Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Ogólnym celem procedury jest wykorzystanie robotyki i zestandaryzowanych testów do usprawnienia izolacji temperaturaczułych mutacji letalnych w Chlamydomonas, aby określić geny i szlaki niezbędne do życia w tym organizmie. Interesuje nas zarówno konserwacja, jak i dywergencja podstawowych funkcji komórkowych u eukariontów. Sposobem, w jaki chcemy to badać, są mutacje zaburzające działanie genów niezbędnych w tych procesach.

Aby ta metoda działała skutecznie, konieczna jest bardzo obszerna kolekcja mutantów, a omawiane metody stanowią nasz sposób generowania takiej kolekcji. Pracujemy na zielonej glonie Chlamydomonas reinhardtii jako reprezentancie królestwa roślin. Główną zaletą tej techniki jest to, że temperaturowrażliwe mutacje letalne można prawdopodobnie znaleźć w każdej niezbędnej ścieżce metabolicznej.

Metoda ta nie wymaga wcześniejszej wiedzy ani celowej mutogenezy. Funkcja molekularna zmutowanego genu jest sugerowana bezpośrednio na podstawie fenotypu letalnego. Pomaga nam to w wyborze interesujących mutacji zaburzających różnorodne szlaki siala poza kontrolą cyklu komórkowego.

Aby przeprowadzić mutagenezę UV, należy hodować komórki Chlamydomonas do uzyskania OD 750 w zakresie od 0,2 do 0,5 w 100 mililitrach pożywki Tris-Acetate-Phosphate (TAP), przy oświetleniu w temperaturze 25 °C i wytrząsaniu z prędkością 100 RPM. Mutagenezę UV przeprowadza się niezależnie w dwóch tła genetycznych zgodnie z protokołem tekstowym. Należy sprawdzić próbkę z każdej hodowli pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są żywe i nie ma kontaminacji.

Następnie rozcieńcz kulturę do wartości OD 750 równej 0,003, a następnie owiń butelkę folią aluminiową, aby zapewnić jednorodną gęstość, ponieważ szczep ten jest modalny i porusza się kierunkowo w odpowiedzi na światło. Po dostosowaniu gęstości zawiesiny zgodnie z protokołem tekstowym, zamocuj małą kasetę rurek pasującą do dozownika cieczy i wykonaj serię płukań w celu sterylizacji, zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapobiec kontaminacji. Używając kasety dozownika cieczy z ośmioma strzykawkami, nanieś cztery razy po 96 kropli kultury o objętości 2 µL każda na suche płytki prostokątne.

Delikatnie stuknij w krawędź płytki, aby upewnić się, że wszystkie krople połączyły się w cienką warstwę cieczy, a następnie niezwłocznie przykryj płytki, aby zapobiec ekspozycji na światło. Po wyschnięciu umieść płytki pod bakteriobójczą lampą UV na czas określony empirycznie, aby uzyskać optymalną liczbę mutantów ts wśród przeżyłych. Następnie przenieś płytki w ciemne miejsce na okres od ośmiu do 24 godzin w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 21°C z oświetleniem. Po około 10 dniach, gdy kolonie urosną, ale nie zleją się ze sobą, załaduj płytki do odpowiedniego stosu jako źródła do robotycznego pobierania kolonii. Następnie pobierz kolonie do matryc 384 na płytkach prostokątnych i hoduj je w temperaturze 21°C z oświetleniem przez około tydzień.

Za pomocą robota do przesiewania metodą replikacji przenieś zawartość macierzy 384 do macierzy 1536 i inkubuj płytki w temperaturze 21°C przez około trzy dni. Przenieś zawartość macierzy 1536 na dwie płytki każdą, umieszczając jedną w inkubatorze w temperaturze 21°C, a drugą w inkubatorze w temperaturze 33°C. Po 24 godzinach w temperaturze 33°C przenieś zawartość płytek z inkubatora 33°C na nowy zestaw wstępnie ogrzanych płytek i umieść je w inkubatorze w temperaturze 33°C.

Po trzech dniach wzrostu w temperaturze 33°C i pięciu dniach wzrostu w temperaturze 21°C, należy za pomocą aparatu cyfrowego sfotografować płytkę siatkową z naniesionymi dziewięcioma wskaźnikami wyrównania. Następnie należy sfotografować płytki, naprzemiennie fotografując płytki inkubowane w 21°C, a po nich odpowiadające im płytki inkubowane w 33°C, umieszczając wszystkie płytki w stałej ramie w celu zachowania dokładnej orientacji. Pary obrazów płytek z 21°C i 33°C należy przetworzyć za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazów matte lab, aby usunąć tło i podzielić obrazy na macierz 1536.

Program określi wykrytą biomasę jako całkowitą intensywność pikseli w każdej pozycji. Załaduj listę wybranych kolonii wygenerowaną przez oprogramowanie jako plik instrukcji dla robota do izolowania pojedynczych kolonii. Następnie przygotuj płytki źródłowe i docelowe zgodnie z instrukcjami robota i pozwól robotowi przenieść wybrane kolonie do tablicy.

