Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Ogólnym celem tego badania jest opisanie nowej techniki wstrzykiwania podsiatkówkowego, która może być stosowana do celowania w wektory wirusowe, środki farmakologiczne lub indukowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauk o widzeniu i okulistyce, takie jak ocena skuteczności nowatorskich interwencji terapeutycznych w przypadku zwyrodnień siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do dostarczania materiału do przestrzeni podsiatkówkowej, z wysoką skutecznością, minimalnymi uszkodzeniami i szybkim przywróceniem struktury i funkcji siatkówki.

Procedurę zademonstruje Sachin P, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przytnij wąsy znieczulonej myszy, aby ułatwić wizualizację, i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą cyrkulującej poduszki wodnej. Następnie rozszerz źrenice za pomocą 2,5% kropli do oczu z fenylefryną.

Następnie zastosuj krople do oczu z metylocelulozą, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować przejściowe zaćmy wywołane znieczuleniem. Wysterylizuj narzędzia przed zabiegiem. Następnie przygotuj rozcieńczoną fluoresceinę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Napełnić strzykawkę odpowiednią ilością fluoresceiny. Następnie należy uszczypnąć palec u nogi, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, i ustawić mysz tak, aby oko, które ma zostać wstrzyknięte, było skierowane do góry i wyraźnie widoczne w mikroskopie preparacyjnym. Delikatnie uszczypnij spojówkę skroniową parą kleszczy z cienką końcówką.

Następnie wykonaj nacięcie obwodowe pod kątem około 90 stopni za pomocą zakrzywionych nożyczek Vannas. Powtórz procedurę na leżącej pod spodem torebce Tenona. Następnie wytnij otaczający problem łączny za pomocą kleszczy z cienką końcówką, obracając gałkę ziemską nosowo.

Pracuj w kierunku miejsca wstrzyknięcia w odległości około 0,5 milimetra od nerwu wzrokowego i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zakłócić pracy zatoki zaoczodołowej. Krytycznym etapem jest odsłonięcie miejsca wstrzyknięcia, które wymaga rotacji oka, bez uszkodzenia samego oka lub powiązanych struktur, w szczególności unikając uszkodzenia worka krwionośnego oczodołu. W tej procedurze należy wykonać małe nacięcie w twardówce miejsca wstrzyknięcia, delikatnie drapiąc muszlę oczną ostrzem okulistycznym pod kątem 22,5 stopnia.

To nacięcie powinno być wystarczająco duże, aby końcówka igły mogła przejść przez twardówkę. Następnie włóż igłę ze skosem o rozmiarze 33 do sklerotomii ze skosem skierowanym do przodu i ustawionym pod kątem równoległym do siatkówki. Wstrzyknąć żądaną ilość 0,01% fluoresceiny, naciskając tłok powoli z równomiernym naciskiem.

Należy pamiętać, że gdy igła znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, podczas naciskania tłoka wyczuwalny będzie lekki opór. Nie będzie oporu, jeśli igła przebije siatkówkę, ale dużego oporu, jeśli igła nie przebije twardówki lub RPE. Kolejnym krytycznym krokiem jest wstrzyknięcie ukierunkowane na przestrzeń podsiatkówkową.

Musi to być osiągnięte bez przenikania przez siatkówkę neurosensoryczną do jamy ciała szklistego. Odczekaj kilka sekund przed wyjęciem igły, aby zminimalizować przepływ wsteczny. Następnie przepłucz oko sterylnym roztworem soli fizjologicznej i upewnij się, że oko obróciło się z powrotem do normalnej pozycji.

Następnie nałóż grubą warstwę kremu okulistycznego z potrójnym antybiotykiem na powierzchnię rogówki wstrzykniętego oka. Następnie umieść mysz w czystej, samotnej klatce w celu odzyskania zdrowia. Monitoruj jego oddech i temperaturę podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i sprawdź, czy może utrzymać leżący mostek.

Wykonać dodatkowe odpowiednie monitorowanie i leczenie pooperacyjne, w tym podskórne wstrzyknięcie karprofenu, w celu leczenia bólu pooperacyjnego. Oto rekonstrukcja 3D pęcherzyka w kształcie kopuły w miejscu wstrzyknięcia. Pęcherzyk w kształcie kopuły jest następnie wypełniany gęstą bielą, aby pokazać zakres i marginesy odwarstwienia siatkówki.

Przekroje siatkówki z OCT są widoczne w kolorze białym, podczas gdy wypełniona płynem przestrzeń na poziomie RPE i fotoreceptorów wydaje się. Na tym rysunku reprezentatywne skany OCTB w miejscu maksymalnego odwarstwienia siatkówki są pokazane przed wstrzyknięciem, 10 minut po wstrzyknięciu i cztery tygodnie po wstrzyknięciu. Ten obraz pokazuje powstawanie i rozdzielczość płaskiego pęcherzyka po wstrzyknięciu 0,3 mikrolitra.

Na tym obrazie widać powstawanie i rozdzielczość wypukłego pęcherzyka po wstrzyknięciu 0,5 mikrolitra, podczas gdy ten obraz pokazuje powstawanie i rozdzielczość wypukłego pęcherzyka po wstrzyknięciu jednego mikrolitra. Wreszcie, oto przykład poważnego bliznowacenia naczyniówki i ścieńczenia siatkówki w miejscu wstrzyknięcia. Siatkówki zachowują normalne funkcjonowanie po ustąpieniu pęcherzyków.

Przy dziewięciu intensywnościach oświetlenia pokazane są przebiegi dla odpowiedzi za pośrednictwem pręcików skotopowych dla wstrzyknięć przed wstrzyknięciem i cztery tygodnie po wstrzyknięciu dla wstrzyknięć 0,3 mikrolitra, 0,5 mikrolitra i 1 mikrolitra. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 10 do 15 minut na oko. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby ocenić stan zdrowia oczu przed rozpoczęciem.

Z wykluczeniem oczu z zmętnieniami rogówki lub soczewki lub oczu głęboko osadzonych, dla których ta procedura byłaby bardzo trudna. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak OCT i obrazowanie dna oka, w celu oceny jakości wstrzyknięcia.