Name: Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowej izolacji śmiertelnych mutantów wrażliwych na temperaturę u Chlamydomonas reinhardtii z użyciem robotyki. Technika ta umożliwia identyfikację genów i szlaków komórkowych niezbędnych dla życia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Cross Lab za rady i pożyteczną dyskusję. Prace te były wspierane przez PHS 5RO1-GM078153 oraz przez nagrodę Junior Fellow przyznaną przez Fundację Simonsa Michałowi Brekerowi.

1. Mutageneza UV
<ol>
	<li>Przygotować partię 100 - 200 prostokątnych płytek agarowych z podłożem tris-acetate-fosforanowym (TAP)9,10. Przygotuj te płytki z kilkudniowym wyprzedzeniem i trzymaj je na stole do wyschnięcia, aby zapewnić szybkie wchłanianie zawieszonych komórek w kolejnych krokach.</li>
	<li>Hodowla komórek Chlamydomonas o gęstości optycznej do 0,2 - 0,5 (OD750; ~ 2 dni) w 100 ml płynu TAP pod światłem, w temperaturze 25 °C i wstrząsając przy 100 obr./min. 
	UWAGA: Mutageneza UV jest przeprowadzana niezależnie w dwóch tłach genetycznych: Mat-Hygror (nadaje odporność na higromycynę B) i Mat+ Paror (nadaje odporność na paromomycynę). Wybór antybiotyku jest arbitralny, pod warunkiem, że oba typy kojarzenia mają komplementarną oporność na leki.</li>
	<li>Sprawdzić próbkę każdej z kultur pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są żywotne, zdrowe (pływające i nienaruszone) oraz wolne od zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Przerośnięte kultury "rozbijają się" i tracą żywotność, pojawiając się jako "duchy" w mikroskopii z kontrastem fazowym. Nie utrzymuj kultur wytrząsających, gdy osiągną nasycenie. Zjawisko "ducha" jest łatwo wykrywalne w kroku 1.3.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę do 0,003 OD750. Owiń butelkę folią aluminiową, aby zapewnić jednorodną gęstość, ponieważ szczep jest ruchliwy i pływa kierunkowo w odpowiedzi na światło.
	<ol>
		<li>Dostosuj gęstość zawiesiny w oparciu o planowaną dawkę UV, tak aby biorąc pod uwagę zabijanie komórek, na płytkach utworzyło się 200 - 600 kolonii ocalałych (ryc. 1). Patrz Tabela 1, aby uzyskać informacje na temat czasów ekspozycji na promieniowanie UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz kasetę z małą tubą, która pasuje do dozownika płynu i wykonaj serię prań w celu sterylizacji, zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Za pomocą dozownika 8 x 12 płynów dozuj 4 x 96 kropli po 2 μl każda na prostokątne płytki (Rysunek 1). Delikatnie postukaj w krawędź płytki, aby upewnić się, że wszystkie krople łączą się w cienki arkusz płynu i natychmiast przykryj płytki, aby zapobiec ekspozycji na światło.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić bardzo równomierne rozproszenie pojedynczych komórek, użyj suchych płytek, jak wspomniano powyżej, i szybko przykryj płytki, aby zapobiec pływaniu komórek w odpowiedzi na światło. Trzymaj przykryte talerze poziomo i w ciemności, aż cały płyn zostanie wchłonięty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść płytki pod bakteriobójczą lampą UV (30-watowa bakteriobójcza lampa UV) na okresy czasu określone empirycznie, aby zapewnić optymalną wydajność mutantów ts- wśród osób, które przeżyły. W tym przypadku użyj czasów 0,5 - 1,5 minuty w odległości 40 - 50 cm, aby uzyskać 90 - 99,9% zabójstwa. Osoby, które przeżyły, zawierają 100 - 1,000 mutacji punktowych wywołanych promieniowaniem UV, z których ~ 10% zmienia sekwencje kodujące.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić maksymalną siłę naświetlania promieniowaniem UV bez odwrócenia z powodu zależnej od światła naprawy DNA11,12, na tym etapie pracuj w ciemności i natychmiast po napromieniowaniu zapakuj płytki do ciemnego pudełka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj talerze w ciemności przez 8 - 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 21 °C z oświetleniem, aby utworzyć kolonie. Tworzenie kolonii trwa ~10 dni. Pamiętaj, aby owinąć talerze plastikowymi torbami i dodać do środka papier absorpcyjny, aby zniwelować kondensację cieczy. W przeciwnym razie cykle parowania i kondensacji mogą zapewnić drogę ciekłego filmu dla zanieczyszczeń do płyt.</li>
	<li>Załaduj płytki do odpowiednich stosów jako źródła do zrobotyzowanego pobierania kolonii (Rysunek 2). Wybierz kolonie dla tablic 384 na prostokątnych płytkach i hoduj je w temperaturze 21 °C z oświetleniem (~ 1 tydzień).</li>
	<li>Skondensuj matryce 384 w 1 536 tablic (4:1) za pomocą robota do galwanizacji replik (rysunek 3) i pozwól płytkom rosnąć przez ~ 3 dni w inkubatorze o temperaturze 21 °C.</li>
	<li>Powtórzyć liczbę 1 536 tablic na dwie płytki każda i umieścić jedną w inkubatorze o temperaturze 21 °C (temperatura dopuszczalna), a drugą w inkubatorze o temperaturze 33 °C (temperatura ograniczona). Po upływie 24 godzin powtórzyć płytki w temperaturze 33 °C do nowego zestawu wstępnie ogrzanych płytek i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 33 °C. 
	UWAGA: Powodem tego wtórnego posiewu jest to, że śmiertelne mutanty mogą w niektórych przypadkach gromadzić znaczną biomasę, nawet jeśli komórki zostaną zatrzymane w pierwszym cyklu komórkowym po posiewaniu. Drugorzędna replika eliminuje ten sygnał i znacznie zwiększa czułość.</li>
	<li>Sfotografować płytki aparatem cyfrowym po 3 dniach wzrostu w temperaturze 33 °C i 5 dniach wzrostu w temperaturze 21 °C. Trzymać płytki w ustalonej ramce. Użyj "płytki siatkowej" oznaczonej dziewięcioma wskaźnikami wyrównania, która jest fotografowana razem z płytkami hodowlanymi (rysunek 4). Sfotografuj płytki hodowlane jako naprzemiennie sparowane obrazy w temperaturze 21 °C i 33 °C (21/33). 
	UWAGA: W celu wyrównania wzrostu stosuje się różne czasy inkubacji, ponieważ dziki typ rośnie znacznie szybciej w temperaturze 33 °C niż w temperaturze 21 °C.</li>
</ol>
2. Identyfikacja kandydatów na mutantów ts: Pierwszy ekran
<ol>
	<li>Przetwarzaj sparowane obrazy płyt 21/33 za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazów Matlab, aby wyeliminować tło i podzielić obrazy na 1 536 tablic. Program określi wykrytą biomasę (całkowitą intensywność pikseli) w każdej pozycji (rysunek 5). 
	UWAGA: Oprogramowanie (dostarczone w SI wraz z instrukcjami) użyje obrazu z płytki siatki do określenia lokalizacji komórek (poszczególnych wpisów) w tablicy 1,536 przy zastosowanym powiększeniu i wyrównaniu płytki oraz obliczy całkowitą intensywność pikseli w każdej komórce. Wartości te dla każdego mutanta są następnie porównywane z regulowanymi parametrami w celu określenia wymaganego wzrostu w temperaturze 21 °C w stosunku do wzorca ts+ i stopnia wrażliwości na temperaturę, zdefiniowanego jako: S(Mut33)/S(WT33)/S(Mut21)/S(WT21), gdzie S jest sygnałem (intensywność pikseli po odjęciu tła), Mut jest indywidualnym mutantem, a "WT" to losowo wybrana kolonia niewrażliwa na temperaturę (zmutagenizowany szczep, który miał fenotyp ts +). Wzrost w temperaturze 21 °C definiuje się jako S(Mut21)/S(WT21). Na tym pierwszym ekranie należy zastosować złagodzone kryteria wyboru (dopuszczające stosunkowo niski wzrost w temperaturze 21 °C i stosunkowo niski stopień wrażliwości na temperaturę), aby utrzymać niski odsetek wyników fałszywie ujemnych.</li>
