Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny
7 grudnia 2016
Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.
Ogólnym celem tego badania jest opisanie nowej techniki wstrzykiwania podsiatkówkowego, która może być stosowana do celowania w wektory wirusowe, środki farmakologiczne lub indukowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauk o widzeniu i okulistyce, takie jak ocena skuteczności nowatorskich interwencji terapeutycznych w przypadku zwyrodnień siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do dostarczania materiału do przestrzeni podsiatkówkowej, z wysoką skutecznością, minimalnymi uszkodzeniami i szybkim przywróceniem struktury i funkcji siatkówki.
Procedurę zademonstruje Sachin P, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przytnij wąsy znieczulonej myszy, aby ułatwić wizualizację, i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą cyrkulującej poduszki wodnej. Następnie rozszerz źrenice za pomocą 2,5% kropli do oczu z fenylefryną.
Następnie zastosuj krople do oczu z metylocelulozą, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować przejściowe zaćmy wywołane znieczuleniem. Wysterylizuj narzędzia przed zabiegiem. Następnie przygotuj rozcieńczoną fluoresceinę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Napełnić strzykawkę odpowiednią ilością fluoresceiny. Następnie należy uszczypnąć palec u nogi, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, i ustawić mysz tak, aby oko, które ma zostać wstrzyknięte, było skierowane do góry i wyraźnie widoczne w mikroskopie preparacyjnym. Delikatnie uszczypnij spojówkę skroniową parą kleszczy z cienką końcówką.
Następnie wykonaj nacięcie obwodowe pod kątem około 90 stopni za pomocą zakrzywionych nożyczek Vannas. Powtórz procedurę na leżącej pod spodem torebce Tenona. Następnie wytnij otaczający problem łączny za pomocą kleszczy z cienką końcówką, obracając gałkę ziemską nosowo.
Pracuj w kierunku miejsca wstrzyknięcia w odległości około 0,5 milimetra od nerwu wzrokowego i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zakłócić pracy zatoki zaoczodołowej. Krytycznym etapem jest odsłonięcie miejsca wstrzyknięcia, które wymaga rotacji oka, bez uszkodzenia samego oka lub powiązanych struktur, w szczególności unikając uszkodzenia worka krwionośnego oczodołu. W tej procedurze należy wykonać małe nacięcie w twardówce miejsca wstrzyknięcia, delikatnie drapiąc muszlę oczną ostrzem okulistycznym pod kątem 22,5 stopnia.
To nacięcie powinno być wystarczająco duże, aby końcówka igły mogła przejść przez twardówkę. Następnie włóż igłę ze skosem o rozmiarze 33 do sklerotomii ze skosem skierowanym do przodu i ustawionym pod kątem równoległym do siatkówki. Wstrzyknąć żądaną ilość 0,01% fluoresceiny, naciskając tłok powoli z równomiernym naciskiem.
Należy pamiętać, że gdy igła znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, podczas naciskania tłoka wyczuwalny będzie lekki opór. Nie będzie oporu, jeśli igła przebije siatkówkę, ale dużego oporu, jeśli igła nie przebije twardówki lub RPE. Kolejnym krytycznym krokiem jest wstrzyknięcie ukierunkowane na przestrzeń podsiatkówkową.
Musi to być osiągnięte bez przenikania przez siatkówkę neurosensoryczną do jamy ciała szklistego. Odczekaj kilka sekund przed wyjęciem igły, aby zminimalizować przepływ wsteczny. Następnie przepłucz oko sterylnym roztworem soli fizjologicznej i upewnij się, że oko obróciło się z powrotem do normalnej pozycji.
Następnie nałóż grubą warstwę kremu okulistycznego z potrójnym antybiotykiem na powierzchnię rogówki wstrzykniętego oka. Następnie umieść mysz w czystej, samotnej klatce w celu odzyskania zdrowia. Monitoruj jego oddech i temperaturę podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i sprawdź, czy może utrzymać leżący mostek.
Wykonać dodatkowe odpowiednie monitorowanie i leczenie pooperacyjne, w tym podskórne wstrzyknięcie karprofenu, w celu leczenia bólu pooperacyjnego. Oto rekonstrukcja 3D pęcherzyka w kształcie kopuły w miejscu wstrzyknięcia. Pęcherzyk w kształcie kopuły jest następnie wypełniany gęstą bielą, aby pokazać zakres i marginesy odwarstwienia siatkówki.
Przekroje siatkówki z OCT są widoczne w kolorze białym, podczas gdy wypełniona płynem przestrzeń na poziomie RPE i fotoreceptorów wydaje się. Na tym rysunku reprezentatywne skany OCTB w miejscu maksymalnego odwarstwienia siatkówki są pokazane przed wstrzyknięciem, 10 minut po wstrzyknięciu i cztery tygodnie po wstrzyknięciu. Ten obraz pokazuje powstawanie i rozdzielczość płaskiego pęcherzyka po wstrzyknięciu 0,3 mikrolitra.
