Name: Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę ilościowego określania podziału i ekspansji komórek w liściach kukurydzy Zea mays. Technika ta umożliwia badanie molekularnych mechanizmów regulujących wzrost roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez stypendium doktoranckie z Uniwersytetu w Antwerpii dla V.A.; stypendium doktoranckie od Flamandzkiej Fundacji Naukowej (FWO, 11ZI916N) dla K.S.; granty projektowe z FWO (G0D0514N); grant badawczy w ramach wspólnej działalności badawczej (GOA), "A Systems Biology Approach of Leaf Morphogenesis" od rady naukowej Uniwersytetu w Antwerpii; oraz Interuniversity Attraction Poles (IUAP VII/29, MARS), "Maize and Arabidopsis Root and Shoot Growth" (Kukurydza i rzodkiewnik pospolity) z belgijskiego Federalnego Biura Polityki Naukowej (BELSPO) do G.T.S.B. Han Asard, Bulelani L. Sizani i Hamada AbdElgawad przyczynili się do powstania filmu.

UWAGA: Poniższy protokół analizy kinematycznej jest prawidłowy wyłącznie dla liści w stanie stabilnego wzrostu. Implikuje to stałą szybkość wydłużania się liści oraz stabilne wzorce przestrzenne długości i ekspansji komórek w liściu w okresie kilku dni6.
1. Wzrost roślin i pomiary szybkości wydłużania się liści (LER)
<ol>
	<li>Wybierz liść znajdujący się w fazie wzrostu stacjonarnego (steady-state growth) oraz w interesującym nas stadium rozwojowym. 
	UWAGA: Istnieje różnica między wzrostem stacjonarnym a wzrostem powtarzalnym, który zakłada podobne wzorce przestrzenne na kolejnych liściach na tej samej osi. W wczesnych etapach wzrostu siewki kolejne liście zazwyczaj rosną coraz szybciej ze względu na zwiększający się rozmiar strefy wzrostu7. Choć w kilku wyższych pozycjach liści może występować podobny wzorzec wzrostu8, jest to faza przejściowa, która może być wpływana przez badane zabiegi. Dlatego ważne jest, aby porównywać linie i zabiegi ściśle w odniesieniu do tej samej pozycji liścia, nawet jeśli rozwija się on w innym czasie. Nawet przy stałej prędkości elongacji profil tempa wzrostu niekoniecznie jest taki sam w różnych stadiach rozwojowych. Dlatego istotne jest analizowanie liści w tym samym stadium rozwojowym8, zazwyczaj definiowanym przez liczbę dni od pojawienia się.</li>
	<li>Aby przeprowadzić pełną analizę kinematyczną wzrostu liści u jedliściennych, wyhoduj co najmniej 15 roślin dla każdego zabiegu i genotypu w kontrolowanych warunkach w pomieszczeniu do upraw.</li>
	<li>W momencie pojawienia się interesującego nas liścia (wyłaniającego się z rozety liści otaczających), zacznij codziennie mierzyć długość liścia za pomocą linijki, aż do jego pełnego rozwinięcia (Rycina 1i). Długość liścia określa się jako odległość od poziomu gleby do wierzchołka liścia. Należy uważać, aby nie złamać ani nie uszkodzić liścia, ponieważ mogłoby to zmienić jego wzrost.</li>
</ol>
<img alt="Schemat analizy wzrostu liścia; wykres długości komórek roślinnych; mikroskopia; przegląd etapów mitozy." src="/files/ftp_upload/54887/54887fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd analizy kinematycznej liści kukurydzy. Długość badanego liścia mierzy się linijką przez trzy kolejne dni, aby obliczyć tempo wydłużania liścia (LER). Następnie liść jest zbierany, a trzycentymetrowy fragment wykorzystywany do określenia wielkości merystemu. Odbywa się to poprzez pomiar długości od podstawy do najbardziej dystalnej figury mitotycznej po barwieniu DAPI. (A) Przykłady proliferacyjnych figur mitotycznych oraz (B) formatywnych figur mitotycznych. Pierwsze jedenaście centymetrów od podstawy liścia po drugiej stronie nerwu głównego służy do wycięcia dziesięciu jednocentymetrowych segmentów do pomiarów długości komórek. Pomiary te stanowią podstawę do stworzenia profilu długości komórek, który służy do określenia długości komórki dojrzałej (lmat) oraz długości komórek opuszczających merystem (ldiv). Wartości LER oraz lmat są wykorzystywane do obliczenia tempa produkcji komórek (P), natomiast ldiv i Lmer służą do obliczenia liczby komórek w merystemie (Nmer). Z kolei P i Nmer są wykorzystywane do obliczenia średniego tempa podziałów komórkowych (D), które jest odwrotnością czasu trwania cyklu komórkowego (Tc). Strzałki tego samego koloru wskazują parametry wykorzystywane do obliczenia parametru następującego po tych strzałkach. Paski skali = 40 µm. Cyfry rzymskie odnoszą się do konkretnych procedur eksperymentalnych opisanych w protokole. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Zbiór
