Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Ogólnymi celami niniejszej analizy jest określenie komórkowych podstaw wzrostu liści kukurydzy oraz wykorzystanie tych danych do zbadania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez zastosowanie strategii pobierania próbek specyficznych dla poszczególnych etapów rozwoju. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie z zakresu biologii rozwoju roślin: w jaki sposób podziały komórkowe i ekspansja komórek wpływają na różnice we wzroście całego organu?

Podejście to umożliwia badanie i mapowanie przestrzenne biochemicznych procesów molekularnych i fizjologicznych, które leżą u podstaw wzrostu całego organu roślinnego. Chociaż system ten pozwala uzyskać wgląd w wzrost liścia kukurydzy, technikę tę można zastosować w innych układach, w tym w przypadku innych gatunków traw oraz organów.

Wizualna demonstracja tych metod jest kluczowa. Etapy zbioru, bi-ablacji próbki oraz pomiarów są trudne do wykonania bez takiej prezentacji. Procedurę zaprezentują Katrien Sprangers i Viktoriya Avramova.

Dwoje doktorantów z mojego laboratorium. Aby przeprowadzić pełną analizę kinematyczną wzrostu liści u roślin jednoliściennych, należy wyhodować co najmniej 15 roślin dla każdej grupy badawczej i genotypu, w kontrolowanych warunkach w pomieszczeniu wzrostowym. Gdy pojawi się wybrany liść, należy codziennie mierzyć linijką długość liścia, czyli odległość od gleby do jego wierzchołka, aż do momentu pełnego rozwinięcia się liścia.

W interesującym nas stadium rozwojowym odetnij nadziemną część rośliny z co najmniej pięciu reprezentatywnych osobników jak najbliżej korzeni, aby zachować nienaruszoną region merystematyczny. Następnie, zaczynając od liści zewnętrznych, delikatnie rozwijaj po kolei wszystkie liście, aż do liścia docelowego. W razie potrzeby usuń kilka dodatkowych milimetrów z nasady, aby oddzielić liście.

Następnie usuń wierzchołek oraz małe liście otaczające wybrany liść, a następnie wytnij segment o długości trzech centymetrów z liścia, zaczynając od podstawy po jednej stronie nerwu głównego. Kluczowe jest przecięcie liścia dokładnie w miejscu jego połączenia z łodygą. Wycięcie segmentu zbyt wysoko doprowadziłoby do niedoszacowania wielkości merystemu.

Przechowywać odcinek w probówce o pojemności 1,5 mililitra, wypełnionej roztworem etanolu absolutnego i kwasu octowego w stosunku objętościowym 3:2:1, w temperaturze 4 °C przez okres od 24 godzin do kilku miesięcy. Z drugiej strony żyły odciąć od podstawy odcinek o długości 11 centymetrów i przechowywać go w probówce o pojemności 15 mililitrów wypełnionej etanolem absolutnym w temperaturze 4 °C przez co najmniej sześć godzin w celu usunięcia pigmentów. Po kolejnej 24-godzinnej inkubacji w etanolu absolutnym w temperaturze 4 °C, zastąpić etanol czystym kwasem mlekowym i przechowywać odcinek w temperaturze 4 °C przez kolejne 24 godziny lub do momentu przeprowadzenia dalszych analiz.

Aby zmierzyć merystem, należy najpierw przenieść trzycentymetrowy fragment liścia do świeżo przygotowanego buforu płuczącego na 20 minut. Po zakończeniu inkubacji fragment przenosi się do pojemnika z roztworem barwiącym Dapi na od dwóch do pięciu minut, w ciemności i w temperaturze 0°C. Następnie należy szybko zamocować tkankę na szklanym szkiełku przedmiotowym i przykryć fragment szkiełkiem nakrywkowym.

Potwierdź fluorescencję komórek naskórka pod mikroskopem, wykorzystując fluorescencję UV. Następnie zamocuj próbkę w kropli buforu płuczącego na nowym szkiełku przedmiotowym z nowym szkiełkiem nakrywnym. Przy 20-krotnym powiększeniu umieść preparat z powrotem pod mikroskopem i przeszukaj próbkę w celu zlokalizowania proliferujących figur mitotycznych.

