Name: Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Naucz się ulepszonych protokołów przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Metody te umożliwiają dokładną analizę anatomicznych i rozwojowych cech liści.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Maize Genetics Cooperation, The Maize Cell Genomics Project, Dave'owi Jacksonowi (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrei Gallavotti (Rutgers University, NJ) i Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) za dostarczenie zmutowanych i transgenicznych zasobów, a także Robertowi F. Bakerowi i Alexandrowi Jurkiewiczowi z Advanced Light Microscopy Core w University of Missouri-Columbia za pomoc w mikroskopii konfokalnej. JMR był wspierany przez J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund oraz National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) do PM. CDTC, CMRV, EDCDP i RJRR są wspierane przez program stypendialny Ateneo College. CDTC, EDCDP i RJRR są wspierane przez stypendium licencjackie DOST-SEI S&T. DODL jest wspierany przez Stypendium Naukowe im. ks. Thomasa Steinbuglera SJ. RJRR jest wspierany przez Aiducation International – Stypendium Pathways to Higher Education. Prace te były wspierane przez Szkołę Nauki i Inżynierii oraz Bibliotekę Rizal Uniwersytetu Ateneo de Manila.

Improved Methods for Imaging Maize Leaf Primordia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Przedstawiamy dwie metody przygotowania zawiązków liści kukurydzy do obrazowania komórkowego. Pierwsza metoda (sekcja protokołu 2) umożliwia pomiar zawiązków do analizy przekroju poprzecznego, podczas gdy druga metoda (sekcja protokołu 3) umożliwia rozwinięcie i spłaszczenie zawiązka do analizy całego montażu. Metody te ułatwiają obrazowanie komórkowe FP w zawiązkach liści kukurydzy24 (jak pokazano na rys. 4 i ryc. 5) i zapewniają proste rozwiązania problemów związanych z obrazowaniem rozwijających się liści kukurydzy. Sekcja 2 protokołu skraca czas preparacji i poprawia dokładność pobierania próbek poprzez pomiar zawiązków przed sekcją, zamiast polegać wyłącznie na parametrach stopnia zaawansowania 9,16. Dzięki dostępnej na rynku taśmie nano, sekcja protokołu 3 rozwiązuje długotrwały problem obrazowania zawiązków całych liści w kukurydzy. Protokół ten jest lepszy od poprzedniej metody, w której wykorzystano rurki do dializy31 i jest znacznie tańszą alternatywą dla tomografii komputerowej i rezonansu magnetycznego 11,32,33. Jednak jeśli chodzi o wizualizację cech anatomicznych liści i uzyskiwanie optymalnych wyników, oba protokoły mają pewne ograniczenia, które przedstawiono w tabeli 2 i omówiono bardziej szczegółowo poniżej.
W sekcji 2 protokołu napotkaliśmy trudności z wizualizacją konturów komórek w grubych poprzecznych odcinkach zawiązków liści, a barwienie przeciwstawne barwnikami fluorescencyjnymi wiążącymi ścianę komórkową lub błonę plazmatyczną nie przyniosło zadowalających wyników. Na przykład FM 4-64 dawał nieoptymalne wyniki w porównaniu z markerem FP błony komórkowej, pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Rysunek 3A-D). Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zalecamy użycie wibratomu do wytworzenia cieńszych odcinków tkanek (~0,1 mm)58, co pozwoli na żywe obrazowanie konturów komórek w jasnym polu lub optymalizację protokołu barwienia przeciwdziałającego barwieniu47,59.
W sekcji 3 protokołu głównym ograniczeniem jest trudność w zamontowaniu skrzydła bez rozdarcia, uszkodzenia lub pęcherzyków powietrza, jak opisano w krokach protokołu 3.2.5-3.2.6 (Rysunek 3E-K). Ponieważ liść kukurydzy jest obustronnie symetryczny, do wizualizacji 9 może wystarczyć montaż na połowie liścia, a nie na całym liściu. Aby to zrobić, zawiązek można przeciąć żyletką wzdłuż osi podłużnej po rozwinięciu go do nerwu środkowego, umożliwiając zamontowanie tylko połowy liścia. Kolejnym ograniczeniem sekcji 3 protokołu jest to, że grubość liścia może ograniczać rozdzielczość optyczną sygnału fluoroforowego podczas głębokiego obrazowania. Aby rozwiązać ten problem, możliwe jest zastosowanie techniki oczyszczania tkanek60. Odkryliśmy jednak, że ClearSee61, powszechnie stosowany odczynnik czyszczący do obrazowania tkanek roślinnych, nie jest zgodny z protokołem, ponieważ powoduje oderwanie próbki i szkiełka nakrywkowego od taśmy nano. Potencjalnym rozwiązaniem tego problemu może być nałożenie półprzepuszczalnej membrany31 na próbkę liścia, co pozwoli na potraktowanie jej roztworem czyszczącym, jednocześnie utrzymując ją na miejscu przez nanotaśmę. Taka metoda, która pozwala na nałożenie płynnych roztworów na rozwinięty liść, może być również wykorzystana do technik hybrydyzacji i immunolokalizacji całego RNA in situ, które wcześniej zostały zoptymalizowane pod kątem rozwoju kwiatostanów kukurydzy, ale nie dla zawiązków całych liści62,63.