<ol>
	<li>W interesującym etapie rozwojowym (np. w trzecim dniu po wyłonieniu) wybrać co najmniej pięć reprezentatywnych roślin z partii do przeprowadzenia analizy kinematycznej. Pozostałe rośliny mierzyć nadal, zgodnie z opisem w kroku 1.3, aby określić końcową długość liścia.</li>
	<li>Odciąć nadziemną część rośliny. Aby zachować nienaruszoną część merystematyczną, należy ciąć jak najbliżej korzeni (Ryc. 1ii).</li>
	<li>Zaczynając od liści zewnętrznych, usuwać wszystkie liście aż do liścia docelowego, delikatnie rozwijając je jeden po drugim. W razie potrzeby usunąć kilka dodatkowych milimetrów z podstawy, aby oddzielić liście. Usunąć również wierzchołek oraz małe liście zamknięte przez liść docelowy (Ryc. 1iii).</li>
	<li>Wyciąć segment o długości 3 cm, zaczynając od podstawy po jednej stronie żyłki środkowej, i przechowywać go w probówce 1,5 ml wypełnionej roztworem etanolu absolutnego i kwasu octowego w stosunku 3:1 (v:v) (UWAGA: należy stosować rękawiczki) w temperaturze 4 °C przez okres od 24 h do kilku miesięcy (Ryc. 1iv). Segment ten zostanie później wykorzystany do określenia długości merystemu.</li>
	<li>Z drugiej strony żyłki wyciąć segment o długości 11 cm od podstawy (Ryc. 1 v) i umieścić go w probówce 15 ml wypełnionej etanolem absolutnym w temperaturze 4 °C na co najmniej 6 h w celu usunięcia pigmentów (Ryc. 1 vi). 
	UWAGA: W dalszej kolejności do określenia profilu długości komórek należy wykorzystać tylko pierwsze 10 cm (patrz: Dyskusja).</li>
	<li>Wymienić etanol absolutny na kolejną rundę oczyszczania w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 h (Ryc. 1vi).</li>
	<li>Na koniec zastąpić etanol absolutny czystym kwasem mlekowym (UWAGA: należy stosować rękawiczki) w celu oczyszczenia i przechowywania w temperaturze 4 °C przez 24 h lub do czasu dalszego użycia (Ryc. 1vi).</li>
</ol>
3. Pomiary długości merystemu
<ol>
	<li>Przygotować bufor płuczący zawierający 50 mM chlorku sodu (NaCl), 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; UWAGA: należy używać rękawiczek) oraz 10 mM Tris(hydroksymetylo)aminometanu-kwasu solnego (TRIS-HCl; pH 7).</li>
	<li>Wziąć odcinek o długości 3 cm z sekcji 2.4 i namoczyć go w buforze przez 20 min (Rycina 1vii).</li>
	<li>W czasie oczekiwania przygotować z buforu płuczącego roztwór barwiący 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) o stężeniu 1 µg/ml, przechowując go w lodzie i w ciemności.</li>
	<li>Zabarwić jądra komórkowe, umieszczając odcinek merystemu w roztworze barwiącym DAPI na 2-5 min. Pracować w lodzie i w ciemności (Rycina 1vii).</li>
	<li>Sprawdzić sygnał fluorescencyjny, szybko montując odcinek na szkiełku przedmiotowym i przykrywając go szkiełkiem nakrywnym. Komórki epidermy powinny wykazywać fluorescencję, natomiast leżące poniżej warstwy komórek nie powinny.</li>
	<li>Jeśli barwienie jest niewystarczające, umieścić odcinek ponownie w roztworze barwiącym DAPI na kilka dodatkowych minut.</li>
	<li>Aby zatrzymać barwienie, zamontować odcinki w kropli buforu płuczącego na szkiełku przedmiotowym i przykryć szkiełkiem nakrywnym.</li>
	<li>Użyć mikroskopu wyposażonego w fluorescencję UV przy powiększeniu 20X, co pozwala na jednoczesną wizualizację około 1 000 komórek epidermy. Przeskanować cały odcinek w poszukiwaniu proliferacyjnych figur mitotycznych (metafaza, anafaza, telofaza i cytokineza), unikając przy tym formatywnych podziałów komórkowych rozwijających się szparek (Rycina 1viii)9. Określić położenie najbardziej dystalnej figury mitotycznej.</li>
	<li>Wyznaczyć długość merystemu, mierząc odległość między podstawą liścia a najbardziej dystalną figurą mitotyczną epidermy. Użyć oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ), aby zmierzyć pełną długość pola widzenia obrazu.
