Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Ogólnym celem tej procedury jest wydrukowanie trzech fibroblastów T trzy na powierzchni pokrytej surowicą. Osiąga się to poprzez wstępną adsorpcję surowicy na powierzchni tkankowej kultury tkankowej. Drugim krokiem jest wydrukowanie zawiesiny fibroblastów na powierzchni za pomocą mikroobserwatora o ciągłym przepływie, a następnie inkubacja komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie wydrukowane komórki, a także komórki wysiane przez standardową hodowlę komórkową są barwione jodkiem propidyny i wizualizowane pod odwróconym mikroskopem w celu porównania. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do oceny żywotności, gęstości i morfologii komórek w odpowiednich punktach czasowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak drukowanie na szpilkach, jest to, że głowica drukująca tworzy uszczelnienie na powierzchni, umożliwiając drukowanie komórek zanurzonych w nośniku komórkowym.

Podczas gdy drukowanie w zanurzeniu komórek jest przydatne do badań przesiewowych nowych kandydatów na leki pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności, drukowanie w zanurzeniu jest również przydatne w innych zastosowaniach. Na przykład, możemy analizować nowych kandydatów na leki w porównaniu z wycinkami tkanek lub możemy użyć ich jako modelu dla układów narządów. Na przykład model obfitości wątroby.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ podczas zalewania drukarki i drukowania komórek powietrze nie może dostać się do linii lub może spowodować śmierć komórki. Aby rozpocząć rozmrażanie NIH, trzy komórki T przez dwie do trzech minut w wstrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnej pożywki i odwirować przy 1500 G przez trzy minuty.

Usunąć supernatant komórkowy bez naruszania osadu komórkowego. Następnie ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki i przenieść 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do 0,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów błękitu triamowego do zawiesiny komórek i wymieszaj końcówką pipety pipety 10 mikrolitrów wybarwionych komórek do komory hemocytometru.

Przed policzeniem komórek w 10-krotnym powiększeniu, policz żywe komórki, które przypominają małe białe kulki, na cztery z dziewięciu dużych kwadratów. Policz tylko żywe komórki, które nie wydają się ciemnoniebieskie z niebieskiej plamy pióra. Oblicz średnią liczbę komórek na duży kwadrat, co daje liczbę komórek razy 10 000 komórek na mililitr w oryginalnej zawiesinie komórek.

Następnie wysiewaj komórki o gęstości 100 000 komórek na mililitr, w sumie pięć mililitrów w każdej kolbie T 25. Hoduj komórki do poziomu od 70 do 80% płynności co przed rozpoczęciem eksperymentów. Aby przygotować powierzchnię drukowania, użyj markera, aby zaznaczyć prostokąt wielkości głowicy drukującej na spodzie polistyrenu 12 poddanego działaniu kultur tkankowych.

Dobrze nacisnąć pipetą 50 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej w prostokątny obszar i rozprowadzić po całym regionie. Za pomocą końcówki pozostaw na noc płytkę dołka w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby plamka surowicy całkowicie wyschła. Aby rozpocząć drukowanie w zanurzeniu, wypłucz głowicę drukującą wodą destylowaną.

Następnie napełnij 60-milimetrową szalkę Petriego wodą destylowaną i zanurz głowicę drukującą na powierzchni, przepływając destylowaną wodę przez każdą z linii przez dwie minuty z prędkością 150 mikrolitrów na minutę za pomocą pompy pneumatycznej. Następnie wylej wodę z szalki Petriego i napełnij ją czystą wodą. Następnie trzykrotnie przesuń głowicę drukującą w górę i w dół w wodzie.

Zadokuj środek głowicy drukującej nad miejscem pokrytym serum we wstępnie przygotowanej płytce 12-dołkowej. Następnie zalej głowicę drukującą za pomocą funkcji Prewarm. Kompletne media o pojemności 300 mikrolitrów na kanał.