Opisaliśmy protokoły dla kukurydzy, która ma duże zawiązki liści już na etapie siewki. Inne gatunki traw ze znacznie mniejszymi zawiązkami liści, takie jak ryż, jęczmień, pszenica, Setaria i Brachypodium 16,23,64,65,66, mogą wymagać użycia dodatkowych precyzyjnych narzędzi, aby skutecznie zastosować te protokoły. Co więcej, protokoły te nie były przeznaczone do obrazowania żywych komórek, które rejestruje dynamiczne procesy tworzenia tkanek i odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym. Jednak w miarę postępów w dziedzinie obrazowania żywych komórek 67 sond fluorescencyjnych, technologii obrazowania i możliwości obliczeniowych67 roślin, przyszłe badania mogą opierać się na tych protokołach w celu opracowania strategii obrazowania żywych komórek dostosowanych do unikalnych cech zawiązków liści trawy.

Uprawy traw są głównym źródłem żywności i biopaliw dla światowej populacji1, a usprawnienie anatomii liści ma potencjał do zwiększenia ich produktywności2,3. Jednakże nasza obecna wiedza na temat regulacji anatomii liści u traw jest ograniczona4 i wymaga analizy primordiów liści, ponieważ wiele cech anatomicznych i fizjologicznych liścia jest zdeterminowanych na wczesnym etapie rozwoju5,6,7. Techniki obrazowania komórkowego, takie jak obrazowanie fluorescencyjne i konfokalne, są niezbędne do badania anatomii liści traw i cech komórkowych, lecz techniki te są trudne do zastosowania w przypadku primordiów liści traw, ponieważ są one głęboko osłonięte i zwinięte wewnątrz wiecha liściowego. Rozwiązaliśmy ten problem, opracowując metody przygotowywania przekrojów poprzecznych oraz preparatów całych rozwiniętych liści do analizy fluorescencyjnej i konfokalnej primordiów liści kukurydzy, która stanowi system modelowy do badania anatomii i rozwoju liści traw2,8.
Liść kukurydzy, podobnie jak liście wszystkich traw, składa się z taśmowatej blaszki z pochwą, która oplata łodygę i rozwijający się pęd9,10,11,12,13. Liście rozwijają się z merystemu wierzchołkowego pędu (SAM) w układzie dwurzędowym, w którym każdy nowy liść inicjuje się w pozycji przeciwnej do poprzedniego, co skutkuje powstaniem dwóch rzędów liści wzdłuż osi pionowej (Rysunek 1A)14. Stadium rozwojowe każdego primordium liścia jest identyfikowane na podstawie jego położenia względem SAM, przy czym najbliższe primordium oznacza się jako plastochron 1 (P1), a kolejne primordia jako P2, P3 i tak dalej (Rysunek 1B,C)2. Podczas rozwoju (Rysunek 1D), primordium liścia pojawia się najpierw jako półksiężycowata podpora u podstawy SAM (P1), a następnie przekształca się w primordium w kształcie kaptura, który rozciąga się nad merystemem (P2)9,10,11. Marginesy podstawowe kaptura rozszerzają się następnie bocznie i nakładają na siebie, podczas gdy wierzchołek rośnie w górę, tworząc stożkowate primordium (P3-P5)10. Następnie primordium szybko rośnie na długość, a granica między pochwą a blaszką u podstawy staje się bardziej wyraźna wraz z formowaniem się języczka — frędzlowatej wypustki po stronie adaksjalnej liścia (P6/P7). Ostatecznie liść rozwija się, wyłaniając z kręgu podczas wzrostu w stanie ustalonym, w którym dzielące się komórki są ograniczone do niewielkiego obszaru podstawowego blaszki, tworząc gradient z komórkami powiększającymi się i różnicującymi wzdłuż osi proksymalno-dystalnej (P7/P8)15. Wierzchołek pędu siewki kukurydzy zawiera wiele primordiów na różnych etapach rozwoju, co czyni go doskonałym modelem do badania rozwoju liści8.