	<li>Załaduj listę wybranych kolonii wygenerowaną przez oprogramowanie jako plik instrukcji dla robotyki zbierającej pojedyncze kolonie (zwykle do tablicy 384). Przygotuj płytkę źródłową i docelową zgodnie z instrukcjami robotyki i wybierz kolonie do ustawienia (Rysunek 6). 
	UWAGA: Konwencjonalne pickery wymagają pliku instrukcji w pewnym formacie, takim jak .csv, .txt lub .xls. Wszystkie selektory będą miały możliwość korzystania z plików; różne formaty będą wymagały drobnej edycji kodu MATLAB (dostarczony kod źródłowy).</li>
	<li>Umieścić płytki docelowe w inkubatorze w temperaturze 21 °C na ~ 5 dni, aby wyhodować płytkę podstawową.</li>
</ol>
3. Identyfikacja mutantów ts: Drugi ekran
<ol>
	<li>Powtórz krok 2.1, aby ponownie przetestować wybrane kolonie. Zazwyczaj 30 - 50% kolonii jest ponownie testowanych jako czyste ts lethals, uzyskując wydajność 2% - 5% ts lethals w stosunku do początkowych kolonii, które przeżyły mutagenezę UV.</li>
	<li>Powtórz krok 2.2 dla wybierania dwukrotnie przesianych ts lethals, ale ze zmodyfikowanym plikiem instrukcji zaprojektowanym do układania kolonii w bloki po 100 kolonii na prostokątnych płytkach o gęstości 384. Ma to na celu wygodne badanie mikroskopowe w następnym kroku. Format pliku instrukcji jest określany w czasie wykonywania przez kod MATLAB.</li>
	<li>Upewnij się, że uwzględniłeś kilka kolonii WT jako kontrolę i umieść płytki w temperaturze 21 °C na ~ 5 dni.</li>
</ol>
4. Wstępne określenie fenotypu
<ol>
	<li>Powtórzyć 100-blokowe płytki ułożone w kroku 3.2 i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 21 °C na ~ 2 dni, aby uzyskać świeżo rosnące kolonie.</li>
	<li>Powielić nową kopię 100-blokowych tabliczek (4.1) do trzech kopii. Umieścić jedną kopię w inkubatorze w temperaturze 21 °C i jedną w inkubatorze w temperaturze 33 °C jako kontrolę.</li>
	<li>Umieść trzecią kopię ("płytki przesiewowe") w zrobotyzowanym ustawieniu i znajdź kolonie długimi szpilkami dotkniętymi wysterylizowaną wodą. 
	UWAGA: Komórki Chlamydomonas przypięte do agaru mają tendencję do lądowania początkowo jako dość gęsta plama komórek, z kilkoma pojedynczymi komórkami dostępnymi do kontroli mikroskopowej. Aby zoptymalizować kolonie do kontroli mikroskopowej, należy dostrzec początkowo przeniesione komórki za pomocą kropli wody (objętość wody przenoszonej przez długie kołki robota wynosi ~ 100 nl). Powoduje to rozproszenie komórek w małym promieniu (~ 1 mm) wokół początkowego środka przypinania, z wieloma izolowanymi pojedynczymi komórkami.</li>
	<li>Wykonać mikrofotografie obszaru każdej plamki na płytkach przesiewowych w czasie 0 (gdy są jeszcze pojedyncze, niepodzielone komórki) (ryc. 7) i umieścić płytki w temperaturze 33 °C w celu inkubacji. Określ lokalizację obrazu za pomocą ręcznej kontroli stolika zmodyfikowanego mikroskopu tetradowego ustawionego tak, aby dawał przystanki w odstępach 4,5 mm od środka do środka matrycy o gęstości 384.</li>
	<li>Wyjąć płytki przesiewające z inkubatora w temperaturze 33 °C i wykonać mikrofotografie, jak w kroku 4.4, w różnych punktach czasowych (10 godzin, 20 godzin, 48 godzin). Upewnij się, że stolik, uchwyt płytki i kontroler stage są precyzyjnie skalibrowane, aby uzyskać obrazy tych samych komórek w każdym punkcie czasowym. Wykonaj szybką akwizycję mikrofotografii (~ 10 min).</li>
	<li>Użyć drugiej kopii w inkubatorze w temperaturze 33 °C, aby zweryfikować fenotyp ts i upewnić się, że wahania temperatury podczas akwizycji obrazu nie mają większego wpływu na fenotyp ts.
	<ol>
		<li>Analizuj obrazy mikroskopowe i wybieraj mutanty na podstawie pożądanych kryteriów (ryc. 8). Znajdź ostatni wybrany zestaw na 96-poziomowej płytce agarowej. Upewnij się, że każda płytka zawiera mutanty o tym samym typie krycia i odporności na leki.</li>
		<li>Dla każdej płytki należy uwzględnić dwie ostatnie kolumny pozytywną (mutacja zapytania) i negatywną (WT) kontrolę dla testu komplementacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Uzupełnianie i testowanie powiązań nowych mutantów z "często podróżującymi"
<ol>
	<li>Przenieś duże ilości ułożonych kolonii do bezazotowego podłoża do indukcji gamet10 w 96-dołkowych mikropłytkach (gęstość każdej kolonii powinna wynosić około 0,2 OD). Inkubuj płytki pod światłem (żarówki rtęciowe o mocy 13 - 20 W) przez ~ 5 godzin, aby umożliwić gametogenezę. 
	UWAGA: Ten krok można przeprowadzić za pomocą replikującej konfiguracji robotycznej lub ręcznie za pomocą prostego urządzenia do galwanizacji.</li>
	<li>Zawieś zapytania z przeciwnymi typami krycia, w których znajdują się alternatywne kasety oporowe w rurkach z bezazotowym medium do indukcji gamet10 do gametogenezy.</li>
	<li>Wymieszać próbki na płytce tarczowej w mieszaninie o objętości 20 μl (rysunek 9). Po ~10 minutach pod światłem wykryj 5 μl z każdej studzienki dwukrotnie: raz na płytce TAP w celu przetestowania połączeń i raz na TAP + 5 μM Paro + 9 μM Hygro w celu zbadania komplementacji.</li>
	<li>Płytki łączące należy inkubować w inkubatorze w temperaturze 21 °C przez noc, a następnie zawinąć je w folię. Trzymaj je w ciemności przez 5 dni, aby umożliwić tworzenie zygospor.</li>
	<li>Inkubować płytki do badania komplementacji przez ~10 dni w świetle w temperaturze 21 °C. 
	UWAGA: Ilości leku są skalibrowane, aby umożliwić przeżycie podwójnie heterozygotycznych diploidów, ale nadal są wystarczające do wyeliminowania współpracujących haploidów. Ilości te zostały skalibrowane dla standardowych integracji kaset rezystancyjnych stosowanych w tym konkretnym projekcie; W przypadku nowych integracji dawki powinny zostać ponownie skalibrowane. Większość biomasy jest weryfikowana jako diploidy za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 9), chociaż zwykle obserwuje się również zmienny poziom haploidów (prawdopodobnie z mejozy i wzrostu podwójnie odpornych segregantów).</li>
	<li>Powtórzyć płytki testowe komplementacji do dwóch kopii w celu identyfikacji fenotypu. Umieścić jedną kopię w temperaturze 21 °C i jedną kopię w temperaturze 33 °C na ~ 5 dni.</li>
	<li>Badaj kolonie pod kątem fenotypu ts-, jak opisano w sekcji 2.1 (ryc. 5). Kolonie, które nie uzupełniają się z zapytaniem, prawdopodobnie reprezentują allele tego samego genu co zapytanie (diploidy hetero-alleliczne dla mutacji w tym samym genie).</li>
	<li>W celu przetestowania sprzężenia, postępując zgodnie z krokiem 5.4, przesuń płytki z powrotem do światła, aby umożliwić mejozę i wzrost haploidalnych segregantów przez ~ 7 dni.</li>
	<li>Powtórzyć płytki do testowania połączeń do TAP + 10 μM Paro i 10 μM Hygro w celu wyselekcjonowania podwójnie opornych potomków (przewiduje się, że będzie to 25% haploidalnego potomstwa, ponieważ kasety są niesprzężone) i inkubować w temperaturze 21 °C przez tydzień. 
	UWAGA: Zwiększ dawkę leku dla podwójnie opornych haploidów.</li>
	<li>Badaj kolonie pod kątem fenotypu ts-, jak w kroku 2.1. 
	UWAGA: Fenotyp ts- jest oczekiwany (i obserwowany) dla mutantów w tej samej grupie komplementacji, co zapytanie. Ponadto fenotyp ts- w teście sprzężeń, dla mutanta, który uzupełnia zapytanie, może odzwierciedlać ścisłe powiązanie między zapytaniem a nową mutacją. Mutanty, które uzupełniają badane zapytania, są prawdopodobnie nowymi genami, które wejdą do procesu bioinformatycznej identyfikacji zmiany sprawczej, a ostatecznie do dalszej analizy fenotypowej.</li>
</ol>

