Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays
December 2nd, 2016
Kwantyfikacja podziału i ekspansji komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu całej rośliny. W tym miejscu przedstawiamy protokół obliczania parametrów komórkowych określających tempo wzrostu liści kukurydzy i podkreślamy wykorzystanie tych danych do badania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez kierowanie strategiami pobierania próbek specyficznymi dla danego etapu rozwoju.
Ogólnym celem tej analizy jest określenie komórkowych podstaw wzrostu liści kukurydzy oraz wykorzystanie tych danych do zbadania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez przeprowadzenie strategii pobierania próbek specyficznych dla rozwoju. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie z zakresu biologii rozwoju roślin. W jaki sposób podział i ekspansja komórki przyczyniają się do różnic we wzroście całego narządu?
Takie podejście pozwala na badanie i mapowanie przestrzenne biochemicznych procesów molekularnych i fizjologicznych, leżących u podstaw wzrostu całego organu rośliny. Chociaż system ten może zapewnić wgląd we wzrost liści kukurydzy, technika ta może być stosowana w innych systemach. W tym inne gatunki traw i narządy.
Wizualna demonstracja tych metod ma kluczowe znaczenie. Podczas zbioru trudno jest przeprowadzić etapy biblacji próbki i pomiaru bez tego wykazania. Procedurę zademonstrują Katrien Sprangers i Viktoriya Avramova.
Dwóch doktorantów z mojego laboratorium. Aby przeprowadzić pełną analizę chenematyczną wzrostu liści u roślin jednoliściennych, należy wyhodować co najmniej 15 roślin dla każdego zabiegu i genotypu, w kontrolowanych warunkach w pomieszczeniu wzrostowym. Kiedy pojawi się interesujący liść, użyj linijki, aby zmierzyć długość liścia, czyli długość od gleby do czubka liścia, codziennie, aż liść zostanie w pełni rozwinięty.
Na interesującym nas etapie rozwoju odetnij nadziemną część rośliny od co najmniej pięciu reprezentatywnych roślin jak najbliżej korzeni, aby zachować nienaruszony obszar merystematyczny. Następnie, zaczynając od zewnętrznych liści, delikatnie rozwiń wszystkie liście aż do interesującego Cię liścia, jeden po drugim. Usuń kilka dodatkowych milimetrów od podstawy, aby w razie potrzeby oderwać liście.
Następnie usuń wierzchołek i małe liście otoczone interesującym Cię liściem i odetnij trzycentymetrowy segment od liścia, zaczynając od podstawy po jednej stronie środkowej żyły. Bardzo ważne jest, aby przyciąć liść dokładnie w miejscu, w którym jest połączony z łodygą. Ponieważ cięcie do wysokiej wartości doprowadziłoby do niedoszacowania wielkości merystema.
Przechowuj segment w 1,5 mililitrowej probówce, wypełnionej trzema dwoma absolutnym roztworem kwasu octowego etanolu o objętości objętościowej, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny do kilku miesięcy. Z drugiej strony żyły odetnij 11-centymetrowy segment od podstawy i przechowuj ten segment w 15-mililitrowej tubie wypełnionej absolutnym etanolem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej sześć godzin, aby usunąć pigmenty. Po drugim 24-godzinnym krążeniu w absolutnym etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zastąp etanol czystym kwasem mlekowym i przechowuj segment w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne 24 godziny lub do dalszej analizy.
Aby zmierzyć merystem, najpierw przenieś trzycentymetrowy segment liścia do świeżo przygotowanego bufora do płukania na 20 minut. Pod koniec inkubacji przenieś segment do pojemnika z roztworem barwiącym Dapi na dwie do pięciu minut na lodzie w ciemności. Następnie szybko zamontuj chusteczkę na szklanym szkiełku mikroskopowym i przykryj segment szkłem nakrywkowym.
Potwierdź fluorescencję komórek naskórka pod mikroskopem, używając fluorescencji UV. Następnie umieścić próbkę w kropli buforu płuczącego na nowym szkiełku mikroskopowym z nową szklaną pokrywą. Używając 20-krotnego powiększenia, zwróć segment do mikroskopu i przewiń próbkę, aby zlokalizować proliferacyjne figury mitotyczne.
