Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ogólnym celem tej metodologii biodruku mikroprzepływowego jest wygenerowanie unaczynionego konstruktu tkankowego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biofabrykacji unaczynionych tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wszechstronna w generowaniu trójwymiarowej naczyniowej o kontrolowanym kształcie do inżynierii unaczynionych tkanek poprzez wtórny proces wysiewu komórek.

Chociaż protokół ten zapewnia wgląd w inżynierię unaczynionych tkanek serca, może być również stosowany do wielu innych typów tkanek, takich jak wątroba, skóra, a nawet nowotwory. Zwykłe osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ konfiguracja biodrukarki może nie być prosta. Aby rozpocząć tę procedurę, skonstruuj dwuwarstwową koncentryczną mikroprzepływową głowicę drukującą, wkładając mniejszą igłę, służącą jako rdzeń, do środka większej igły, służącej jako osłona.

Upewnij się, że igła rdzeniowa wystaje z zewnętrznej powłoki na około jeden milimetr. Następnie włóż igłę o rozmiarze 23 do cylindra centralnej igły w odwrotnym kierunku. Zrób otwór z boku cylindra zewnętrznej igły i włóż metalowe łącznik o odpowiednim rozmiarze.

Uszczelnij klejem epoksydowym. Zamontuj ekstruder na głowicy biodrukarki za pomocą uchwytu z polimetakrylanu metylu lub PMMA. Następnie, w celu wstrzyknięcia biotuszu i roztworu sieciującego przez dwie rurki PVC oddzielnie, podłącz wloty głowicy drukującej do dwukanałowej pompy strzykawkowej.

Wykonaj biotusz za pomocą mieszaniny alginianu, żelu i fotoinicjatora. Rozpuszczony w 25-milimolowym buforze HEPES, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Następnie przygotuj roztwór 0,3 molowego chlorku wapnia w buforze HEPES zawierającym 10% FBS, który posłuży jako sieciujący płyn nośny.

Tuż przed biodrukowaniem trypsynizuj ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC przez pięć do 10 minut. Odwiruj komórki z prędkością 800 obr./min przez pięć minut w 15-mililitrowej probówce. Ponownie zawiesić komórki w biotuszu w stężeniu od pięciu do 10 razy od 10 do sześciu komórek na mililitr, powoli pipetując od pięciu do 10 razy.

Następnie użyj dwukanałowej pompy strzykawkowej, aby rozpocząć wstrzykiwanie biotuszu HUVEC przez jeden, a płynu sieciującego przez drugi kanał z natężeniem przepływu pięciu mikrolitrów na minutę. Pozwól, aby przepływy działały w sposób ciągły przez maksymalnie jedną minutę, aż się ustabilizują. Następnie rozpocznij ruch głowicy drukującej, utrzymując prędkość osadzania biodrukarki na poziomie około czterech milimetrów na sekundę.

To biodrukowanie powinno skutkować szybkim żelowaniem jonowym składnika alginianowego i osadzaniem się rusztowania z mikrofibry. Po wydrukowaniu rusztowania należy usieciować komponent gelMA za pomocą od pięciu do 10 miliwatów na centymetr kwadratowy światła UV przez 20 do 30 sekund, aby uzyskać żelowanie chemiczne. Następnie usuń nadmiar chlorku wapnia z rusztowania, delikatnie spłukując je ciepłym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Hoduj to rusztowanie w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach objętości CO2, przez okres do 16 dni. Zmieniaj podłoże co najmniej co dwa dni. W okresie hodowli monitoruj HUVEC pod mikroskopem, aż przeniosą się na obrzeża mikrowłókien rusztowania i utworzą struktury przypominające światło.

Następnie ostrożnie usunąć całe podłoże z przestrzeni śródwęzłowej rusztowania z siłą kapilarną za pomocą kawałka sterylnej bibuły filtracyjnej. Natychmiast dodaj kroplę zawiesiny wtórnego typu komórek, takich jak kardiomiocyty, na szczycie rusztowania, umożliwiając komórkom infiltrację całej przestrzeni śródmiąższowej. Następnie inkubuj to rusztowanie w inkubatorze przez 30 minut do dwóch godzin, pozwalając komórkom przylegać do poszczególnych mikrowłókien.

Usuń nieprzylegające komórki, delikatnie myjąc rusztowanie PBS. Hoduj to rusztowanie w odpowiednim podłożu, aż utworzy się pożądana unaczyniona tkanka. Opisany tutaj biodruk mikroprzepływowy pozwala na bezpośrednie biodrukowanie rusztowań mikrowłóknistych przy użyciu biotuszów o niskiej lepkości.

Rusztowanie o wymiarach sześć na sześć na sześć na sześć milimetrów kwadratowych < zawierające ponad 30 mikrowłókien, może zostać wydrukowane biologicznie w ciągu 10 minut. Widoki z góry i z boku mikrofotografii rusztowania pokazują doskonałą integralność strukturalną podczas procesu biodruku. Osiągnięto to dzięki natychmiastowemu usieciowaniu jonowemu składnika alginianowego z chlorkiem wapnia.

Po mikroprzepływowym wytłaczaniu biotuszu, sieciowaniu jonowym i fotosieciowaniu, HUVEC utrzymały stosunkowo wysoką żywotność. Komórki namnażały się i migrowały z początkowo losowego rozkładu w dniu zero do peryferii mikrowłókien w dniu 16. Kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów, które zostały wysiane na rusztowaniu, dojrzały i zasiedliły rusztowanie.

Wykazali silną ekspresję funkcjonalnych biomarkerów serca. Takich jak sarkomeryczna alfa aktynina i koneksyna 43. Mikroskopia konfokalna biodrukowanego rusztowania mikrofibrowego, wypełnionego kardiomiocytami, ujawniła współistnienie zarówno HUVEC, jak i kardiomiocytów.

HUVEC są obecne głównie w granicach mikrowłókien, podczas gdy kardiomiocyty otaczają zewnętrzną część mikrowłókien. Komórki były w stanie utrzymać spontaniczne i zsynchronizowane bicie przez okres od dziewięciu do 28 dni. W zależności od źródła komórek i konfiguracji rusztowań.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać unaczynione tkanki przy użyciu techniki biodruku mikroprzepływowego, a także produkcji głowicy drukującej i operacji biodrukarki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ produkcja głowicy drukującej i operacje biodrukarki mogą być trudne dla osób, które wcześniej z niej nie korzystały. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby dwie igły były koncentryczne w głowicy drukującej i pozwoliły, aby przepływ ustabilizował się przed rozpoczęciem biodrukowania.

Wraz z rozwojem tej techniki, naukowcy zajmujący się inżynierią tkankową i biofabrykacją mają teraz do dyspozycji kolejne narzędzie umożliwiające generowanie unaczynionych konstruktów tkanek do celów regeneracji in vivo lub do modelowania tkanek in vitro.