<ol><li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li>
<li>Cross, F. R., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas cell cycle.</a> Plant J. 82, 370-392 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Indexed%2C+Mapped+Mutant+Library+Enables+Reverse+Genetics+Studies+of+Biological+Processes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 28, 367-387 (2016).</li>
<li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-Dependent+Kinase+Regulation+of+Diurnal+Transcription+in+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas.</a> Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).</li>
<li>Simchen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell cycle mutants.</a> Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).</li>
<li>Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+the+cell-division+cycle+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Detection+of+mutants.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic control of the cell-division cycle in yeast.</a> I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+E+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+into+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier Academic Press. (2008).</li>
<li>Dutcher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+and+tetrad+analysis+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).</li>
<li>Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+in+plants+under+ultraviolet+and+ionizing+radiations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations.</a> Sci World J. 2015, 250158(2015).</li>
<li>Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+mechanisms+of+DNA+repair+by+photolyase%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li>
<li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews%2C+Volume+32%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li>
<li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+end+is+destruction%3A+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li>
<li>Merchant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+genome+reveals+the+evolution+of+key+animal+and+plant+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions.</a> Science. 318, 245-250 (2007).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak istotnych interesów finansowych.

Opisana tutaj procedura wysokowydajnej izolacji letalnych mutantów ts zapewnia, że przypuszczalnie wszystkie niezbędne dla komórek szlaki genomu Chlamydomonas są reprezentowane. Dwa najbardziej krytyczne kroki dla skutecznego zbierania potencjalnych genów cyklu komórkowego i eliminacji powtarzających się alleli "częstych lotów" to: 1) spójna definicja cech fenotypu zatrzymania dla niekompletnych cykli komórkowych oraz 2) równoległy test komplementacji wobec już zidentyfikowanych genów zapytania w celu powiększenia kolekcji o nowo wyizolowane.
Po zsynchronizowaniu przez cykle światło-ciemność, Chlamydomonas rośnie fotosyntetycznie w ciągu dnia i zwiększa rozmiar komórek > 10 razy bez replikacji DNA lub podziału komórki13. W przybliżeniu zbiegając się z nadejściem nocy, komórki przechodzą następnie wiele cykli naprzemiennej replikacji DNA, mitozy i podziału komórki (ryc. 8). Ten schemat regulacyjny zapewnia naturalne rozróżnienie między genami wymaganymi przede wszystkim do wzrostu i integralności komórki a genami wymaganymi specjalnie do cyklu podziału komórki. Odkryliśmy, że 10-godzinne i 20-godzinne punkty czasowe są bardzo pouczające dla początkowego przybliżonego cięcia fenotypowego1. Szerokie klasy śmiertelnych mutantów, które obecnie rozpoznajemy, na podstawie tych obrazów (patrz SI w Tulin i Cross, 2014)1, to: Notch, Popcorn, Round, Small, Medium, early lysis i multiple-cycle (Figura 8).
Trzy najważniejsze kategorie, na których się skupiamy, to Notch, Popcorn i Round. Wcześniej wykazano, że fenotypy "Notch" i "Popcorn" są charakterystyczne dla większości zmian specyficznych dla cyklu komórkowego (np. kinaza zależna od cykliny mitotycznej, maszyneria replikacji DNA i topoizomeraza II)1. Pojawienie się jednej (Notch) lub wielu (Popcorn) pozornych płaszczyzn początkowego, ale nieudanego podziału komórki jest wygodnym wskaźnikiem morfologicznym inicjacji cyklu komórkowego. Mutanty te na ogół wykazują niewielkie lub żadne wady wzrostu, ze wzrostem objętości komórek podobnym do WT po 10 godzinach. Fenotypy Notch i Popcorn są widoczne po 10 godzinach i są w pełni rozwinięte (często związane z lizą komórek) po 20 godzinach. "Okrągłe" komórki rosną podobnie do WT, ale ze znacznie zmniejszoną produkcją pozornych początkowych płaszczyzn podziału, dając w ten sposób duże, okrągłe zatrzymane komórki. Wcześniejsze mutanty z tej kategorii zaliczały się do składników kompleksu promującego anafazę14 lub do genów niezbędnych do funkcjonowania mikrotubul (kofaktory zwijające tubulinę, kompleks pierścieniowy gamma-tubuliny)1. W późniejszym czasie komórki te często wykazują wyraźną lizę komórek.
"Małe" i "średnie" komórki rosną albo nieznacznie (małe), albo znacznie mniej niż WT (średnie). Wiele z tych zidentyfikowanych do tej pory mutantów ma zmiany w genach, których adnotacje sugerują rolę w podstawowych procesach wzrostu komórkowego (translacja lub biogeneza błony). Główna mikroskopowa dyskryminacja między średnim a okrągłym opiera się na wielkości wzrostu po 10 godzinach (Okrągły: jak WT; Średni: zredukowany). Ponieważ kategorie Małe i Średnie są dość duże i prawdopodobnie odzwierciedlają zmiany w szerokim zakresie szlaków komórkowych, nie próbujemy nasycić tych kategorii; Chcemy jednak molekularnie zidentyfikować przedstawicieli tej klasy, aby zrozumieć fenotypy utraty w różnych ścieżkach. Dwie niezbadane kategorie to: 1) mutanty wcześnie ulegające lizie, które tracą integralność (utrata zielonego koloru, utrata refrakcji) po 10 godzinach, z niewielkimi dowodami na wcześniejszy wzrost komórek oraz 2) wielokrotne cykle. Komórki namnażają się podobnie do WT po 10 i 20 godzinach, choć wykazują całkowitą niezdolność do przeprowadzania długotrwałej proliferacji.
