Name: Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę bioprintingu 3D do tworzenia żywych konstruktów komórkowych z ludzkich komórek tkanki tłuszczowej. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie komórek w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez wsparcie rządowe w ramach grantu nr. EPS-0903795 przyznany przez National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI) oraz Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

1. Przygotowanie podłoża zawierającego żelatynę do trójwymiarowego biodrukowania hydrożeli alginianowych
<ol>
	<li>Przygotować podłoże wapniowo-żelatynowe zgodnie z metodą przygotowania podłoża wapniowo-żelatynowego opisaną przez Patakym i wsp.11 aby uniknąć ograniczenia żywotności związanej z wysoką gęstością komórek. Poniżej opisano metodę z użyciem podłoża wapniowo-żelatynowego.
	<ol>
		<li>Połączyć chlorek wapnia dwuwodny (1,5% wag.), chlorek sodu (0,9% wag.) oraz żelatynę wieprzową (2% wag.) w wodzie destylowanej i gotować przez 2 min, aby przygotować 100 mM roztwór żelatyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej 5 ml roztworu żelatyny z wapniem do standardowych szalek Petriego o średnicy 100 mm, zakręć roztworem, aby uzyskać równomierną warstwę na powierzchni, a następnie umieść szalki na płaskiej powierzchni w lodówce w celu żelowania przez noc (pozostaw do żelowania przez co najmniej 8 h przed użyciem).</li>
	<li>Aby zwiększyć nieprzezroczystość powierzchni podłoża, należy dodać dwutlenek tytanu (0,3% masy) do żelatyny/CaCl22 roztwór. Mieszać przez 10 min. Autoklawować żelatynę/TiO2 roztwór w cyklu płynów przez 30 min w celu jego sterylizacji.
	<ol>
		<li>Dodać 3 ml żelatyny/TiO22 roztwór na powierzchnię wcześniej przygotowanych płytek żelatynowych. Zamieszaj delikatnie mieszaninę, aby upewnić się, że została równomiernie rozprowadzona po całej powierzchni. Pozostaw do żelowania w 4 °C lodówka przez noc (pozostawić do zżelowania przez co najmniej 8 h przed użyciem). Podłoża należy wykorzystać w ciągu 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utlenianie alginianu
<ol>
	<li>Utlenij bioatrament z alginianu sodu zgodnie z metodą otrzymywania częściowo utlenionego alginianu opisaną poniżej przez Bouhadira et al30 .
	<ol>
		<li>Aby przygotować 5% roztwór utlenionego alginianu, rozpuść 1 g alginianu sodu w 100 ml wody destylowanej. Dodaj wodny roztwór nadwęglanu sodu (0,25 M, 0,25 mmol), który pełni rolę utleniacza, aby otrzymać 5% roztwór utleniania. Mieszaj przez 19 hr w RT. Po 24 hr dodaj do roztworu 40 ml glikolu etylenowego, aby przerwać reakcję.</li>
		<li>Rozpuść 2,5 g chlorku sodu w roztworze. Dodaj nadmiar alkoholu etylowego (w stosunku 2:1), aby wytrącić utlenione alginiany. Odwiruj roztwór przy 1 000 ×g, aby zebrać osad, a następnie ponownie rozpuść go w wodzie destylowanej. Powtórz przemywanie etanolem.</li>
		<li>Liofilizuj granulki utlenionego alginianu i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz stopień utlenienia, mierząc procent zużytego nadwęglanu sodu przed przerwaniem reakcji glikolem etylenowym.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór jodku potasu (20% w/v, bufor fosforanowy sodu o pH 7,0) oraz roztwór tiodeny (10% w/v, bufor fosforanowy sodu o pH 7,0). Wymieszaj oba roztwory z utlenionym alginianem w RT.</li>
		<li>Stopniowo dodawaj kroplami przereagowany alginian i roztwór nadwęglanu sodu do mieszaniny roztworów jodku potasu i tiodeny. Zmierz spektrofotometrycznie absorbancję mieszaniny przy 426 nm. Po osiągnięciu maksimum zapisz zużytą objętość roztworu alginianu i nadwęglanu sodu jako V1.</li>
		<li>Reakcja przebiega zgodnie z <img alt="Równanie reakcji redox z udziałem jonów jodynowych i nadjodynowych; symboliczny wzór chemiczny." fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">. Ilość nieprzereagowanego nadwęglanu sodu wynosi <img alt="Równanie rozcieńczenia z obliczeniem procentowym w/v, wzór dla korekty stężenia w analizie wolumetrycznej." fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.5"></li>
		<li>Odejmij ilość nieprzereagowanego nadwęglanu sodu od stężenia początkowego, aby wyznaczyć ilość zużytego nadwęglanu sodu. Korzystając z poprzedniego wzoru, wyznacz końcowy stopień utlenienia alginianu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konjugacja alginianu z peptydem
<ol>
	<li>Przymocuj ligandy z odsłoniętą sekwencją argininy-glicyny-asparaginianu (peptyd) do wcześniej przygotowanego utlenionego alginianu, stosując metodę konjugacji RGD-Alginian opisaną poniżej przez Rowley et al31, aby wspomóc adhezję i rozprzestrzenianie się komórek.</li>
	<li>Do konjugacji użyj chemii wodnej karbodiimidu z G4RGDSP31.</li>
	<li>Rozpuść 1 g 5% utlenionego alginianu w 0,1 M buforze kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), pH = 4. Dodaj 1-etylo-(dimetylaminopropylo)karbodiimid (EDC, 0,54 mmol) oraz N-hydroksysukcynimid (NHS, 0,27 mmol) w stosunku 2:1, aby utworzyć produkt pośredni w formie amidu.</li>
	<li>Dodaj 0,28 mmol peptydu, łącząc go z szkieletem polimeru alginianu poprzez terminalną grupę aminową. Mieszaj w RT przez noc (O/N).</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję sprzęgania, dodając do roztworu 2,5 g chlorku sodu. Dodaj nadmiar etanolu (stosunek 2:1), aby wytrącić utlenione alginiany. Odwiruj mieszaninę przy 4 000 ×g przez 5 min w celu zebrania osadu. Odessij medium w komorze do hodowli komórkowej i ponownie rozpuść osad w wodzie destylowanej. Powtórz przemywanie etanolem.</li>
	<li>Liofilizuj osady do całkowitego wysuszenia (powstanie biała substancja proszkowa) i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek szczątkowych tkanki tłuszczowej człowieka (hADSC)
<ol>
	<li>Hoduj ludzkie komórki pochodzące ze zrazów tkanki tłuszczowej (hADSC) w traktowanych kolbach do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² (kolby T75), wypełnionych 15 ml pożywki DMEM o niskiej zawartości glukozy z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% glutaminy oraz 1% antymycyny. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wymieniaj pożywkę co dwa dni, aż komórki osiągną konfluencję (80-90%).</li>
	<li>Po osiągnięciu konfluencji przenieś kolby T75 do komory hodowlanej i zawieś komórki hADSC, stosując metodę trawienia enzymatycznego trypsyną.
