Name: Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj alternatywną metodę iniekcji podsiatkówkowej u myszy zapewniającą minimalne uszkodzenia i szybką regenerację siatkówki. Ta technika umożliwia skuteczną dostawę wektorów wirusowych oraz leków w badaniach okulistycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony Katedry Okulistyki Harolda i Pauline Price oraz Instytutu Okulistycznego Julesa Steina dla MBG, grantu NEI Core (EY00331-43) dla SN. Badania były częściowo wspierane przez hojny dar rodziny Sakaria dla SN i MGB oraz z nieograniczonego grantu z Badań nad Zapobieganiem Ślepocie dla Oddziału Okulistyki. Dziękujemy Charlotte Yiyi Wang z Berkeley School of Optometry za uzyskanie wstępnych obrazów OCT zastrzyków podsiatkówkowych.

Zwierzęta: Myszy typu dzikiego C57Bl/6J wyhodowane na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (UCLA). Wszystkie zwierzęta były w wieku od 11 do 17 tygodni i obejmowały samce i samice myszy. Wszystkie myszy trzymano w grupach, utrzymywano w cyklu światło/ciemność 12:12 z jedzeniem i wodą ad libitum. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi UCLA i Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
UWAGA: Wszystkie leki i środki iniekcyjne są klasy Farmakopei Stanów Zjednoczonych (USP).
1. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 100 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny w mieszaninie soli fizjologicznej. Podaj znieczulenie na taką głębokość, aby mysz nie miała odruchów szczypania palców u nóg ani dotyku rogówki.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37,0 °C za pomocą poduszki z krążącą wodą.</li>
	<li>Rozszerz źrenice za pomocą kropli do oczu z 2,5% fenylefryny i przytnij wąsy, aby ułatwić wizualizację. Wąsy dostarczają myszowi znaczącego bodźca sensorycznego, dlatego przycinanie wąsów powinno usuwać tylko tę część, która blokuje wyraźny dostęp do oka, a nie do podstawy wąsa. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy wykazują normalną regenerację po tym zabiegu. Zastosuj krople do oczu z metylocelulozą, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować przejściową zaćmę wywołaną znieczuleniem13.</li>
	<li>Sterylizuj narzędzia przed zabiegiem (tj. betadynę i etanol lub gorące kulki).</li>
	<li>Przygotować rozcieńczoną fluoresceinę (0,01% przy użyciu 0,9% soli fizjologicznej) w sterylnym środowisku (tj. w komorze bezpieczeństwa biologicznego), jeśli ma być wykonywana wizualizacja (patrz sekcja 3 poniżej).</li>
</ol>
2. Przygotowanie miejsca wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę (np. strzykawkę o pojemności 5 μl) z odpowiednią objętością wstrzyknięcia (np. 0,3 do 1,0 μl).</li>
	<li>Ustaw mysz tak, aby oko było skierowane do góry i dobrze widoczne w mikroskopie preparacyjnym.</li>
	<li>Delikatnie ściśnij spojówkę skroniową kleszczami z cienką końcówką. Wykonaj nacięcie obwodowe pod kątem około 90 stopni za pomocą zakrzywionych nożyczek Vannas.</li>
	<li>Powtórz krok 2.3 z leżącą pod spodem kapsułką Tenona.</li>
	<li>Wytnij otaczającą tkankę łączną za pomocą kleszczy z cienką końcówką, obracając gałkę ziemską nosowo. Pracować w kierunku miejsca wstrzyknięcia około 0,5 mm skroniowego do nerwu wzrokowego. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć zakłócenia zatoki zaoczodołowej.</li>
</ol>
3. Sklerotomia i wstrzyknięcie podsiatkówkowe
UWAGA: Zaleca się wstrzyknięcie 0,01% fluoresceiny do 0,9% soli fizjologicznej, aby pomóc w wizualizacji podczas nauki tej procedury. Topograficzne rozmieszczenie fluoresceiny można skutecznie udokumentować za pomocą obrazowania dna oka (patrz punkt 4 poniżej).