Unikaj wszelkich formacyjnych podziałów komórek rozwijającej się łodygi, a następnie określ, gdzie znajduje się najbardziej dystalna figura mitotyczna. Za pomocą oprogramowania do analizy obrazu zmierz pełną długość ramki obrazu. W tym przykładzie 645 mikrometrów.
Następnie policz liczbę ramek, które pokrywają pełną długość merystemu od najbardziej dystalnej figury mitotycznej do podstawy liścia i pomnóż tę liczbę przez długość jednej ramki, aby uzyskać pełną długość merystemu. Aby uzyskać profil długości komórki, przenieś 11-centymetrowy segment z kwasu mlekowego na ławkę i za pomocą skalpela pokrój tkankę na 10 jednocentymetrowych segmentów. Zamontuj powstałe segmenty liści na pojedynczym szkiełku mikroskopowym i małej kropli kwasu mlekowego.
Ułożenie wszystkich elementów tą samą stroną do góry. A następnie przenieś szkiełko pod mikroskop wyposażony w interferencyjną optykę kontrastową różnicowo-interferencyjną. Zaczynając od segmentu znajdującego się najbliżej podstawy liścia, należy użyć odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć długość co najmniej 20 powtórzonych komórek naskórka i plików bezpośrednio przylegających do komórek macierzystych, aby zapewnić spójny wybór tego samego typu komórek w równych odstępach wzdłuż każdego z segmentów.
Weź to, aby ustawić odpowiednią pozycję dla każdego pomiaru na całym liściu. Następnie określ średnią długość komórki na każdym milimetrze wzdłuż osi liścia za pomocą lokalnej procedury wygładzania wielomianów zaimplementowanej w skrypcie języka R, który jest dostępny jako plik uzupełniający. Uważaj, aby nie wygładzić zbyt mocno.
Wygładzanie powinno usunąć szum w danych cellingu, ale nie powinno wpływać na ogólny kształt krzywej. W tym miejscu przedstawiono porównanie roślin dobrze nawodnionych z roślinami narażonymi na warunki stresu suszy pod względem wzrostu liści. Ostateczna długość liści roślin kontrolnych była o 40 procent krótsza niż w przypadku roślin narażonych na suszę, ze względu na niższy współczynnik wydłużania liści.
Tempo wydłużania się liści roślin narażonych na suszę jest o 73 procent niższe niż w przypadku dobrze nawodnionych roślin kontrolnych, ze względu na zmniejszoną produkcję komórek. Co w rybitwie jest spowodowane głównie zmniejszoną szybkością podziału komórek. Analiza kinematyczna zapewnia mapę lokalizacji strefy wzrostu liści, umożliwiając pobieranie próbek z rozdzielczością podstrefową do analizy molekularnej i biochemicznej.
Na przykład oznaczanie ilościowe MDA wzdłuż strefy wzrostu liścia kukurydzy w roślinie poddanej dobrze nawodnionej kontroli i warunkom suszy wykazuje znaczny wzrost tego produktu rozkładu lipidów w całej strefie wzrostu w odpowiedzi na warunki zatrzymywania wody. Ze względu na skracanie się liści w odpowiedzi na suszę, strefy rozwojowe nie pokrywały się w grupie kontrolnej i w roślinach zestresowanych w tym doświadczeniu. Za pomocą profilu długości komórek można jednak określić długość stref rozwojowych, co pozwala na porównanie poziomów MDA w poszczególnych strefach.
Po opanowaniu pojedyncza próbka może być przetworzona w ciągu czterech godzin, jeśli technika zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby merystem pozostał nienaruszony podczas zbioru. Po tej procedurze można zastosować inne techniki, takie jak oznaczanie parametrów molekularnych i biochemicznych, w celu zbadania ich udziału w regulacji wzrostu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo podział komórek i ekspansję komórek w rosnących liściach kukurydzy, określić wielkość różnych stref wzrostu i odpowiednio zinterpretować dane molekularne i biochemiczne. Nie zapominaj, że praca z kwasem mlekowym i octowym oraz EDTA może być niebezpieczna. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i czyszczenie mikroskopu na każdym etapie po użyciu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół ilościowego określania podziału komórek i ekspansji w liściach kukurydzy, co jest niezbędne do zrozumienia wzrostu całej rośliny. Podejście to umożliwia badanie molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez strategie pobierania próbek specyficznych dla etapu rozwojowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju roślin
- Mechanizmy wzrostu komórkowego
- Wzrost liści kukurydzy
Tło
- Zrozumienie podziału i ekspansji komórek jest niezbędne dla wzrostu roślin.