	<ol>
		<li>W komorze odessij całą pożywkę z hodowli komórkowej. Przepłucz komórki 5 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym według Dulbecco z dodatkiem wapnia i magnezu (DPBS ++). Odessij DPBS++ z komórek.</li>
		<li>W komorze przygotuj roztwór trypsyny i DPBS++, mieszając 1 ml trypsyny oraz 4 ml DPBS++. Każda kolba wymaga 5 ml roztworu, dlatego przygotuj objętość odpowiednią do liczby konfluencyjnych kolb. Dodaj 5 ml mieszaniny trypsyny/DPBS++ do każdej kolby i wstaw je do inkubatora na 2 min.</li>
		<li>Po 2 min wyjmij kolby i lekko postukaj w ich ścianki, aby odczepić komórki od dna. Sprawdź każdą kolbę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zawieszone. Wstaw kolby z powrotem do komory hodowlanej i dodaj do każdej 3 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej. Pozwoli to zatrzymać reakcję trypsyny.</li>
		<li>Przenieś pożywkę z komórkami z każdej kolby do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Odwiruj je przy 1 000 x g przez 5 min. Komórki powinny utworzyć mały biały pellet na dnie probówki. Przenieś probówki z powrotem do komory hodowlanej i odessij pożywkę. Resuspenduj komórki w 2 ml pożywki do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Po policzeniu komórek, w komorze hodowlanej, odmierz objętość pożywki zawierającą ~1,3 miliona komórek i przenieś ją do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Ponownie odwiruj probówkę 15 ml z komórkami przez 5 min przy 1 000 x g.</li>
		<li>W komorze hodowlanej przesiej pozostałe komórki do kilku kolb T-75, dodając do każdej kolby stężenie ~350 000 komórek. Dodaj 15 ml pożywki DMEM i przenieś do inkubatora aż do ponownego osiągnięcia konfluencji.</li>
		<li>Po zakończeniu cyklu wirowania przenieś probówkę 15 ml do komory hodowlanej. Odessij pożywkę z pelletu komórkowego i resuspenduj komórki w wodnym roztworze alginianu przy stężeniu 1,3 miliona komórek na mililitr biotuszu, często potrząsając roztworem, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek w biotuszu. Napełnij sterylną strzykawkę 3 ml kompatybilną z drukarką roztworem z komórkami i zakręć sterylną plastikową końcówką 22 G.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Konfiguracja biodrukarki
<ol>
	<li>Włącz biodrukarkę, komputery każdego z dozowników oraz cyrkulacyjną kąpiel wodną.
	<ol>
		<li>Ręcznie ustaw temperaturę cyrkulacyjnej kąpieli wodnej dla mechanizmu żelowania.</li>
		<li>Ręcznie ustaw parametry drukowania dla każdego dozownika na odpowiadającym mu komputerze. Ustaw objętość dozowania na 230 nl, liczbę kroków wstecznych na 0 oraz szybkość dozowania na 10μl –sec.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do projektowania oraz program do podglądu obrazu z kamery USB na komputerze.
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania ręcznie wprowadź współrzędne dla macierzy 5 x 5 kropli z odstępem 2,4 mm między nimi.</li>
		<li>Ustaw parametry drukowania następująco: odległość między końcem końcówki a powierzchnią podłoża = 0,1 mm; wysokość podniesienia strzykawki między aplikacjami = 20 mm; czas jednej aplikacji = 1 sec.</li>
		<li>Zapisz program i prześlij go do robota.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szalkę Petri zawierającą żelatynę/TiO2 na stole drukarki o temperaturze 4 °C. Zamknij i zablokuj drzwi komory.</li>
	<li>Użyj sterownika PLC, aby uruchomić źródła światła ultrafioletowego i wysterylizować komorę przez 90 sec.</li>
	<li>Po zakończeniu sterylizacji otwórz komorę i załaduj do Gun 1 strzykawkę zawierającą hADSC zawieszone w alginianie. Zamknij i zablokuj drzwi komory.</li>
	<li>Użyj sterownika PLC, aby włączyć system wentylatorów i odczekaj 30 sec do wyrównania ciśnienia wewnętrznego.</li>
	<li>Na komputerze uruchom program zawierający ścieżkę geometryczną i parametry drukowania.</li>
	<li>W trakcie procesu drukowania obserwuj podgląd z kamery USB na komputerze, aby potwierdzić dokładność i jednorodność druku.</li>
	<li>Po zakończeniu drukowania pozostaw konstrukty do żelowania na 40 min.</li>
</ol>
6. Ocena żywotności komórek
<ol>
	<li>Konstrukcje, które nie zostaną poddane obrazowaniu bezpośrednio po drukowaniu, należy przykryć DMEM i przechowywać w inkubatorze do czasu obrazowania.</li>
	<li>Aby ocenić przeżywalność konstrukcji, należy poddać je barwieniu przy użyciu fluorescencyjnego testu żywotności/cytotoksyczności, a następnie obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej.