	<ol>
		<li>Policzyć liczbę pól widzenia, które pokrywają pełną długość merystemu (od podstawy liścia do najbardziej dystalnej figury mitotycznej) i pomnożyć tę liczbę przez długość jednego pola widzenia, aby uzyskać całkowitą długość merystemu (Rycina 1ix).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Profil długości komórek
<ol>
	<li>Nabrać fragment przechowywany w kwasie mlekowym (krok 2.5) i ostrożnie położyć go na blacie. Za pomocą skalpela pociąć fragmenty na 10 odcinków o długości 1 cm każdy (Rycyna 1x).</li>
	<li>Zamontować kolejne fragmenty liścia na szkiełku przedmiotowym w małej kropli kwasu mlekowego. Należy upewnić się, że każdorazowo stroną skierowaną do góry jest strona adaksjalna lub abaksjalna. Co do zasady nie ma preferencji co do wyboru konkretnej strony.</li>
	<li>Użyć mikroskopu wyposażonego w optykę kontrastu interferencyjnego (DIC), aby przeanalizować fragmenty, zaczynając od nasady liścia. Za pomocą oprogramowania do analizy obrazu zmierzyć długość co najmniej 20 powielonych komórek epidermalnych w rzędach bezpośrednio sąsiadujących z rzędami szpारकowymi, aby zapewnić spójny wybór tego samego typu komórek.
	<ol>
		<li>Wykonamy to w równomiernie rozmieszczonych pozycjach wzdłuż każdego z fragmentów (wystarczy 4 pozycje na fragment) i należy pamiętać o zapisaniu odpowiadającej pozycji dla każdego pomiaru w obrębie liścia (Rycyna 1xi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczyć średnią długość komórek na każdym mm wzdłuż osi liścia, stosując procedurę lokalnego wygładzania wielomianowego zaimplementowaną w skrypcie R (Rycyna 1xii; Plik uzupełniający 1). 
	UWAGA: Skrypt R dostarcza serię danych z rosnącym stopniem wygładzania. Wymagany stopień wygładzania jest w pewnym stopniu arbitralny i idealnie powinien jedynie usuwać lokalny szum, nie wpływając na ogólny kształt krzywej. Należy upewnić się, że zastosowano ten sam stopień wygładzania dla wszystkich próbek w ramach jednego eksperymentu.</li>
	<li>Obliczyć średnią długość komórek w każdej pozycji pomiędzy roślinami i wyznaczyć błąd standardowy, aby stworzyć profil długości komórek wzdłuż osi liścia.</li>
</ol>
5. Obliczenia parametrów kinematycznych (Patrz plik uzupełniający 2)
<ol>
	<li>Oblicz LER, wyznaczając zmianę długości liścia między dwoma kolejnymi punktami czasowymi (np. 24 hr, jak w kroku 1.3) i dzieląc ją przez przedział czasowy.</li>
	<li>Oblicz długość strefy wzrostu (Lgz) odpowiadającą pozycji dystalnej względem podstawy, w której komórki osiągają 95% swojej dojrzałej długości na wygładzonym profilu długości komórek.