Dokładna analiza wczesnego rozwoju liści wymaga etapowania lub zastosowania ustandaryzowanych kryteriów w celu zdefiniowania odrębnych stadiów rozwoju primordium w odniesieniu do innych parametrów wzrostu lub morfologicznych. Ponieważ primordia liści są ukryte w pędzie trawy, badacze zazwyczaj wykorzystują takie parametry jak wiek rośliny lub rozmiar wyłaniających się liści jako predyktory stadiów i rozmiarów primordiów liściowych9,16. W przypadku kukurydzy chronologiczny wiek rośliny określa się na podstawie liczby dni od posadzenia lub kiełkowania (DAP/DAG)17,18. Stadium wegetatywne (stadium V) określa się według najwyższego liścia z widocznym kołnierzykiem – jasną linią na stronie abaksjalnej pomiędzy blaszką a pochwą, która odpowiada położeniu liguli i uszek, czyli pary klinowatych obszarów u podstawy blaszki (Rysunek 1A,B)17,19. Między 20 a 25 DAG SAM przekształca się w merystem kwiatostanowy i przestaje wytwarzać nowe liście20. Tempo wzrostu primordiów liści kukurydzy może się różnić w zależności od środowiska i genotypu rośliny. Z tego powodu wiek rośliny i rozmiar wyłaniających się liści nie mogą precyzyjnie przewidzieć rozmiarów primordiów liściowych; jednak zastosowanie tych parametrów może pomóc w określeniu zakresu stadiów i rozmiarów primordiów na potrzeby eksperymentalne.
Analiza przekroju poprzecznego jest popularną metodą badania anatomii i rozwoju liści kukurydzy oraz innych traw, ponieważ umożliwia pobranie próbek z wielu plastochronów w jednym przekroju całego pędu21,22,23. Metoda ta jest również wygodna do obrazowania komórkowego świeżych próbek, ponieważ otaczające liście służą jako rusztowanie, które utrzymuje primordia liści na miejscu podczas krojenia i montowania24. Wadą tej metody jest jednak trudność w precyzyjnym zlokalizowaniu docelowego plastochronu i obszaru w obrębie primordium podczas wykonywania przekroju z nienaruszonego pędu. Ponadto, ponieważ wzrost liści różni się w zależności od plastochronu oraz wzdłuż osi proksymało-dystalnej2,5, nieprecyzyjne pobieranie próbek może prowadzić do błędnej interpretacji stadium rozwojowego i obszaru primordium w danym przekroju. Dlatego opracowanie metody precyzyjnego pobierania próbek z przekroju poprzecznego jest kluczowe dla zapewnienia dokładności i powtarzalności analiz anatomicznych i rozwojowych primordiów liści traw.
Analiza preparatów całych liści umożliwia kompleksowe i integracyjne badanie procesów tkankowych i komórkowych zachodzących w skali całego organu, takich jak wzrost proliferacyjny25 oraz wzorowanie żyłek26,27,28. Metoda ta zapewnia paradermalny przekrój liścia, co pozwala na odkrycie odrębnych procesów i wzorców, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia przy użyciu analizy przekrojów poprzecznych24,27. W przeciwieństwie do Arabidopsis, gdzie istnieją już opracowane metody obrazowania preparatów całych liści29,30, obecnie nie istnieje standardowa metoda obrazowania rozwiniętych preparatów całych liści u traw. Poprzedni protokół rozwijania izolowanych primordiów liści kukurydzy wymagał rzadko stosowanych materiałów i nie nadawał się do obrazowania komórkowego31. Zaawansowane techniki obrazowania, takie jak tomografia komputerowa (CT) i obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI), pozwalają na uzyskanie trójwymiarowych informacji anatomicznych bez izolowania i rozwijania primordiów11,32,33, jednak są one kosztowne i wymagają specjalistycznego sprzętu. Opracowanie techniki pozwalającej przełamać ograniczenia wynikające z zwiniętej i stożkowatej morfologii primordiów liści kukurydzy i innych traw przyczyniłoby się do postępu w badaniach nad ich cechami anatomicznymi i rozwojowymi.
W niniejszej pracy przedstawiamy metody przygotowania przekrojów poprzecznych oraz rozprostowanych preparatów całych primordiów liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Metody te wykorzystaliśmy do ilościowego określenia liczby żyłek oraz mapowania czasowo-przestrzennego rozkładu hormonów w primordiach liści kukurydzy przy użyciu białek fluorescencyjnych (FPs)24. Pierwsza metoda polega na usunięciu górnej części starszych liści z siewek kukurydzy za pomocą ściągacza do przewodów (Rysunek 1E). Dzięki odsłonięciu wierzchołka primordium (P5-P7) możliwe jest określenie jego długości bez konieczności całkowitego usuwania otaczających go starszych liści, co umożliwia łatwe i precyzyjne wykonywanie przekrojów. Druga metoda polega na rozwijaniu i montowaniu całych primordiów liści (P3-P7) za pomocą przezroczystej, dwustronnej nanotaśmy (Rysunek 1F). Metody te nadają się do wizualizacji różnych białek FP24, jednak wymagają optymalizacji w przypadku stosowania barwników fluorescencyjnych i odczynników przejrzystiających. Ponadto opisujemy procedury spłaszczania stosów z-stack, łączenia obrazów (stitching) oraz nakładania kanałów w programie ImageJ/FIJI34, które mają zastosowanie do obrazów uzyskanych obiema metodami. Opisane procedury są przydatne w rutynowym obrazowaniu fluorescencyjnym lub konfokalnym liści kukurydzy, ale mogą zostać również zaadaptowane dla innych modelowych gatunków traw, takich jak ryż, Setaria i Brachypodium.