	<ol>
		<li>Zgodnie z instrukcją do zestawu, należy przygotować roztwór barwiący zawierający calcein AM i etydyniowy homodimer-1. Aby przygotować 10 ml roztworu barwiącego, należy dodać 20 μl etydyniowego homodimeru-1 oraz 5 μl calcein AM do 10 ml sterylnego, przeznaczonego do hodowli tkankowych roztworu soli fizjologicznej Dulbecco z buforem fosforanowym (+magnez, +wapń; DPBS++).</li>
		<li>Biodrukowane konstrukcje należy zanurzyć w roztworze barwiącym na 15 min w ciemności.</li>
		<li>Zabarwione konstrukcje należy obrazować za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego w dniu 0 i 8. Należy wykonać wiele zdjęć każdej biodrukowanej konstrukcji, stosując parametry Z-stack obejmujące 30 plastrów optycznych na głębokości 300 μm, a następnie ręcznie policzyć komórki. Komórki żółte lub zielone należy liczyć jako żywe, a czerwone jako martwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procent przeżywalności komórek oblicza się jako liczbę żywych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek w konstrukcji; Przeżywalność komórek = liczba żywych komórek (zielone+żółte)/ całkowita liczba komórek (zielone+żółte+czerwone) x 100%.</li>
	<li>Ilość proliferacji komórek dla każdej próbki oblicza się jako liczbę komórek w dniu 8 podzieloną przez liczbę komórek w dniu 0; Proliferacja komórek = liczba żywych komórek w dniu 8/ liczba żywych komórek w dniu 0 x 100%.</li>
</ol>
7. Analiza konjugacji peptydów RGD
<ol>
	<li>Aby przeanalizować sukces konjugacji peptydów RGD z alginianem, porównaj alginian skoniugowany z RGD oraz alginian nieskoniugowany. W tym celu wykonaj obrazowanie wydrukowanych konstrukcji przy użyciu barwników (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) oraz faloidyny.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy faloidyny, rozcieńczając 5 μl mętnego roztworu zapasowego w metanolu w 200 μl DPBS++. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Przygotuj 300 μM roztwór zapasowy barwnika DAPI zgodnie z równaniem: (0,10509 g/L)/(350,3 g/mol)=3 × 10-4 M=0,0003 M=0,300 mM=300 μM. Przygotuj roztwór roboczy DAPI, rozcieńczając roztwór zapasowy 1:100 w DPBS++, aby otrzymać roztwór o stężeniu 3 μM. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowicie zanurz próbkę w 4% paraformaldehydzie. Inkubuj przez 1 hr w temperaturze pokojowej (RT). Przemyj trzy razy DPBS++, pozwalając roztworowi działać przez 5 min podczas każdego płukania. Przenieś próbkę żelu z dołka na szkiełko przedmiotowe, odwracając żel podczas tego procesu. Zanurz żel w 0,1% Triton X-100 (0,1 g/ 100 ml) w DPBS++ na 10 min. Przemyj trzy razy DPBS++, poświęcając 5 min na każde płukanie.</li>
	<li>Zbarw wydrukowane konstrukcje faloidyną, zanurzając je w roztworze roboczym. Przykryj folią i inkubuj przez 4 hr. Usuń barwnik faloidynowy i przemyj trzy razy DPBS++. Pierwsze płukanie powinno być szybkie, a kolejne powinny trwać po 5 min.</li>
	<li>Zbarw wydrukowane konstrukcje DAPI, zanurzając je w roztworze roboczym DAPI. Przykryj folią i inkubuj w RT przez 30 min. Przemyj trzy razy DPBS++, pozwalając każdemu płukaniu trwać 5 min. Przeanalizuj i wykonaj obrazowanie próbek przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego.</li>
</ol>

<ol><li>Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Printing+and+Prototyping+of+Tissues+and+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds.</a> Science. 338 (6109), 921-926 (2012).</li>
<li>Kachurin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-Write+Construction+of+Tissue-Engineered+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).</li>
<li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+the+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+the+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+and+Materials%22%5BJournal%5D)">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).</li>
<li>Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+in+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Challenges+and+Potential.+Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping in Tissue Engineering.</a> Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).</li>
<li>Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Soft+Tissue+Engineering+Scaffolds+by+means+of+Rapid+Prototyping+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques.</a> Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).</li>
<li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Hydrogels+for+Bio%E2%80%93Printing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).</li>
<li>Burg, K. J. L., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+Invasive+Tissue+Engineering+Composites+and+Cell+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng+Med+Biol+Mag%22%5BJournal%5D)">Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing.</a> IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).</li>
<li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Trends+and+Limitations+in+Hydrogel-Rapid+Prototyping+for+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering.</a> Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).</li>
<li>Khalil, S., Nam, J., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi%E2%80%93Nozzle+Deposition+for+Construction+of+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymer+Tissue+Scaffolds.+Rapid+Prototyping+Journal%22%5BJournal%5D)">Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D.</a> Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).</li>
<li>Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdrop+Printing+of+Hydrogel+Bioinks+into+Three%E2%80%93Dimensional+Tissue%E2%80%93Like+Geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries.</a> Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).</li>
<li>Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Printing+of+Cell%E2%80%93Laden+Constructs+for+Heterogeneous+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Manufacturing+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration.</a> Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).</li>
<li>Gruene, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Printing+of+Three%E2%80%93Dimensional+Multicellular+Arrays+for+Studies+of+Cell%E2%80%93Cell+and+Cell%E2%80%93Environment+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions.</a> Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).</li>
<li>Khalil, S., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Endothelial+Cells+With+Alginate+for+3D+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs.</a> J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+Printing+of+Mechanically+and+Biologically+Improved+Constructs+for+Cartilage+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications.</a> Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).</li>
<li>Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Characterization+of+Bioprinted+in+vitro+Soft+Tissue+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models.</a> Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>Chung, J. H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%E2%80%93ink+Properties+and+Printability+for+Extrusion+Printing+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.%2C+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells.</a> J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).</li>
