Name: Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj zanurzone drukowanie komórek fibroblastów NIH 3T3 na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie cytotoksyczności i skuteczności leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Chrisowi Morrowowi za pomoc techniczną. Finansowanie zostało zapewnione przez NIH SBIR (R43) grant 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przechowuj zapasy komórek NIH/3T3 w ciekłym azocie, aż będą gotowe do użycia.</li>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę dla komórek NIH/3T3 za pomocą zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 mM buforem HEPES, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Rozmrażać komórki przez 2-3 minuty w wstrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki i odwirować przy 1 500 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant komórkowy bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 5 ml pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
	<ol>
		<li>Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.</li>
		<li>Dodać 10 μl błękitu trypanowego do zawiesiny komórek i wymieszać końcówką pipety.</li>
		<li>Pobrać pipetą 10 μl wybarwionych komórek do komory hemocytometru.</li>
		<li>Policz komórki w hemocytometrze przy 10-krotnym powiększeniu.
		<ol>
			<li>Policz żywe komórki (małe, białe kulki) na 4 z 9 dużych kwadratów. Policz tylko żywe komórki, które nie wydają się ciemnoniebieskie z plamy Trypan Blue.</li>
			<li>Oblicz średnią liczbę komórek na duży kwadrat, co daje liczbę komórek x 104 komórki/ml w oryginalnej zawiesinie komórek.</li>
			<li>Komórki nasienne o gęstości 1 x105 komórek/ml o łącznej objętości 5 ml w każdej kolbie T25.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hoduj komórki do zbieżności od 70% do 80% przed rozpoczęciem eksperymentów. Odświeżaj nośniki co 2-3 dni lub w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie powierzchni druku
<ol>
	<li>Zaznacz markerem prostokąt na spodzie 12-dołkowej płytki z polistyrenu poddanego działaniu kultur tkankowych (TCTPS) o rozmiarze głowicy drukującej (7 mm x 19 mm).</li>
	<li>Odpipetować 50 μl płodowej surowicy bydlęcej do prostokątnego obszaru i rozprowadzić ją po całym obszarze za pomocą końcówki.</li>
	<li>Pozostaw szalkę Petriego w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego O/N, aby plamka surowicy całkowicie wyschła. Płytki te należy przygotować nie później niż 2 dni przed użyciem.</li>
</ol>
3. Drukowanie zanurzone
<ol>
	<li>Wypłucz głowicę drukującą wodą destylowaną.
	<ol>
		<li>Napełnij szalkę Petriego o średnicy 60 mm wodą destylowaną i zanurz głowicę drukującą w powierzchni.</li>
		<li>Przepływać wodę destylowaną przez każdą z linii przez 2 minuty z prędkością 150 μl/min za pomocą pompy pneumatycznej.</li>
		<li>Wylej wodę z szalki Petriego i napełnij ją czystą wodą.</li>
		<li>Przesuń głowicę drukującą w górę i w dół w wodzie 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokuj środek głowicy drukującej nad miejscem pokrytym serum we wstępnie przygotowanej płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Zalać głowicę drukującą wstępnie podgrzanym kompletnym nośnikiem o pojemności 300 μl na kanał.</li>
	<li>Wydrukuj zawieszone komórki w stężeniu 50 000 komórek/ml na powierzchni i 60 μl/min, 100 μl na kanał.</li>
	<li>Umieść głowicę drukującą przytwierdzoną do powierzchni, a kolektor w inkubatorze do hodowli komórkowych ustaw na 5% CO2 i 37 °C na 2 godziny.</li>
	<li>Po 2-godzinnej inkubacji zdejmij głowicę drukującą i umieść pokrywkę na naczyniu hodowlanym. Czas, w którym głowica drukująca została usunięta, jest uważany za punkt czasowy 0 godzin.</li>
</ol>
4. Standardowa hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do jednej z 12-dołkowych płytek TCTPS z plamkami surowicy, przygotowanych w kroku 2.</li>
	<li>Pobrać 1 ml pozostałej zawiesiny komórek z etapu 2 i pipetować do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce TCTPS. W ten sposób powstanie kultura zawierająca 50 000 komórek w naczyniu.</li>
	<li>Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 godziny.</li>
	<li>Po 2-godzinnej inkubacji rozpocznij odmierzanie czasu; dla spójności między próbkami drukowanymi a wysiewanymi uważa się ten punkt czasowy 0 godzin.</li>
</ol>
5. Wizualizacja kultury
<ol>
	<li>Po 0, 2, 24 i 48 godzinach pobierz komórki z każdej z dwóch metod opisanych powyżej i zobrazuj za pomocą standardowego mikroskopu odwróconego.
	<ol>
		<li>Wybarwić komórki za pomocą jodku propidyny, czerwonego barwnika fluorescencyjnego, który jest wprowadzany tylko do jądra martwych komórek.
		<ol>
			<li>Delikatnie opłucz komórki 3 razy 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z wapniem i magnezem (PBS++), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
			<li>Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego PBS++ do każdego naczynia hodowlanego.</li>
			<li>Dodać 1 μl roztworu podstawowego jodku propidyny (1 mg/ml) do każdego naczynia hodowlanego.</li>
			<li>Inkubować komórki wybarwione jodkiem propidyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zobrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu przy powiększeniu 10x i 40x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzuć komórki do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cellular+microarray+platforms%3A+applications+in+drug+discovery%2C+toxicology+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research.</a> Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+assays%3A+fuelling+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-based assays: fuelling drug discovery.</a> Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidic+devices+for+in+vitro+cell+culture+for+cell-biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).</li>
<li>Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+compound+libraries+for+drug+discovery%3A+an+ongoing+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).</li>
<li>Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+approach+to+stem-cell+biology+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine.</a> Nature. 453, 338-344 (2008).</li>
<li>Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+technologies+for+tissue+engineering+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microscale technologies for tissue engineering and biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).</li>
<li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).</li>
<li>Gottwald, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Liu, R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+R+%22Integrated+Biochips+for+DNA+Analysis%22">Integrated Biochips for DNA Analysis</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Natarajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow+microfluidic+printing+of+proteins+for+array-based+applications+including+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).</li>
<li>Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Conditions+for+Protein+Array+Deposition+Using+Continuous+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow.</a> Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> , Summer 2011. Drug Discovery World Online at:
 