<img alt="Proces sekcjonowania i obrazowania rośliny, pokazujący stadia liści, etapy sekcjonowania i techniki obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Organizacja i morfologia primordiów liści kukurydzy oraz przegląd metod. (A) Schematyczne przedstawienie siewki kukurydzy. Kukurydza posiada filotaksję dwuszeregową, przy której nowy liść powstaje w pozycji przeciwległej do poprzedniego liścia. Numer liścia wskazuje chronologiczną kolejność wyłaniania się liści od momentu kiełkowania (np. pierwszy liść, L1; drugi liść, L2; trzeci liść, L3; itd.). Każdy liść posiada dystalną blaszkę i bazalną pochwę, oddzielone od siebie obrączką, która odpowiada języczkowi i uszkom. Najwyższy liść z widoczną obrączką wyznacza stadium wegetatywne. Siewka w tym przykładzie znajduje się w stadium V2, z widoczną obrączką L2 (grot strzałki). Ikona nożyczek wskazuje miejsce na mesokotylu (me), w którym siewka musi zostać przecięta w celu pobrania próbki. (B) Schematyczne przedstawienie wysektrygowanego pędu z wyizolowanymi liśćmi od L1 do L4, natomiast primordia liści od L5 do L9 przedstawiono jako powiększony obraz w części (C). Numer plastochronu wskazuje pozycję primordium względem SAM, przy czym najmłodsze primordium liściowe (P1) znajduje się najbliżej SAM, a starsze primordia liściowe (P2, P3, P4 i kolejne) znajdują się sukcesywnie dalej2. (D) Schematyczne przedstawienie morfologii primordiów liści kukurydzy od P1 do P5. (E) Schematyczny przegląd metody analizy przekrojów poprzecznych primordiów liści kukurydzy. (1) Przycięcie starszych liści za pomocą ściągacza do izolacji. (2) Pomiar primordium i wycięcie przekroju pędu. (3) Osadzenie przekroju na szkiełku do obrazowania i przetwarzania (4, 5). (F) Schematyczny przegląd metody analizy całych preparatów (whole-mount) primordiów liści kukurydzy. (1) Usunięcie otaczających liści w celu wyekstrahowania primordium. (2) Przecięcie i rozprostowanie primordium na taśmie nano. (3) Osadzenie próbki do obrazowania i przetwarzania (4, 5). Skróty: L = liść; bl = blaszka; sh = pochwa; co = obrączka; me = mesokotyl; V = wegetatywny; P = plastochron; SAM = merystem wierzchołkowy pędu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Akrylowa żel przezroczysty dwustronna taśma nano Tape 16,5 stopy x 1,2 cala, grubość 2 mm</td><td>Sklep EZlifego (Amazonka</td> <td>B07YB1ZXG6</td><td>1 rolka</td></tr><tr><td>Bellucci Pick Zakrzywiona mikrosonda 16,8 cm, 6,6 cala</td><td>Bausch & Lomb</td><td>N1692 9 1</td><td>szt</td></tr><tr><td>Mikrosonda prowadząca Clayman Hak Sinskey kątowy wałek, 11,6 cm, 4,6 cala</td><td>Storz Opthalmic Instruments</td><td>E0542</td><td>1 szt</td></tr><tr><td>Sonda dentystyczna, wygięta igła, 14 cm (5,5 cala)</td><td>Ted Pella</td><td>13553</td><td>1 szt</td></tr><tr><td>DOWELL 10-22 AWG Ściągacz izolacji</td><td>Dowell Store (Amazonka)</td><td>10-22 AWG</td><td>1 szt</td></tr><tr><td>Pióra Ostrza ze stali węglowej o podwójnej krawędzi</td><td>Ted Pella</td><td>121-9</td><td>pakiet pakietowy/10; do precyzyjnego cięcia</td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe z matowym szkłem, 75 mm x 25 mm x 1-1,2 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260442</td><td>opakowanie/144</td></tr><tr><td>GEM Jednokrawędziowe, niepowlekane ostrza ze stali nierdzewnej</td><td>Ted Pella</td><td>121-1</td><td>pudełko/200; do ogólnego cięcia/cięcia</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI17904</td><td>1 litr</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI z wtyczką EDF (wersja 17.05.2021) i wtyczką</td> <td>Grid/Collection StitchingNational Institutes of Health (NIH) USA</td><td>wersja 2.9.0/1.54s</td><td>Wtyczka EDF została opracowana przez Alexa Prudencio, Jesse Berenta i Daniela Sage'a dla Biomedical Imaging Group, &Eacute; cole Polytechnique F&eacute; d&eacute; rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). Oprogramowanie do zszywania siatki/kolekcji zostało opracowane przez Stephana Preibischa dla Instytutu Molekularnej Biologii Komórki i Genetyki im. Maxa Plancka (MPI-CBG).