Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Ogólnym celem procedury jest wykorzystanie robotyki i standaryzowanych testów w celu usprawnienia izolacji wrażliwych na temperaturę mutacji śmiertelnych u Chlamydomonas w celu określenia podstawowych genów i szlaków w tym organizmie. Interesuje nas zarówno ochrona, jak i dywergencja podstawowych funkcji komórkowych u eukariontów. Lubimy to badać za pomocą mutacji, które zaburzają działanie genów w tych procesach.

Aby to dobrze zadziałało, potrzebujesz naprawdę obszernej kolekcji mutantów, a metody, o których usłyszysz, są naszym sposobem na wygenerowanie takiej kolekcji. Pracujemy w uprawie zielonych alg Chlamydomonas reinhardtii jako przedstawiciel królestwa roślin. Główną zaletą tej techniki jest to, że wrażliwe na temperaturę śmiertelne mutacje można prawdopodobnie znaleźć w każdym istotnym szlaku.

Metoda nie wymaga wcześniejszej wiedzy ani ukierunkowanej mutagenezy. Molekularna funkcja zmutowanego genu sugeruje się bezpośrednio na podstawie fenotypu letalnego. Pomaga nam to wybrać interesujące mutacje zakłócające różne szlaki siala poza kontrolą cyklu komórkowego.

Aby przeprowadzić hodowlę mutagenezy UV, komórki Chlamydomonas do OD 750 od 0,2 do 0,5 w 100 mililitrach fosforanu tris-octanu lub TAP, pod światłem w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wytrząsając przy 100 obr./min. Mutageneza UV jest przeprowadzana niezależnie w dwóch tłach genetycznych zgodnie z protokołem tekstowym. Należy sprawdzić próbkę każdej kultury pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są żywotne i wolne od zanieczyszczeń.

Następnie rozcieńczyć kulturę do OD 750 0,003, a następnie owinąć butelkę folią aluminiową, aby zapewnić jednorodną gęstość, ponieważ szczep jest modalny i pływa kierunkowo w odpowiedzi na światło. Po dostosowaniu gęstości zawiesiny zgodnie z protokołem tekstowym należy przymocować małą kasetę z rurką, która pasuje do dozownika płynu i wykonać serię prań w celu sterylizacji, zgodnie z instrukcją producenta, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Używając kasety z dozownikiem płynu z ośmioma strzykawkami, dozuj cztery po 96 kropli po dwa mikrolitry kultury każda na suche prostokątne płytki.

Delikatnie postukaj w krawędź płytki, aby upewnić się, że wszystkie krople połączyły się w cienki arkusz płynu i natychmiast przykryj płytki, aby zapobiec ekspozycji na światło. Po wysuszeniu umieść płytki pod bakteriobójczą lampą UV na okresy czasu określone empirycznie, aby uzyskać optymalną wydajność mutantów ts wśród osób, które przeżyły. Następnie przenieś płytki w ciemność na osiem do 24 godzin w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 21 stopni Celsjusza z oświetleniem. Po około 10 dniach, gdy kolonie są hodowane, ale nie łączone, załaduj płytki do odpowiedniego stosu jako źródła do zrobotyzowanego pobierania kolonii. Następnie wybierz kolonie dla 384 tablic na prostokątnych płytkach i hoduj je w temperaturze 21 stopni Celsjusza z oświetleniem przez około tydzień.

Używając repliki robota do galwanizacji, skondensuj 384 tablice w tablicę 1536 i pozwól płytkom rosnąć w inkubatorze o temperaturze 21 stopni Celsjusza przez około trzy dni. Powtórz 1536 tablic na dwóch płytkach każda i umieść jedną w inkubatorze o temperaturze 21 stopni Celsjusza, a drugą w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach w temperaturze 33 stopni Celsjusza powtórz płytki z inkubatora o temperaturze 33 stopni Celsjusza do nowego zestawu wstępnie podgrzanych płytek i umieść je w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza.

Po trzech dniach wzrostu w temperaturze 33 stopni Celsjusza i pięciu dniach wzrostu w temperaturze 21 stopni Celsjusza, użyj aparatu cyfrowego, aby sfotografować płytkę siatki oznaczoną dziewięcioma wskaźnikami wyrównania. Następnie sfotografuj płyty, naprzemiennie płytki o temperaturze 21 stopni Celsjusza, a następnie odpowiadające im płytki o temperaturze 33 stopni Celsjusza, przy czym wszystkie płytki są umieszczone w stałej ramce, aby zachować dokładną orientację. Przetwarzaj sparowane obrazy 21, 33 płyt za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazów matowych w laboratorium, aby wyeliminować tło i podzielić obrazy na tablicę 1536.

Program określi wykrytą biomasę jako całkowitą intensywność pikseli w każdej pozycji. Załaduj listę wybranych kolonii wygenerowaną przez oprogramowanie jako plik instruktażowy dla robotyki zbierającej pojedyncze kolonie. Następnie przygotuj płytkę źródłową i docelową zgodnie z instrukcjami robotyki i pozwól robotowi wybrać wybrane kolonie do tablicy.