<li>Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Design+of+Scaffolds+for+Use+in+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Part+II.+Rapid+Prototyping+Techniques.+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering.</a> Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).</li>
<li>Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication%3A+An+Overview+of+the+Approaches+Used+for+Printing+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).</li>
<li>Lu, L., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+New+Processing+Techniques+in+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering.</a> MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).</li>
<li>Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+pliable+biodegradable+polymer+foams+to+engineer+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues.</a> Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).</li>
<li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Printing%3A+Tissue+Spheroids+as+Building+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%E2%80%93free+Vascular+Tissue+Engineering+Using+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li>
<li>Devillard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+by+Laser%E2%80%93Assisted+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting.</a> Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).</li>
<li>Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop%E2%80%93on%E2%80%93Demand+Inkjet+Bioprinting%3A+a+Primer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther+Reg%22%5BJournal%5D)">Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer.</a> Gene Ther Reg. 6 (1), 33(2011).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+Electrophysiology+of+Neural+Cell+Structures+Generated+by+the+Inkjet+Printing+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method.</a> Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).</li>
<li>Calvert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+Printing+for+Materials+and+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Inkjet Printing for Materials and Devices.</a> Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).</li>
<li>Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%E2%80%93Write+Bioprinting+Three%E2%80%93Dimensional+Biohybrid+Systems+for+Future+Regenerative+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).</li>
<li>Li, M. G., Tian, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Dispensing%E2%80%93Based+Rapid+Prototyping+Techniques+in+Tissue+Scaffold+Fabrication%3A+Role+of+Modeling+on+Scaffold+Properties+Prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction.</a> Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).</li>
<li>Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+Partially+Oxidized+Alginate+and+its+Potential+Application+for+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering.</a> Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambaya, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+Hydrogels+as+Synthetic+Extracellular+Matrix+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
<li>Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Environmental+Factors+that+Impact+Viability+of+Tissue%E2%80%93Engineered+Constructs+Fabricated+by+a+Direct%E2%80%93Write+Bioassembly+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).</li>
<li>Ozbolat, I., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Towards+Organ+Fabrication%3A+Challenges+and+Future+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).</li>
<li>Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Rapid+Prototyping+Techniques+for+Tissue+Engineering+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes.</a> Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+Anniversary+Article%3A+Engineering+Hydrogels+for+Biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication.</a> Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Bioprinting+of+Tissues+and+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">3D Bioprinting of Tissues and Organs.</a> Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Alginate+as+Bioink+for+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).</li>
<li>Forty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Differential+Adhesion+Hypothesis%3A+a+Direct+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation.</a> Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).</li>
<li>Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Fabrication+of+a+Biodegradable%2C+Covalently+Crosslinked+Shape%E2%80%93Memory+Alginate+Scaffold+for+Cell+and+Growth+Factor+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tis+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery.</a> Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).</li>
<li>El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+Scaffolds+for+Tissue+Engineering%3A+Progress+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science%2C+%26+Practice%22%5BJournal%5D)">Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges.</a> Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).</li>
<li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three%E2%80%93Dimensional+BioAssembly+Tool+for+Generating+Viable+Tissue-Engineered+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs.</a> Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).</li>
<li>Ozbolat, I. T., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+%E2%80%98Multi-arm+Bioprinter%E2%80%99+for+Hybrid+Fabrication+of+Tissue+Engineering+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Robotics+and+Computer%E2%80%93Integrated+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs.</a> Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).</li>
<li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Bioprinting+of+Vascularized%2C+Heterogeneous+Cell%E2%80%93Laden+Tissue+Constructs.+Adv+Mater.+X%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X.</a> Adv Mater. X, x-y (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem inżynierii tkankowej jest wypełnienie luki między niedoborem narządów a potrzebami transplantacyjnymi poprzez opracowanie biologicznych substytutów zdolnych do przywrócenia, utrzymania lub poprawy funkcji tkanek natywnych. Doprowadziło to do bezpośredniego wytwarzania rusztowań o złożonej, anatomicznie poprawnej geometrii zewnętrznej i precyzyjnej kontroli nad wewnętrznym geometrem. Bioprinting trójwymiarowy to metodologia stosowana do generowania trójwymiarowych konstrukcji o różnych rozmiarach i kształtac...

Inżynieria tkankowa wykorzystuje zasady biologii i inżynierii do opracowywania funkcjonalnych substytutów w celu utrzymania, przywrócenia lub ulepszenia rodzimej tkanki i . Zdolność do generowania trójwymiarowych konstruktów biomimetycznych na żądanie ułatwiłaby postęp naukowy i technologiczny w inżynierii tkankowej, a także w czujnikach komórkowych, badaniach przesiewowych leków/toksyczności, modelach tkanek lub nowotworów i innych. Trójwymiarowa organizacja konstruktów inżynierii tkankowej jest podstawowym elementem metody wytwarzania, ponieważ musi ściśle naśladować wysoce zorganizowaną interakcję komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej w tkance natywnej.