Jeśli wykonujesz wiele wydruków, dodaj wybielacz do płukania oprócz płukania wodą między wydrukami. Przystąp do drukowania zawieszonych komórek w stężeniu 50 000 komórek na mililitr na powierzchni i przy 60 mikrolitrach na minutę. 100 mikrolitrów na kanał.

Po wydrukowaniu komórek umieść głowicę drukującą przytwierdzoną do powierzchni, a kolektor w inkubatorze do hodowli komórkowych. Ustaw na 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Po dwugodzinnej inkubacji zdejmij głowicę drukującą i umieść pokrywkę na naczyniu hodowlanym.

Godzina, w której głowica drukująca jest wyjmowana, jest uważana za punkt czasu godziny zero. Dla porównania przeprowadza się również standardową hodowlę komórkową. Dodaj jeden mililitr wstępnie ciepłej pożywki do jednej z 12-dołkowych płytek z surowicą, a następnie weź jeden mililitr pozostałej zawiesiny komórek i pipetuj ją do jednego dołka 12-dołkowej płytki.

W ten sposób powstanie kultura zawierająca 50 000 komórek w naczyniu. Umieść płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Po dwugodzinnej inkubacji rozpocznij odmierzanie czasu w celu uzyskania spójności między próbkami drukowanymi a próbkami do wysiewu.

Jest to uważane za punkt czasowy godziny zero. Po 0, 2, 24 i 48 godzinach przygotuj komórki z każdej z dwóch metod do obrazowania poprzez barwienie jodkiem propidyny, który jest wprowadzany tylko do jądra martwych komórek. Najpierw delikatnie spłucz komórki trzy razy jednym mililitrem soli fizjologicznej z wapniem i magnezem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Następnie dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdego naczynia hodowlanego, a następnie jeden mikrolitr jodku propidyny. Roztwór podstawowy inkubować komórki wybarwione jodkiem propidyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przed obrazowaniem komórek za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 10x i 40x. Na koniec wyrzuć komórki do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.

Linia komórkowa fibroblastów, NIH trzy komórki T trzy zostały wydrukowane lub wysiane na zanurzonej powierzchni. Po wydrukowaniu i wysianiu komórki zostały zobrazowane w celu oceny gęstości i morfologii w odpowiednich punktach czasowych. Obrazy pokazały, że komórki mają prawie identyczne fenotypy w każdym punkcie czasowym i przy każdym powiększeniu.

Na podstawie tych danych ustalono, że efektywny druk jest minimalny. Żywotność komórek oceniono za pomocą barwienia jodkiem propidyny i ujawniono, że żywotność wydrukowanych komórek nie różniła się znacząco od żywotności komórek osadzonych w każdym punkcie czasowym. Główną różnicą między tymi dwiema metodami mocowania komórek do powierzchni jest gęstość komórek.

Gęstość drukowanych komórek zmniejsza się w dwugodzinnym punkcie czasowym o ponad 50% zarówno w komórkach siedzących, jak i drukowanych. Uzasadnione są dalsze badania w celu ustalenia przyczyny tego spadku. Jednak ogólne proporcje gęstości druku w porównaniu z zasiewem pozostają znacznie wyższe.

Gęstość drukowanych komórek w komórce przepływowej była około 10 razy gęstsza w każdym punkcie czasowym niż w komórkach zasianych, biorąc pod uwagę, że komórki były drukowane z tą samą gęstością co zasiewanie, ale na mniejszym obszarze. W końcowym punkcie czasowym komórki mają tę samą gęstość, co jest prawdopodobnie spowodowane ruchliwością komórek i ograniczeniami zużycia zasobów. Od czasu jej opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków do badania wpływu toksyczności i skuteczności leków na komórki i raka, AIDS, choroby serca i inne dziedziny, na które jest duże zapotrzebowanie.

Stosując zanurzone drukowanie komórek w połączeniu z innymi technologiami, takimi jak adherencja, programowalna adhezja komórek, możemy rozszerzyć zasięg tej techniki na komórki zawiesinowe w celu rozszerzonego odkrywania leków i badań przesiewowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć solidną wiedzę na temat drukowania komórek przy użyciu naszej techniki drukowania zanurzonego.