Należy unikać podziałów komórkowych o charakterze formacyjnym w rozwijających się stemmatach, a następnie określić położenie najbardziej dystalnej figury mitotycznej. Przy użyciu programu do analizy obrazu należy zmierzyć pełną długość ramki obrazu. W tym przykładzie wynosi ona 645 micrometer.

Następnie należy policzyć liczbę klatek, które obejmują pełną długość merystemu, od najbardziej dystalnej figury mitotycznej do podstawy liścia, i pomnożyć tę liczbę przez długość jednej klatki, aby uzyskać całkowitą długość merystemu. Aby uzyskać profil długości komórek, należy przenieść 11-centymetrowy odcinek z kwasu mlekowego na blat laboratoryjny i za pomocą skalpela pociąć tkankę na 10 odcinków o długości jednego centymetra. Powstałe fragmenty liści należy umieścić na pojedynczym szkiełku przedmiotowym i dodać małą kroplę kwasu mlekowego.

Ułóż wszystkie fragmenty tą samą stroną do góry. Następnie przenieś preparat pod mikroskop wyposażony w optykę kontrastu interferencyjnego (DIC). Zaczynając od segmentu najbliższego nasady liścia, użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć długość co najmniej 20 powtórzeń komórek naskórka i rzędów komórek bezpośrednio sąsiadujących z rzędami stemmatalnymi, aby zapewnić spójny wybór tego samego typu komórek w równo odstępach wzdłuż każdego z segmentów.

Należy zapisać odpowiadającą pozycję dla każdego pomiaru w obrębie liścia. Następnie należy wyznaczyć średnią długość komórki dla każdego milimetra wzdłuż osi liścia, stosując procedurę lokalnego wygładzania wielomianowego zaimplementowaną w skrypcie R, który jest dostępny jako plik uzupełniający nr 1. Należy uważać, aby nie zastosować zbyt silnego wygładzenia.

Wygładzanie powinno usunąć szum w danych komórkowych, nie wpływając jednocześnie na ogólny kształt krzywej. Przedstawiono tutaj porównanie wzrostu liści roślin dobrze nawodnionych oraz roślin poddanych warunkom stresu suszy. Końcowa długość liścia roślin kontrolnych była o 40 procent niższa niż w przypadku roślin poddanych stresowi suszy, co wynikało z niższego tempa elongacji liści.

Szybkość elongacji liści roślin poddanych stresowi suszy jest o 73 procent niższa niż w przypadku dobrze nawodnionych kontroli, co wynika ze zmniejszonej produkcji komórek. Z kolei jest to spowodowane przede wszystkim obniżeniem tempa podziałów komórkowych. Analiza kinematyczna dostarcza mapy lokalizacji strefy wzrostu liścia, co umożliwia pobieranie próbek z rozdzielczością podstrefową do analiz molekularnych i biochemicznych.

Na przykład oznaczanie ilości MDA wzdłuż strefy wzrostu liścia kukurydzy u roślin poddanych kontrolnemu podlewaniu oraz warunkom suszy wykazuje znaczący wzrost tego produktu rozkładu lipidów w całej strefie wzrostu w odpowiedzi na deficyt wody. Ze względu na skrócenie liści w wyniku suszy, strefy rozwojowe w grupie kontrolnej i w roślinach poddanych stresowi w tym doświadczeniu nie były ze sobą zgodne. Jednakże, wykorzystując profil długości komórek, można określić długość stref rozwojowych, co pozwala na porównanie poziomów MDA w poszczególnych strefach.

Po opanowaniu metody, jedna próbka może zostać przetworzona w ciągu czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania techniki. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu nienaruszonego merystemu podczas jego pobierania. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak oznaczanie parametrów molekularnych i biochemicznych, aby zbadać ich udział w regulacji wzrostu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kwantyfikować podziały i rozrost komórek w rosnącym liściu kukurydzy, określać wielkość poszczególnych stref wzrostu oraz odpowiednio interpretować dane molekularne i biochemiczne. Należy pamiętać, że praca z kwasem mlekowym, octowym oraz EDTA może być niebezpieczna. Dlatego podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek oraz czyszczenie każdego etapu mikroskopu po zakończeniu pracy.