Biodegradowalne i kształtujące kształty trójwymiarowe rusztowania są kluczowymi czynnikami w generowaniu nowych konstrukcji tkankowych, ponieważ komórki migrują, tworząc dwuwymiarową warstwę komórek, ale nie mają zdolności do wzrostu w preferowanym trójwymiarze. Rusztowanie służy jako tymczasowa podstawa do przyczepiania i proliferacji komórek, dlatego musi być zbudowane z materiałów o kontrolowanej porowatości i biodegradowalności oraz wystarczającej integralności mechanicznej. Materiały rusztowań nie powinny być cytotoksyczne ani wywoływać niepożądanej reakcji gospodarza. Hydrożele są powszechnie stosowane w technikach inżynierii tkankowej, a ze względu na swoją hydrofilowość hydrożele umożliwiają wymianę płynów i gazów w całej strukturze. Łącząc różne hydrożele, właściwości zsyntetyzowanego hydrożelu można modyfikować, aby spełnić różne wymagania aplikacji.
Konwencjonalne podejście inżynierii tkankowej polega na tworzeniu bezkomórkowych, porowatych rusztowań ofiarnych, które są zasiewane komórkami po faktylacji. Zastosowano wiele technik, takich jak klejenie włókien, odlewanie rozpuszczalnikowe i formowanie ze stopu, ale okazało się, że są one minimalnie skuteczne w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Metody łączenia włókien pozwalają na wyrównanie włókien w określonych kształtach, ale są one w stanie wytworzyć tylko bardzo cienkie rusztowanie. Metody odlewania rozpuszczalnikowego pozwoliły uzyskać wysoce porowate konstrukcje, jednak największa wyprodukowana membrana miała zaledwie 3 mm grubości. Dlatego tworzenie trójwymiarowych konstrukcji nie jest możliwe przy użyciu tych technik. Techniki formowania ze stopu okazały się skuteczne w produkcji trójwymiarowych rusztowań, ale wymagane są tak wysokie temperatury, że materiały biologiczne nie mogą być włączone do procesu produkcyjnego. Rusztowania wysiewane po wytworzeniu mają ograniczoną zdolność do spełnienia wymagań inżynierii tkankowej w zakresie produkcji trójwymiarowych rusztowań z predefiniowanymi lub sterowalnymi mikrostrukturami i . Innym poważnym problemem związanym z technologiami siewu rusztowań litych jest brak unaczynienia i słaba mechaniczna .
Bioprinting został od tego czasu rozszerzony do trzech wymiarów dzięki zastosowaniu nietoksycznych, biodegradowalnych, termoodwracalnych żeli, aby przezwyciężyć wady konwencjonalnych . Kilka z obecnie stosowanych technik wytwarzania brył o swobodnych kształtach to biodruk wspomagany laserem i druk atramentowy. Techniki biodruku wspomaganego laserowo wykorzystują impulsowe źródło lasera, płytkę docelową i podłoże odbiorcze do generowania trójwymiarowych. Jednak technika ta jest ograniczona ze względu na niską przepustowość, niską żywotność komórek i może wytwarzać tylko ograniczone układy wytwarzanych struktur, ponieważ do utworzenia usieciowanego hydrożelu można użyć tylko fotosieciowalnych prepolimerów. Druk atramentowy został opracowany jako metodologia bezkontaktowa, która odtwarza cyfrowe dane obrazu na podłożu poprzez osadzanie atramentu pikolitrowego. Jednak druk atramentowy nie wytwarza konstruktu o wysokiej rozdzielczości, konstrukty doświadczają szybkiej denaturacji białek, a wiele komórek ulega lizie podczas osadzania.
Obecnie opracowano nowe metody biodruku w produkcji addytywnej. W tych systemach komórki, białka, czynniki wzrostu i hydrożele biomimetyczne są zwykle integrowane z materiałami matrycowymi podczas procesu produkcyjnego i jednocześnie osadzane za pomocą sterowanych komputerowo siłowników w celu wygenerowania trójwymiarowych konstruktów komórkowych opartych na rusztowaniach, które ściśle naśladują mikroarchitekturę natywnych. Hydrożele obciążone komórkami tworzą biotusz, który może być niejednorodny, składający się z wielu typów komórek lub jednorodny. Systemy produkcji addytywnej umieszczają biotusz kropla po kropli lub warstwa po warstwie za pomocą jednorazowych strzykawek i końcówek na sterowanym komputerowo stoliku, który może poruszać się w kierunkach x, y i z. Dzięki oprogramowaniu komputerowemu architekturą rusztowań drukowanych można łatwo manipulować w zależności od wymagań aplikacji. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, trójwymiarowe technologie medyczne (rezonans magnetyczny, tomografia komputerowa) mogą być włączone do projektów, generując konstrukcję specyficzną dla pacjenta. Metody te dają również możliwość wytwarzania unaczynionych zamienników, ponieważ konstrukty są wytwarzane z większą lokalną gęstością komórek, co umożliwia interakcje komórka-komórka i zwiększa prawdopodobieństwo przeżycia po implantacji.
Drukarka Palmetto to specjalnie zbudowany trójwymiarowy system wielodozownikowy, który wykorzystuje programowalne metody produkcji robotycznej do generowania trójwymiarowych heterogenicznych konstrukcji tkanek (Rysunek 1). Pozwala na użycie wielu materiałów w unikalnych kombinacjach w celu uzyskania niejednorodnych struktur. Inicjalizacja biodrukarki jest jednym z najważniejszych kroków w biodruku, ponieważ pozwala ustawić różne parametry w celu optymalizacji drukowalności biodrukowanych konstrukcji.
