senior, pracownik naukowy z Uniwersytetu w Huddersfield.
Aby rozpocząć, włącz reometr i włóż 40-milimetrową ząbkowaną geometrię, pozwalając mu stać przez 30 minut. Wyzeruj wysokość szczeliny reometru za pomocą funkcji wysokości zerowej szczeliny. Dodaj około dwóch mililitrów próbki na dolną płytkę i opuść górną geometrię, aby utworzyć szczelinę o wysokości jednego milimetra.
Przyciąć próbkę, usuwając nadmiar materiału wyrzuconego spomiędzy płytek za pomocą płaskiej, nieściernej krawędzi, aby odciągnąć nadmiar płynu od szczeliny, i zanurzyć ją w bibułce. Aby określić możliwość wstrzykiwania biotuszu, wykonaj profile wiskozymetryczne, wybierając Test wiskozymetrii z opcji użytkownika. Wprowadź parametry testu rampy z kontrolowaną szybkością ścinania przy prędkości od 0,1 do 500 na sekundę z jednominutowym czasem narastania.
Załaduj nową próbkę i powtórz proces, aby zapewnić odtwarzalność. Aby określić charakterystykę żelowania biotuszu, przeprowadzono testy małych odkształceń, wybierając testy oscylacyjne z opcji użytkownika. Wprowadź parametry do testu pojedynczej częstotliwości pod stałym obciążeniem, jako częstotliwość jednego herca, odkształcenie 0,5% w ciągu jednej godziny, podczas gdy atrament żeluje.
Powtórzyć badanie rampy wiskozymetrycznej na nowych próbkach pod kontrolą naprężeń, stosując górne i dolne naprężenia określone na podstawie badania rampy z kontrolowaną szybkością ścinania w kroku, jak pokazano wcześniej. Aby wykonać pomiary amplitudy i częstotliwości in situ na próbkach żelowych, wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika. Po wybraniu przemiatania amplitudy wprowadź parametry testu przemiatania amplitudy, który jest kontrolowany odkształceniem w zakresie od 0,01 do 500% przy stałej częstotliwości jednego herca.
Po zakończeniu testu przeanalizuj widma, aby określić liniowy obszar lepkosprężysty. Załaduj nową próbkę do reometru i pozwól jej się zżelować. Następnie wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika.
Wybierz test częstotliwości i parametry częstotliwości wejściowej w zakresie od 0,01 do 10 Hz oraz odkształcenie w liniowym obszarze lepkosprężystym widm wyznaczone na podstawie uzyskanych wcześniej danych amplitudy. Aby uruchomić oprogramowanie CAD i rozpocząć generowanie modelu CAD, należy wybrać opcję Narzędzia, a następnie kliknąć na Materiały w oprogramowaniu CAD, aby zdefiniować parametry druku dla wybranego biotuszu. Wprowadź szacowaną średnicę filamentu w zakładce Grubość, aby określić grubość z każdej warstwy.
Aby zaprojektować strukturę warstwa po warstwie, użyj zakładek Warstwy w oprogramowaniu, pogrupuj warstwy za pomocą karty Grupuj i przypisz każdą warstwę do poziomu na płaszczyźnie z za pomocą zakładki Poziom. Wygeneruj strukturę kratową, tworząc jedną warstwę z włóknami wzdłuż osi x i drugą warstwę wzdłuż osi y i przypisz obie do osobnego poziomu. Na karcie Grupuj określ wysokość budowy, wybierając liczbę powtarzających się jednostek w konstrukcji.
Następnie kliknij narzędzie Generuj, aby utworzyć kod G dla projektu i wyświetlić render 3D konstrukcji. W biodrukarce wlej biotusz do wkładu drukującego i wkręć go w głowicę drukującą nad mikrozaworem. Następnie kliknij funkcję pomiaru długości igły, aby skalibrować głowicę drukującą.
Następnie podłącz zmontowaną głowicę drukującą do pneumatycznego układu ciśnieniowego i załaduj naczynie do hodowli na platformę drukującą. Po wybraniu odpowiedniego nacisku otwórz wygenerowany wcześniej kod G i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć proces drukowania. Po zakończeniu drukowania tętnicy szyjnej użyj strzykawki i igły, aby wstrzyknąć dwa mililitry 200-milimolowego dwuwodzianu chlorku wapnia wokół konstruktu.
Po upływie co najmniej trzech godzin usuń podłoże z płynnego żelu z okolic konstrukcji i delikatnie umyj je w PBS. Następnie usuń konstrukcję z kąpieli podtrzymującej za pomocą szpatułki. Zaobserwowano dostosowanie rozdzielczości druku sieci alginianowych i kolagenowych w funkcji średnicy filamentu poprzez wytłaczanie przy 30, 60 i 120 kilopaskalach, a wyniki wykazały, że rozdzielczość można bezpośrednio dostroić do zmian ciśnienia wytłaczania.