<ol>
	<li>Wykonaj małe nacięcie twardówki w miejscu wstrzyknięcia, delikatnie drapiąc muszlę oczną ostrzem okulistycznym pod kątem 22,5 stopnia. To nacięcie powinno być tylko na tyle duże, aby końcówka igły mogła przejść przez twardówkę.</li>
	<li>Wprowadzić igłę ze skosem 33 G (pod kątem 5 - 10° do sklerotomii ze skosem skierowanym w stronę i pod kątem równoległym do siatkówki. Wstrzyknąć żądaną objętość (np. 0,3 do 1,0 μl 0,01% fluoresceiny do celów edukacyjnych). 
	UWAGA: Należy zachować sterylność strzykawki poprzez dokładne czyszczenie poprzez kolejne płukania odpowiednim rozpuszczalnikiem i wodą demineralizowaną przed każdym wstrzyknięciem.</li>
	<li>Wciskać tłok powoli (ponad ~ 3 sekundy) bez przesuwania igły i z równomiernym naciskiem. 
	UWAGA: Gdy igła znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, podczas wciskania tłoka wyczuwalny będzie lekki opór. Opór nie będzie minimalny lub minimalny, jeśli igła przebije siatkówkę, a wysoki opór, jeśli igła nie wbije się w twardówkę lub RPE.</li>
	<li>Odczekaj kilka sekund przed wyjęciem igły, aby zminimalizować przepływ wsteczny.</li>
	<li>Przepłukać oko sterylnym buforowanym roztworem soli fizjologicznej i upewnić się, że oko obróciło się z powrotem do normalnej pozycji.</li>
</ol>
4. Ocena odwarstwienia siatkówki za pomocą OCT i obrazowania dna oka
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie OCT natychmiast po wstrzyknięciu, aby ocenić jakość wstrzyknięcia i w odpowiednich momentach po wstrzyknięciu, w razie potrzeby w celu oceny struktury siatkówki. 
	UWAGA: Przykłady zastosowania OCT w podobnych badaniach zostały wcześniej opisane7,14.
	<ol>
		<li>Dostosuj i wyrównaj obraz OCT, aby celować w miejsce wstrzyknięcia. Miejsce wstrzyknięcia powinno znajdować się w linii środkowej i 0,5 mm skroniowo do głowy nerwu wzrokowego. Powtórz w razie potrzeby, jeśli odczepienie znajduje się poza kadrem lub nie jest optymalnie wyśrodkowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja odwarstwienia siatkówki i obszaru iniekcji barwnika za pomocą obrazowania dna twarzy 7,14, 
	UWAGA: Jeśli system obrazowania OCT nie jest dostępny, wstrzyknięcie niewielkiej ilości fluoresceiny z wektorem do ćwiczeń umożliwi wizualizację za pomocą dowolnej kamery do badania dna oka, która wykonuje angiografię fluoresceinową przy użyciu tych samych długości fal wzbudzenia i filtrów blokujących. Zlokalizowane obszary hiperfluorescencji pojawią się pod naczyniem, a układ naczyniowy będzie miał ostre i wyraźne granice, jeśli przestrzeń podsiatkówkowa zostanie prawidłowo ukierunkowana. Krawędź pęcherzyka po wstrzyknięciu zostanie wyznaczona przez przejście od hiper- do hipofluorescencji. Kilka instrumentów zapewnia tę funkcję myszy; Zastosowane tutaj oprzyrządowanie jest opisane w innym miejscu14.</li>
</ol>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Nałóż grubą warstwę kremu okulistycznego z potrójnym antybiotykiem na powierzchnię rogówki wstrzykniętego oka.</li>
	<li>Umieść myszy w czystych, samotnych klatkach w celu odzyskania zdrowia. Nie należy łączyć myszy, które przeszły operację, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.</li>
	<li>Monitoruj oddech i temperaturę podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie będą w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka.</li>
	<li>Należy przeprowadzić dodatkowe odpowiednie monitorowanie i leczenie pooperacyjne, w tym podskórne wstrzyknięcie karprofenu (5 mg/kg) w celu leczenia bólu pooperacyjnego.</li>
</ol>
6. Ocena funkcji siatkówki za pomocą elektroretinografii (ERG)
<ol>