Bioprinter składa się z procesu typu wsadowego z sekwencjami uruchamiania, działania i wyłączania kontrolowanymi przez programowalny sterownik logiczny (PLC), który użytkownik obsługuje za pomocą interaktywnego panelu sterowania z ekranem dotykowym (Rysunek 1, A). Aby zapobiec zanieczyszczeniu materiałów biologicznych, biodrukarka jest zamknięta w komorze z poli(metakrylanu metylu) (PMMA) pod dodatnim ciśnieniem z wysokowydajnym systemem cyrkulacji powietrza filtrowanym przez filtr cząstek stałych (HEPA) (rysunek 1, B, C). Wnętrze drukarki można sterylizować za pomocą wbudowanych źródeł światła ultrafioletowego (rysunek 1, D). Centralnym elementem biodrukarki jest w pełni programowalny robot pozycjonujący, który może w sposób powtarzalny umieścić końcówkę dozownika z dokładnością do 10 mikrometrów (rys. 1, E). Dostępne są trzy dozowniki, które są w stanie nanosić objętości tak małe jak 230 nl za pomocą obrotowej (rysunek 1, F). Są one niezależnie programowalne za pomocą oddzielnych komputerów, które zarządzają parametrami drukowania dla każdego dozownika (rysunek 1, G). Dozowanie śrubowe obrotowe wykorzystuje obrót napędzanej silnikiem do przesuwania biotuszu w dół strzykawki i na zewnątrz końcówki strzykawki. Dozowniki te są zamontowane na pneumatycznie sterowanym gnieździe narzędziowym (Rysunek 2A, B), co pozwala robotowi przełączać dozownik zamontowany na ramieniu robota osi Z pod zaprogramowanym sterowaniem (Rysunek 1, H).
Robot XYZ otrzymuje instrukcje drukowania z komputera z uruchomionym oprogramowaniem do projektowania (Rysunek 1, I). Każdy program zawiera lokalizacje dozowania, procedury kalibracji i protokoły wymiany dozownika. Projekt generowanych konstrukcji składa się przede wszystkim ze współrzędnych XYZ, na których każdy dozownik będzie deponował materiał. Biodrukarka składa się z dwóch optycznych czujników światła (rysunek 2C), które określają współrzędne XYZ końcówki strzykawki. Czujniki te wysyłają informacje o współrzędnych do robota, który wykorzystuje je do obliczania pozycji końcówek końcówek dozownika. Istnieje dodatkowy laser przemieszczeniowy (rysunek 2D), który emituje czerwoną wiązkę lasera diodowego o długości 633 nm o wielkości plamki 30 x 100 mikrometrów w celu pomiaru odległości z dokładnością do 0,1 mikrometra. Gdy wiązka jest mocno skupiona, robot określa odległość Z powierzchni druku. Pomiar ten, a także pomiar końcówki końcówki w Z przez czujniki światła optycznego, pozwala na obliczenie dokładnych współrzędnych Z używanych do umieszczenia końcówki dozownika w stosunku do powierzchni druku. Końcówki dozownika poruszają się poprzecznie i pionowo przez optyczny czujnik światła zorientowany na oś X, aby znaleźć środki Y i Z, oraz poprzecznie przez czujnik osi Y, aby znaleźć środek osi X. Powierzchnia drukowania jest odwzorowywana przy użyciu wzoru na płaską płaszczyznę w przestrzeni xyz: ax + by +cz = d w celu określenia, gdzie znajduje się powierzchnia względem położenia końcówki dozującej. Stolik drukarki (rysunek 1, J) zawiera próbkę szalki Petriego o średnicy do 80 mm i wykorzystuje recyrkulacyjną łaźnię wodną do utrzymania ustawionej temperatury (rysunek 1, K). Temperaturę stage można ustawić w zakresie -20 i pozostaje stabilna w zakresie . Na ramieniu Z robota zamontowana jest kamera USB, która zapewnia powiększony widok końcówki dozującej podczas procesu drukowania (Rysunek 1, L). W górnej części wnętrza komory zamontowana jest druga kamera, która zapewnia pełny widok biodrukarki podczas procesu drukowania (Rysunek 1, L).
Wspomagane komputerowo oprogramowanie do rysowania projektów określa wzór osadzania i pozwala użytkownikowi na generowanie przyrostowo rozmieszczonych kropel i skomplikowanych struktur (Rysunek 3). Trójwymiarowe ścieżki można ręcznie zakodować w oprogramowaniu do projektowania kompatybilnym z drukarką lub zaimportować z oddzielnego oprogramowania do rysowania projektów wspomaganych komputerowo (Rysunek 4, Tabela 1). Oprogramowanie kompatybilne z drukarką umożliwia zmianę parametrów drukowania, takich jak metoda osadzania (osadzanie pojedynczej kropli lub osadzanie ciągłe), trójwymiarowa geometria ścieżek, szybkość stapiania, odległość między końcówką strzykawki a powierzchnią drukowania podłoża, ilość czasu do nałożenia pojedynczej kropli oraz wysokość i prędkość podnoszenia strzykawki między osadzaniem kropli. Każdy program zawiera lokalizacje dozowania XYZ, procedury kalibracji końcówek i protokoły wymiany dozownika, aby zapewnić sterylne środowisko podczas drukowania bez interwencji operatora. Programowalny sterownik logiczny (PLC) robota otrzymuje instrukcje z komputera, na którym działa oprogramowanie do projektowania, i steruje czasem zdarzeń z zewnętrznych sterowników (np. dozowników). W tym celu sterownik PLC wykorzystuje mechanizm pętli do sterowania dozownikami, zrobotyzowanym urządzeniem pozycjonującym i czynnikami środowiskowymi.
Trójwymiarowy biodruk bezpośredniego zapisu, wykorzystujący obrotowo-śrubowy system dozowania płynów, pozwala na to, aby proces osadzania komórek był bardziej wydajny, dokładny i łatwiejszy niż poprzednie metody. Badanie to pokazuje, że specjalnie zbudowana biodrukarka jest w stanie generować obciążone komórkami konstrukcje hydrożelowe o wysokiej żywotności komórek.

