Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów
11 sierpnia 2017
Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.
Ogólnym celem tej metodologii biodruku mikroprzepływowego jest wygenerowanie unaczynionego konstruktu tkankowego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biofabrykacji unaczynionych tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wszechstronna w generowaniu trójwymiarowej naczyniowej o kontrolowanym kształcie do inżynierii unaczynionych tkanek poprzez wtórny proces wysiewu komórek.
Chociaż protokół ten zapewnia wgląd w inżynierię unaczynionych tkanek serca, może być również stosowany do wielu innych typów tkanek, takich jak wątroba, skóra, a nawet nowotwory. Zwykłe osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ konfiguracja biodrukarki może nie być prosta. Aby rozpocząć tę procedurę, skonstruuj dwuwarstwową koncentryczną mikroprzepływową głowicę drukującą, wkładając mniejszą igłę, służącą jako rdzeń, do środka większej igły, służącej jako osłona.
Upewnij się, że igła rdzeniowa wystaje z zewnętrznej powłoki na około jeden milimetr. Następnie włóż igłę o rozmiarze 23 do cylindra centralnej igły w odwrotnym kierunku. Zrób otwór z boku cylindra zewnętrznej igły i włóż metalowe łącznik o odpowiednim rozmiarze.
Uszczelnij klejem epoksydowym. Zamontuj ekstruder na głowicy biodrukarki za pomocą uchwytu z polimetakrylanu metylu lub PMMA. Następnie, w celu wstrzyknięcia biotuszu i roztworu sieciującego przez dwie rurki PVC oddzielnie, podłącz wloty głowicy drukującej do dwukanałowej pompy strzykawkowej.
Wykonaj biotusz za pomocą mieszaniny alginianu, żelu i fotoinicjatora. Rozpuszczony w 25-milimolowym buforze HEPES, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Następnie przygotuj roztwór 0,3 molowego chlorku wapnia w buforze HEPES zawierającym 10% FBS, który posłuży jako sieciujący płyn nośny.
Tuż przed biodrukowaniem trypsynizuj ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC przez pięć do 10 minut. Odwiruj komórki z prędkością 800 obr./min przez pięć minut w 15-mililitrowej probówce. Ponownie zawiesić komórki w biotuszu w stężeniu od pięciu do 10 razy od 10 do sześciu komórek na mililitr, powoli pipetując od pięciu do 10 razy.
Następnie użyj dwukanałowej pompy strzykawkowej, aby rozpocząć wstrzykiwanie biotuszu HUVEC przez jeden, a płynu sieciującego przez drugi kanał z natężeniem przepływu pięciu mikrolitrów na minutę. Pozwól, aby przepływy działały w sposób ciągły przez maksymalnie jedną minutę, aż się ustabilizują. Następnie rozpocznij ruch głowicy drukującej, utrzymując prędkość osadzania biodrukarki na poziomie około czterech milimetrów na sekundę.
To biodrukowanie powinno skutkować szybkim żelowaniem jonowym składnika alginianowego i osadzaniem się rusztowania z mikrofibry. Po wydrukowaniu rusztowania należy usieciować komponent gelMA za pomocą od pięciu do 10 miliwatów na centymetr kwadratowy światła UV przez 20 do 30 sekund, aby uzyskać żelowanie chemiczne. Następnie usuń nadmiar chlorku wapnia z rusztowania, delikatnie spłukując je ciepłym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Hoduj to rusztowanie w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach objętości CO2, przez okres do 16 dni. Zmieniaj podłoże co najmniej co dwa dni. W okresie hodowli monitoruj HUVEC pod mikroskopem, aż przeniosą się na obrzeża mikrowłókien rusztowania i utworzą struktury przypominające światło.
Następnie ostrożnie usunąć całe podłoże z przestrzeni śródwęzłowej rusztowania z siłą kapilarną za pomocą kawałka sterylnej bibuły filtracyjnej. Natychmiast dodaj kroplę zawiesiny wtórnego typu komórek, takich jak kardiomiocyty, na szczycie rusztowania, umożliwiając komórkom infiltrację całej przestrzeni śródmiąższowej. Następnie inkubuj to rusztowanie w inkubatorze przez 30 minut do dwóch godzin, pozwalając komórkom przylegać do poszczególnych mikrowłókien.