	<ol>
		<li>Dla każdej pozycji na wygładzonym profilu długości komórek wyznacz 95% średniej wszystkich długości komórek następujących po tej pozycji (Rysunek 2).</li>
		<li>Porównaj wygładzone długości komórek (krok 4.4) z obliczoną wartością 95% długości komórki dla każdej pozycji. Począwszy od podstawy liścia, strefa wzrostu kończy się w pozycji, w której rzeczywista długość komórki jest równa 95% długości komórek następnych (Rysunek 2; patrz Supplementary Data 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Analiza wzrostu komórek; wykres długości komórek względem odległości od liścia, schemat stref wzrostu; badanie roślin." src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyznaczanie końca strefy wzrostu. Merystem: W pozycji zaznaczonej czerwoną gwiazdką rzeczywisty rozmiar komórki jest mniejszy niż 95% (czerwona przerywana linia) średniego rozmiaru wszystkich komórek znajdujących się za tą pozycją (czerwona linia ciągła). Koniec strefy wzrostu (Lgz; zaznaczony niebieską gwiazdką) znajduje się w miejscu, gdzie 95% (niebieska linia przerywana) średniego rozmiaru wszystkich komórek znajdujących się za tą pozycją (niebieska linia ciągła) jest równe rzeczywistemu rozmiarowi komórki. Strefa podziałów (D), strefa elongacji (E) i strefa dojrzała (M). Przerywane strzałki wskazują zbieżność między rozmiarem lokalnym a 95% średniego rozmiaru w części dystalnej liścia podczas przemieszczania się z pozycji bazalnych w stronę wierzchołka liścia. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="3">
	<li>Oblicz długość strefy elongacji (Lel) jako różnicę między długością strefy wzrostu (Lgz) a rozmiarem merystemu (Lmer; wyznaczonym w kroku 3).</li>
	<li>Oblicz długość dojrzałej komórki (lmat) jako średnią długość komórek w strefie dojrzałej.</li>
	<li>Podziel LER przez lmat, aby uzyskać tempo produkcji komórek (P).</li>
	<li>Oblicz liczbę komórek w strefie elongacji (Nel) jako różnicę między Ngz a Nmer. Liczba komórek w merystemie (Nmer) odpowiada skumulowanej liczbie komórek znajdujących się w przedziałach odpowiadających merystemowi. Liczba komórek w strefie wzrostu (Ngz) odpowiada skumulowanej liczbie komórek znajdujących się w przedziałach odpowiadających strefie wzrostu.</li>
	<li>Oblicz średnie tempo podziałów komórkowych (D) jako P/Nmer. Czas trwania cyklu komórkowego (Tc) wynosi ln(2)/D.</li>
	<li>Oblicz czas przebywania w strefie elongacji (Tel), dzieląc Nel przez P. Czas w strefie podziałów wynosi log2(Nmer)*Tc. Długość komórek opuszczających merystem (ldiv) odpowiada długości komórki z wygładzonego profilu długości komórek na końcu merystemu.</li>
	<li>Oblicz średnie tempo ekspansji komórek (Rel) korzystając z następującego wzoru: ln(lmat)-ln(ldiv)]/Tel.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pełna analiza kinematyczna liści kukurydzy umożliwia określenie komórkowych podstaw wzrostu liści i pozwala na zaprojektowanie skutecznych strategii pobierania próbek. Chociaż protokół jest stosunkowo prosty, zaleca się pewną ostrożność w następujących krytycznych krokach: (1) Ważne jest, aby oderwać młodsze, zamknięte liście (krok 2.3) bez uszkodzenia merystemu, ponieważ określenie długości merystemu (krok 3) wymaga obecności całego merystemu. Może być potrzebna wcześniejsza praktyka. (2) Wyznaczanie długości merystemat...

Analiza wzrostu opiera się na zestawie narzędzi powszechnie stosowanych przez naukowców zajmujących się roślinami w celu opisania różnic w wzroście uwarunkowanych genotypowo i/lub odpowiedzi fenotypowych na czynniki środowiskowe. Obejmują one pomiary rozmiaru i masy całej rośliny lub konkretnego organu oraz obliczenia tempa wzrostu, aby zbadać mechanizmy leżące u podłoża wzrostu. Wzrost organu jest determinowany przez podziały i ekspansję komórek na poziomie komórkowym. Dlatego uwzględnienie ilościowego pomiaru tych dwóch procesów w analizach wzrostu jest kluczowe dla zrozumienia różnic w wzroście całych organów1. W związku z tym niezbędne jest opracowanie odpowiedniej metodologii wyznaczania parametrów wzrostu komórkowego, która byłaby stosunkowo łatwa w użyciu dla laboratoriów niespecjalistycznych.
Analiza kinetyczna została już ustanowiona jako podejście zapewniające potężne ramy dla rozwoju modeli wzrostu organów2. Technika ta została zoptymalizowana dla układów liniowych, takich jak korzenie Arabidopsis thaliana i liście roślin jedliściennych, ale także dla układów nieliniowych, takich jak liście roślin dwuliściennych3. Obecnie metodologia ta jest coraz częściej wykorzystywana do badania, w jaki sposób czynniki genetyczne, hormonalne, rozwojowe i środowiskowe wpływają na podziały i ekspansję komórek w różnych organach (Tabela 1). Ponadto zapewnia ona ramy pozwalające powiązać procesy komórkowe z ich podstawowymi regulacjami biochemicznymi, molekularnymi i fizjologicznymi (Tabela 2), choć ograniczenia mogą wynikać z rozmiaru organu i organizacji przestrzennej w przypadku technik wymagających większej ilości materiału roślinnego (np. pomiary metabolitów, proteomika, itp.).