</td></tr><tr><td>Kimwipes Ex-L Małe 111,76 mm x 213,36 mm</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>pudełko/280-warstwowe</td></tr><tr><td>okulary Micro Cover Glasses, grubość 22 mm x 22 mm x 0,13 - 0,16 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260140</td><td>1 uncja</td></tr><tr><td>dwustronnej taśmy nano Gel PU o wymiarach 29,5 stopy x 1,18 cala, grubość 1 mm</td><td>Sklep Yecaye (Amazon)</td><td>L354 W1.18</td><td>2 rolki okularów</td></tr><tr><td>nakrywkowych Superslip, Grubość 24 mm x 50 mm x 0,13 - 0,16 mm Ted</td><td>Pella</td><td>260166</td><td>1 uncja</td></tr><tr><td>Okulary Superslip, grubość 24 mm x 60 mm x 0,13 - 0,16 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260168</td><td>1 uncja</td></tr><tr><td>deska do krojenia ze szkła hartowanego</td><td>Hacaroa (Amazonka</td> <td>B09XMXBT5S</td><td>4 szt</td></tr></tbody></table>

ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

U kukurydzy (Zea mays) i innych traw (Poaceae), zawiązki liści są głęboko osłonięte i zwinięte w okółku liścia, co utrudnia badanie wczesnego rozwoju liści. W tym artykule opisano metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Pierwsza metoda wykorzystuje ściągacz izolacji do usuwania górnych części starszych liści, odsłaniając wierzchołek zawiązka liścia i umożliwiając jego pomiar w celu dokładniejszego pobrania próbek przekroju poprzecznego. Druga metoda wykorzystuje przezroczystą, dwustronną taśmę nano do rozwijania i montowania zawiązków całych liści do obrazowania. Pokazujemy przydatność tych dwóch metod w wizualizacji i analizie fluorescencyjnych reporterów białkowych w kukurydzy. Metody te stanowią rozwiązanie problemów związanych z charakterystyczną morfologią zawiązków liści kukurydzy i będą przydatne do wizualizacji i ilościowego określania cech anatomicznych i rozwojowych liści kukurydzy i innych gatunków traw.

Analiza przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy 
Wykorzystaliśmy sekcję 2 protokołu do ilościowego określenia liczby żyłek i charakterystyki wzorców odpowiedzi hormonalnej w przekrojach poprzecznych prymordiów liści kukurydzy z FP (Rysunek 4)24. Aby ocenić rolę hormonu roślinnego auksyny we wzroście liści i tworzeniu żyłek, policzyliśmy liczbę żyłek w prymordiach liści mutanta kukurydzy z niedoborem auksyny, vanishing tassel254. W wczesnych plastochronach rozwijające się żyłki wykazują wyraźną komórkowość w środkowej warstwie komórek prymordium liścia kukurydzy21,22. Jednak identyfikacja i liczenie żyłek przy użyciu konwencjonalnych technik histologicznych22 może być pracochłonne i czasochłonne. Dlatego w celu ilościowego określenia liczby żyłek wykorzystaliśmy marker białka eksportującego auksynę u kukurydzy pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (dalej określany jako PIN1a-YFP), który znakuje rozwijające się żyłki i pasma procambium (PCS; Rysunek 4A). Dzięki sekcji 2 protokołu udało nam się ustandaryzować pobieranie przekrojów poprzecznych poprzez pomiar prymordiów przed cięciem (Rysunek 4B,C). Odkryliśmy tendencję, zgodnie z którą vt2 posiada szersze prymordium i więcej żyłek niż rośliny normalne (Rysunek 4D,E)24, co jest zgodne z danymi z w pełni rozwiniętych liści55 i wskazuje, że defekt w vt2 pojawia się wcześnie w rozwoju liścia. Korzystając z sekcji 2 protokołu, mogliśmy również systematycznie badać wzorce ekspresji reporterów FP odpowiedzi hormonalnej w prymordiach liści (przykłady obrazów znajdują się na Rysunku 4F-I). Poprzez ustandaryzowany schemat pobierania przekrojów poprzecznych zmapowaliśmy rozkład odpowiedzi na auksynę, cytokininę (CK) i kwas giberelowy (GA) w różnych plastochronach i regionach prymordiów liści oraz odkryliśmy nowe wzorce odpowiedzi, które w naszej hipotezie mają znaczenie dla wzrostu liści i tworzenia żyłek24. Zatem te reprezentatywne wyniki demonstrują użyteczność sekcji 2 protokołu w analizie przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy.