Najczęściej charakteryzujemy "karb", "popcorn" i "okrągły" i wykluczamy małe i średnio okrągłe komórki, a także nieszczelne mutanty, które kończą kilka podziałów komórkowych. Ma to na celu przede wszystkim zapewnienie, że podstawowe cechy komórkowe, takie jak wzrost i integralność błony, są funkcjonalne i zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia genów związanych z podziałem. Podejście to okazało się empirycznie skuteczne; jednak może się zdarzyć, że gen cyklu komórkowego jest plejotropowy i pełni dodatkowe role wcześniej w G1, przed faktycznym podziałem. Takie przypadki, które spodziewamy się, że będą rzadkie, są pomijane. Mówiąc bardziej ogólnie, dążymy do jednorodnego zatrzymania, które z dużym prawdopodobieństwem jest spowodowane jedną mutacją sprawczą, która jest całkowicie dysfunkcyjnym białkiem. Jednak z tego samego powodu, który właśnie opisano, może istnieć kilka punktów zatrzymania, dlatego wskazana jest pewna elastyczność w doborze kandydatów.
W celu wzbogacenia kolekcji o nowo zidentyfikowane geny, wybrani kandydaci są poddawani testom pod kątem komplementacji. Wymagamy ts- w kontroli pozytywnej (zapytanie przeciwko mutacji zapytania) i ts+ w kontroli ujemnej (zapytanie przeciwko WT). Nowe mutanty w tej samej grupie komplementacji co zapytanie to ts-. Przynależność do tej samej grupy komplementacji prawie zawsze odzwierciedla zmianę molekularną w tym samym genie (tak było w przypadku każdego takiego genu, który testowaliśmy). W związku z tym w przypadku "osób często podróżujących" kryterium to ma charakter wykluczający dla dalszej charakterystyki. Mutanty, które nie znajdowały się w tych samych grupach komplementacji, co badane zapytania, są kandydatami na nowe geny i są dalej charakteryzowane przez narzędzia bioinformatyczne i eksperymentalne. Wysoce zmienny odzysk alleli ts- do różnych grup komplementacji jest dobrze znanym zjawiskiem - to znaczy zmienność jest znacznie większa niż szum Poissona, ze względu na dużą wewnętrzną zmienność mutowalności do ts- między różnymi genami. Przyczyny mogą obejmować wewnętrzne różnice w termolabilności; różne wielkości białek; obecność białka jako monomeru w porównaniu z dużym, ustabilizowanym kompleksem; i mutagenne gorące punkty. To prawie czysta uciążliwość. Jednak jednym z korzystnych wyników jest to, że lista "często podróżujących" nie jest długa (tylko kilka celów zajmuje większość listy), więc pracochłonne testowanie komplementacji nie jest ogromnym przedsięwzięciem aż do późniejszych etapów projektu.
W ramach podejścia uzupełniającego przeprowadziliśmy test sprzężeń. W tym teście wybierane są podwójnie odporne potomstwo, które jest testowane pod kątem fenotypu ts-. Fenotyp ts- jest oczekiwany (i obserwowany) dla mutantów w tej samej grupie komplementacji co zapytanie lub dla mutacji ściśle powiązanych. Dla każdego z badanych genów oczekuje się, że pojawi się potomstwo WT (fenotyp ts+) z pewnym prawdopodobieństwem w zależności od odległości genetycznej. Szacujemy, że na każde krycie w tych miejscach przypada około 100 zygospor. Zakładając 100% skuteczność mejotyczną, otrzymamy około 100 podwójnie lekoopornych potomstwo z niepołączonych kaset oporności na leki (25% potomstwa mejotycznego, cztery na mejozę, ze względu na dziedziczenie mendlowskie). Dotyczy to również mutacji ts-, gdzie 25% potomstwa będzie podwójnie zmutowane, a 25% będzie WT, jeśli mutacje zapytania i testu nie są ze sobą powiązane. Dlatego z podwójnie lekoopornego potomstwa 25% będzie stanowić WT (około 25 komórek). Dzieje się tak w przypadku całkowicie niepowiązanych mutacji; jednak umiarkowane wiązanie (w granicach ~ 20 cm, około 2 Mb lub 2% genomu115) znacznie zmniejszy lub wyeliminuje sygnał TS+. W przypadku sprzężenia badanej mutacji z kasetą z antybiotykiem, haploidy ts+, które są podwójnie lekooporne, występują w bardzo małych ilościach. Objawia się to pozornym brakiem rekombinacji ze wszystkimi testowanymi mutantami, pomimo uzupełnienia wszystkich testowanych mutantów, co jest nieprawidłowym wynikiem, który łatwo zauważyć; W takich przypadkach krzyżowanie wsteczne rozwiąże problem.
Zarówno na podstawie wcześniejszej wiedzy, jak i analizy sekwencji, spodziewamy się, że geny cyklu komórkowego u Chlamydomonas wynoszą około 500 genów2, chociaż większość, ale prawdopodobnie nie wszystkie, są niezbędne. Ocenimy konieczność dodatkowych rund mutagenezy w miarę zbierania większej liczby mutantów i wzrostu poziomu saturacji.
Procedura ta jest unikalnie zaprojektowana do badania podstawowych procesów biologicznych oraz genów i białek, które je przeprowadzają. Istnieją inne metodologie generowania perturbacji w podstawowych genach (np. transformacja losowo zmutowanych alleli16, warunkowo transkrybowanych alleli17 lub alleli hipomorficznych18). Jednak wszystkie wymagają rekombinacji homologicznej, która jest silnie tłumiona w wegetatywnych Chlamydomonas. Zgrupowany, regularnie rozmieszczony system krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/Cas9 został uznany za potężne narzędzie do modyfikacji genów19; jednak nie działa jeszcze wydajnie w Chlamydomonas20. Co najważniejsze, wszystkie te metody wymagają wcześniejszej wiedzy na temat celu. Jest to poważne ograniczenie, jeśli ktoś chce mieć możliwość nauczenia się czegoś nowego! Nasze podejście pozwoli na uzyskanie mutacji identyfikujących niezbędne geny, niezależnie od jakiejkolwiek wcześniejszej wiedzy. Dlatego też, przy obecnym poziomie technologii, izolacja losowych mutacji ts, a następnie identyfikacja genów poprzez głębokie sekwencjonowanie, może być najbardziej efektywną metodą szybkiego wejścia do biologii komórek drobnoustrojów w superkrólestwie roślin.
Identyfikacja mutacji przyczynowych (spośród ~100 mutacji zmieniających sekwencję kodującą w każdym klonie) wykracza poza zakres tego artykułu. Głębokie sekwencjonowanie dużych pul segregantów1 jest skuteczne, ale pracochłonne. Strategia puli kombinatorycznej do oznaczania wszystkich mutacji w dużej liczbie szczepów, po sekwencjonowaniu niewielkiej liczby pul, jest bardzo opłacalna i pracochłonna. Opracowywana jest nowa strategia kombinatorycznego sekwencjonowania segregantów masowych, która pozwoli na identyfikację mutacji przyczynowych u dziesiątek mutantów jednocześnie w jednym cyklu sekwencjonowania (w przygotowaniu). Skuteczność ta jest bardzo ważna, aby umożliwić krytyczny etap identyfikacji genów i nadążanie za bardzo szybką akumulacją mutantów, która jest możliwa dzięki opisanym tutaj procedurom.