Liście roślin jednoszkiełkowych, takie jak liść kukurydzy (Zea mays), stanowią układy linearne, w których komórki przemieszczają się od podstawy liścia w kierunku jego wierzchołka, przechodząc sekwencyjnie przez merystem i strefę elongacji, aż do strefy dojrzałej. Dzięki temu jest to idealny system modelowy do ilościowych badań przestrzennych wzorców wzrostu4. Co więcej, liście kukurydzy posiadają rozległe strefy wzrostu (merystem i strefa elongacji rozciągające się na kilka centymetrów5), co stwarza możliwości prowadzenia badań na innych poziomach organizacji. Pozwala to na badanie (domniemanych) mechanizmów regulacyjnych kontrolujących podziały i ekspansję komórek, ilościowo określonych za pomocą analizy kinematycznej z wykorzystaniem szeregu technik molekularnych, pomiarów fizjologicznych oraz metod biologii komórki (Tabela 2).
W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przeprowadzania analizy kinematycznej w liściach roślin jednoliściennych. Po pierwsze, wyjaśniamy, jak przeprowadzić właściwą analizę podziałów komórkowych oraz elongacji komórek w zależności od położenia wzdłuż osi liścia i jak obliczyć parametry kinematyczne. Po drugie, pokazujemy, w jaki sposób analiza ta może posłużyć jako podstawa do zaprojektowania schematu pobierania próbek. Omówiono tutaj dwa przypadki: pobieranie próbek o wysokiej rozdzielczości oraz pobieranie próbek celowanych, co pozwala odpowiednio na lepszą interpretację danych lub oszczędność czasu i środków.
Tabela 1. Przegląd metod analizy kinematycznej do kwantyfikacji podziałów i ekspansji komórek w różnych organach.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>organ</td>
			<td>bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liście jedliścienne</td>
			<td>16, 20, 21, 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wierzchołki korzeni</td>
			<td>2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liście dwudzielcowe</td>
			<td>21, 30, 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>merystem wierzchołkowy pędu</td>
			<td>32</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przegląd metod analizy kinematycznej służących do ilościowego określania podziału i rozrostu komórek w różnych organach.
<img alt="Tabela analizy kinetycznej procesów komórkowych, ekspresji genów, proteomu, metabolitów, aktywności enzymatycznej." src="/files/ftp_upload/54887/54887table2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3">
Tabela 2. Związek między procesami komórkowymi ilościowo określonymi za pomocą analizy kinematycznej a ich regulacją na poziomie molekularnym.Odesłania do różnych badań łączących ilościowe określanie procesów komórkowych z wynikami testów biochemicznych i molekularnych u różnych gatunków i w różnych organach. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), malondialdehyde (MDA), cyclin-dependent kinases (CDK). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.</a>

<table><tbody><tr><td>Doniczki</td><td>Dowolne</td><td>Używamy</td><td>doniczek o następujących wymiarach, ale mogą się różnić w zależności od zabiegu/badania: średnica dna: 11 cm, średnica otworu: 15 cm, wysokość: 12 cm. Uprawiamy jedną roślinę kukurydzy w doniczce.</td></tr><tr><td>Podłoże do sadzenia</td><td>Dowolne</td><td>Używamy</td><td>podłoża doniczkowego (Jiffy, Holandia), ale można użyć innych substratów, w zależności od zabiegu/badania.</td></tr><tr><td>Linijka</td><td></td><td>Dowolna Dowolna</td><td>Linijka przedłużająca, która obejmuje co najmniej 1,5 metra, jest potrzebna do zmierzenia końcowej długości liści roślin.</td></tr><tr><td>Nasiona</td><td>Dowolne</td><td></td><td>nasiona NA można zamówić u hodowcy.</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>dowolny</td><td></td><td>Skalpel jest używany podczas zbioru liści w celu oddzielenia interesującego liścia od otaczających go liści i zaraz po zbiorach do wycięcia odpowiedniej próbki do pomiaru długości komórek i długości merystemu.</td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 ml</td><td>Dowolne</td><td></td><td>Probówki Falcon o pojemności 15 ml służą do przechowywania próbek używanych do pomiarów długości komórek podczas oczyszczania próbki za pomocą bezwzględnego etanolu i kwasu mlekowego.</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Dowolne</td><td>Dowolne</td><td>Probówki Eppendorfa służą do przechowywania próbek używanych do pomiaru długości merystemów w roztworze etanolu:kwasu octowego 3:1 (v:v).</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td>Dowolne</td><td>rękawice lateksowe, które chronią przed odczynnikami.