Umieść płytki docelowe w inkubatorze o temperaturze 21 stopni Celsjusza na około pięć dni, aby wyhodować płytkę podstawową. Po przeprowadzeniu drugiego testu akumulacji biomasy i powtórzeniu 100 płytek blokowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy powtórzyć nową kopię 100 płytek blokowych do trzech kopii. Po ustawieniu trzeciej płytki w robocie i wykryciu kolonii, należy wykonać mikrofotografie obszaru każdej plamki na płytkach przesiewowych w czasie zero i umieścić płytki w temperaturze 33 stopni Celsjusza w celu inkubacji.

W różnych punktach czasowych po wyjęciu płytek przesiewających z inkubatora o temperaturze 33 stopni Celsjusza szybko wykonaj mikrofotografie, upewniając się, że uchwyt płytki i kontroler stopnia są precyzyjnie skalibrowane, aby uzyskać obrazy tych samych komórek w każdym punkcie czasowym. Analizuj obrazy mikroskopowe i wybieraj mutanty na podstawie pożądanych kryteriów. Umieść ostatni wybrany zestaw na 96 ułożonych płytkach agarowych, upewniając się, że każda płytka zawiera mutanty o tym samym typie krycia i odporności na leki.

Przenieś duże ilości ułożonych kolonii do pożywki indukcyjnej gamet wolnych od azotu na 96-dołkowych mikropłytkach. Inkubuj płytki pod światłem przez około pięć godzin, aby umożliwić gametogenezę. Zawieś zapytania z przeciwnymi typami krycia, w których znajdują się alternatywne kasety oporowe w probówkach z pożywką do indukcji gamet wolnych od azotu do gametogenezy.

Wymieszać próbki z płytki docelowej w mieszaninie o objętości 20 mikrolitrów. Po około 10 minutach pod światłem dwukrotnie wykryj pięć mikrolitrów z każdej studzienki. Raz na płytce TAP do testowania połączeń i raz na TAP plus pięć mikromoli paro plus dziewięć mikromoli higro w celu zbadania komplementacji.

Po inkubacji płytek do badania komplementacji, powtórzyć płytki w dwóch kopiach w celu identyfikacji fenotypu ts. Badaj kolonie pod kątem fenotypu ts zgodnie z protokołem tekstowym. Po napromieniowaniu pojedynczych komórek Chlamydomonas, komórkom pozwala się rosnąć przez dziesięć dni w dopuszczalnej temperaturze, a następnie zbiera się w szyku, jak pokazano tutaj.

Powstałe w ten sposób płyty w formacie 384 są łączone w tablicę 1536. Przetestowano trzy czasy ekspozycji na promieniowanie UV w celu wygenerowania mutantów Chlamydomonas ts. Empirycznie 1,5-minutowy czas ekspozycji przyniósł najwięcej mutantów ts.

Jednak zdecydowanie jednominutowy czas ekspozycji pozwolił uzyskać większość kandydatów na cykl komórkowy. W tym eksperymencie przeprowadzono dwa sekwencyjne testy fenotypu ts i wyizolowano około 3000 mutantów ts i scharakteryzowano fenotypowo za pomocą mikroskopii poklatkowej. Jak widać tutaj, w celu usunięcia wysoce powtarzających się genów z dalszego potoku, przeprowadzono testy komplementacji i sprzężeń z już scharakteryzowanymi genami z więcej niż dwoma allelami, na nowo pobranych kandydatach.

Kolonie te nie wykazują komplementarności z zapytaniem i dlatego są nowymi allelami ts dla badanego genu. Są one zasadniczo wyłączone z dalszej charakterystyki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać z dużą przepustowością.

Tysiące mutantów ts można wyizolować w zaledwie dwóch lub trzech rundach mutagenezy. Kluczowym krokiem po wyizolowaniu mutantów ts jest wybranie podzbioru do dalszych badań i bardzo interesujące jest zobaczenie zakresu śmiertelnych fenotypów. Fenotypowanie dostarcza wskazówek dotyczących funkcji molekularnych, a także pomaga nam ustalić priorytety mutantów do dalszych badań.

Należy pamiętać, że mutanty mogą mieć setki lub tysiące mutacji w swoich genomach. Zwykle tylko jedna z nich jest przyczynowa, chociaż czasami dla fenotypu ts wymagane są dwie mutacje, które można określić za pomocą analizy tetra. Zgodnie z tą procedurą, mutacje przyczynowe można zidentyfikować za pomocą analizy sekwencjonowania nowej generacji puli Zidentyfikowane geny czasami będą miały mutacje sugerujące funkcję lub mogą to być nowe, nieznane sekwencje, co jest interesujące i ekscytujące.

Chlamydomonas jest wspaniałym systemem modelowym do badania biologii komórek w królestwie roślin. Procedury, o których słyszeliście, powinny otworzyć badania nad tym organizmem pod kątem podstawowych procesów, które były stosunkowo niezbadane i mamy nadzieję, że wyniki będą również istotne dla szerszego królestwa roślin.