Usuń nieprzylegające komórki, delikatnie myjąc rusztowanie PBS. Hoduj to rusztowanie w odpowiednim podłożu, aż utworzy się pożądana unaczyniona tkanka. Opisany tutaj biodruk mikroprzepływowy pozwala na bezpośrednie biodrukowanie rusztowań mikrowłóknistych przy użyciu biotuszów o niskiej lepkości.
Rusztowanie o wymiarach sześć na sześć na sześć na sześć milimetrów kwadratowych < zawierające ponad 30 mikrowłókien, może zostać wydrukowane biologicznie w ciągu 10 minut. Widoki z góry i z boku mikrofotografii rusztowania pokazują doskonałą integralność strukturalną podczas procesu biodruku. Osiągnięto to dzięki natychmiastowemu usieciowaniu jonowemu składnika alginianowego z chlorkiem wapnia.
Po mikroprzepływowym wytłaczaniu biotuszu, sieciowaniu jonowym i fotosieciowaniu, HUVEC utrzymały stosunkowo wysoką żywotność. Komórki namnażały się i migrowały z początkowo losowego rozkładu w dniu zero do peryferii mikrowłókien w dniu 16. Kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów, które zostały wysiane na rusztowaniu, dojrzały i zasiedliły rusztowanie.
Wykazali silną ekspresję funkcjonalnych biomarkerów serca. Takich jak sarkomeryczna alfa aktynina i koneksyna 43. Mikroskopia konfokalna biodrukowanego rusztowania mikrofibrowego, wypełnionego kardiomiocytami, ujawniła współistnienie zarówno HUVEC, jak i kardiomiocytów.
HUVEC są obecne głównie w granicach mikrowłókien, podczas gdy kardiomiocyty otaczają zewnętrzną część mikrowłókien. Komórki były w stanie utrzymać spontaniczne i zsynchronizowane bicie przez okres od dziewięciu do 28 dni. W zależności od źródła komórek i konfiguracji rusztowań.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać unaczynione tkanki przy użyciu techniki biodruku mikroprzepływowego, a także produkcji głowicy drukującej i operacji biodrukarki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ produkcja głowicy drukującej i operacje biodrukarki mogą być trudne dla osób, które wcześniej z niej nie korzystały. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby dwie igły były koncentryczne w głowicy drukującej i pozwoliły, aby przepływ ustabilizował się przed rozpoczęciem biodrukowania.
Wraz z rozwojem tej techniki, naukowcy zajmujący się inżynierią tkankową i biofabrykacją mają teraz do dyspozycji kolejne narzędzie umożliwiające generowanie unaczynionych konstruktów tkanek do celów regeneracji in vivo lub do modelowania tkanek in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodologię mikrofluidycznego biodrukowania ukierunkowaną na generowanie naczyniopotencjalnych konstrukcji tkankowych. Technika ta radzi sobie z wyzwaniami w biofabrykacji, umożliwiając stworzenie trójwymiarowego łożyska naczyniowego, które może być zaludnione drugorzędnymi typami komórek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biofabrykacja
- Mikrofluidyka
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Inżynieria tkanek naczyniowych jest kluczowa dla rozwoju organoidalnego.
- Obecne metody stoją przed ograniczeniami w tworzeniu złożonych struktur tkankowych.
- Mikrofluidyczne biodrukowanie oferuje wszechstronną metodę do pokonywania tych wyzwań.
- Ta technika może być dostosowana do różnych rodzajów tkanek, w tym tkanek serca, wątroby i skóry.
Cel badania
- Opracowanie protokołu tworzenia naczyniopotencjalnych konstrukcji tkankowych.
- Poprawa rozumienia technik biofabrykacji.
- Dostarczenie podstawy dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej.
Stosowane metody
- Konstrukcja dwuwarstwowej koncentrycznej głowicy do mikrofluidycznego druku.
- Wykorzystanie mniejszej stępionej igły jako rdzenia w większej stępionej igle.
- Zasiedlenie drugorzędnych typów komórek do mikrofibrylarnej struktury.