	<li>Wykonaj analizę ERG przed wstrzyknięciem i w odpowiednim czasie po wstrzyknięciu, w razie potrzeby, aby ocenić czynność siatkówki. Jeśli wstrzyknięcie zostało wykonane w przestrzeń podsiatkówkową, odwarstwienie siatkówki powinno ustąpić w ciągu 72 godzin.
	<ol>
		<li>Należy zastosować standardowe techniki ERG do oceny funkcji siatkówki przed i po wstrzyknięciu, jak opisano wcześniej14,15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 3D Rekonstrukcja i kwantyfikacja objętości bleb
UWAGA: Skany OCT o wysokim kontraście, obejmujące całe oderwanie w kadrze view, są optymalne do użycia. Użyto ImageJ/Fiji17,18 i Imaris, ale można użyć innego oprogramowania.
<ol>
	<li>Wyeksportuj interesujący Cię b-scan, zaimportuj do ImageJ/Fiji i przytnij (Image > Crop) część skanu OCT, która ma być modelowana, za pomocą prostokątnego narzędzia do zaznaczania.
	<ol>
		<li>Dostosuj kontrast (Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast) i wyznacz brakujące granice, łącząc dwie sekcje linią.</li>
		<li>Narysuj linię prostą za pomocą narzędzia do tworzenia linii (przytrzymując Shift), która rozciąga RPE na warstwę fotoreceptorów. Zmierz (Analizuj > Zmierz) długość linii, aby uzyskać rozmiar maksymalnego odcięcia dla kroku 7.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Importuj przycięte klatki do oprogramowania do rekonstrukcji 3D (patrz tabela materiałów) za pomocą wtyczki "RGB do szarości" i środowiska uruchomieniowego kompilatora MATLAB.</li>
	<li>Ustaw rozmiar woksela (w obszarze Właściwości obrazu) przy użyciu parametrów kalibracji ze skanowania OCT (x,y,z).</li>
	<li>Uruchom wtyczkę "RGB do szarości" (w obszarze Właściwości obrazu), z równą wagą dla każdego kanału, aby utworzyć czwarty kanał. Usuń oryginalne kanały czerwono-zielono-niebieskie.</li>
	<li>Odwróć kanał szarości za pomocą zmiany kontrastu. Przechowuj obraz.</li>
	<li>Kliknij przycisk "dodaj nową powierzchnię" w zakładce Widok 3D i rozpocznij 4-etapowy proces tworzenia powierzchni z przewodnikiem.
	<ol>
		<li>Ustawianie szczegółowości poziomu powierzchni (krok 1 z 4). 
		UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że najskuteczniejszy zakres wynosił od 8,0 do 12,0.</li>
		<li>Ustawia maksymalny rozmiar sfery (w obszarze Wybór tła) na nieco mniejszy niż maksymalny rozmiar odłączenia zmierzony w 7.1.2. Utwórz powierzchnię i cofnij odwrócenie kanału szarości (krok 2 z 4).</li>
		<li>Ustaw próg na wartość maksymalną, aby powierzchnia ujemnych przestrzeni na zewnątrz siatkówki i odwarstwienie nie stykały się (krok 3 z 4).</li>
		<li>Ustaw typ filtra na liczbę wokseli i wyizoluj ujemną przestrzeń w miejscu odłączenia według rozmiaru. Wykończ powierzchnię (krok 4 z 4). 
		UWAGA: Objętość powierzchni odczepiania znajduje się w sekcji objętość w zakładce statystyki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li>
<li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials%3A+Safety+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285(2015).</li>
<li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
<li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3%2C+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523(2015).</li>
<li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li>
<li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li>
<li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+%28LCA%29+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li>
<li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li>
<li>Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li>
<li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie posiada żadnych ujawnień handlowych.

