Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego
September 22nd, 2023
Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.
Trawy, takie jak kukurydza, mają zawiązki liści zwinięte w pędach, co utrudnia ich badanie. Rozwiązujemy ten problem za pomocą ulepszonych protokołów przygotowania odcinków transferu liści kukurydzy oraz hormonów do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. W pierwszym protokole wykorzystuje się urządzenie do wycinania starszych liści za pomocą urządzenia do malowania pasów, co pozwala na pomiar zawiązków przed cięciem.
Drugi protokół wykorzystuje przezroczystą dwustronną nanotaśmę do rozwijania zawiązków całych liści. Protokoły te poprawiają dokładność przekroju poprzecznego i umożliwiają rozwijanie zawiązków liści, co było bardzo trudne do osiągnięcia ze względu na stożkowatą morfologię zwiniętego. Metody te będą przydatne do wizualizacji i ilościowego określania cech anatomicznych i rozwojowych liści kukurydzy i innych traw.
W oparciu o te metody planujemy opracować strategie obrazowania stylu życia, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rozwoju liści trawy. Zacznij od pokrojenia pożądanej dojrzałej sadzonki kukurydzy w tkance mezokotylu za pomocą małego noża lub nożyczek. Oczyść sadzonkę pędzlem.
Następnie przytrzymaj ściągacz izolacji szczękami skierowanymi w stronę rynny. Umieść rynnę w wybranym otworze i ściśnij uchwyty zdzieraku. Odsuń ściągacz od zsypu, aby przyciąć górną część liści.
Użyj linijki, aby zmierzyć długość od czubka zawiązka do podstawy zsypu. Aby rozpocząć obrazowanie zawiązka liścia, trzymaj rynnę stabilnie na gładkiej powierzchni pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 0,8x. Za pomocą żyletki lub skalpela wykonaj wstępne cięcie nieco powyżej obszaru docelowego, aby wyrzucić dystalną część rynny.
Następnie uzyskaj około 0,25 do 0,8 milimetra cienkich odcinków w pożądanych punktach na całej długości zawiązków. Po zakończeniu zamontuj część skrzydła na czystym szkiełku podstawowym. Nanieś kilka kropel wody bezpośrednio na sekcję za pomocą pipety i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
W razie potrzeby nałóż jeszcze kilka kropli przez krawędzie szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego i dostosuj ustawienia, aby uwidocznić fluorofor. Stosując tę metodę, próbkowanie przekroju poprzecznego zostało ustandaryzowane poprzez pomiar zawiązków przed przekrojem.
Odkryto trend pokazujący, że znikający frędzel drugi miał szersze zawiązki i więcej żyłek niż normalnie, co wskazuje, że wada mutanta rozpoczęła się wcześnie w rozwoju liścia. Metoda ta umożliwiła również systematyczne badanie wzorców ekspresji fluorescencyjnych reporterów białkowych odpowiedzi hormonalnej w zawiązkach liści. Przygotowanie szkiełka należy rozpocząć od wycięcia prostokątnego kawałka przezroczystej dwustronnej nanotaśmy i przyklejenia go do środka czystego szkiełka bez usuwania folii ochronnej z tworzywa sztucznego na górnej stronie taśmy.
Następnie rozetnij rynnę, usuwając górną część starszych liści za pomocą ściągacza izolacji. Następnie przytrzymaj rynnę za mezokotyl i ostrożnie usuń otaczające liście za pomocą sondy dentystycznej, aby wydobyć interesujące nas primordie. Aby zamontować primordium, usuń folię ochronną z taśmy.
Połóż odsłonięte zawiązki na taśmie. Przetnij zawiązek u podstawy za pomocą żyletki, odrzucając podstawową łodygę i hipokotyl. Aby uzyskać płynniejsze rozwijanie, nasmaruj wewnętrzną lub przyosiową powierzchnię liścia, zanurzając końcówkę igły w 100% glicerolu.
Rozwiń zawiązek za pomocą sondy dentystycznej z wygiętą igłą. Ustawić końcówkę igły równolegle do powierzchni i rozwinąć zewnętrzny brzeg podstawy, delikatnie dociskając go do taśmy. Tak aby zewnętrzny brzeg przylegał do taśmy, wyrównaj końcówkę igły równolegle do długiej osi liścia.