<img alt="Wzrost prymordium rośliny, PIN1a-YFP, wykresy, obrazy z mikroskopii, analiza danych w badaniu botanicznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki analizy przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy. (A-E) Ilościowe oznaczenie liczby żyłek i szerokości prymordium w prymordiach liści rośliny normalnej oraz vanishing tassel2 z zastosowaniem markera białka eflluksu auksyny PIN1a-YFP. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów poprzecznych od P5 do P7 wykazujących ekspresję PIN1a-YFP w rozwijających się żyłkach i pasmach procambialnych. Przekroje poprzeczne obrazowano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z wykorzystaniem filtra FITC (pobudzenie 495-519 nm). Liczbę żyłek oraz szerokość prymordium wyznaczono odpowiednio za pomocą narzędzi wielopunktowych i linii rysowanej ręcznie w programie FIJI/ImageJ. (B) Siewka kukurydzy z usuniętymi górnymi kręgami liści za pomocą ściągacza do przewodów w celu odsłonięcia wierzchołka czwartego liścia (L4). Nawias obejmuje projektowaną długość prymordium, a linia przerywana wskazuje połowę długości. (C) Schemat różnych kształtów prymordium od P5 do P7, ilustrujący, jak liczba żyłek i szerokość prymordium w połowie długości (pozioma linia przerywana) mogą różnić się w zależności od stadium rozwoju prymordium. (D,E) Pomiar szerokości prymordium (D) i liczby żyłek (E) w przekroju w połowie długości L4 roślin normalnych i vt2. Linia trendu przedstawia średnie kroczące z 10 mm pomiarów ± błąd standardowy średniej (SEM). (F-I) Reprezentatywne obrazy konfokalne przekrojów poprzecznych prymordiów liści wykazujących ekspresję kombinacji PIN1a-YFP, reportera odpowiedzi na auksynę DR5-RFP, reportera odpowiedzi na cytokininę TCS-Tomato, markera odpowiedniego na kwas giberelinowy GAR2-YFP oraz mDII-Venus, zmutowanej wersji reportera sygnału wejściowego auksyny DII-Venus. Kanały FP nałożono na kanał jasnego pola na każdym obrazie. Pasek skali = 200 µm (A); 10 mm (B); 100 µm (F-I). Rycina ta została zmodyfikowana i powielona za zgodą Robila i McSteena24. Skróty: DAG = dni po kiełkowaniu; P = plastochron; vt2 = vanishing tassel2; PCS = pasmo procambialne; YFP = żółte białko fluorescencyjne; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Analiza całych preparatów prymordiów liści kukurydzy 
Zastosowano sekcję 3 protokołu w celu wizualizacji i analizy ekspresji FP w całych preparatach prymordiów liści kukurydzy (Rycina 5). Poprzez wizualizację wzorców żyłkowania za pomocą PIN1a-YFP stwierdzono, że formowanie żyłek zachodzi w całym prymordium podczas wczesnych plastochronów, jednak proces ten ogranicza się do obszarów proksymalnych w późniejszym etapie rozwoju (Rycina 5A)24. Uzupełniająco do analiz przekrojów poprzecznych, analizy całych preparatów liści ujawniły tkankowe i etapowo specyficzne wzorce odpowiedzi hormonalnej podczas formowania żyłek24. Przykładem jest wzorzec ekspresji raportera odpowiedzi na CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato) w odniesieniu do ekspresji PIN1a-YFP (Rycina 5B)24. Postępując zgodnie z sekcją 3 protokołu, możliwe było przeprowadzenie zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz ekspresji FP w prymordiach liści (Rycina 5D-F; niepublikowane dane). Zbadano wzorce ekspresji raportera odpowiedzi na auksynę, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), oraz markera reagującego na GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), w całych preparatach liści pojedynczych i podwójnych mutantów vt2 oraz dwarf plant3 (d3), który jest mutantem z niedoborem GA56 (Rycina 5D). Porównano również względne poziomy proliferacji komórek między normalnymi a vt2 prymordiami liści przy użyciu pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), który jest markerem przejścia G1/S w cyklu komórkowym57 (Rycina 5E,F). Choć nie stwierdzono istotnej różnicy między roślinami normalnymi a vt2, ekspresja Cyclin-D2B-YFP była zgodna ze znanym profilem proliferacji komórek we wczesnych plastochronach31. Wyciągnięto wniosek, że sekcja 3 protokołu jest skuteczną metodą analizy całych preparatów prymordiów liści kukurydzy, które są trudne do obrazowania ze względu na ich zwiniętą morfologię.