Charakterystyka fenotypowa systematycznych zmutowanych kolekcji organizmów modelowych jest sprawdzonym podejściem do analizowania złożoności komórkowej. Haploidalne jednokomórkowe zielone algi Chlamydomonas reinhardtii mają zestaw genów podobny do roślin, ale oddzieliły się od roślin lądowych przed wielokrotnymi duplikacjami genomu w linii roślin lądowych2. Zasadniczo, brak duplikacji genów i głównie haploidalny cykl życiowy znacznie ułatwiają genetyczne podejścia do utraty funkcji. Jednak celowe zakłócenie genów będących przedmiotem zainteresowania jest prawie niemożliwe ze względu na brak wydajnej homologicznej integracji genomowej. Biblioteka losowych zakłóceń insercyjnych jest w trakcie budowy, w połączeniu z identyfikacją zakłóconego miejsca, co do tej pory dało zestaw 1935 zmapowanych zakłóceń reprezentujących 1562 geny3. Jednak to podejście (od którego oczekuje się, że na ogół spowoduje mutacje zerowe) nie ma zastosowania do niezbędnych genów. Mutacje wrażliwe na temperaturę (ts) można odzyskać w kluczowych genach, a najnowsze metody pozwalają na skuteczną identyfikację zmutowanego genu i zmiany sprawczej. Analiza fenotypowa w wysokiej temperaturze dostarcza natychmiastowych informacji na temat funkcji zmutowanego genu. Informowaliśmy o izolacji i charakterystyce mutacji letalnych ts w ~ 70 podstawowych genach w Chlamydomonas, koncentrując się szczególnie na genach zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego i kontrolę1,4.
Ts śmiertelne ekrany są podstawą analizy genetycznej mikroorganizmów od dziesięcioleci5,6. W zasadzie pożądaną cechą jest zbliżenie się do "nasycenia", co oznacza, że wszystkie geny zdolne do mutacji do śmiertelności są identyfikowane przez co najmniej jednego mutanta, co pozwala na pełną analizę. Jednak w praktyce kilka czynników ogranicza podejście do nasycenia. Po pierwsze, podczas gdy prawie wszystkie geny mogą być zmutowane w wyniku utraty aktywności w wysokiej temperaturze, skuteczność odzyskiwania takich mutantów waha się co najmniej o rząd wielkości7,8. W związku z tym losowy ekran zaczyna wychwytywać powtarzające się trafienia u "osób często podróżujących" na długo przed zbliżeniem się do nasycenia. Po drugie, podczas gdy mutacje ts zwykle skutkują zmniejszeniem funkcji, mogą nie być prawdziwymi wartościami zerowymi w temperaturze restrykcyjnej (i odwrotnie, często nie są w pełni funkcjonalne w temperaturze dopuszczającej). Problem ten można do pewnego stopnia rozwiązać, porównując wiele alleli; Jeśli wszystkie mają wspólny fenotyp, jest bardziej prawdopodobne, że odzwierciedla to wynik prostej inaktywacji genu. Allele wielokrotne są również bardzo pomocne w ostatecznej identyfikacji molekularnej zmiany przyczynowej1. Jednak problem "osób często podróżujących" oznacza, że wiele alleli w rzadko występujących genach może być trudne do odzyskania.
Z tych powodów rozwijamy ulepszony potok do izolowania i fenotypowego charakteryzowania mutantów ts. Do tej pory zebraliśmy ponad 3000 mutantów TS, w tym około 200 nowych mutacji cyklu komórkowego. Analiza molekularna i fenotypowa tego zbioru, który już teraz prawdopodobnie obejmuje mutacje w większości lub wszystkich szlakach niezbędnych dla komórki, powinna dostarczyć nowych spostrzeżeń i hipotez w biologii komórek roślinnych. Co ważne, rurociąg ten może być stosowany do każdego mikroorganizmu, który rośnie na agarze w celu efektywnego konstruowania zmutowanych kolekcji.
Uwaga na temat sprzętu: dwa roboty są bardzo ważne dla efektywności tej procedury (zbieracz kolonii i kombinacja repliki plater/cherry picker). Pickery zazwyczaj mają metalowe kołki. Zebrane kolonie są trzymane w powietrzu na tych kołkach przez pewien czas (od sekund do minut, w zależności od modelu). Chlamydomonas umiera w ciągu około 20 sekund na metalowej szpilce w powietrzu. Ogranicza to wybór modelu dla organizmu. Precyzja ma znaczenie. Nasz zbieracz kolonii jest dość dokładny; Jest jednak nieco gwałtowny w swoim działaniu i ma pewną możliwość zanieczyszczenia krzyżowego na bazie sprayu. Nie jest używany przy gęstości większej niż 384 (4,5 mm odstęp między środkami); Przy tej gęstości dokładność jest całkowicie akceptowalna. Replika robota do galwanizacji/zbierania wiśni (różne przystawki używane do tych zastosowań) jest znacznie wolniejszy w zbieraniu, ale jest wystarczająco dokładny dla gęstości 1,536 (6,144 jest wyzwaniem, nawet dla tego bardzo dokładnego robota; oceniliśmy tę gęstość, ale zdecydowaliśmy się jej nie używać ze względu na różne trudności). Robot nie będzie działał dobrze, jeśli talerze będą ładowane nierównomiernie itp. Ważne jest, aby sprawdzać wyrywkowo, aby upewnić się, że dzieją się właściwe rzeczy; Oczywiście robot będzie działał bez nadzoru i ogólnie rzecz biorąc, wszystko pójdzie dobrze, jeśli kilka pierwszych płyt będzie prawidłowych.

<table><tbody><tr><td>< mocny>Sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hudson RapidPick zbieracz kolonii</td><td>Hudson Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiDrop Combi Dozownik odczynników</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta z metalową końcówką w małej tubie</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Singer Replika robota galwanicznego RotoR</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Bardzo istotne dla tego procesu. W przypadku przesiewów o niższej skali można użyć własnego narzędzia ręcznego</td></tr><tr><td>Singer do zbierania pojedynczej kolonii (' Stinger')</td><td>Instrumenty</td><td></td> śpiewaka <td>Można wybierać ręcznie, jednak w przypadku dużych skal jest to prawie niemożliwe</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Zielona plama kwasu nukleinowego</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>S7020</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematyczna identyfikacja i charakterystyka zaburzeń genetycznych okazały się przydatne do rozszyfrowania funkcji genów i ścieżek komórkowych. Jednak konwencjonalne podejścia do trwałej delecji genów nie mogą być stosowane do genów podstawowych. Opracowaliśmy unikalną kolekcję ~70 wrażliwych na temperaturę (ts) śmiertelnych mutantów do badania regulacji cyklu komórkowego w jednokomórkowych zielonych algach Chlamydomonas reinhardtii1. Mutacje te identyfikują niezbędne geny, a allele ts mogą być warunkowo inaktywowane przez zmianę temperatury, dostarczając cennych narzędzi do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. Kolekcje mutantów są znacznie cenniejsze, jeśli są bliskie kompleksowości, ponieważ kolekcje rozproszone mogą pomijać ważne komponenty. Wymaga to jednak skutecznego zbierania dużej liczby mutantów, zwłaszcza na szerokim ekranie docelowym. W tym miejscu opisujemy oparty na robotyce potok do generowania śmiertelnych mutantów ts i analizy ich fenotypu u Chlamydomonas. Technikę tę można zastosować do każdego mikroorganizmu rosnącego na agarze . Zebraliśmy ponad 3000 mutantów ts, prawdopodobnie zawierających mutacje w większości lub wszystkich szlakach niezbędnych dla komórki, w tym około 200 nowych kandydujących mutacji cyklu komórkowego. Późniejsza charakterystyka molekularna i komórkowa tych mutantów powinna dostarczyć nowych informacji w biologii komórek roślinnych; Kompleksowa kolekcja mutantów jest niezbędnym warunkiem wstępnym do zapewnienia pokrycia szerokiego zakresu szlaków biologicznych. Metody te są zintegrowane z dalszymi procedurami genetycznymi i bioinformatycznymi w celu skutecznego mapowania i identyfikacji mutacji powodujących, które wykraczają poza zakres tego manuskryptu.