Na tym obrazie widać powstawanie i rozdzielczość wypukłego pęcherzyka po wstrzyknięciu 0,5 mikrolitra, podczas gdy ten obraz pokazuje powstawanie i rozdzielczość wypukłego pęcherzyka po wstrzyknięciu jednego mikrolitra. Wreszcie, oto przykład poważnego bliznowacenia naczyniówki i ścieńczenia siatkówki w miejscu wstrzyknięcia. Siatkówki zachowują normalne funkcjonowanie po ustąpieniu pęcherzyków.
Przy dziewięciu intensywnościach oświetlenia pokazane są przebiegi dla odpowiedzi za pośrednictwem pręcików skotopowych dla wstrzyknięć przed wstrzyknięciem i cztery tygodnie po wstrzyknięciu dla wstrzyknięć 0,3 mikrolitra, 0,5 mikrolitra i 1 mikrolitra. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 10 do 15 minut na oko. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby ocenić stan zdrowia oczu przed rozpoczęciem.
Z wykluczeniem oczu z zmętnieniami rogówki lub soczewki lub oczu głęboko osadzonych, dla których ta procedura byłaby bardzo trudna. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak OCT i obrazowanie dna oka, w celu oceny jakości wstrzyknięcia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje nową technikę podplamowej iniekcji do wprowadzania środków terapeutycznych do przestrzeni podplamowej u myszy. Metoda ma na celu minimalizowanie uszkodzeń towarzyszących, zapewniając jednocześnie szybki powrót do normy struktury i funkcji siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki o widzeniu
- Oftalmologia
Tło
- Podplamowe iniekcje są powszechnie stosowane do wprowadzania terapii.
- Istniejące metody mogą powodować uszkodzenia towarzyszące i dłuższy czas powrotu do normy.
- Niniejsze badanie przedstawia alternatywną technikę o lepszych wynikach.
Cel badania
- Opisanie nowej techniki podplamowych iniekcji.
- Ocena skuteczności interwencji terapeutycznych w przypadku zwyrodnieniu siatkówki.
- Ułatwienie wprowadzania wektorów wirusowych i środków farmakologicznych.
Zastosowane metody
- Przycięcie wąsów anestetyzowanej myszy w celu lepszej wizualizacji.
- Utrzymanie temperatury ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą padu z obiegającą się wodą.
- Rozszerzenie źrenic kroplami do oczu z 2,5% efedryną.
- Demonstracja procedury przez wyszkolonego technika.
Główne wyniki
- Technika pozwala na wysoką skuteczność wprowadzania materiałów.
- Obserwuje się minimalne uszkodzenia struktur siatkówki.
- Osiąga się szybki powrót do normy funkcji siatkówki.
Wnioski
- Ta nowa technika podplamowej iniekcji jest skuteczna w badaniach.
- Ma potencjał do rozwijania strategii terapeutycznych w okulistyce.
- Dalsze badania mogą zbadać jej zastosowania w zwyrodnieniach siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This transcleral posterior subretinal injection method addresses a key challenge in preclinical ophthalmology: delivering therapeutic agents to the subretinal space while minimizing surgical trauma and preserving retinal integrity. By avoiding retinal penetration and vitreous disruption, the technique enables more accurate assessment of drug efficacy in rodent models of retinal degeneration. This supports de-risking of target validation and lead identification efforts in vision science pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise delivery of viral vectors, pharmacological agents, or stem cells to the subretinal space for functional target validation in retinal disease models.
- Operational Value: Minimizes confounding tissue damage, allowing clearer interpretation of therapeutic effects on photoreceptors and RPE.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces consistent, reproducible subretinal delivery with quantifiable outcomes via OCT and fundus imaging.
- Operational Value: Standardizes injection depth and location (0.5 mm from optic nerve), reducing variability across experiments and operators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal assessment of retinal structure and function due to rapid retinal reattachment and minimal chronic scarring.
- Operational Value: Compatible with postoperative monitoring using OCT, fundus imaging, and ERG to evaluate therapeutic durability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable delivery of candidate therapeutics to the subretinal space, a critical step before efficacy testing in degenerative retinal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing targeted delivery of agents to interrogate retinal pathways and cell-specific functions.
- Screening: Enables standardized preparation of disease models for compound screening with minimal procedural failure.
- Analytics: Generates clear OCT- and fundus-based readouts to quantify retinal detachment resolution and functional recovery over time.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical validation by preserving retinal architecture for accurate biomarker and functional assessments.
- Enterprise Reuse: Reusable across studies involving viral vectors, proteins, or cell-based therapies for retinal degeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing surgical artifacts that could mask or mimic therapeutic effects.
- Operational Value: Short procedure time (10–15 minutes per eye) and low failure rate improve throughput in preclinical studies.
- Strategic Value: Reduces biological noise in efficacy data, supporting better go/no-go decisions in target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by providing cleaner preclinical data on mechanism and durability.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and fine motor control for sclerotomy and needle placement.
- Dependent on specialized instrumentation including Vannas scissors, 22.5° ophthalmic blade, and 33-gauge beveled needle.
- Necessitates standardized postoperative care including antibiotics, analgesics, and monitoring for retinal reattachment.
- Adaptation to other model systems may require adjustment of incision size and needle angle based on ocular anatomy.
- Limited to posterior segment access; not suitable for anterior segment or intravitreal delivery applications.