Aby uzyskać gradient właściwości mechanicznych podobny do tych, które występują w skórze, zastosowano różne proporcje pektyn i kolagenu w warstwie skórnej i podskórnej, w wyniku czego uzyskano strukturę bez oznak rozwarstwienia. Po 14 dniach hodowli, podczas których materiały usztywniały się, zaobserwowano wysoki poziom żywotności komórek w całej strukturze, co wskazuje na przebudowę materiału. W przypadku reologii ważne jest, aby próbka była prawidłowo załadowana, aby zapewnić powtarzalne dane, a w przypadku biodruku ważne jest, aby struktura była w pełni usieciowana przed usunięciem jej ze złoża nośnego.
Hodowla konstruktów tkankowych na dużą skalę przez dłuższy czas pomaga zbadać reakcję osadzonych komórek na bodźce fizyczne i chemiczne.
Przegląd
Artykuł ten omawia wykorzystanie przetwórstwa ścinającego w procesie formowania hydrożeli w celu stworzenia zawiesin mikrogeli, które mogą być wykorzystywane w druku 3D tkankami (bioprintingu). Szczegółowo opisano metody wytwarzania nośnych łóżek i bioatramentów, podkreślając ich znaczenie w opracowywaniu złożonych struktur zawierających komórki.
Kluczowe Elementy Badań
Obszar Nauki
- Druk 3D tkankami (Bioprinting)
- Technologia hydrożeli
- Nauka o materiałach
Wprowadzenie
- Hydrogele są niezbędne do tworzenia struktur, które naśladują tkanki rodzime.
- Materiały o właściwościach spływających pod wpływem ścinania (shear-thinning) mogą szybko restrukturyzować się po usunięciu sił ścinających.
- Różne bioatramenty umożliwiają integrację zróżnicowanych właściwości w drukowanych strukturach.
- Pomyślny druk 3D tkankami wymaga starannej kontroli właściwości materiałowych i parametrów drukowania.
Cel Badań
- Zbadanie metod wytwarzania bioatramentów i macierzy nośnych.
- Demonstracja procesu druku 3D tkankami przy użyciu dopasowanych bioatramentów.
- Ocena właściwości mechanicznych i przeżywalności struktur drukowanych.
Wykorzystane Metody
- Reometria do oceny właściwości bioatramentów.
- Profile wiskozymetrii w celu określenia wstrzykiwalności.
- Testy oscylacyjne w celu oceny właściwości żelujących.
- Modelowanie CAD do projektowania struktur drukowanych 3D.
Główne Wyniki
- Rozdzielczość struktur drukowanych można było dostosować, regulując ciśnienie ekstruzji.
- Właściwości mechaniczne o własnościach gradientowych uzyskano dzięki stosowaniu zróżnicowanych kompozycji bioatramentów.
- Wysoka przeżywalność komórek była utrzymywana przez cały okres hodowli.
- Materiały wykazywały cechy przebudowy w czasie.
Wnioski
- Przetwórstwo ścinające jest skuteczne do tworzenia odpowiednich bioatramentów do druku 3D tkankami.
- Odpowiednie obciążenie i krzyżowanie są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych wyników.
- Długotrwała hodowla konstruktów tkankowych może ujawnić odpowiedzi komórkowe na bodźce.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Suspended 3D bioprinting using agarose fluid gels formed by shear processing enables the fabrication of complex, high-resolution tissue constructs from low-viscosity bioinks. This approach addresses a key challenge in bioprinting by providing a tunable, supportive matrix that maintains construct fidelity and allows integration of multiple bioinks for region-specific properties. The method enhances predictive confidence in early-stage tissue engineering and supports portfolio advancement by enabling reproducible, scalable workflows for advanced biomaterial development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of bioink compatibility and mechanical property gradients in engineered tissues.
- Enables functional validation of support matrices for complex construct formation.
- Supports predictive confidence in material selection and construct design for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible support beds for high-resolution bioprinting workflows.
- Standardizes rheological and viscometric assessment of bioinks for quantitative assay development.
- Enables scalable screening of bioink formulations and construct geometries.
Translational & Preclinical Research
- Supports creation of tissue constructs with region-specific chemical and mechanical properties relevant to disease modeling.
- Enables long-term culture and assessment of cell viability and material remodeling in preclinical models.
- Provides continuity from discovery-stage material validation to translational tissue engineering studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust hypothesis testing of bioink and support matrix combinations, supporting lead identification and validation of tissue constructs for advanced applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of bioink performance and construct stability under physiologically relevant conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative rheological and viscometric outputs for bioink and support matrix assessment.
- Analytics: Provides mechanical and structural readouts to compare construct fidelity and material remodeling.
- Translational Research: Aligns with preclinical requirements for tissue construct viability and functional integration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for rapid prototyping and validation of new bioink formulations and construct designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct fidelity and material performance.
- Operational Value: Standardizes bioprinting and rheological assessment for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for bioink and construct development, reducing late-stage risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of tissue engineering programs and advanced biomaterial assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rheology, viscometry, and bioprinting instrumentation.
- Demands access to calibrated rheometers, bioprinters, and CAD modeling tools.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and testing protocols.
- Adaptation may be needed for different bioink chemistries and construct geometries.
- Careful control of cross-linking and support removal is essential for reproducible outcomes.