Przedstawiamy przyspieszony schemat izolacji mutantów temperaturosensytywnych (ts) w organizmie Chlamydomonas. Komórki są wysiewane na płytki agarowe, a krótko po szybkiej weryfikacji gęstości pojedynczych komórek pod mikroskopem, płytki są naświetlane promieniowaniem UV (Rycina 1). Typowe naświetlone kolonie są identyfikowane i przenoszone do formatu macierzowego po 10 dniach wzrostu w temperaturze dopuszczalnej (Rycina 2). Powstałe płytki w formacie 384 są łączone w macierz 1536 (Rycina 3). Na tym pierwszym etapie zbierania naświetlonych kolonii wyselekcjonowano do tej pory ok. 20 0 kolonii. Gęstość zawiesiny jest dostosowywana do planowanej dawki UV w taki sposób, aby po uwzględnieniu śmiertelności na płytkach utworzyło się od 20 do 60 kolonii ocalałych. Odpowiednio przetestowano trzy czasy ekspozycji na UV (1,5 min, 1 min i 0,5 min) oraz trzy gęstości (Tabela 1). Empirycznie czas ekspozycji 1,5 min przyniósł najwięcej mutantów ts (~ 50%), jednak zdecydowanie najwięcej kandydatów do badań nad cyklem komórkowym uzyskano przy czasie 1 min. W związku z tym kolejne rundy mutagenezy UV przeprowadzano wyłącznie z czasem 1 min. Istotnym problemem są rozbryzgi podczas wstępnego przenoszenia kolonii oraz zanieczyszczenia krzyżowe (zwłaszcza w formatach o wysokiej gęstości). Może to prowadzić do powielenia i ponownego fenotypowania tego samego mutanta. Aby zminimalizować prawdopodobieństwo takiego scenariusza, należy zadbać o zbieranie kolonii o optymalnym rozmiarze i upewnić się, że w początkowym badaniu nie przeniesiono sąsiednich kolonii.
Następnie przeprowadzono dwa sekwencyjne testy fenotypu ts (Rycina 5przeprowadzono, a około 30 mutantów ts- wyizolowano i scharakteryzowano fenotypowo za pomocą mikroskopii poklatkowej (Rycina 8). Ze względu na ukierunkowanie biologiczne na badanie cyklu komórkowego w fenotypach spełniających określone kryteria, nie dążymy do pozyskania więcej niż dwóch alleli w każdym genie docelowym. W związku z tym przeprowadzono testy komplementacji i sprzężenia genów już scharakteryzowanych, posiadających więcej niż dwa allele (Zapytanie), z nowo pozyskanymi kandydatami w celu usunięcia genów o wysokiej częstości występowania z dalszych etapów analizy (Rycina 9).
<img alt="Konfiguracja zautomatyzowanego systemu pipetowania w celu walidacji wysiewu pojedynczych komórek; wyniki mikroskopii i naświetlania promieniowaniem UV." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Równomierne rozprzestrzenianie komórek niepoddanych mutagenzie oraz mutagenza UV. (a) 384 x 2 µl Krople nanosi się na płytkę agarową za pomocą dozownika odczynników. (b) Losowo wybrane płytki są badane pod mikroskopem w celu weryfikacji gęstości pojedynczych komórek, a następnie poddawane naświetlaniu UV przez 1 minutę. Pasek skali = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Doświadczenie z hodowlą komórkową i schemat rozkładu kolonii w badaniu mikrobiologicznym." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kolonie poddane mutagenzie UV wybrane do macierzy 384-dołkowych. (a) Naświetlone promieniowaniem UV pojedyncze komórki są hodowane przez ok. 10 dni do momentu powstania widocznych kolonii. Pasek skali = 2 cm. (b) Program do analizy obrazu rozpoznaje oddzielne kolonie na podstawie określonych parametrów, a następnie za pomocą robota rozmieszcza je w płytkach 384-dołkowych. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy mikromacierzy roślinnej przedstawiający rozmieszczenie próbek eksperymentalnych w badaniu ekspresji genów." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Łączenie z matrycą 1536-dołkową. Cztery płytki w formacie 384 są łączone w jedną płytkę 1536; po wyhodowaniu są one ponownie replikowane w celu przetestowania fenotypu ts. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do analizy mikromacierzy z kamerą rejestrującą plamki DNA; obrazy załadowanej mikropłytki do detekcji." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazowanie do analizy ilościowej. (a) Płytki są umieszczane w ramce pod statywem do fotografii dokumentacyjnej, aby wszystkie płytki w serii były fotografowane przy identycznym powiększeniu i takim samym ustawieniu. (b) Pierwszy obraz przedstawia płytkę mikrotitracyjną o 1536 dołkach z czerwonymi kropkami umieszczonymi w narożnikach i punktach środkowych. Ten obraz „płytki-siatki” definiuje pozycję macierzy. (c) Przykład matrycy 1536-dołkowej po inkubacji. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat kolorymetrycznej detekcji macierzy mikropunktowej; analiza próbek białek; wizualizacja siatki punktów." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Identyfikacja fenotypu ts- za pomocą półautomatycznej analizy obrazu. Obrazy płytek są analizowane przy użyciu specjalistycznego oprogramowania MATLAB (dostępnego w materiałach uzupełniających). Obraz jest automatycznie segmentowany na macierze komórek (96, 384 lub 1536), a następnie kwantyfikowany jest sygnał w każdej komórce. Wzrost w 21 °C jest zaznaczony na niebiesko, a wzrost w 33 °C jest zaznaczony na żółto. Kolonie wykazujące znacznie silniejszy wzrost przy 21 °C w porównaniu z 33 °C (standaryzowane do ts+) są wybierane i zaznaczane czarnymi kwadratami z zieloną kropką. Wybory te można edytować ręcznie. Ostateczne wybory są przenoszone do pliku wykorzystywanego przez robota do pobierania kolonii. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zautomatyzowany system pipetowania na mikropłytkach. Konfiguracja wysokoprzepustowego przesiewu dla analiz biochemicznych." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Robotyczne wyłuskiwanie kandydatów na mutanty letalne temperaturoczułe z pierwszej rundy. Robot do selekcji kolonii (cherry-picking) postępuje zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku wygenerowanym zgodnie z opisem w kroku 2.1, aby pobrać kandydatów do nowej tablicy. Górny panel przedstawia załadowanie sterylnego pinu. Dolny panel przedstawia precyzyjne pobieranie z określonej kolonii na płytce źródłowej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ mikroskopowy do analizy próbek, wyposażony w system cyfrowej akwizycji obrazu i możliwość obserwacji na monitorze." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Przesiewy time-lapse do wstępnej selekcji fenotypów letalnych zależnych od temperatury (ts). Klony, które przeszły dwie rundy protokołu przesiewowego przedstawionego w Rysunek 5 przenosi się na płytki przy takiej gęstości komórek, aby poszczególne komórki były rozróżnialne pod mikroskopem. Do wyznaczenia pozycji, w których wykonywane są mikrofotografie po 0, 10 i 20 godzinach inkubacji w, wykorzystuje się zmodyfikowany mikroskop do dyssekcji tetrad. 33 °C. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat faz cyklu komórkowego; mikroskopia różnicowania komórek w 0, 10 i 20 godzinach; wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rycina 8: Mutanty cyklu komórkowego Chlamydomonas zidentyfikowane za pomocą mikroskopii poklatkowej. (a) Ilustracja unikalnego cyklu komórkowego Chlamydomonas opisuje długą fazę G1, charakteryzującą się wzrostem komórki, po której następują cykle podziału S-M, kończące się wykluciem nowo powstałych komórek potomnych. (b) Obrazy mikroskopowe przedstawiają komórki WT w trakcie cyklu komórkowego oraz identyfikację typowych mutantów cyklu komórkowego, które nie kończą mitozy. Pasek skali = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat testu komplementacji drożdży; wyniki barwienia kwasów nukleinowych; eksperyment z inkubacją w temperaturze 21°C–3°C." src="/files/ftp_upload/54831/54831fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rycina 9: Test komplementacji i sprzężenia. (a) odporna na antybiotyki (np. Próbkę (Hygro) z często powtarzającą się mutacją genu krzyżuje się na płytce 96-dołkowej z zestawem mutantów przeciwnego typu matingowego, które posiadają drugą kasetę oporności na antybiotyk (np. Płytki komplementacyjne dają wysoką frakcję diploidów, co wykazano poprzez barwienie kwasów nukleinowych i analizę w cytometrii przepływowej (dolny lewy panel na rys. a). (b) Mieszaninę krzyżową testuje się zarówno pod kątem komplementacji w diploidach, jak i sprzężenia w podwójnie opornych potomstwie mejotycznym. Kontrolą pozytywną jest samo zapytanie w przeciwległym typie zapłodnienia, która, zgodnie z oczekiwaniami, wykazuje fenotyp ts w 33 °Cnatomiast kontrola negatywna to szczep WT, który wykazuje fenotyp ts+. Zakreślone kolonie nie wykazują komplementacji z badanym genem, a zatem stanowią nowe allele ts- dla tego genu. Są one zazwyczaj pomijane w dalszej charakterystyce, ponieważ w zestawie testów komplementacji znajdują się jedynie tzw. „frequent flyers”. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Czas</td>
			<td >O.D.</td>
			<td >Wybrane kolonie (#)</td>
			<td >Fenotyp Ts-</td>
			<td >Kandydaci do cyklu komórkowego</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1.5’</td>
			<td >0.012</td>
			<td >60 (Śr=~20)</td>
			<td >20 (3.3%)</td>
			<td >7 (3.5%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">1’</td>
			<td rowspan="2">0.03</td>
			<td >1,0</td>
			<td rowspan="2">131 (1.19%)</td>
			<td rowspan="2">15 (1.4%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >(Śr=~360)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">0.5’</td>
			<td rowspan="2">6E-04</td>
			<td >900</td>
			<td rowspan="2">40 (0.45%)</td>
			<td rowspan="2">1 (2.5%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >(Śr=~30)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Kalibracja czasów napromieniowania w celu maksymalizacji liczby kandydatów na mutanty cyklu komórkowego. Przetestowano trzy czasy napromieniowania (po 30 płytek dla każdego), dobierając odpowiednie wartości OD, aby zapewnić liczbę przeżyłych kolonii w zakresie 20 – 600).