 <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">http://www.ddw-online.com/p-149288</a> (2011).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+ovarian+cancer+coculture+model+using+a+high-throughput+cell+patterning+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform.</a> Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).</li>
<li>Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+a+review+of+their+structure+and+mechanisms+of+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107(1993).</li>
<li>Roberts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mixed+self-assembled+monolayers+presenting+RGD+and+%28EG%29+3OH+groups+to+characterize+long-term+attachment+of+bovine+capillary+endothelial+cells+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces.</a> Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).</li>
<li>Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+cell+adhesion+encoded+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization.</a> Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).</li>
<li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+surface+modification+with+DNA+for+the+capture+of+primary+cells+and+the+investigation+of+myotube+formation+on+defined+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns.</a> Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting%3A+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Microfabrication%3A+Observing+Intercellular+Interactions+Using+Lithographically-Defined+DNA+Capture+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences.</a> Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).</li>
<li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Coated+AFM+Cantilevers+for+the+Investigation+of+Cell+Adhesion+and+the+Patterning+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami i udziałowcami firmy Wasatch Microfluidics, która produkuje odczynniki i/lub instrumenty używane w tym manuskrypcie.

Opisana tutaj technologia druku mikroprzepływowego 3D jest wyjątkowo zdolna do mikroprzepływowego drukowania tablic komórek w studni wypełnionej cieczą, tj. Zanurzonej powierzchni. Drukując na zanurzonych powierzchniach, można wytworzyć mikromacierze komórkowe, które utrzymują fizjologicznie istotny fenotyp komórkowy komórek, a także zdolność do multipleksowania komórek na dnie pojedynczej studzienki Rysunek 4. Wyniki tego badania pokazują, że mikroprzepływowe drukowanie komórek powoduje przyłąc...