<table><tbody><tr><td>Robot pozycjonujący (JR2000 XYZ)</td><td>Janome&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dozowniki: SDAV Napęd liniowy Inteligentne dozowniki</td><td>Fishman Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optyczne czujniki światła:&nbsp;</td><td>Keyensce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser wyporowy: OD Mini</td><td>SICK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recyrkulacyjna kąpiel wodna: Polystat</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12122-02</td><td></td></tr><tr><td>Kamery USB: Dino-Lite Premier 5MP</td><td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td><td>AD7013MT</td><td></td></tr><tr><td>Kompatybilne z drukarką oprogramowanie do projektowania komputerowego: JR-C Points</td><td>Janome</td><td></td><td>W zestawie z zakupem robota Janome</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rysowania wspomaganego komputerowo: Visual PathBuilder</td><td>RatioServ</td><td></td><td>Można pobrać pod adresem: www.ratioserv.com/index.php/downloads</td></tr><tr><td>Drukarka 3 cc Strzykawki:&nbsp;</td><td>Fishman Corporation</td><td>122051</td><td></td></tr><tr><td>22 G Końcówki dozownika</td><td>Fishman Corporation</td><td>Z520122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna wieprzowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dwutlenek tytanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13462-67-7</td><td></td></tr><tr><td>Protanal LF 20/40 Alginian (alginian sodu)</td><td>FMC BioPolymer</td><td>9005-38-3</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Mallinckrodt Baker, Inc</td><td>9300-01</td><td></td></tr><tr><td>Periodynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7790-28-5</td><td></td></tr><tr><td>hADSC</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td>Przechowywać w fiolkach w ciekłym azocie do czasu użycia.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's Medium</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C woda przed użyciem.</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C woda przed użyciem.</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td>Przechowywać w ciemności w temperaturze -80 stopni; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania żywotności żywych/martwych ssaków</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>L-3224</td><td>Przechowywać w ciemności w temperaturze -80 stopni Celsjusza; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>MES Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-etylo-(dimetyloaminopropylo)karbodimid (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769&nbsp;</td><td>10 gramów</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco, +Wapń, +Technologie Magnezu</td><td>Życia</td><td>14040133</td><td>ciepła w 37 stopniach; C woda przed użyciem.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, -wapń, -magnez</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td>ciepła w 37 stopniach; C woda przed użyciem.</td></tr><tr><td>RGD Peptides</td><td>International Peptides</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>A22283</td><td>Przechowywać pod adresem -20 & C do czasu użycia</td></tr> <tr><td>(4', 6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek) (DAPI) Stain</td><td>Life Technologies</td><td>R37606</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &; C do momentu użycia</td></tr></tbody></table>

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Inżynieria tkankowa skupiła się na budowie zamienników dla niefunkcjonalnych lub uszkodzonych tkanek. Wykorzystanie trójwymiarowego biodruku w inżynierii tkankowej stworzyło nowe metody drukowania komórek i matryc w celu wytwarzania biomimetycznych konstruktów tkankowych. Metoda wytwarzania brył o swobodnych kształtach (SFF) opracowana na potrzeby trójwymiarowego biodruku wykorzystuje podejście do wytwarzania przyrostowego polegające na osadzaniu kropelek komórek i hydrożeli warstwa po warstwie. Produkcja biodruku jest zależna od specyficznego rozmieszczenia materiałów biologicznych w trójwymiarowych architekturach, a wydrukowane konstrukty powinny ściśle naśladować złożoną organizację komórek i macierzy zewnątrzkomórkowych w tkance natywnej. W artykule zwrócono uwagę na zastosowanie drukarki Palmetto, biodrukarki kartezjańskiej, a także proces wytwarzania przestrzennie zorganizowanych, żywotnych konstrukcji, przy jednoczesnym umożliwieniu kontroli czynników środowiskowych. Metodologia ta wykorzystuje projektowanie wspomagane komputerowo i produkcję wspomaganą komputerowo do wytwarzania tych specyficznych i złożonych geometrii. Wreszcie, takie podejście pozwala na powtarzalną produkcję gotowych konstrukcji zoptymalizowanych pod kątem kontrolowanych parametrów drukowania.

Wyniki wykazują, że biodrukarka jest w stanie precyzyjnie i spójnie nanosić hydrożele z zawieszonymi komórkami w określonych lokalizacjach trójwymiarowych przy użyciu oprogramowania wspomaganego komputerowo. Programy te określają rozmieszczenie każdej kropli i kontrolują wiele parametrów dozowania (Rycina 3,4). Powtarzalność biodrukarki w zakresie prawidłowego nanoszenia biomateriałów jest kluczowa dla jej sukcesu w zastosowaniach inżynierii tkankowej.
Żywotność komórek, będąc...