Iniekcje podsiatkówkowe są metodą z wyboru w dostarczaniu wektorów wirusowych i terapii pochodzącej z komórek macierzystych do manipulowania fotoreceptorami i RPE zarówno w badaniach podstawowych, jak i leczeniu klinicznym. U pacjentów wstrzyknięcia podsiatkówkowe są zwykle wykonywane z sklerotomią przednią w pars plana, witrektomią rdzenia tylnego i penetracją siatkówki przez igłę z bezpośrednią wizualizacją. Podobnie jak w przypadku większości zabiegów witrektomii, często dochodzi do przedwczesnego powstawania zaćmy, c...

Zastrzyki podsiatkówkowe są głównym sposobem dostarczania czynników komórkowych i wirusowych do siatkówki myszy w celu zbadania ich wpływu na fotoreceptory i leżący u ich podstaw RPE1,2. Większość protokołów wstrzyknięć podsiatkówkowych u myszy wykorzystuje miejsce wstrzyknięcia przezrogówkowego lub przeztwardówkowego przed równikiem (ryc. 1). Takie podejście może prowadzić do nieodłącznych uszkodzeń ubocznych, które obejmują nacinanie i wynikające z tego zmętnienie soczewki, zakłócenie integralności ciała szklistego, penetrację siatkówki neurosensorycznej i tęczówki, krwotok siatkówki, znaczne odwarstwienie siatkówki i trwały obrzęk podsiatkówkowy 3-9. Manipulacje eksperymentalne muszą przezwyciężyć te efekty, aby ocenić efekty interwencji terapeutycznych3,7,10,11. Badanie to zawiera szczegółowy opis i walidację metody wstrzykiwania tylnego przeztwardówkowego, która pozwala uniknąć tych powikłań, minimalizuje uraz i ma wysoki wskaźnik sukcesu w celowaniu w przestrzeń podsiatkówkową.
Zastrzyki celujące w przestrzeń podsiatkówkową u myszy są często bardzo trudne do wykonania, a większość badaczy spotyka się z dużą częstotliwością nieudanych prób, w których wektor jest dostarczany w niewłaściwe miejsce lub dochodzi do znacznego uszkodzenia siatkówki, na przykład w całkowitym odwarstwieniu siatkówki6. Liczba oczu wykluczonych z analizy z powodu powikłań po wstrzyknięciu zazwyczaj nie jest podawana w badaniach na myszach, ale z naszego własnego doświadczenia i w dyskusji z innymi badaczami wynika, że liczba nieudanych wstrzyknięć może sięgać nawet 50% i różnić się w zależności od doświadczenia i możliwości badacza, który wykonuje zastrzyki. Powodzenie wstrzyknięcia jest zwykle oceniane za pomocą bezpośredniego obrazowania dna oka i/lub optycznej koherentnej tomografii (OCT)7,9. Łatwa do opanowania metoda o wysokim wskaźniku powodzenia w iniekcjach podsiatkówkowych u myszy może przyspieszyć eksperymenty i obniżyć koszty badań przedklinicznych nad leczeniem chorób siatkówki, które są główną przyczyną ślepoty w Stanach Zjednoczonych.
Opisana tutaj technika iniekcji podtwardówkowej tylnej jest adaptacją z klinicznych i przedklinicznych protokołów9,12. Nieinwazyjne oceny diagnostyczne przeprowadzone na myszach, którym wstrzyknięto zastrzyki, wykazują łagodne i wysoce zlokalizowane uszkodzenia oraz brak dodatkowych uszkodzeń soczewek ubocznych, siatkówki i RPE. Co więcej, przy stosunkowo niewielkiej praktyce eksperymentator może osiągnąć te wyniki z wysokim wskaźnikiem sukcesu (80 - 90% lub lepszym), zmniejszając w ten sposób koszty związane z takimi badaniami. Procedura ta może być stosowana do dostarczania komórkowych, wirusowych lub farmakologicznych interwencji terapeutycznych do fotoreceptorów i/lub RPE w badaniach przedklinicznych oraz do łatwej oceny interwencji eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Strzykawka x 1</td></tr><tr><td>Igła Hamilton 33 G, 1.0 ", 20 STOPNI, punkt 3 (stal nierdzewna 304)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Igły x 6</td></tr><tr><td>Vannas Zakrzywione nożyczki</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>Ostrze 5 mm</td></tr><tr><td>Nóż mikrochirurgiczny 22,5 stopnia</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Ksylazyna</td></tr><tr><td>Fluoresceina 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg / ml</td></tr><tr><td>0,9% Sól fizjologiczna USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Maść antybiotykowa</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td> Woda <td>okulistyczna</td></tr><tr><td> Pompa obiegowa</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/pompa&nbsp;</td><td>Nr kat. 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Komercyjna</td></tr><tr><td>kamera do badania dna oka Phoenix</td><td>Research Laboratories</td><td>Pęseta MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Typ 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Okulistyczny</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Wersja 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromeloza&nbsp; 2,5%</td> <td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Metylocelulozowe</td></tr><tr><td>krople do oczu (do płukania)</td> <td>Bausch & Mikroskop</td><td>roztworu soli</td>fizjologicznej Lomb <td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Źródło światła</td></tr></tbody></table>

alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Zastrzyki podsiatkówkowe były z powodzeniem stosowane zarówno u ludzi, jak i gryzoni, aby dostarczyć interwencje terapeutyczne białek, czynników wirusowych i komórek do przedziału międzyfotoreceptorowego/podsiatkówkowego, który ma bezpośrednią ekspozycję na fotoreceptory i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE). Podsiatkówkowe zastrzyki plazminogenu, a także niedawne badania przedkliniczne i kliniczne wykazały bezpieczeństwo i/lub skuteczność dostarczania wektorów wirusowych i komórek macierzystych osobom z zaawansowaną chorobą siatkówki. Mysie modele chorób siatkówki, w szczególności dziedzicznych dystrofii siatkówki, są niezbędne do testowania tych terapii. Najczęstszą procedurą iniekcji u gryzoni jest wykonanie małych nacięć przezrogówkowych lub przeztwardówkowych z przednim dostępem do siatkówki. Dzięki takiemu podejściu igła iniekcyjna przenika do siatkówki neurosensorycznej, zaburzając leżące pod nią RPE, a po wprowadzeniu może łatwo naciąć soczewkę, powodując zmętnienie soczewki i upośledzenie nieinwazyjnego obrazowania. Dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez dostęp przeztwardówkowy, tylny pozwala uniknąć tych problemów: igła przecina twardówkę około 0,5 mm od nerwu wzrokowego, bez penetracji siatkówki i unika przerwania ciała szklistego. Uszkodzenia uboczne są ograniczone do tych związanych ze sklerotomią ogniskową i skutkami przejściowego, surowiczego odwarstwienia siatkówki. Prostota metody minimalizuje obrażenia oczu, zapewnia szybkie ponowne przyczepienie i regenerację siatkówki oraz ma niski wskaźnik awaryjności. Minimalne uszkodzenia siatkówki i RPE pozwalają na jasną ocenę skuteczności i bezpośrednich efektów samych środków terapeutycznych. Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego, która może być stosowana do kierowania wektorów wirusowych, środków farmakologicznych, komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy z wysoką skutecznością, minimalnymi uszkodzeniami i szybkim powrotem do zdrowia.

Podgałkowe iniekcje podsiatkówkowe metodą tylną przeprowadzono w 31 zdrowych oczach 16 myszy typu dzikiego, wstrzykując 0,3 µl (n = 18), 0,5 µl (n = 8) oraz 1,0 µl (n = 5) 0,01% fluoresceiny. Jedno oko wykluczono z iniekcji ze względu na istniejące zmętnienie rogówki, które uniemożliwiło analizę strukturalną i funkcjonalną. W niniejszym raporcie uwzględniono każde oko poddane iniekcji. Nie stwierdzono żadnych niezamierzonych odwarstwień siatkówki, przebić siatkówki neurosensorycznej ani w...