- Zastosowanie metody do różnych rodzajów tkanek, poza tkankami serca.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem generuje naczyniopotencjalną konstrukcję tkankową.
- Wykazano wszechstronność w tworzeniu różnych typów tkanek.
- Dostarczono wglądu w inżynierię złożonych struktur tkankowych.
- Zidentyfikowano potencjalne wyzwania dla osób zaczynających w procesie biodrukowania.
Konkluzje
- Mikrofluidyczne metody biodrukowania są skuteczne w inżynierii tkankowej naczyniowej.
- To podejście może ułatwić postęp w badaniach nad organoidalnymi.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jego zastosowanie na inne typy tkanek i warunki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microfluidic bioprinting enables the engineering of vascularized tissue constructs with high structural fidelity, addressing a critical bottleneck in preclinical model development. By generating perfusable microvascular networks within hydrogel scaffolds, this method supports the creation of more physiologically relevant tissue models for drug screening and mechanistic studies. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a tunable platform to study cell-cell interactions, tissue maturation, and functional responses under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-pericyte or stromal cell interactions within a defined vascular niche to validate therapeutic targets involved in angiogenesis or vascular permeability.
- Operational Value: Provides a reproducible, microfluidically controlled system for generating vascularized scaffolds with consistent microfiber architecture and lumen formation.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on vascular integrity and cell migration in a human-relevant, 3D microenvironment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized microfibrous scaffolds with encapsulated endothelial cells that form lumen-like structures, enabling quantitative assessment of vascular network formation over time.
- Operational Value: Compatible with dual-channel syringe pump bioprinting, allowing precise control over bioink and crosslinking fluid delivery for high-throughput scaffold fabrication.
- Assay Readiness: Produces scaffolds with >30 microfibers in a 6x6x6 mm volume within 10 minutes, supporting scalable preparation for downstream secondary cell seeding and compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables secondary seeding of cardiomyocytes or other parenchymal cells into the interstitial space, facilitating the study of vascularized tissue maturation and synchronized contractile function.
- Translational Continuity: Supports long-term culture (>16 days) with monitoring of cell migration, lumen formation, and biomarker expression (e.g., sarcomeric alpha actinin, connexin 43) to model tissue-level responses.
- Risk Mitigation: Allows evaluation of cell viability, proliferation, and functional maturation under perfusion-like conditions, reducing attrition due to poor vascular engraftment in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a vascularized platform that bridges simple monocultures and complex in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular-dependent pathways by enabling controlled co-culture of endothelial and parenchymal cells in a defined 3D geometry.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with reproducible microstructure and endothelialization, suitable for evaluating compound effects on vascular stability and tissue organization.
- Analytics: Enables quantitative readouts via confocal microscopy of cell distribution, lumen formation, and biomarker co-localization to assess tissue quality and functional maturation.
- Translational Research: Models vascularized tissue development from early endothelial network formation to secondary cell integration, supporting preclinical validation of vascular-targeted or regenerative candidates.
- Enterprise Reuse: The microfluidic printhead design and bioink system (GelMA-alginate with ionic/photocrosslinking) represent a reusable platform adaptable to multiple tissue types (cardiac, liver, skin) and secondary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by generating vascularized tissues with perfusable lumen-like structures and sustained cellular function (e.g., synchronized beating up to 28 days).
- Operational Value: Enables standardization of scaffold fabrication through microfluidic flow control, reducing variability in microfiber diameter, crosslinking efficiency, and cell distribution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early insight into vascular compatibility and tissue-level responses, reducing late-stage failure due to inadequate vascularization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their effects in a human-relevant, vascularized tissue model that recapitulates key structural and functional hallmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including concentric needle assembly and epoxy sealing to prevent leakage.
- Dependent on dual-channel syringe pump systems and UV photocrosslinking equipment for precise bioink delivery and GelMA stabilization.
- Necessitates optimization of cell concentration (5–10×10⁶ HUVECs/mL) and flow rates (5 µL/min) to ensure cell viability and uniform encapsulation during printing.
- Requires aseptic handling and sterile filter paper for medium removal during secondary cell seeding to avoid contamination and ensure proper infiltration.
- Limited by the need for post-printing rinsing to remove excess calcium chloride, which adds a manual step that must be standardized across batches.