<img alt="Rozwój roślin, analiza lokalizacji białek, PIN1a-YFP, DR5-RFP, GAR2-YFP, mikroskopia fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki analizy całego preparatu primordiów liści kukurydzy. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne primordiów liści siewek kukurydzy w wieku 7 DAG, wykazujące rozwijające się żyłki i wiązki procambialne, znakowane markerem białka efleksu auksyny PIN1a-YFP. Primordia P3-P6 zostały wycięte z podstawy, rozwinięte i spłaszczone stroną adaksjalną do góry. Wstawki pokazują powiększenia P3 i P4. W P5 i P6 linie przerywane wyznaczają dystalny koniec stref proliferacyjnych, gdzie większość wiązek procambialnych wciąż się rozwija i wydłuża. (B,C) Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazujące ekspresję PIN1a-YFP i reportera odpowiedzi na cytokininę, TCS-Tomato, w proksymalnym regionie brzegowym primordium P5. (D) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne primordiów P4 wykazujące ekspresję reportera odpowiedzi na auksynę, DR5-RFP, oraz markera reagującego na kwas giberelowy, GAR2-YFP, w roślinach prawidłowych oraz pojedynczych i podwójnych mutantach vanishing tassel2 i dwarf plant3. (E) Reprezentatywne obrazy konfokalne P3 i/lub P4 wykazujące ekspresję Cyclin-D2B-YFP, reportera przejścia G1/S w cyklu komórkowym. (F) Względne poziomy proliferacji komórek w primordiach liści P3/P4 roślin prawidłowych i vt2, określone poprzez pomiar zintegrowanej gęstości sygnału Cyclin-D2B-YFP na obszarze primordium przy użyciu ImageJ/FIJI. Słupki reprezentują średnie pomiary ± błąd standardowy średniej. Pasek skali = 500 µm (A,D,E); 200 µm (B); 100 µm (C). Rysunek 4A-C został zmodyfikowany i powielony za zgodą Robila i McSteena24, natomiast Rysunek 4D-F przedstawia nieopublikowane dane autorów. Skróty: DAG = dni po wykiełkowaniu; P = plastochron; vt2 = vanishing tassel2; d3 = dwarf plant3; YFP = żółte białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = brak istotnej różnicy; au = jednostka arbitralna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Przykłady określania stadium rozwoju liści u siewek kukurydzy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S1: Próbki roślin i materiały użyte w protokołach. (A,B) Siewka kukurydzy w 7-8 DAG po usunięciu górnego kręgu liści za pomocą ściągacza do przewodów. (B) Wstawka przedstawia zbliżenie pędu z odsłoniętym primordium P6. (C-G) Pędy siewek kukurydzy z usuniętymi górnymi kręgami do analizy w przekroju poprzecznym (C,D) oraz z całkowicie usuniętymi liśćmi otaczającymi do analizy całego preparatu (E-G). (H) Rolka przezroczystej dwustronnej nano taśmy z żelu poliuretanowego. (I,J) Primordium liścia P6 (I) oraz region proksymalny liścia P8 (J) rozwinięte i zamocowane na szkiełkach przedmiotowych za pomocą nano taśmy. (K) Szkiełko przedmiotowe z rozwiniętym primordium liścia umieszczone na stole mikroskopu epifluorescencyjnego. Skrót: DAG = dni po kiełkowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Trawy, takie jak kukurydza, mają zawiązki liści zwinięte w pędach, co utrudnia ich badanie. Rozwiązujemy ten problem za pomocą ulepszonych protokołów przygotowania odcinków transferu liści kukurydzy oraz hormonów do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. W pierwszym protokole wykorzystuje się urządzenie do wycinania starszych liści za pomocą urządzenia do malowania pasów, co pozwala na pomiar zawiązków przed cięciem.Drugi protokół wykorzystuje przezroczystą dwustronną nanotaśmę do rozwijania zawiązków całych liści. Protokoły te poprawiają dokładność przekroju poprzecznego i umożliwiają rozwijanie zawiązków liści, co było bardzo trudne do osiągnięcia ze względu na stożkowatą morfologię zwiniętego. Metody te będą przydatne do wizualizacji i ilościowego określania cech anatomicznych i rozwojowych liści kukurydzy i innych traw.W oparciu o te metody planujemy opracować strategie obrazowania stylu życia, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rozwoju liści trawy. Zacznij od pokrojenia pożądanej dojrzałej sadzonki kukurydzy w tkance mezokotylu za pomocą małego noża lub nożyczek. Oczyść sadzonkę pędzlem.Następnie przytrzymaj ściągacz izolacji szczękami skierowanymi w stronę rynny. Umieść rynnę w wybranym otworze i ściśnij uchwyty zdzieraku. Odsuń ściągacz od zsypu, aby przyciąć górną