Umieść płytki docelowe w inkubatorze w temperaturze 21°C przez około pięć dni w celu wyhodowania płytki zapasowej. Po przeprowadzeniu drugiego testu akumulacji biomasy i powieleniu 100 płytek blokowych zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj trzy kopie nowej wersji 100 płytek blokowych. Po ustawieniu trzeciej płytki w robocie i naniesieniu kolonii, wykonaj mikrofotografie obszaru każdego punktu na płytkach przesiewowych w czasie zero, a następnie umieść płytki w temperaturze 33°C w celu inkubacji.

W różnych odstępach czasu po wyjęciu płytek przesiewowych z inkubatora ustawionego na 33°C, szybko wykonaj mikrofotomografie, upewniając się, że uchwyt na płytkę i sterownik stolika są precyzyjnie skalibrowane, aby uzyskać obrazy tych samych komórek w każdym punkcie czasowym. Przeanalizuj obrazy mikroskopowe i wybierz mutanty na podstawie pożądanych kryteriów. Przeniesienie ostatecznego wybranego zestawu wykonaj na 96-dołkową płytkę agarową, upewniając się, że każda płytka zawiera mutanty o tym samym typie kojarzenia i oporności na leki.

Przenieś duże ilości ułożonych w tablicy kolonii na pożywkę do indukcji gamet pozbawioną azotu na mikropłytki 96-dołkowe. Inkubuj płytki pod światłem przez około pięć godzin, aby umożliwić gametogenezę. Zawieś zapytania o przeciwnych typach kopulacyjnych, zawierające alternatywne kasety oporności, w probówkach z pożywką do indukcji gamet pozbawioną azotu w celu przeprowadzenia gametogenezy.

Wymieszaj próbki z płyty docelowej w objętości mieszaniny kopulacyjnej wynoszącej 20 µL. Po około 10 minutach ekspozycji na światło, nanieś pięć mikrolitrów z każdej studni dwukrotnie. Raz na płytę TAP w celu przeprowadzenia testów sprzężenia, a raz na płytkę TAP z dodatkiem 5 µmol paro i 9 µmol hygro w celu przeprowadzenia testów komplementacji.

Po inkubacji płyt do testów komplementacji, wykonaj replikację płyt w dwóch kopiach w celu identyfikacji fenotypu ts. Przebadaj kolonie pod kątem fenotypu ts zgodnie z protokołem tekstowym. Po napromieniowaniu pojedynczych komórek Chlamydomonas, komórki pozostawia się do wzrostu przez dziesięć dni w temperaturze dopuszczalnej, a następnie wycina się je w formacie macierzowym, jak pokazano tutaj.

Otrzymane płytki w formacie 384 są łączone w macierz 1536. W celu wygenerowania mutantów ts Chlamydomonas przetestowano trzy czasy ekspozycji na UV. Empirycznie czas ekspozycji wynoszący 1,5 minuty pozwolił uzyskać najwięcej mutantów ts.

Jednak zdecydowanie najwięcej kandydatów w cyklu komórkowym uzyskano przy czasie ekspozycji wynoszącym jedną minutę. W tym doświadczeniu przeprowadzono dwa sekwencyjne testy fenotypu ts, w wyniku których wyizolowano około 3000 mutantów ts i scharakteryzowano je fenotypowo za pomocą mikroskopii poklatkowej. Jak widać, aby usunąć często powtarzające się geny z dalszego etapu analizy, przeprowadzono testy komplementacji i sprzężenia nowo wyselekcjonowanych kandydatów z już scharakteryzowanymi genami posiadającymi więcej niż dwa allele.

Kolonie te nie wykazują komplementacji z zapytaniem, a zatem stanowią nowe allele ts dla badanego genu. Są one zazwyczaj wykluczane z dalszej charakterystyki. Po opanowaniu tej techniki można ją stosować w wysokiej przepustowości.

Tysiące mutantów ts można wyizolować w zaledwie dwóch lub trzech rundach mutagenezy. Kluczowym krokiem po izolacji mutantów ts jest wybór podgrupy do dalszych badań; bardzo interesujące jest przy tym zaobserwowanie zakresu fenotypów letalnych. Fenotypowanie dostarcza wskazówek co do funkcji molekularnej, a także pomaga w ustaleniu priorytetów wyboru mutantów do dalszych analiz.

Należy pamiętać, że mutanty mogą posiadać setki lub tysiące mutacji w swoich genomach. Zazwyczaj tylko jedna z nich jest przyczynowa, choć czasami do wystąpienia fenotypu ts wymagane są dwie mutacje, co można ustalić za pomocą analizy tetra. Po przeprowadzeniu tej procedury mutacje przyczynowe można zidentyfikować za pomocą analizy sekwencjonowania następnej generacji z próbek pulowanych. Zidentyfikowane geny będą czasami posiadać mutacje sugerujące ich funkcję lub mogą to być nowe, nieznane sekwencje, co jest interesujące i ekscytujące.

Chlamydomonas stanowi doskonały system modelowy do badania biologii komórki w królestwie roślin. Przedstawione procedury powinny umożliwić badanie kluczowych procesów zachodzących w tym organizmie, które pozostawały dotąd stosunkowo niepoznane, i mamy nadzieję, że uzyskane wyniki będą mieć znaczenie również dla całego królestwa roślin.