Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami
22 września 2015
A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie żywotnych konstruktów obciążonych komórkami o złożonej geometrii przy użyciu biodruku 3D. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw komórek zrębu ludzkiej tkanki tłuszczowej z hodowli. Następnie komórki miesza się ze świeżo przygotowanym utlenionym sprzężonym biotuszem alginianowym RGD.
W ostatnim etapie komórka LA w biomateriale jest wytłaczana za pomocą biodruku. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do analizy żywotności, proliferacji i migracji biodrukowanych komórek. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi procedurami, takimi jak formowanie rusztowań i wysiewanie komórek, jest to, że dzięki naszej procedurze można bezpośrednio umieścić komórki i agregaty komórkowe dokładnie tam, gdzie muszą się znaleźć, aby utworzyć tkankę.
Dzisiaj procedurę zademonstruje Sarah Grace Dennis, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od wysiewu 350 000 ludzkich komórek zrębowych tkanki tłuszczowej na traktowanej kolbie T 75 w 15 mililitrach TMEM o niskiej stężeniu glukozy w celu ekspansji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy kultura osiągnie 80% płynności CO, usuń pożywkę i przepłucz komórki w pięciu mililitrach DPBS bez wapnia i magnezu.
Następnie inkubuj komórki w pięciu mililitrach trypsyny i DPBS przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję enzymatyczną za pomocą trzech mililitrów pożywki do hodowli komórkowej i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki do hodowli komórkowych. Następnie policz komórki, przenieś 1,3 razy 10 z sześciu podwielokrotności komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i ponownie odwiruj komórki.
Zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego bio tuszu, uważając, aby jednorodnie rozprowadzić komórki w wodnym roztworze alginianu. Następnie załaduj komórki do sterylnej trzymililitrowej strzykawki kompatybilnej z drukarką i przykręć sterylną plastikową końcówkę o rozmiarze 22. Teraz włącz bioprint, każdy z komputerów dozujących i recyrkulacyjną kąpiel wodną.
Ręcznie ustaw temperaturę kąpieli na cztery stopnie Celsjusza dla mechanizmu i parametry drukowania dla każdego dozownika na skorelowanym komputerze dozującym. Ustaw objętość dozowania na 230 nanolitrów, liczbę kroków wstecznych na zero, a szybkość dozowania na 10 mikrolitrów na sekundę. Następnie otwórz oprogramowanie do projektowania i program do przeglądania wyświetlacza kamery USB na komputerze.
Następnie ręcznie wprowadź współrzędne tablicy kropek pięć na pięć z 2,4 milimetra odstępu między kroplami. Zapisz program i wyślij program do robota. Następnie umieścić żelatynową płytkę Petriego zawierającą dwutlenek tytanu na stoliku drukarki o temperaturze czterech stopni Celsjusza i zamknąć i zablokować drzwi komory.
Za pomocą programowalnego sterownika logicznego zainicjowano źródła światła ultrafioletowego w celu sterylizacji komory. Po 90 sekundach otwórz komorę i załaduj strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek zrębu ludzkiej tkanki tłuszczowej do pistoletu, zamknij i zablokuj drzwi komory i użyj programowalnego sterownika logicznego, aby włączyć system wentylatorów. Odczekaj 30 sekund, aż ciśnienie wewnętrzne się zrównoważy, a następnie uruchom program zawierający ścieżkę geometryczną i parametry drukowania przez cały proces drukowania.
Obserwuj obraz z kamery USB na komputerze, aby potwierdzić dokładne i jednolite drukowanie. Aby określić ilościowo żywotność biodrukowanych konstruktów, zanurz je w świeżo przygotowanym roztworze bejcy. Następnie umieść konstrukcje w lodówce na 15 minut w ciemności, aby plama stwardniała.
Następnie, używając obrazu mikroskopu konfokalnego, barwione konstrukcje, jeśli komórki wydają się żółte lub zielone, klasyfikują je jako żywe, jeśli czerwone, komórki są martwe. Jak pokazują te wyniki, bioprinting ułatwia osadzanie pomocy komórkowej i hydrożeli w określonych lokalizacjach trójwymiarowych w sposób dokładny i spójny przy użyciu oprogramowania komputerowego. Oprogramowanie komputerowe określa położenie każdej kropli i kontroluje wiele parametrów dozowania.
Jednym z wymogów skutecznej techniki biodruku jest to, aby komórki pozostały żywotne. Komórki wydrukowane w alginowym tuszu biologicznym, jak właśnie pokazano, analizowano godzinę i osiem dni po wydrukowaniu, przy czym 98% komórek wydawało się zielonych i zdolnych do życia w dniu zero, a 95% w ósmym dniu. Jak wskazuje czerwone zabarwienie, w obu punktach czasowych zaobserwowano niewiele martwych komórek, co potwierdza przydatność alternatywnego atramentu do biodruku.