Wrażliwe na temperaturę (ts) śmiertelne mutanty są cennymi narzędziami do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. W tym miejscu opisujemy metody generowania i klasyfikowania letalnych mutantów ts o wysokiej przepustowości.

Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Ogólnym celem procedury jest wykorzystanie robotyki i zestandaryzowanych testów do usprawnienia izolacji temperaturaczułych mutacji letalnych w Chlamydomonas, aby określić geny i szlaki niezbędne do życia w tym organizmie. Interesuje nas zarówno konserwacja, jak i dywergencja podstawowych funkcji komórkowych u eukariontów. Sposobem, w jaki chcemy to badać, są mutacje zaburzające działanie genów niezbędnych w tych procesach.Aby ta metoda działała skutecznie, konieczna jest bardzo obszerna kolekcja mutantów, a omawiane metody stanowią nasz sposób generowania takiej kolekcji. Pracujemy na zielonej glonie Chlamydomonas reinhardtii jako reprezentancie królestwa roślin. Główną zaletą tej techniki jest to, że temperaturowrażliwe mutacje letalne można prawdopodobnie znaleźć w każdej niezbędnej ścieżce metabolicznej.Metoda ta nie wymaga wcześniejszej wiedzy ani celowej mutogenezy. Funkcja molekularna zmutowanego genu jest sugerowana bezpośrednio na podstawie fenotypu letalnego. Pomaga nam to w wyborze interesujących mutacji zaburzających różnorodne szlaki siala poza kontrolą cyklu komórkowego.Aby przeprowadzić mutagenezę UV, należy hodować komórki Chlamydomonas do uzyskania OD 750 w zakresie od 0,2 do 0,5 w 100 mililitrach pożywki Tris-Acetate-Phosphate (TAP), przy oświetleniu w temperaturze 25 °C i wytrząsaniu z prędkością 100 RPM. Mutagenezę UV przeprowadza się niezależnie w dwóch tła genetycznych zgodnie z protokołem tekstowym. Należy sprawdzić próbkę z każdej hodowli pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są żywe i nie ma kontaminacji.Następnie rozcieńcz kulturę do wartości OD 750 równej 0,003, a następnie owiń butelkę folią aluminiową, aby zapewnić jednorodną gęstość, ponieważ szczep ten jest modalny i porusza się kierunkowo w odpowiedzi na światło. Po dostosowaniu gęstości zawiesiny zgodnie z protokołem tekstowym, zamocuj małą kasetę rurek pasującą do dozownika cieczy i wykonaj serię płukań w celu sterylizacji, zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapobiec kontaminacji. Używając kasety dozownika cieczy z ośmioma strzykawkami, nanieś cztery razy po 96 kropli kultury o objętości 2 µL każda na suche płytki prostokątne.Delikatnie stuknij w krawędź płytki, aby upewnić się, że wszystkie krople połączyły się w cienką warstwę cieczy, a następnie niezwłocznie przykryj płytki, aby zapobiec ekspozycji na światło. Po wyschnięciu umieść płytki pod bakteriobójczą lampą UV na czas określony empirycznie, aby uzyskać optymalną liczbę mutantów ts wśród przeżyłych. Następnie przenieś płytki w ciemne miejsce na okres od ośmiu do 24 godzin w temperaturze pokojowej.Następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 21°C z oświetleniem. Po około 10 dniach, gdy kolonie urosną, ale nie zleją się ze sobą, załaduj płytki do odpowiedniego stosu jako źródła do robotycznego pobierania kolonii. Następnie pobierz kolonie do matryc 384 na płytkach prostokątnych i hoduj je w temperaturze 21°C z oświetleniem przez około tydzień.Za pomocą robota do przesiewania metodą replikacji przenieś zawartość macierzy 384 do macierzy 1536 i inkubuj płytki w temperaturze 21°C przez około trzy dni. Przenieś zawartość macierzy 1536 na dwie płytki każdą, umieszczając jedną w inkubatorze w temperaturze 21°C, a drugą w inkubatorze w temperaturze 33°C. Po 24 godzinach w temperaturze 33°C przenieś zawartość płytek z inkubatora 33°C na nowy zestaw wstępnie ogrzanych płytek i umieść je w inkubatorze w temperaturze 33°C.Po trzech dniach wzrostu w temperaturze 33°C i pięciu dniach wzrostu w temperaturze 21°C, należy za pomocą aparatu cyfrowego sfotografować płytkę siatkową z naniesionymi dziewięcioma wskaźnikami wyrównania. Następnie należy sfotografować płytki, naprzemiennie fotografując płytki inkubowane w 21°C, a po nich odpowiadające im płytki inkubowane w 33°C, umieszczając wszystkie płytki w stałej ramie w celu zachowania dokładnej orientacji. Pary obrazów płytek z 21°C i 33°C należy przetworzyć za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazów matte lab, aby usunąć tło i podzielić obrazy na macierz 1536.Program określi wykrytą biomasę jako całkowitą intensywność pikseli w każdej pozycji. Załaduj listę wybranych kolonii wygenerowaną przez oprogramowanie jako plik instrukcji dla robota do izolowania pojedynczych kolonii. Następnie przygotuj płytki źródłowe i docelowe zgodnie z instrukcjami robota i pozwól robotowi przenieść wybrane kolonie do tablicy.Umieść płytki docelowe w inkubatorze w temperaturze 21°C przez około pięć dni w celu wyhodowania płytki zapasowej. Po przeprowadzeniu drugiego testu akumulacji biomasy i powieleniu 100 płytek blokowych zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj trzy kopie nowej wersji 100 płytek blokowych. Po ustawieniu trzeciej płytki w robocie i naniesieniu kolonii, wykonaj mikrofotografie obszaru każdego punktu na płytkach przesiewowych w czasie zero, a następnie umieść płytki w temperaturze 33°C w celu inkubacji.W różnych odstępach czasu