</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td>UWAGA: Działa żrąco na metale, kategoria 1 Działanie na skórę, kategorie 1A,1B,1C Poważne uszkodzenie oczu, kategoria 1; Ciecze łatwopalne, kategorie 1,2,3</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Dowolny</td><td>OSTRZEŻENIE</td><td>: Stwarza zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), kontaktu z oczami (działanie drażniące), lub wdychania. Lekko niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą (przenikacz), spożycia</td></tr><tr><td>Kwas mlekowy&nbsp; >98%</td><td>Dowolne</td>: <td>Dowolna</td><td>UWAGA: Działa żrąco na metale, kategoria 1 Działanie na skórę, kategorie 1A,1B,1C Poważne uszkodzenie oczu, kategoria 1</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Dowolna</td><td>Kwas</td><td></td></tr><tr><td>etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td></td><td>Dowolny OSTRZEŻENIE</td><td>: Toksyczność ostra (doustna, skórna, wziewna), kategoria 4 Działanie drażniące na skórę, kategoria 2 Działanie drażniące na oczy, kategoria 2 Działanie uczulające na skórę, kategoria 1 Działanie toksyczne na narządy docelowe &ndash; Jednorazowe narażenie, kategoria 3</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl)</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Ten materiał może działać drażniąco, należy unikać kontaktu z oczami i skórą. Wdychanie pyłu może działać drażniąco na drogi oddechowe.</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek 4&-prime;,6-diamidyno-2&prime;-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Dowolna</td><td></td><td>przepuszczalna dla komórek fluorescencyjna sonda do wiązania rowków dla DNA. Działa drażniąco na skórę. Może powodować reakcję alergiczną skóry. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.</td></tr><tr><td>Lód</td><td>Dowolny</td><td>NA</td><td>Roztwór DAPI musi być przechowywany na lodzie.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 firmy Zeiss lub inny</td><td></td><td>Do określenia długości merystemów można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkło nakrywkowe</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pęseta</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Pęseta jest potrzebna do rozłożenia zwijanego liścia kukurydzy zaraz po zbiorach w celu wycięcia odpowiedniej próbki do pomiaru długości komórek i długości merystemu.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Axiovision (wydanie 4.8) firmy Zeiss</td><td>NA</td><td>Oprogramowanie można pobrać ze strony: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Można również użyć innego oprogramowania, takiego jak ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).</td></tr><tr><td>Mikroskop wyposażony w DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 firmy Zeiss lub inny</td><td></td><td>Do pomiaru długości komórek można użyć dowolnego mikroskopu wyposażonego w różnicowy kontrast interferencyjny (DIC).</td></tr><tr><td>R oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open source; Można pobrać ze strony https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>R SCRIPT</td><td>NA</td><td>NA Używamy</td><td>funkcji wygładzania jądra locpoly z pakietu Kern Smooth (Wand MP, Jones MC.&nbsp; Wygładzanie jądra: Chapman & Hall/CRC (1995)). Skrypt jest dostępny dla komputerów Mac i Windows po zapytaniu u odpowiedniego autora.</td></tr></tbody></table>

analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach zea mays

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Analizy wzrostu są często używane w nauce o roślinach do badania kontrastujących genotypów i wpływu warunków środowiskowych. Aspekt komórkowy tych analiz ma kluczowe znaczenie, ponieważ wzrost jest napędzany przez podział i wydłużanie komórek. Analiza kinematyczna stanowi metodologię ilościowego określania tych dwóch procesów. Co więcej, technika ta jest łatwa w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach. W niniejszej pracy przedstawiono protokół przeprowadzania analizy kinematycznej w liściach kukurydzy jednoliściennej (Zea mays). Przedstawiono dwa aspekty: (1) kwantyfikację parametrów podziału i ekspansji komórek oraz (2) określenie lokalizacji stref rozwojowych. Może to służyć jako podstawa do projektowania próbek i/lub może być przydatne do interpretacji danych z pomiarów biochemicznych i molekularnych z wysoką rozdzielczością przestrzenną w strefie wzrostu liści. Strefa wzrostu liści kukurydzy jest zbierana w stanie ustalonym. Poszczególne liście są używane do oznaczania długości merystemów za pomocą barwienia DAPI, a profile długości komórek za pomocą mikroskopii DIC. Protokół jest odpowiedni dla pojawiających się liści jednoliściennych zbieranych w stanie ustalonym, ze strefami wzrostu rozciągającymi się na co najmniej kilka centymetrów. Aby lepiej zrozumieć regulację wzrostu roślin, należy połączyć dane dotyczące wzrostu i badania molekularne. Dlatego istotną zaletą analizy kinematycznej jest możliwość skorelowania zmian na poziomie molekularnym z dobrze zdefiniowanymi etapami rozwoju komórkowego. Co więcej, pozwala na bardziej skoncentrowane próbkowanie określonych etapów rozwoju, co jest przydatne w przypadku ograniczonego budżetu lub czasu.