Delikatnie przesuń igłę na boki, aby rozwinąć i spłaszczyć liść na taśmie. Nanieś kroplę wody na rozwinięte zawiązki. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na kropli wody i zawiązku.
Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby przylegały do taśmy. Po zakończeniu umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego, aby uwidocznić fluorofor. Metodę tę zastosowano w celu wizualizacji i analizy ekspresji białek fluorescencyjnych w zawiązkach liści kukurydzy.
Uzupełnienie analizy przekroju poprzecznego, analiza całego montażu liścia ujawniła specyficzne dla tkanek i etapów wzorce odpowiedzi hormonalnej podczas informacji. Metoda analizy całego wierzchowca umożliwiła przeprowadzenie jakościowych i ilościowych analiz ekspresji białek fluorescencyjnych w zawiązkach liści kukurydzy, co wskazuje na skuteczność tej metody w badaniu zawiązków liści kukurydzy, które są trudne do zobrazowania ze względu na ich fałdowaną budowę.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje wyzwanie obrazowania pierwotków liści kukurydzy, które naturalnie są zwinięte i trudne do badania. Badacze przedstawiają ulepszone protokoły przygotowywania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych struktur tych pierwotków, umożliwiające ulepszoną fluorescencyjną i konfokalną wizualizację.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia roślin
- Rozwijanie liści kukurydzy
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Pierwotki liści kukurydzy są osłonięte i zwinięte, co komplikuje ich badanie.
- Zrozumienie anatomii i rozwoju tych struktur jest kluczowe dla badań w biologii roślin.
- Tradycyjne metody obrazowania były ograniczone ze względu na morfologię pierwotków.
Stosowane metody
- Protokoły przygotowywania przekrojów poprzecznych za pomocą ściągacza izolacji.
- Metody rozwijania całych pierwotków liści za pomocą przezroczystej dwustronnej taśmy nano.
- Techniki fluorescencyjne i konfokalne do wizualizowania.
Główne wyniki
- Ulepszona dokładność przycinanie w przekroju poprzecznym i rozwijanie pierwotków liści.
- Wyniki wskazują na różnice w rozwoju pierwotków związane z określonymi mutantami genetycznymi.
- Metody umożliwiają systematyczne badanie wzorców ekspresji hormonów w pierwotkach liści.
Wnioski
- Badanie pokazuje skuteczne techniki wizualizacji i analizy pierwotków liści kukurydzy.
- Te metody mają zastosowanie w szerszych badaniach rozwoju liści traw i badaniach anatomicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate visualization and quantification of maize leaf primordia are critical for early discovery in plant trait development and functional genomics. The improved sectioning and unrolling protocols enable reliable imaging of deeply ensheathed tissues, supporting hypothesis-driven research and mechanistic de-risking in crop biotechnology pipelines. These methods enhance predictive confidence in phenotypic screening and trait validation for grass species.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of developmental pathways in maize and other grasses.
- Supports functional validation of genetic and hormonal targets in early leaf development.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing systematic analysis of mutant phenotypes.
- Improves predictive confidence in trait selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Standardizes preparation of biological samples for fluorescence and confocal imaging workflows.
- Enhances reproducibility and quantitative assessment of reporter expression patterns.
- Prepares validated tissue systems for downstream phenotypic screening and analysis.
- Enables reliable evaluation of compound or genetic perturbation effects on leaf development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant or agronomically important traits in grasses.
- Supports continuity from discovery through preclinical trait validation in crop improvement programs.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in trait development pipelines.
- Delivers mechanistic insights that inform translational biomarker strategies in plant systems.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position sample preparation and imaging as foundational steps bridging early discovery, phenotypic screening, and preclinical trait validation in plant biotechnology workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing anatomical and developmental traits.
- Screening: Provides standardized, reproducible sample preparation for quantitative imaging assays.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements and readouts for comparative analysis of genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects imaging data to trait validation and biomarker alignment in crop improvement pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for imaging challenging plant tissues across multiple projects and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in trait and target validation.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency in trait development programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of high-value traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant dissection and fluorescence/confocal microscopy.
- Needs access to specialized imaging instrumentation and sample preparation tools.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample handling and imaging.
- May require adaptation for different grass species or tissue morphologies.
- Practical limitations include tissue fragility and the need for precise manual manipulation.