po wyjęciu płytek przesiewowych z inkubatora ustawionego na 33°C, szybko wykonaj mikrofotomografie, upewniając się, że uchwyt na płytkę i sterownik stolika są precyzyjnie skalibrowane, aby uzyskać obrazy tych samych komórek w każdym punkcie czasowym. Przeanalizuj obrazy mikroskopowe i wybierz mutanty na podstawie pożądanych kryteriów. Przeniesienie ostatecznego wybranego zestawu wykonaj na 96-dołkową płytkę agarową, upewniając się, że każda płytka zawiera mutanty o tym samym typie kojarzenia i oporności na leki.Przenieś duże ilości ułożonych w tablicy kolonii na pożywkę do indukcji gamet pozbawioną azotu na mikropłytki 96-dołkowe. Inkubuj płytki pod światłem przez około pięć godzin, aby umożliwić gametogenezę. Zawieś zapytania o przeciwnych typach kopulacyjnych, zawierające alternatywne kasety oporności, w probówkach z pożywką do indukcji gamet pozbawioną azotu w celu przeprowadzenia gametogenezy.Wymieszaj próbki z płyty docelowej w objętości mieszaniny kopulacyjnej wynoszącej 20 µL. Po około 10 minutach ekspozycji na światło, nanieś pięć mikrolitrów z każdej studni dwukrotnie. Raz na płytę TAP w celu przeprowadzenia testów sprzężenia, a raz na płytkę TAP z dodatkiem 5 µmol paro i 9 µmol hygro w celu przeprowadzenia testów komplementacji.Po inkubacji płyt do testów komplementacji, wykonaj replikację płyt w dwóch kopiach w celu identyfikacji fenotypu ts. Przebadaj kolonie pod kątem fenotypu ts zgodnie z protokołem tekstowym. Po napromieniowaniu pojedynczych komórek Chlamydomonas, komórki pozostawia się do wzrostu przez dziesięć dni w temperaturze dopuszczalnej, a następnie wycina się je w formacie macierzowym, jak pokazano tutaj.Otrzymane płytki w formacie 384 są łączone w macierz 1536. W celu wygenerowania mutantów ts Chlamydomonas przetestowano trzy czasy ekspozycji na UV. Empirycznie czas ekspozycji wynoszący 1,5 minuty pozwolił uzyskać najwięcej mutantów ts.Jednak zdecydowanie najwięcej kandydatów w cyklu komórkowym uzyskano przy czasie ekspozycji wynoszącym jedną minutę. W tym doświadczeniu przeprowadzono dwa sekwencyjne testy fenotypu ts, w wyniku których wyizolowano około 3000 mutantów ts i scharakteryzowano je fenotypowo za pomocą mikroskopii poklatkowej. Jak widać, aby usunąć często powtarzające się geny z dalszego etapu analizy, przeprowadzono testy komplementacji i sprzężenia nowo wyselekcjonowanych kandydatów z już scharakteryzowanymi genami posiadającymi więcej niż dwa allele.Kolonie te nie wykazują komplementacji z zapytaniem, a zatem stanowią nowe allele ts dla badanego genu. Są one zazwyczaj wykluczane z dalszej charakterystyki. Po opanowaniu tej techniki można ją stosować w wysokiej przepustowości.Tysiące mutantów ts można wyizolować w zaledwie dwóch lub trzech rundach mutagenezy. Kluczowym krokiem po izolacji mutantów ts jest wybór podgrupy do dalszych badań; bardzo interesujące jest przy tym zaobserwowanie zakresu fenotypów letalnych. Fenotypowanie dostarcza wskazówek co do funkcji molekularnej, a także pomaga w ustaleniu priorytetów wyboru mutantów do dalszych analiz.Należy pamiętać, że mutanty mogą posiadać setki lub tysiące mutacji w swoich genomach. Zazwyczaj tylko jedna z nich jest przyczynowa, choć czasami do wystąpienia fenotypu ts wymagane są dwie mutacje, co można ustalić za pomocą analizy tetra. Po przeprowadzeniu tej procedury mutacje przyczynowe można zidentyfikować za pomocą analizy sekwencjonowania następnej generacji z próbek pulowanych. Zidentyfikowane geny będą czasami posiadać mutacje sugerujące ich funkcję lub mogą to być nowe, nieznane sekwencje, co jest interesujące i ekscytujące.Chlamydomonas stanowi doskonały system modelowy do badania biologii komórki w królestwie roślin. Przedstawione procedury powinny umożliwić badanie kluczowych procesów zachodzących w tym organizmie, które pozostawały dotąd stosunkowo niepoznane, i mamy nadzieję, że uzyskane wyniki będą mieć znaczenie również dla całego królestwa roślin.

high-throughput-robotically-assisted-isolation-temperature-sensitive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Opracowaliśmy strategię oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli w różnych orientacjach, które można poddać mikroskopii superrozdzielczej i uśrednianiu pojedynczych cząstek.

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Reaktywacja in vitro ruchliwych komórek jest kluczowym eksperymentem w zrozumieniu mechanizmów ruchliwości komórek. Protokół opisuje reaktywację zdemembranowanych modeli komórkowych Chlamydomonas reinhardtii, organizmu modelowego do badania rzęsek/wici.

Reaktywacja zdemembranowanych modeli komórkowych u Chlamydomonas reinhardtii

Większość pływających organizmów fotoautotroficznych wykazuje wywołane foto zmiany zachowania (fotozachowanie). W niniejszym protokole zaobserwowano wspomniane fotozachowanie w organizmie modelowym Chlamydomonas reinhardtii.

Obserwacja fotozachowania u Chlamydomonas reinhardtii

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Poznaj metodę wysokoprzepustowej izolacji śmiertelnych mutantów wrażliwych na temperaturę u Chlamydomonas reinhardtii z użyciem robotyki. Technika ta umożliwia identyfikację genów i szlaków komórkowych niezbędnych dla życia.

Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Przeglądaj więcej filmów