Ostatnie postępy w przemyśle farmaceutycznym doprowadziły do wzrostu zainteresowania wykorzystaniem mikromacierzy komórkowych w procesie odkrywania leków do badań przesiewowych leków i analiz cytotoksykologicznych1,2,3. Opracowanie wysokoprzepustowych testów in vitro i metod badań przesiewowych z wykorzystaniem mikromacierzy komórkowych ułatwiłoby szybki i opłacalny rozwój potencjalnych leków, a także przyczyniłoby się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat komórki1,4. Tradycyjne podejście do badań przesiewowych z wykorzystaniem komórek wykorzystuje konwencjonalne platformy z płytkami studziennymi; Podejście to jest jednak ograniczone ze względu na wysokie koszty, ograniczoną przepustowość i ograniczoną zdolność do uzyskiwania informacji ilościowych na temat funkcji komórek1,5. Ze względu na te ograniczenia, badania nad technologiami mikromacierzy komórkowych rozwijają się w zakresie molekularnej charakterystyki biologicznej, inżynierii tkankowej i badań przesiewowych leków1,6. Do zalet mikromacierzy komórkowych zalicza się mniejsze zużycie próbek, minimalny wpływ informacji o maskowaniu niejednorodności fenotypu komórkowego, a co najważniejsze, możliwość automatyzacji testów dla zastosowań o większej przepustowości1,7,8.
Przemysł farmaceutyczny obecnie wykorzystuje wysokoprzepustowe testy przesiewowe oparte na komórkach z jednowarstwowymi hodowlami komórkowymi 2D do badań przesiewowych leków na płytkach mikromiareczkowych9. Multipleksowanie komórek w studzienkach płytek do mikromiareczkowania oferuje potencjał wyższej przepustowości dzięki unikalnym opcjom eksperymentalnym. Co więcej, obecne technologie mikromacierzy komórkowych pozwalają na wysuszenie komórek, co może radykalnie zmienić fenotyp komórek w porównaniu z in vivo10,11. Aby przezwyciężyć te problemy, zaprojektowano MFCA, który pokazano na rysunku 1. Konstrukcja płynów MFCA 3D umożliwia opuszczenie końcówki głowicy drukującej na rysunku 1 do kąpieli i dociśnięcie do powierzchni w celu utworzenia uszczelnienia. Miękka silikonowa końcówka głowicy drukującej zachowuje się jak uszczelka i tworzy odwracalne uszczelnienie. Technologia MFCA jest wyjątkowo dostosowana do interakcji z zanurzonymi powierzchniami, co jest wymagane zarówno w przypadku kultur komórkowych, jak i systemów warstw tkanek, i jest trudne lub niemożliwe w przypadku większości innych podejść. Piny lub druk atramentowy nie będą działać, a urządzenia mikroprzepływowe 2D nie nadają się do osadzania lub łączenia z dużymi tablicami dyskretnych plamek. Ponadto, poprzez miniaturyzację i lokalizację eksperymentu - mikromacierzy komórkowej - MFCA pokonuje główne problemy związane z wysokoprzepustowymi testami przesiewowymi opartymi na komórkach.
CFM wykorzystuje sieci kanałów 3D do cyklicznego przepływu próbek płynów o małej objętości w mikroskopijnych miejscach na powierzchni12,13. Dzięki drukowaniu przepływowemu, biomolekuły, komórki i inne odczynniki są utrzymywane w płynnym środowisku przez cały proces drukowania, co umożliwia drukowanie wrażliwych biomolekuł i komórek bez ekspozycji na powietrze, co utrudnia obecne techniki drukowania komórek. Możliwe jest również drukowanie bezpośrednio z surowego materiału, takiego jak hybrydoma lub supernatanty, pod warunkiem, że na powierzchni matrycy znajduje się mechanizm wychwytywania. Celem tego manuskryptu jest szczegółowe wyjaśnienie zanurzonego drukowania dwóch typów komórek na powierzchni.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop z ciągłym przepływem</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Pożywka bazowa do komórek</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Dodatek do pożywek komórkowych (kontrola pH)</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Dodatek do pożywek komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Dodatek do pożywek komórkowych</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Barwnik do liczenia</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Komora komórkowa do zliczania komórek</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Służy do sprawdzania komórek</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Służy do zbierania obrazów</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (z wapniem i magnezem)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Płukanie komórek przed pasażowaniem i przed barwieniem za pomocą PI</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Służy do usuwania komórek z powierzchni</td></tr></tbody></table>

zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Drukowanie komórek do zastosowań mikromatrycowych wiąże się z poważnymi wyzwaniami, w tym problemem utrzymania fizjologicznie istotnego fenotypu komórki po wydrukowaniu, słabą organizacją i dystrybucją pożądanych komórek oraz niezdolnością do dostarczania leków i/lub składników odżywczych do wybranych obszarów w układzie. Nasza technologia druku mikroprzepływowego 3D jest wyjątkowo zdolna do uszczelniania i drukowania tablic komórek na zanurzonych powierzchniach w sposób zautomatyzowany i multipleksowany. Konstrukcja płynów 3D z matrycą komórek mikroprzepływowych (MFCA) umożliwia opuszczenie końcówki głowicy drukującej do studni lub naczynia wypełnionego cieczą i dociśnięcie do powierzchni w celu utworzenia uszczelnienia. Miękka silikonowa końcówka głowicy drukującej zachowuje się jak uszczelka i jest w stanie utworzyć odwracalne uszczelnienie poprzez wywieranie nacisku lub cofanie. Inne technologie drukowania komórek, takie jak drukarki szpilkowe lub atramentowe, nie mogą drukować w zastosowaniach zanurzonych. Drukowanie na zanurzonej powierzchni jest niezbędne do utrzymania fenotypów komórek i monitorowania tych komórek na powierzchni bez naruszania charakterystyki powierzchni materiału. Drukując na zanurzonych powierzchniach, wytwarzane są mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach, w tym w raku, cukrzycy, stanach zapalnych, infekcjach i chorobach sercowo-naczyniowych.

Linia komórek fibroblastów NIH/3T3 została wydrukowana lub wysiana na zanurzoną powierzchnię. Komórki hodowano do zagęszczenia 5 X 104 komórek na ml. Wysiew komórek przeprowadzono z wykorzystaniem tradycyjnych technik hodowli komórkowych. Komórki wydrukowano za pomocą wielkoformatowej, dwunastokanałowej głowicy drukującej, w której kanały są większe (~500 µm) niż w przypadku CFM stosowanego do białek i innych biomolekuł. Komórki wydrukowano lub wysiano na powierzchnię pokrytą surowicą. Proces drukowania przeds...