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ogólnym celem niniejszego badania jest opis nowatorskiej techniki wstrzykiwania podsiatkówkowego, która może być wykorzystana do dostarczania wektorów wirusowych, czynników farmakologicznych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauki o widzeniu i okulistyki, takie jak ocena skuteczności nowych interwencji terapeutycznych w przypadku degeneracji siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość dostarczenia materiału do przestrzeni podsiatkówkowej z wysoką skutecznością, przy minimalnych uszkodzeniach i szybkiej regeneracji struktury oraz funkcji siatkówki.Procedurę zaprezentuje Sachin P, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przytnij wibrysy zanestezjowanej myszy w celu ułatwienia wizualizacji, a temperaturę ciała zwierzęcia utrzymuj na poziomie 37 °C za pomocą cyrkulacyjnej podkładki wodnej. Następnie rozszerz źrenice, stosując 2,5% krople do oczu z fenylefryną.Następnie należy zastosować krople do oczu z metylocelulozą, aby zapobiec przesuszeniu oraz zminimalizować ryzyko wystąpienia przejściowej zaćmy wywołanej środkami znieczulającymi. Przed operacją należy wysterylizować instrumenty. Następnie przygotować rozcieńczoną fluoresceinę w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Napełnić strzykawkę odpowiednią ilością fluoresceiny. Następnie wykonać ucisk palca u nogi, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w głębokiej anestezji, i ustawić mysz tak, aby oko, w które ma być wykonany zastrzyk, było skierowane do góry i wyraźnie widoczne w mikroskopie stereoskopowym. Delikatnie uchwycić spojówkę skroniową za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami.Następnie, za pomocą zakrzywionych nożyczek Vannasa, wykonaj nacięcie okrężne o kącie około 90 stopni. Powtórz tę procedurę na leżącej poniżej torebce Tenona. Po tym czasie wycięcie otaczającą tkankę łączną za pomocą pęsety z cienkimi końcami, obracając gałkę oczną w kierunku nosa.Pracuj w kierunku miejsca iniekcji, w odległości około 0,5 milimetra od nerwu wzrokowego, i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić zatokitocznej. Krytycznym etapem jest odsłonięcie miejsca iniekcji, co wymaga rotacji gałki ocznej bez uszkodzenia samego oka lub struktur powiązanych, a w szczególności unikając uszkodzenia krwawego worka oczodołowego. W tej procedurze wykonaj niewielkie nacięcie twardówki w miejscu iniekcji, delikatnie nacinając gałkę oczną za pomocą ostrza oftalmicznego o kącie 22,5 stopnia.Nacięcie powinno być na tyle duże, aby umożliwić przejście końcówki igły przez twardówkę. Następnie wprowadzić ściętą igłę o rozmiarze 33 G do miejsca sklerotomii, tak aby ścięcie było skierowane i ustawione równolegle do siatkówki. Wstrzyknąć pożądaną ilość 0,01% fluoresceiny, powoli i z równomiernym naciskiem przesuwając tłok.Należy pamiętać, że gdy igła znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, podczas naciskania tłoka wyczuwalny będzie lekki opór. Brak oporu oznacza przebicie siatkówki, natomiast wysoki opór występuje, gdy igła nie przebije twardówki lub nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Kolejnym krytycznym krokiem jest wykonanie wstrzyknięcia celowanego w przestrzeń podsiatkówkową.Należy to wykonać bez przebijania siatkówki neurosensorycznej do jamistości ciała szklistego. Przed wycofaniem igły należy odczekać kilka sekund, aby zminimalizować cofanie się płynu. Następnie należy przepłukać oko sterylną solą fizjologiczną i upewnić się, że oko powróciło do swojej normalnej pozycji.Następnie na powierzchnię rogówki wstrzykniętego oka nanieś grubą warstwę trójskładnikowej antybiotycznej maści okulistycznej. Po tym zabiegu umieść mysz w czystej, pojedynczej klatce w celu rekonwalescencji. Monitoruj oddech oraz temperaturę zwierzęcia podczas wybudzania z anestezji i upewnij się, że mysz jest w stanie utrzymać pozycję sternalną.Należy przeprowadzić dodatkowy, odpowiedni monitoring i leczenie pooperacyjne, w tym podać podskórny zastrzyk z karprofenu w celu opanowania bólu pooperacyjnego. Oto rekonstrukcja 3D kopulastego pęcherza w miejscu wstrzyknięcia. Kopulasty pęcherz został następnie wypełniony gęstym białym kolorem, aby zobrazować zasięg i krawędzie odwarstwienia siatkówki.Przekroje poprzeczne siatkówki w obrazowaniu OCT są widoczne w kolorze białym, natomiast przestrzeń wypełniona płynem na poziomie nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) oraz fotoreceptorów wydaje się czarna. Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne skany OCTB w miejscu maksymalnego odwarstwienia siatkówki przed wstrzyknięciem, 10 minut po wstrzyknięciu oraz cztery tygodnie po wstrzyknięciu. Obraz ten przedstawia formowanie się i zanikanie płaskiego pęcherza po wstrzyknięciu 0,3 µL.Ten obraz przedstawia formowanie i znikanie kopulastego pęcherzyka po iniekcji 0,5 µL, natomiast ten obraz pokazuje formowanie i znikanie kopulastego pęcherzyka po iniekcji 1 µL. Na koniec przedstawiono przykład rozległego bliznowacenia naczyniówki i przerzedzenia siatkówki w miejscu iniekcji. Siatkówki zachowują prawidłową funkcję po ustąpieniu pęcherzyka.Dla dziewięciu intensywności oświetlenia przedstawiono przebiegi fal dla odpowiedzi czułych pośredniczonych przez pręciki w stanie skotopowym, przed wstrzyknięciem oraz cztery tygodnie po wstrzyknięciu dla dawek 0,3 microliter, 0,5 microliter i 1 microliter. Po opanowaniu tej techniki procedurę można przeprowadzić w ciągu 10 do 15 minut na jedno oko. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ocenienie stanu zdrowia oczu przed rozpoczęciem prac.Należy wykluczyć oczy z zmętnieniami rogówki lub soczewki, a także oczy głęboko osadzone, w których przeprowadzenie tej procedury byłoby bardzo trudne. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak OCT i obrazowanie dna oka, aby ocenić jakość wstrzyknięcia.