Co więcej, sprzężony atrament algin RGD zwiększa przyczepianie komórek do wydrukowanych konstruktów, co prowadzi do lepszego rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek, jak określono ilościowo w trzech oddzielnych obszarach hydrożelu na zero i ósemkę. W tym przypadku porównano jakość koniugacji peptydu RGD na tuszu bio ginnet z użyciem samego atramentu Ginnet w ósmym dniu. Rozprzestrzenianie się komórek zaobserwowane w sprzężonej próbce barwionej ginnetem RGD wskazywało na pomyślne włączenie peptydu do ginnetu, zjawisko, które było zauważalnie nieobecne w niesprzężonych próbkach bioprintu po jego opracowaniu.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do zbadania produkcji addytywnej jako sposobu na składanie żywych konstruktów inżynieryjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia procedurę generowania żywotnych konstrukcji z komórkami o złożonych geometriach za pomocą 3D bioprintera. Metoda polega na izolowaniu ludzkich komórek stromalnych tkanki tłuszczowej i ich mieszaniu z bioinktem przed wydaleniem przez bioprinter.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biodrukowanie
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
Tło
- 3D biodrukowanie pozwala na precyzyjne umieszczanie komórek.
- Tradycyjne metody obejmują formowanie struktury wstępnej i wszczepianie komórek.
- Bezpośrednie umieszczanie komórek może poprawić formowanie tkanki.
- Mikroskopia konfokalna jest używana do analizy żywotności komórek.
Cel badania
- Stworzenie złożonych, żywych konstrukcji za pomocą 3D bioprintera.
- Poprawa dokładności umieszczania komórek w inżynierii tkankowej.
- Analiza zachowania komórek po biodruku.
Zastosowane metody
- Izolowanie ludzkich komórek stromalnych tkanki tłuszczowej.
- Przygotowanie utlenionego bio inku alginianu z koniugacją RGD.
- Wydalenie biomateriału z komórkami za pomocą biodrukarki.
- Analiza żywotności, proliferacji i migracji komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Główne wyniki
- Skuteczna generacja żywych konstrukcji z komórkami.
- Poprawiona kontrola nad umieszczaniem komórek w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Wykazana żywotność i proliferacja komórek po biodruku.
- Mikroskopia konfokalna potwierdziła wzorce migracji komórek.
Wnioski
- 3D bioprinter pozwala na precyzyjne i powtarzalne umieszczanie komórek.
- Ta metoda może potencjalnie rozwijać zastosowania inżynierii tkankowej.
- Przyszłe badania mogą eksplorować dalsze zastosowania tej techniki biodrukowania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This bioprinting method enables precise spatial organization of cells within complex 3D geometries, addressing a key challenge in tissue engineering for regenerative medicine and disease modeling. By maintaining high cell viability and supporting proliferation, the approach provides a reproducible platform for evaluating therapeutic candidates in physiologically relevant constructs. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by allowing direct placement of bioactive agents in defined microenvironments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatially controlled cell deposition in biomimetic architectures.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining cell viability (>95% at day eight) and proliferation in printed constructs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by replicating native tissue-like organization for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell-laden constructs with quantifiable outputs via confocal microscopy for viability, proliferation, and migration.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through controllable printing parameters and computer-aided design manufacturing.
- Scalability: Facilitates platform reuse for downstream compound evaluation via precise droplet placement and environmental control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining cell function in RGD-conjugated alginate bio ink.
- Mechanistic De-risking: Improves predictive confidence through enhanced cell adhesion and spreading due to RGD peptide conjugation.
- Disease-Relevant System: Generates biomimetic tissue constructs that closely mimic native extracellular matrix organization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification by providing reproducible, quantifiable biological readouts in engineered tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via precise placement of cells and hydrogels in defined 3D locations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized construct production and quantitative confocal imaging of cell behavior.
- Analytics: Enables comparative analysis of conditions using viability, proliferation, and migration metrics from stained constructs.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining cell function in bio ink over eight days post-printing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating complex geometries across multiple projects via programmable dispensing and software control.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in cell-environment interactions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled dispensing parameters and sterile chamber environment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of cellular responses in tissue-like contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative viability and proliferation data supporting advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, bio ink preparation, and confocal microscopy for viability assessment.
- Dependent on bioprinter hardware, sterile syringe systems, and temperature-controlled printing stages.
- Necessitates cross-team standardization of CAD designs, dispensing rates, and environmental controls.
- Adaptation considerations include bio ink composition and cell type compatibility with alginate-based matrices.
- Practical limitations include nozzle clogging risks and the need for post-print staining protocols to quantify viability.