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach. Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie. Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest nadruk fibroblastów 3T3 na powierzchni pokrytej surowicą. Jest to realizowane poprzez uprzednią adsorpcję surowicy na powierzchni do hodowli tkankowej. Drugim krokiem jest nadruk zawiesiny fibroblastów na powierzchni przy użyciu mikropunktownika z ciągłym przepływem, a następnie inkubacja komórek w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.Następnie zarówno wydrukowane komórki, jak i komórki wysiane w standardowej kulturze komórkowej, są barwione jodeczkiem propidyny i obrazowane pod mikroskopem odwróconym w celu porównania. Ostatecznie do oceny żywotności, gęstości i morfologii komórek w odpowiednich punktach czasowych wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pin printing, jest fakt, że głowica drukująca tworzy uszczelnienie nad powierzchnią, co umożliwia drukowanie komórek podczas ich zanurzenia w pożywce komórkowej.Choć druk komórek w warunkach zanurzenia jest przydatny do badania bezpieczeństwa i skuteczności nowych kandydatów na leki, technika druku zanurzeniowego znajduje zastosowanie również w innych obszarach. Można ją na przykład wykorzystać do analizy działania nowych kandydatów na leki na skrawkach tkanek lub jako model systemów narządowych, np. w modelu perfuzji wątroby.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ podczas przygotowania drukarki (primingu) oraz drukowania komórek do linii nie może dostać się powietrze, gdyż może to spowodować śmierć komórek. Aby rozpocząć, rozmrozić komórki NIH 3T3 przez dwie do trzech minut w wodnej łaźni z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C. Ponownie zawiesić komórki w 5 mL pożywki kompletnej i odwirować przy 1500 ×g przez trzy minuty.Usunąć nadsącz z komórkami, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie zawiesić komórki w pięciu mililitrach medium i przenieść 10 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml. Następnie dodać 10 µL triam blue do zawiesiny komórkowej i wymieszać końcówką pipety; nanieść 10 µL zabarwionych komórek do komory hemocytometru.Przed policzeniem komórek przy powiększeniu 10x, należy policzyć żywe komórki, które przypominają małe białe kuleczki, w czterech z dziewięciu dużych pól. Należy liczyć tylko te żywe komórki, które nie zabarwiły się na ciemnoniebiesko w barwieniu trypanem niebieskim. Oblicz średnią liczbę komórek na jedno duże pole, a następnie pomnóż tę liczbę przez 10 000, aby otrzymać liczbę komórek na mililitr w oryginalnej zawiesinie komórkowej.Następnie wysiej komórki z gęstością 100 000 komórek na mililitr, tak aby w każdej kolbie T 25 znajdowało się łącznie pięć mililitrów zawiesiny. Hoduj komórki do uzyskania konfluencji od 70 do 80% przed rozpoczęciem eksperymentów. Aby przygotować powierzchnię druku, użyj markera i zaznacz na spodzie polistyrenowej płytki 12 traktowanej do hodowli tkanek prostokąt o rozmiarze głowicy drukującej.Za pomocą pipety nanieś 50 µL płodowej surowicy bydlęcej na obszar prostokątny w płytce wielodołkowej i rozprowadź ją po całym tym regionie. Pozostaw płytkę wielodołkową w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza na noc, aby plama z surowicy całkowicie wyschła. Aby rozpocząć druk zanurzeniowy, przepłucz głowicę drukującą wodą destylowaną.Następnie należy napełnić 60 mm szalkę Petri destylowaną wodą i umieścić głowicę drukującą na powierzchni, przepuszczając destylowaną wodę przez każdą z linii przez dwie minuty z przepływem 150 µL/min przy użyciu pompy pneumatycznej. Następnie wodę z szalki Petri należy wylać i napełnić ją czystą wodą. W kolejnym kroku głowicę drukującą należy trzy razy przemieścić w górę i w dół w wodzie.Ustaw głowicę drukującą centralnie nad plamką pokrytą surowicą w wcześniej przygotowanej płytce 12-dołkowej. Następnie przeprowadź płukanie wstępne głowicy drukującej za pomocą Prewarm. Kompletna pożywka w ilości 300 microliters na kanał.W przypadku wykonywania wielu wydruków, pomiędzy nimi należy dodać płukanie wybielaczem oprócz płukania wodą. Następnie należy wydrukować zawieszone komórki na powierzchni w stężeniu 50 000 cells per milliliter, przy prędkości 60 µL per minute. 100 µL per channel.Po wydrukowaniu komórek należy umieścić głowicę drukującą w pozycji zaparkowanej po lewej stronie, przylegając do powierzchni, a rozdzielacz w inkubatorze do hodowli komórkowych. Ustawić stężenie dwutlenku węgla na 5% oraz temperaturę od 37 °C przez dwie godziny. Po dwugodzinnej inkubacji należy wyjąć głowicę drukującą i założyć pokrywkę na szalkę hodowlaną.Moment usunięcia głowicy drukującej uznaje się za punkt czasowy zero. Dla porównania przeprowadza się również standardową hodowlę komórkową. Do jednej z 12-dołkowych płytek z naniesionym surowicą dodaje się 1 mL podgrzanego wcześniej medium, a następnie 1 mL pozostałej zawiesiny komórkowej pipetuje się do pojedynczego dołka płytki 12-dołkowej.Pozwoli to na uzyskanie hodowli zawierającej 50 000 komórek w naczyniu. Umieść płytkę z hodowlą komórkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C na dwie godziny. Po dwugodzinnej inkubacji rozpocznij pomiar czasu, aby zapewnić spójność między próbkami drukowanymi a zasiewanymi.Punkt ten uznaje się za czas zerowy. Po 0, 2, 24 i 48 godzinach przygotować komórki z każdej z dwóch metod do obrazowania poprzez barwienie jodkiem propidyny, który wbudowuje się jedynie w jądra martwych komórek. Najpierw delikatnie wypłukać komórki trzykrotnie za pomocą 1 mL buforu fosforanowego z dodatkiem wapnia i magnezu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.Następnie do każdego naczynia hodowlanego dodaje się 1 mL uprzednio ogrzanej pożywki, a następnie 1 µL jodku propidyny z roztworu stokowego. Komórki zabarwione jodkiem propidyny inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 10 minut przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 10 x i 40 x. Na koniec komórki utylizuje się w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne.Linię komórkową fibroblastów, komórki NIH 3T3, wydrukowano lub wysiano na powierzchnię zanurzoną. Po drukowaniu i wysiewaniu komórki wizualizowano w odpowiednich punktach czasowych w celu oceny gęstości i morfologii. Obrazy wykazały, że komórki posiadają niemal identyczne fenotypy w każdym punkcie czasowym i przy każdym powiększeniu.Na podstawie tych wyników stwierdzono, że efektywność drukowania była minimalna. Żywotność komórek oceniono za pomocą barwienia jodkiem propidyny, co wykazało, że żywotność komórek wydrukowanych nie różniła się znacząco od żywotności komórek osadzonych w każdym z punktów czasowych. Główną różnicą między dwiema metodami przytwierdzania komórek do powierzchni jest gęstość komórek.Gęstość wydrukowanych komórek w punkcie czasowym dwóch godzin zmniejsza się o ponad 50% zarówno w przypadku komórek osadzonych, jak i wydrukowanych. Wskazane jest przeprowadzenie dalszych badań w celu ustalenia przyczyny tego spadku. Niemniej jednak, ogólne stosunki gęstości komórek wydrukowanych w porównaniu do osadzonych pozostają znacząco wyższe.Gęstość wydrukowanych komórek w celi przepływowej w każdym punkcie czasowym była około 10 razy większa niż w przypadku komórek zasianych, biorąc pod uwagę, że komórki były drukowane z taką samą gęstością jak przy sianiu, ale na mniejszej powierzchni. W końcowym punkcie czasowym komórki osiągnęły tę samą gęstość, co prawdopodobnie wynika z ruchliwości komórek oraz ograniczeń w zużyciu zasobów. Od momentu opracowania technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie odkrywania leków do badania wpływu toksyczności i skuteczności leków na komórki, a także w badaniach nad rakiem, chorobami serca i innymi obszarami o dużym zapotrzebowaniu.Stosując druk komórek w środowisku zanurzonym w połączeniu z innymi technologiami, takimi jak programowalna adhezja komórek, możemy rozszerzyć zakres zastosowania tej techniki na komórki w zawiesinie, co pozwoli na szersze badania przesiewowe w procesie odkrywania i opracowywania leków. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat drukowania komórek z wykorzystaniem naszej techniki druku w środowisku zanurzonym.