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Źródło: Parikh, S., et al. Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowe podejście tylne. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje procedurę dostarczania barwnika fluorescencyjnego do przestrzeni podsiatkówkowej myszy. Proces polega na znieczuleniu myszy, przygotowaniu oka, wykonaniu precyzyjnych nacięć w celu uzyskania dostępu do przestrzeni podsiatkówkowej i wstrzyknięciu barwnika w celu uzyskania kontrolowanego odwarstwienia...

Dostarczanie barwnika fluorescencyjnego do przestrzeni podsiatkówkowej myszy

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Ten protokół opisuje technikę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów za pomocą centralnego nacięcia rogówki i długiego tunelu do przedniej komory. Ta metoda iniekcji minimalizuje ryzyko wywołania niezamierzonego uszkodzenia tkanki, a tym samym poprawia precyzję i odtwarzalność.

Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Ten artykuł opisuje metody iniekcji podsiatkówkowej u szczurów, wykorzystując śródoperacyjną wizualizację do kontrolowania zarówno miejsca wstrzyknięcia, jak i obszaru odwarstwienia siatkówki.

Śródoperacyjna wizualizacja wstrzyknięcia podsiatkówkowego i odwarstwienia siatkówki u szczurów

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Poznaj alternatywną metodę iniekcji podsiatkówkowej u myszy zapewniającą minimalne uszkodzenia i szybką regenerację siatkówki. Ta technika umożliwia skuteczną dostawę wektorów wirusowych oraz leków w badaniach okulistycznych.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny (Wideo) | JoVE Journal

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Przeglądaj więcej filmów