Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie żywotnych konstruktów obciążonych komórkami o złożonej geometrii przy użyciu biodruku 3D. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw komórek zrębu ludzkiej tkanki tłuszczowej z hodowli. Następnie komórki miesza się ze świeżo przygotowanym utlenionym sprzężonym biotuszem alginianowym RGD.

W ostatnim etapie komórka LA w biomateriale jest wytłaczana za pomocą biodruku. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do analizy żywotności, proliferacji i migracji biodrukowanych komórek. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi procedurami, takimi jak formowanie rusztowań i wysiewanie komórek, jest to, że dzięki naszej procedurze można bezpośrednio umieścić komórki i agregaty komórkowe dokładnie tam, gdzie muszą się znaleźć, aby utworzyć tkankę.

Dzisiaj procedurę zademonstruje Sarah Grace Dennis, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od wysiewu 350 000 ludzkich komórek zrębowych tkanki tłuszczowej na traktowanej kolbie T 75 w 15 mililitrach TMEM o niskiej stężeniu glukozy w celu ekspansji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy kultura osiągnie 80% płynności CO, usuń pożywkę i przepłucz komórki w pięciu mililitrach DPBS bez wapnia i magnezu.

Następnie inkubuj komórki w pięciu mililitrach trypsyny i DPBS przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję enzymatyczną za pomocą trzech mililitrów pożywki do hodowli komórkowej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki do hodowli komórkowych. Następnie policz komórki, przenieś 1,3 razy 10 z sześciu podwielokrotności komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i ponownie odwiruj komórki.

Zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego bio tuszu, uważając, aby jednorodnie rozprowadzić komórki w wodnym roztworze alginianu. Następnie załaduj komórki do sterylnej trzymililitrowej strzykawki kompatybilnej z drukarką i przykręć sterylną plastikową końcówkę o rozmiarze 22. Teraz włącz bioprint, każdy z komputerów dozujących i recyrkulacyjną kąpiel wodną.

Ręcznie ustaw temperaturę kąpieli na cztery stopnie Celsjusza dla mechanizmu i parametry drukowania dla każdego dozownika na skorelowanym komputerze dozującym. Ustaw objętość dozowania na 230 nanolitrów, liczbę kroków wstecznych na zero, a szybkość dozowania na 10 mikrolitrów na sekundę. Następnie otwórz oprogramowanie do projektowania i program do przeglądania wyświetlacza kamery USB na komputerze.

Następnie ręcznie wprowadź współrzędne tablicy kropek pięć na pięć z 2,4 milimetra odstępu między kroplami. Zapisz program i wyślij program do robota. Następnie umieścić żelatynową płytkę Petriego zawierającą dwutlenek tytanu na stoliku drukarki o temperaturze czterech stopni Celsjusza i zamknąć i zablokować drzwi komory.

Za pomocą programowalnego sterownika logicznego zainicjowano źródła światła ultrafioletowego w celu sterylizacji komory. Po 90 sekundach otwórz komorę i załaduj strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek zrębu ludzkiej tkanki tłuszczowej do pistoletu, zamknij i zablokuj drzwi komory i użyj programowalnego sterownika logicznego, aby włączyć system wentylatorów. Odczekaj 30 sekund, aż ciśnienie wewnętrzne się zrównoważy, a następnie uruchom program zawierający ścieżkę geometryczną i parametry drukowania przez cały proces drukowania.

Obserwuj obraz z kamery USB na komputerze, aby potwierdzić dokładne i jednolite drukowanie. Aby określić ilościowo żywotność biodrukowanych konstruktów, zanurz je w świeżo przygotowanym roztworze bejcy. Następnie umieść konstrukcje w lodówce na 15 minut w ciemności, aby plama stwardniała.

Następnie, używając obrazu mikroskopu konfokalnego, barwione konstrukcje, jeśli komórki wydają się żółte lub zielone, klasyfikują je jako żywe, jeśli czerwone, komórki są martwe. Jak pokazują te wyniki, bioprinting ułatwia osadzanie pomocy komórkowej i hydrożeli w określonych lokalizacjach trójwymiarowych w sposób dokładny i spójny przy użyciu oprogramowania komputerowego. Oprogramowanie komputerowe określa położenie każdej kropli i kontroluje wiele parametrów dozowania.

Jednym z wymogów skutecznej techniki biodruku jest to, aby komórki pozostały żywotne. Komórki wydrukowane w alginowym tuszu biologicznym, jak właśnie pokazano, analizowano godzinę i osiem dni po wydrukowaniu, przy czym 98% komórek wydawało się zielonych i zdolnych do życia w dniu zero, a 95% w ósmym dniu. Jak wskazuje czerwone zabarwienie, w obu punktach czasowych zaobserwowano niewiele martwych komórek, co potwierdza przydatność alternatywnego atramentu do biodruku.

Co więcej, sprzężony atrament algin RGD zwiększa przyczepianie komórek do wydrukowanych konstruktów, co prowadzi do lepszego rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek, jak określono ilościowo w trzech oddzielnych obszarach hydrożelu na zero i ósemkę. W tym przypadku porównano jakość koniugacji peptydu RGD na tuszu bio ginnet z użyciem samego atramentu Ginnet w ósmym dniu. Rozprzestrzenianie się komórek zaobserwowane w sprzężonej próbce barwionej ginnetem RGD wskazywało na pomyślne włączenie peptydu do ginnetu, zjawisko, które było zauważalnie nieobecne w niesprzężonych próbkach bioprintu po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do zbadania produkcji addytywnej jako sposobu na składanie żywych konstruktów inżynieryjnych.