- To badanie koncentruje się na kukurydzy jako organizmie modelowym.
- Metoda ta może być stosowana do innych gatunków traw i narządów roślin.
- Uzyskane informacje mogą odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju.
Cel badania
- Określenie podstawy komórkowej wzrostu liści kukurydzy.
- Zbadanie molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu.
- Przeprowadzenie strategii pobierania próbek specyficznych dla etapu rozwojowego.
Stosowane metody
- Ilościowe określanie podziału i ekspansji komórek.
- Pobieranie próbek specyficznych dla etapu rozwojowego.
- Przestrzenne mapowanie procesów biochemicznych i fizjologicznych.
- Zastosowanie metody do różnych systemów roślinnych.
Główne wyniki
- Podział i ekspansja komórek przyczyniają się do różnic w wzroście narządów.
- Metoda zapewnia wgląd w mechanizmy wzrostu.
- Może być stosowana do innych gatunków traw i narządów roślin.
- Ułatwia zrozumienie dynamiki wzrostu całej rośliny.
Wnioski
- Protokół poprawia zrozumienie wzrostu liści kukurydzy.
- Może być dostosowany do stosowania w innych systemach roślinnych.
- Wyniki przyczyniają się do rozwoju dziedziny biologii rozwoju roślin.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Kinematic analysis quantifies cell division and expansion to link molecular data with defined cellular developmental stages, enabling targeted sampling in plant systems. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying how cellular processes drive phenotypic variation. It provides a reproducible framework for aligning biochemical measurements with spatial growth zones, improving predictive confidence in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies cellular contributions to organ growth, enabling hypothesis testing of growth regulatory mechanisms.
- Operational Value: Defines meristem length and developmental zones using DAPI staining and DIC microscopy for precise staging.
- Predictive Value: Correlates molecular changes (e.g., MDA levels) to specific cellular developmental stages, reducing ambiguity in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cell length profiles along the leaf axis using image analysis and local polynomial smoothing.
- Operational Value: Enables standardized sampling of epidermal cells at equally spaced positions for reproducible phenotypic screening.
- Scalability: Processes a single sample in four hours post-mastery, supporting medium-throughput applications in discovery biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maps developmental zones to allow zone-specific comparison of biochemical markers across conditions (e.g., well-watered vs. drought).
- Mechanistic De-risking: Isolates cellular drivers of growth differences (e.g., reduced cell division under drought) to inform target prioritization.
- Predictive Confidence: Supports data interpretation of high-spatial-resolution molecular assays by anchoring them to validated cellular stages.
Pipeline & Workflow Integration
Kinematic analysis fits within early discovery to inform lead identification by providing cellular resolution to growth phenotypes, particularly in grass species models.
- Discovery Biology: Tests hypotheses on how cell division and expansion contribute to whole-organ growth differences.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved cell length measurements to standardize compound or genotype evaluation.
- Analytics: Outputs meristem length and cell length profiles that enable statistical comparison of growth conditions.
- Translational Research: Connects molecular biomarkers (e.g., lipid peroxidation) to defined developmental zones for continuity across validation stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable method for growth zone mapping applicable across monocot systems and organs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying cellular basis of growth, increasing confidence in target hypotheses.
- Operational Value: Standardizes developmental staging via meristem length and cell length profiling, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Enables focused, stage-specific sampling to optimize resource use in molecular and biochemical studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking cellular phenotypes to molecular mechanisms, improving go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy (DIC, UV fluorescence) and image analysis for meristem and cell length measurement.
- Needs instrumentation for tissue sectioning, staining (DAPI, lactic acid), and controlled storage (ethanol-acetic acid, lactic acid solutions).
- Demands cross-team standardization of sampling protocols to ensure consistent developmental zone definition.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to non-monocot systems or organs with different growth zone sizes.
- Limited to emerged leaves with growth zones spanning several centimeters during steady-state growth, per protocol constraints.