the-submerged-printing-cells-onto-modified-surface-using-continuous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zanurzenie drukowania komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikro-plotera z ciągłym przepływem

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Opis metod wykorzystanych do przekształcenia drukarki HP DeskJet 500 w biodrukarkę. Drukarka jest zdolna do przetwarzania żywych komórek, co powoduje powstanie przejściowych porów w błonie. Pory te mogą być wykorzystane do wprowadzania małych cząsteczek, w tym fluorescencyjnej G-aktyny, do wydrukowanych komórek.

Tworzenie przejściowych porów w błonie komórkowej przy użyciu standardowej drukarki atramentowej

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Przedstawiamy protokół do wykonywania subtraktywnego wzorcowania monowarstw żywych komórek na powierzchni. Osiąga się to poprzez miejscową i selektywną lizę przylegających komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej (MFP). Lizat komórkowy pobrany z lokalnych regionów może być wykorzystany do dalszej analizy, umożliwiając badania profilowania molekularnego.

Szybkie subtraktywne modelowanie warstw żywych komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Tutaj prezentujemy protokół do tworzenia wzorów przewodzących o wysokiej rozdzielczości za pomocą elektrohydrodynamicznego (EHD) druku strumieniowego. Protokół obejmuje dwa tryby druku strumieniowego EHD: ciągłe elektroprzędzenie w bliskim polu (NFES) i drukowanie EHD metodą kropli na żądanie (DOD) oparte na kropkach.

Modelowanie w wysokiej rozdzielczości przy użyciu dwóch trybów strumienia elektrohydrodynamicznego: kropli na żądanie i elektroprzędzenia w bliskim polu

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Poznaj zanurzone drukowanie komórek fibroblastów NIH 3T3 na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie cytotoksyczności i skuteczności leków.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Przeglądaj więcej filmów