część liści.Użyj linijki, aby zmierzyć długość od czubka zawiązka do podstawy zsypu. Aby rozpocząć obrazowanie zawiązka liścia, trzymaj rynnę stabilnie na gładkiej powierzchni pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 0,8x. Za pomocą żyletki lub skalpela wykonaj wstępne cięcie nieco powyżej obszaru docelowego, aby wyrzucić dystalną część rynny.Następnie uzyskaj około 0,25 do 0,8 milimetra cienkich odcinków w pożądanych punktach na całej długości zawiązków. Po zakończeniu zamontuj część skrzydła na czystym szkiełku podstawowym. Nanieś kilka kropel wody bezpośrednio na sekcję za pomocą pipety i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.W razie potrzeby nałóż jeszcze kilka kropli przez krawędzie szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego i dostosuj ustawienia, aby uwidocznić fluorofor. Stosując tę metodę, próbkowanie przekroju poprzecznego zostało ustandaryzowane poprzez pomiar zawiązków przed przekrojem.Odkryto trend pokazujący, że znikający frędzel drugi miał szersze zawiązki i więcej żyłek niż normalnie, co wskazuje, że wada mutanta rozpoczęła się wcześnie w rozwoju liścia. Metoda ta umożliwiła również systematyczne badanie wzorców ekspresji fluorescencyjnych reporterów białkowych odpowiedzi hormonalnej w zawiązkach liści. Przygotowanie szkiełka należy rozpocząć od wycięcia prostokątnego kawałka przezroczystej dwustronnej nanotaśmy i przyklejenia go do środka czystego szkiełka bez usuwania folii ochronnej z tworzywa sztucznego na górnej stronie taśmy.Następnie rozetnij rynnę, usuwając górną część starszych liści za pomocą ściągacza izolacji. Następnie przytrzymaj rynnę za mezokotyl i ostrożnie usuń otaczające liście za pomocą sondy dentystycznej, aby wydobyć interesujące nas primordie. Aby zamontować primordium, usuń folię ochronną z taśmy.Połóż odsłonięte zawiązki na taśmie. Przetnij zawiązek u podstawy za pomocą żyletki, odrzucając podstawową łodygę i hipokotyl. Aby uzyskać płynniejsze rozwijanie, nasmaruj wewnętrzną lub przyosiową powierzchnię liścia, zanurzając końcówkę igły w 100% glicerolu.Rozwiń zawiązek za pomocą sondy dentystycznej z wygiętą igłą. Ustawić końcówkę igły równolegle do powierzchni i rozwinąć zewnętrzny brzeg podstawy, delikatnie dociskając go do taśmy. Tak aby zewnętrzny brzeg przylegał do taśmy, wyrównaj końcówkę igły równolegle do długiej osi liścia.Delikatnie przesuń igłę na boki, aby rozwinąć i spłaszczyć liść na taśmie. Nanieś kroplę wody na rozwinięte zawiązki. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na kropli wody i zawiązku.Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby przylegały do taśmy. Po zakończeniu umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego, aby uwidocznić fluorofor. Metodę tę zastosowano w celu wizualizacji i analizy ekspresji białek fluorescencyjnych w zawiązkach liści kukurydzy.Uzupełnienie analizy przekroju poprzecznego, analiza całego montażu liścia ujawniła specyficzne dla tkanek i etapów wzorce odpowiedzi hormonalnej podczas informacji. Metoda analizy całego wierzchowca umożliwiła przeprowadzenie jakościowych i ilościowych analiz ekspresji białek fluorescencyjnych w zawiązkach liści kukurydzy, co wskazuje na skuteczność tej metody w badaniu zawiązków liści kukurydzy, które są trudne do zobrazowania ze względu na ich fałdowaną budowę.

improved-methods-for-preparing-transverse-sections-unrolled-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Oferujemy nowatorską metodę poprawy kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego tkanki kukurydzy, odpowiednią do zwykłego skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Na podstawie obrazów CT wprowadzamy zestaw procesów przetwarzania obrazów dla różnych materiałów kukurydzianych, aby skutecznie wyodrębnić mikroskopijne fenotypy wiązek naczyniowych kukurydzy.

Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Ten protokół immunolokalizacji w męskich mejocytach kukurydzy zachowuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale utrwalonym paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Naucz się ulepszonych protokołów przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Metody te umożliwiają dokładną analizę anatomicznych i rozwojowych cech liści.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Przeglądaj więcej filmów