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie żywotnych konstruktów zawierających komórki o złożonej geometrii przy użyciu biodrukarki 3D. Osiąga się to poprzez wstępną izolację ludzkich komórek stromalnych tkanki tłuszczowej z hodowli. Następnie komórki są mieszane ze świeżo przygotowanym biotuszem z alginianu utlenionego sprzężonego z RGD.W ostatnim kroku LA komórkowa w biomateriale jest ekstrudowana za pomocą biodruku. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do analizy żywotności, proliferacji i migracji biodrukowanych komórek. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tworzenie rusztowań i wysiew komórek, jest możliwość bezpośredniego umieszczenia komórek i agregatów komórkowych dokładnie tam, gdzie są one niezbędne do utworzenia tkanki.Procedurę zaprezentuje Sarah Grace Dennis, doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij od wysiania 350 000 ludzkich stromalnych komórek tkanki tłuszczowej do przygotowanej kolby T 75 w 15 mililitrach niskoglukozowego TMEM w celu ekspansji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, usuń medium i wypłucz komórki w pięciu mililitrach DPBS bez wapnia i magnezu.Następnie inkubuj komórki w 5 ml trypsyny i DPBS przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Gdy komórki się oddzielą, zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 3 ml pożywki do hodowli komórkowej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwiruj komórki i resuspenduj osad w 2 ml pożywki do hodowli komórkowej. Potem policz komórki, przenieś alikwot zawierający 1,3 × 10⁶ komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ponownie odwiruj komórki.Resuspender osad w jednym mililitrze świeżo przygotowanego bioatramentu, dbając o jednorodne rozprowadzenie komórek w wodnym roztworze alginianu. Następnie przenieść komórki do sterylnej strzykawki o pojemności trzech mililitrów, kompatybilnej z drukarką, i nakręcić sterylną plastikową końcówkę o rozmiarze 22 gauge. Włączyć biodrukarkę, komputery każdego z dozowników oraz cyrkulacyjną łaźnię wodną.Ręcznie ustaw temperaturę kąpieli na 4 °C dla mechanizmu pozycjonowania oraz parametry drukowania dla każdego dozownika na odpowiadającym mu komputerze sterującym. Ustaw objętość dozowania na 230 nanolitrów, liczbę kroków cofania na zero oraz szybkość dozowania na 10 µL/s. Następnie otwórz oprogramowanie projektowe oraz program do podglądu z kamery USB na komputerze.Następnie ręcznie wprowadź współrzędne dla macierzy kropek o wymiarach pięć na pięć z odstępem 2,4 mm między kroplami. Zapisz program i prześlij go do robota. Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą żelatynę z dwutlenkiem tytanu na platformie drukarki o temperaturze 4 °C, a następnie zamknij i zablokuj drzwi komory.Za pomocą programowalnego sterownika logicznego uruchomiono źródła światła ultrafioletowego w celu sterylizacji komory. Po 90 sekundach otwarto komorę i załadowano strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek stromalnych tkanki tłuszczowej człowieka do pistoletu nr 1, zamknięto i zablokowano drzwi komory, a następnie za pomocą programowalnego sterownika logicznego włączono system wentylatorów. Odczekano 30 sekund do wyrównania ciśnienia wewnętrznego, a następnie uruchomiono program zawierający ścieżkę geometryczną i parametry drukowania, które były stosowane przez cały proces druku.Obserwuj obraz z kamery USB na komputerze, aby potwierdzić dokładność i jednorodność drukowania. W celu ilościowego określenia żywotności biodrukowanych konstruktów, zanurz je w świeżo przygotowanym roztworze barwiącym. Następnie umieść konstrukty w lodówce na 15 minut w ciemności, aby barwnik mógł się utrwalić.Następnie, analizując obraz z mikroskopu konfokalnego, konstrukcje barwione na żółto lub zielono klasyfikuje się jako żywe, natomiast komórki barwione na czerwono jako martwe. Jak wykazują te wyniki, biodruk umożliwia precyzyjne i powtarzalne rozmieszczanie komórek oraz hydrożeli w określonych lokalizacjach trójwymiarowych przy użyciu oprogramowania komputerowego. Oprogramowanie to wyznacza miejsce osadzenia każdej kropli i kontroluje wiele parametrów dozowania.Jednym z wymagań skutecznej techniki biodruku jest zachowanie żywotności komórek. Komórki wydrukowane w bioatramencie alginianowym, zgodnie z powyższą demonstracją, zostały poddane analizie jedną godzinę oraz osiem dni po druku; w dniu zerowym 98% komórek wykazuje zielone barwienie i jest żywe, a w ósmym dniu odsetek ten wynosi 95%. Jak wskazuje czerwone barwienie, w obu punktach czasowych zaobserwowano niewiele martwych komórek, co potwierdza przydatność alternatywnego atramentu do biodruku.Ponadto tusz alginianowy sprzężony z RGD zwiększa przyleganie komórek do wydrukowanych konstruktów, co prowadzi do poprawy rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek, co ilościowo określono w trzech oddzielnych obszarach hydrożelu w dniu zerowym i ósmym. Tutaj, w dniu ósmym, porównano jakość sprzężenia peptydu RGD w biotuszu Ginnet z zastosowaniem samego biotuszu Ginnet. Rozprzestrzenianie się komórek zaobserwowane w próbce barwionej biotuszem Ginnet sprzężonym z RGD wskazało na skuteczne włączenie peptydu do Ginnet, co było zjawiskiem wyraźnie nieobecnym w próbkach biodrukowanych niesprzężonych po ich opracowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej do zbadania wytwarzania przyrostowego jako sposobu montażu żywych konstruktów inżynieryjnych.

viability-bioprinted-cellular-constructs-using-three-dispenser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metody opisane w tym artykule pokazują, jak przekształcić komercyjną drukarkę atramentową w biodrukarkę z jednoczesną polimeryzacją UV. Drukarka jest w stanie konstruować strukturę tkankową 3D z komórek i biomateriałów. Badanie, które wykazało, że tutaj skonstruowano chrząstkę nową 3D.

Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Rozpuszczalne ekstrakty z błony podstawnej są najczęściej stosowanymi matrycami biologicznymi w badaniach nad rakiem, ale ich skomplikowane zachowanie reologiczne utrudnia ich biodrukowanie za pomocą dostępnych na rynku systemów biodruku. W pracy przedstawiono zindywidualizowaną strategię biodruku w celu uzyskania czystych konstruktów matrycowych o dobrej wierności kształtu zarówno w jednej, jak i wielu warstwach.

Projekt i walidacja biodrukarki do wytłaczania wolumetrycznego do biodruku rozpuszczalnego ekstraktu z błony podstawnej do badań translacyjnych

Poznaj metodę bioprintingu 3D do tworzenia żywych konstruktów komórkowych z ludzkich komórek tkanki tłuszczowej. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie komórek w inżynierii tkankowej.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Przeglądaj więcej filmów