Poniżej przedstawiono porównanie roślin podlewanych odpowiednio (kontrola, zawartość wody w glebie 54% (SWC)) i roślin poddanych stresowi suszy (susza, 34% SWC) pod względem wzrostu liści. Wszystkie rośliny uprawiano w komorze wzrostu w warunkach kontrolowanych (16 godz. dnia/8 godz. nocy, 25 °C/18 °C dzień/noc, 300–400 µEm-2sec-1 promieniowanie fotosyntetycznie czynne (PAR)). Warunki suszy wprowadzono poprzez zaprzestanie podlewania aż do osiągnięcia odpowiedniej za...

Kwantyfikacja podziału i ekspansji komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu całej rośliny. W tym miejscu przedstawiamy protokół obliczania parametrów komórkowych określających tempo wzrostu liści kukurydzy i podkreślamy wykorzystanie tych danych do badania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez kierowanie strategiami pobierania próbek specyficznymi dla danego etapu rozwoju.

Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Ogólnymi celami niniejszej analizy jest określenie komórkowych podstaw wzrostu liści kukurydzy oraz wykorzystanie tych danych do zbadania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez zastosowanie strategii pobierania próbek specyficznych dla poszczególnych etapów rozwoju. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie z zakresu biologii rozwoju roślin: w jaki sposób podziały komórkowe i ekspansja komórek wpływają na różnice we wzroście całego organu?Podejście to umożliwia badanie i mapowanie przestrzenne biochemicznych procesów molekularnych i fizjologicznych, które leżą u podstaw wzrostu całego organu roślinnego. Chociaż system ten pozwala uzyskać wgląd w wzrost liścia kukurydzy, technikę tę można zastosować w innych układach, w tym w przypadku innych gatunków traw oraz organów.Wizualna demonstracja tych metod jest kluczowa. Etapy zbioru, bi-ablacji próbki oraz pomiarów są trudne do wykonania bez takiej prezentacji. Procedurę zaprezentują Katrien Sprangers i Viktoriya Avramova.Dwoje doktorantów z mojego laboratorium. Aby przeprowadzić pełną analizę kinematyczną wzrostu liści u roślin jednoliściennych, należy wyhodować co najmniej 15 roślin dla każdej grupy badawczej i genotypu, w kontrolowanych warunkach w pomieszczeniu wzrostowym. Gdy pojawi się wybrany liść, należy codziennie mierzyć linijką długość liścia, czyli odległość od gleby do jego wierzchołka, aż do momentu pełnego rozwinięcia się liścia.W interesującym nas stadium rozwojowym odetnij nadziemną część rośliny z co najmniej pięciu reprezentatywnych osobników jak najbliżej korzeni, aby zachować nienaruszoną region merystematyczny. Następnie, zaczynając od liści zewnętrznych, delikatnie rozwijaj po kolei wszystkie liście, aż do liścia docelowego. W razie potrzeby usuń kilka dodatkowych milimetrów z nasady, aby oddzielić liście.Następnie usuń wierzchołek oraz małe liście otaczające wybrany liść, a następnie wytnij segment o długości trzech centymetrów z liścia, zaczynając od podstawy po jednej stronie nerwu głównego. Kluczowe jest przecięcie liścia dokładnie w miejscu jego połączenia z łodygą. Wycięcie segmentu zbyt wysoko doprowadziłoby do niedoszacowania wielkości merystemu.Przechowywać odcinek w probówce o pojemności 1,5 mililitra, wypełnionej roztworem etanolu absolutnego i kwasu octowego w stosunku objętościowym 3:2:1, w temperaturze 4 °C przez okres od 24 godzin do kilku miesięcy. Z drugiej strony żyły odciąć od podstawy odcinek o długości 11 centymetrów i przechowywać go w probówce o pojemności 15 mililitrów wypełnionej etanolem absolutnym w temperaturze 4 °C przez co najmniej sześć godzin w celu usunięcia pigmentów. Po kolejnej 24-godzinnej inkubacji w etanolu absolutnym w temperaturze 4 °C, zastąpić etanol czystym kwasem mlekowym i przechowywać odcinek w temperaturze 4 °C przez kolejne 24 godziny lub do momentu przeprowadzenia dalszych analiz.Aby zmierzyć merystem, należy najpierw przenieść trzycentymetrowy fragment liścia do świeżo przygotowanego buforu płuczącego na 20 minut. Po zakończeniu inkubacji fragment przenosi się do pojemnika z roztworem barwiącym Dapi na od dwóch do pięciu minut, w ciemności i w temperaturze 0°C. Następnie należy szybko zamocować tkankę na szklanym szkiełku przedmiotowym i przykryć fragment szkiełkiem nakrywkowym.Potwierdź fluorescencję komórek naskórka pod mikroskopem, wykorzystując fluorescencję UV. Następnie zamocuj próbkę w kropli buforu płuczącego na nowym szkiełku przedmiotowym z nowym szkiełkiem nakrywnym. Przy 