Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie żywotnych konstruktów zawierających komórki o złożonej geometrii przy użyciu biodrukarki 3D. Osiąga się to poprzez wstępną izolację ludzkich komórek stromalnych tkanki tłuszczowej z hodowli. Następnie komórki są mieszane ze świeżo przygotowanym biotuszem z alginianu utlenionego sprzężonego z RGD.

W ostatnim kroku LA komórkowa w biomateriale jest ekstrudowana za pomocą biodruku. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do analizy żywotności, proliferacji i migracji biodrukowanych komórek. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tworzenie rusztowań i wysiew komórek, jest możliwość bezpośredniego umieszczenia komórek i agregatów komórkowych dokładnie tam, gdzie są one niezbędne do utworzenia tkanki.

Procedurę zaprezentuje Sarah Grace Dennis, doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij od wysiania 350 000 ludzkich stromalnych komórek tkanki tłuszczowej do przygotowanej kolby T 75 w 15 mililitrach niskoglukozowego TMEM w celu ekspansji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, usuń medium i wypłucz komórki w pięciu mililitrach DPBS bez wapnia i magnezu.

Następnie inkubuj komórki w 5 ml trypsyny i DPBS przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Gdy komórki się oddzielą, zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 3 ml pożywki do hodowli komórkowej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwiruj komórki i resuspenduj osad w 2 ml pożywki do hodowli komórkowej. Potem policz komórki, przenieś alikwot zawierający 1,3 × 10⁶ komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ponownie odwiruj komórki.

Resuspender osad w jednym mililitrze świeżo przygotowanego bioatramentu, dbając o jednorodne rozprowadzenie komórek w wodnym roztworze alginianu. Następnie przenieść komórki do sterylnej strzykawki o pojemności trzech mililitrów, kompatybilnej z drukarką, i nakręcić sterylną plastikową końcówkę o rozmiarze 22 gauge. Włączyć biodrukarkę, komputery każdego z dozowników oraz cyrkulacyjną łaźnię wodną.

Ręcznie ustaw temperaturę kąpieli na 4 °C dla mechanizmu pozycjonowania oraz parametry drukowania dla każdego dozownika na odpowiadającym mu komputerze sterującym. Ustaw objętość dozowania na 230 nanolitrów, liczbę kroków cofania na zero oraz szybkość dozowania na 10 µL/s. Następnie otwórz oprogramowanie projektowe oraz program do podglądu z kamery USB na komputerze.

Następnie ręcznie wprowadź współrzędne dla macierzy kropek o wymiarach pięć na pięć z odstępem 2,4 mm między kroplami. Zapisz program i prześlij go do robota. Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą żelatynę z dwutlenkiem tytanu na platformie drukarki o temperaturze 4 °C, a następnie zamknij i zablokuj drzwi komory.

Za pomocą programowalnego sterownika logicznego uruchomiono źródła światła ultrafioletowego w celu sterylizacji komory. Po 90 sekundach otwarto komorę i załadowano strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek stromalnych tkanki tłuszczowej człowieka do pistoletu nr 1, zamknięto i zablokowano drzwi komory, a następnie za pomocą programowalnego sterownika logicznego włączono system wentylatorów. Odczekano 30 sekund do wyrównania ciśnienia wewnętrznego, a następnie uruchomiono program zawierający ścieżkę geometryczną i parametry drukowania, które były stosowane przez cały proces druku.

Obserwuj obraz z kamery USB na komputerze, aby potwierdzić dokładność i jednorodność drukowania. W celu ilościowego określenia żywotności biodrukowanych konstruktów, zanurz je w świeżo przygotowanym roztworze barwiącym. Następnie umieść konstrukty w lodówce na 15 minut w ciemności, aby barwnik mógł się utrwalić.

Następnie, analizując obraz z mikroskopu konfokalnego, konstrukcje barwione na żółto lub zielono klasyfikuje się jako żywe, natomiast komórki barwione na czerwono jako martwe. Jak wykazują te wyniki, biodruk umożliwia precyzyjne i powtarzalne rozmieszczanie komórek oraz hydrożeli w określonych lokalizacjach trójwymiarowych przy użyciu oprogramowania komputerowego. Oprogramowanie to wyznacza miejsce osadzenia każdej kropli i kontroluje wiele parametrów dozowania.

Jednym z wymagań skutecznej techniki biodruku jest zachowanie żywotności komórek. Komórki wydrukowane w bioatramencie alginianowym, zgodnie z powyższą demonstracją, zostały poddane analizie jedną godzinę oraz osiem dni po druku; w dniu zerowym 98% komórek wykazuje zielone barwienie i jest żywe, a w ósmym dniu odsetek ten wynosi 95%. Jak wskazuje czerwone barwienie, w obu punktach czasowych zaobserwowano niewiele martwych komórek, co potwierdza przydatność alternatywnego atramentu do biodruku.

Ponadto tusz alginianowy sprzężony z RGD zwiększa przyleganie komórek do wydrukowanych konstruktów, co prowadzi do poprawy rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek, co ilościowo określono w trzech oddzielnych obszarach hydrożelu w dniu zerowym i ósmym. Tutaj, w dniu ósmym, porównano jakość sprzężenia peptydu RGD w biotuszu Ginnet z zastosowaniem samego biotuszu Ginnet. Rozprzestrzenianie się komórek zaobserwowane w próbce barwionej biotuszem Ginnet sprzężonym z RGD wskazało na skuteczne włączenie peptydu do Ginnet, co było zjawiskiem wyraźnie nieobecnym w próbkach biodrukowanych niesprzężonych po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej do zbadania wytwarzania przyrostowego jako sposobu montażu żywych konstruktów inżynieryjnych.