Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Ogólnym celem niniejszego badania jest opis nowatorskiej techniki wstrzykiwania podsiatkówkowego, która może być wykorzystana do dostarczania wektorów wirusowych, czynników farmakologicznych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauki o widzeniu i okulistyki, takie jak ocena skuteczności nowych interwencji terapeutycznych w przypadku degeneracji siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość dostarczenia materiału do przestrzeni podsiatkówkowej z wysoką skutecznością, przy minimalnych uszkodzeniach i szybkiej regeneracji struktury oraz funkcji siatkówki.

Procedurę zaprezentuje Sachin P, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przytnij wibrysy zanestezjowanej myszy w celu ułatwienia wizualizacji, a temperaturę ciała zwierzęcia utrzymuj na poziomie 37 °C za pomocą cyrkulacyjnej podkładki wodnej. Następnie rozszerz źrenice, stosując 2,5% krople do oczu z fenylefryną.

Następnie należy zastosować krople do oczu z metylocelulozą, aby zapobiec przesuszeniu oraz zminimalizować ryzyko wystąpienia przejściowej zaćmy wywołanej środkami znieczulającymi. Przed operacją należy wysterylizować instrumenty. Następnie przygotować rozcieńczoną fluoresceinę w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Napełnić strzykawkę odpowiednią ilością fluoresceiny. Następnie wykonać ucisk palca u nogi, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w głębokiej anestezji, i ustawić mysz tak, aby oko, w które ma być wykonany zastrzyk, było skierowane do góry i wyraźnie widoczne w mikroskopie stereoskopowym. Delikatnie uchwycić spojówkę skroniową za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami.

Następnie, za pomocą zakrzywionych nożyczek Vannasa, wykonaj nacięcie okrężne o kącie około 90 stopni. Powtórz tę procedurę na leżącej poniżej torebce Tenona. Po tym czasie wycięcie otaczającą tkankę łączną za pomocą pęsety z cienkimi końcami, obracając gałkę oczną w kierunku nosa.

Pracuj w kierunku miejsca iniekcji, w odległości około 0,5 milimetra od nerwu wzrokowego, i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić zatokitocznej. Krytycznym etapem jest odsłonięcie miejsca iniekcji, co wymaga rotacji gałki ocznej bez uszkodzenia samego oka lub struktur powiązanych, a w szczególności unikając uszkodzenia krwawego worka oczodołowego. W tej procedurze wykonaj niewielkie nacięcie twardówki w miejscu iniekcji, delikatnie nacinając gałkę oczną za pomocą ostrza oftalmicznego o kącie 22,5 stopnia.

Nacięcie powinno być na tyle duże, aby umożliwić przejście końcówki igły przez twardówkę. Następnie wprowadzić ściętą igłę o rozmiarze 33 G do miejsca sklerotomii, tak aby ścięcie było skierowane i ustawione równolegle do siatkówki. Wstrzyknąć pożądaną ilość 0,01% fluoresceiny, powoli i z równomiernym naciskiem przesuwając tłok.

Należy pamiętać, że gdy igła znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, podczas naciskania tłoka wyczuwalny będzie lekki opór. Brak oporu oznacza przebicie siatkówki, natomiast wysoki opór występuje, gdy igła nie przebije twardówki lub nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Kolejnym krytycznym krokiem jest wykonanie wstrzyknięcia celowanego w przestrzeń podsiatkówkową.

Należy to wykonać bez przebijania siatkówki neurosensorycznej do jamistości ciała szklistego. Przed wycofaniem igły należy odczekać kilka sekund, aby zminimalizować cofanie się płynu. Następnie należy przepłukać oko sterylną solą fizjologiczną i upewnić się, że oko powróciło do swojej normalnej pozycji.

Następnie na powierzchnię rogówki wstrzykniętego oka nanieś grubą warstwę trójskładnikowej antybiotycznej maści okulistycznej. Po tym zabiegu umieść mysz w czystej, pojedynczej klatce w celu rekonwalescencji. Monitoruj oddech oraz temperaturę zwierzęcia podczas wybudzania z anestezji i upewnij się, że mysz jest w stanie utrzymać pozycję sternalną.

Należy przeprowadzić dodatkowy, odpowiedni monitoring i leczenie pooperacyjne, w tym podać podskórny zastrzyk z karprofenu w celu opanowania bólu pooperacyjnego. Oto rekonstrukcja 3D kopulastego pęcherza w miejscu wstrzyknięcia. Kopulasty pęcherz został następnie wypełniony gęstym białym kolorem, aby zobrazować zasięg i krawędzie odwarstwienia siatkówki.

Przekroje poprzeczne siatkówki w obrazowaniu OCT są widoczne w kolorze białym, natomiast przestrzeń wypełniona płynem na poziomie nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) oraz fotoreceptorów wydaje się czarna. Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne skany OCTB w miejscu maksymalnego odwarstwienia siatkówki przed wstrzyknięciem, 10 minut po wstrzyknięciu oraz cztery tygodnie po wstrzyknięciu. Obraz ten przedstawia formowanie się i zanikanie płaskiego pęcherza po wstrzyknięciu 0,3 µL.

Ten obraz przedstawia formowanie i znikanie kopulastego pęcherzyka po iniekcji 0,5 µL, natomiast ten obraz pokazuje formowanie i znikanie kopulastego pęcherzyka po iniekcji 1 µL. Na koniec przedstawiono przykład rozległego bliznowacenia naczyniówki i przerzedzenia siatkówki w miejscu iniekcji. Siatkówki zachowują prawidłową funkcję po ustąpieniu pęcherzyka.

Dla dziewięciu intensywności oświetlenia przedstawiono przebiegi fal dla odpowiedzi czułych pośredniczonych przez pręciki w stanie skotopowym, przed wstrzyknięciem oraz cztery tygodnie po wstrzyknięciu dla dawek 0,3 microliter, 0,5 microliter i 1 microliter. Po opanowaniu tej techniki procedurę można przeprowadzić w ciągu 10 do 15 minut na jedno oko. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ocenienie stanu zdrowia oczu przed rozpoczęciem prac.

Należy wykluczyć oczy z zmętnieniami rogówki lub soczewki, a także oczy głęboko osadzone, w których przeprowadzenie tej procedury byłoby bardzo trudne. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak OCT i obrazowanie dna oka, aby ocenić jakość wstrzyknięcia.