20-krotnym powiększeniu umieść preparat z powrotem pod mikroskopem i przeszukaj próbkę w celu zlokalizowania proliferujących figur mitotycznych.Należy unikać podziałów komórkowych o charakterze formacyjnym w rozwijających się stemmatach, a następnie określić położenie najbardziej dystalnej figury mitotycznej. Przy użyciu programu do analizy obrazu należy zmierzyć pełną długość ramki obrazu. W tym przykładzie wynosi ona 645 micrometer.Następnie należy policzyć liczbę klatek, które obejmują pełną długość merystemu, od najbardziej dystalnej figury mitotycznej do podstawy liścia, i pomnożyć tę liczbę przez długość jednej klatki, aby uzyskać całkowitą długość merystemu. Aby uzyskać profil długości komórek, należy przenieść 11-centymetrowy odcinek z kwasu mlekowego na blat laboratoryjny i za pomocą skalpela pociąć tkankę na 10 odcinków o długości jednego centymetra. Powstałe fragmenty liści należy umieścić na pojedynczym szkiełku przedmiotowym i dodać małą kroplę kwasu mlekowego.Ułóż wszystkie fragmenty tą samą stroną do góry. Następnie przenieś preparat pod mikroskop wyposażony w optykę kontrastu interferencyjnego (DIC). Zaczynając od segmentu najbliższego nasady liścia, użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć długość co najmniej 20 powtórzeń komórek naskórka i rzędów komórek bezpośrednio sąsiadujących z rzędami stemmatalnymi, aby zapewnić spójny wybór tego samego typu komórek w równo odstępach wzdłuż każdego z segmentów.Należy zapisać odpowiadającą pozycję dla każdego pomiaru w obrębie liścia. Następnie należy wyznaczyć średnią długość komórki dla każdego milimetra wzdłuż osi liścia, stosując procedurę lokalnego wygładzania wielomianowego zaimplementowaną w skrypcie R, który jest dostępny jako plik uzupełniający nr 1. Należy uważać, aby nie zastosować zbyt silnego wygładzenia.Wygładzanie powinno usunąć szum w danych komórkowych, nie wpływając jednocześnie na ogólny kształt krzywej. Przedstawiono tutaj porównanie wzrostu liści roślin dobrze nawodnionych oraz roślin poddanych warunkom stresu suszy. Końcowa długość liścia roślin kontrolnych była o 40 procent niższa niż w przypadku roślin poddanych stresowi suszy, co wynikało z niższego tempa elongacji liści.Szybkość elongacji liści roślin poddanych stresowi suszy jest o 73 procent niższa niż w przypadku dobrze nawodnionych kontroli, co wynika ze zmniejszonej produkcji komórek. Z kolei jest to spowodowane przede wszystkim obniżeniem tempa podziałów komórkowych. Analiza kinematyczna dostarcza mapy lokalizacji strefy wzrostu liścia, co umożliwia pobieranie próbek z rozdzielczością podstrefową do analiz molekularnych i biochemicznych.Na przykład oznaczanie ilości MDA wzdłuż strefy wzrostu liścia kukurydzy u roślin poddanych kontrolnemu podlewaniu oraz warunkom suszy wykazuje znaczący wzrost tego produktu rozkładu lipidów w całej strefie wzrostu w odpowiedzi na deficyt wody. Ze względu na skrócenie liści w wyniku suszy, strefy rozwojowe w grupie kontrolnej i w roślinach poddanych stresowi w tym doświadczeniu nie były ze sobą zgodne. Jednakże, wykorzystując profil długości komórek, można określić długość stref rozwojowych, co pozwala na porównanie poziomów MDA w poszczególnych strefach.Po opanowaniu metody, jedna próbka może zostać przetworzona w ciągu czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania techniki. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu nienaruszonego merystemu podczas jego pobierania. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak oznaczanie parametrów molekularnych i biochemicznych, aby zbadać ich udział w regulacji wzrostu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kwantyfikować podziały i rozrost komórek w rosnącym liściu kukurydzy, określać wielkość poszczególnych stref wzrostu oraz odpowiednio interpretować dane molekularne i biochemiczne. Należy pamiętać, że praca z kwasem mlekowym, octowym oraz EDTA może być niebezpieczna. Dlatego podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek oraz czyszczenie każdego etapu mikroskopu po zakończeniu pracy.

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę ilościowego określania podziału i ekspansji komórek w liściach kukurydzy Zea mays. Technika ta umożliwia badanie molekularnych mechanizmów regulujących wzrost roślin.

Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays (Wideo) | JoVE Journal

Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Przeglądaj więcej filmów