Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego
22 września 2023
Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.
Trawy, takie jak kukurydza, mają zawiązki liści zwinięte w pędach, co utrudnia ich badanie. Rozwiązujemy ten problem za pomocą ulepszonych protokołów przygotowania odcinków transferu liści kukurydzy oraz hormonów do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. W pierwszym protokole wykorzystuje się urządzenie do wycinania starszych liści za pomocą urządzenia do malowania pasów, co pozwala na pomiar zawiązków przed cięciem.
Drugi protokół wykorzystuje przezroczystą dwustronną nanotaśmę do rozwijania zawiązków całych liści. Protokoły te poprawiają dokładność przekroju poprzecznego i umożliwiają rozwijanie zawiązków liści, co było bardzo trudne do osiągnięcia ze względu na stożkowatą morfologię zwiniętego. Metody te będą przydatne do wizualizacji i ilościowego określania cech anatomicznych i rozwojowych liści kukurydzy i innych traw.
W oparciu o te metody planujemy opracować strategie obrazowania stylu życia, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rozwoju liści trawy. Zacznij od pokrojenia pożądanej dojrzałej sadzonki kukurydzy w tkance mezokotylu za pomocą małego noża lub nożyczek. Oczyść sadzonkę pędzlem.
Następnie przytrzymaj ściągacz izolacji szczękami skierowanymi w stronę rynny. Umieść rynnę w wybranym otworze i ściśnij uchwyty zdzieraku. Odsuń ściągacz od zsypu, aby przyciąć górną część liści.
Użyj linijki, aby zmierzyć długość od czubka zawiązka do podstawy zsypu. Aby rozpocząć obrazowanie zawiązka liścia, trzymaj rynnę stabilnie na gładkiej powierzchni pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 0,8x. Za pomocą żyletki lub skalpela wykonaj wstępne cięcie nieco powyżej obszaru docelowego, aby wyrzucić dystalną część rynny.
Następnie uzyskaj około 0,25 do 0,8 milimetra cienkich odcinków w pożądanych punktach na całej długości zawiązków. Po zakończeniu zamontuj część skrzydła na czystym szkiełku podstawowym. Nanieś kilka kropel wody bezpośrednio na sekcję za pomocą pipety i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
W razie potrzeby nałóż jeszcze kilka kropli przez krawędzie szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego i dostosuj ustawienia, aby uwidocznić fluorofor. Stosując tę metodę, próbkowanie przekroju poprzecznego zostało ustandaryzowane poprzez pomiar zawiązków przed przekrojem.
Odkryto trend pokazujący, że znikający frędzel drugi miał szersze zawiązki i więcej żyłek niż normalnie, co wskazuje, że wada mutanta rozpoczęła się wcześnie w rozwoju liścia. Metoda ta umożliwiła również systematyczne badanie wzorców ekspresji fluorescencyjnych reporterów białkowych odpowiedzi hormonalnej w zawiązkach liści. Przygotowanie szkiełka należy rozpocząć od wycięcia prostokątnego kawałka przezroczystej dwustronnej nanotaśmy i przyklejenia go do środka czystego szkiełka bez usuwania folii ochronnej z tworzywa sztucznego na górnej stronie taśmy.
Następnie rozetnij rynnę, usuwając górną część starszych liści za pomocą ściągacza izolacji. Następnie przytrzymaj rynnę za mezokotyl i ostrożnie usuń otaczające liście za pomocą sondy dentystycznej, aby wydobyć interesujące nas primordie. Aby zamontować primordium, usuń folię ochronną z taśmy.
Połóż odsłonięte zawiązki na taśmie. Przetnij zawiązek u podstawy za pomocą żyletki, odrzucając podstawową łodygę i hipokotyl. Aby uzyskać płynniejsze rozwijanie, nasmaruj wewnętrzną lub przyosiową powierzchnię liścia, zanurzając końcówkę igły w 100% glicerolu.
Rozwiń zawiązek za pomocą sondy dentystycznej z wygiętą igłą. Ustawić końcówkę igły równolegle do powierzchni i rozwinąć zewnętrzny brzeg podstawy, delikatnie dociskając go do taśmy. Tak aby zewnętrzny brzeg przylegał do taśmy, wyrównaj końcówkę igły równolegle do długiej osi liścia.
Delikatnie przesuń igłę na boki, aby rozwinąć i spłaszczyć liść na taśmie. Nanieś kroplę wody na rozwinięte zawiązki. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na kropli wody i zawiązku.
Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby przylegały do taśmy. Po zakończeniu umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego, aby uwidocznić fluorofor. Metodę tę zastosowano w celu wizualizacji i analizy ekspresji białek fluorescencyjnych w zawiązkach liści kukurydzy.
Uzupełnienie analizy przekroju poprzecznego, analiza całego montażu liścia ujawniła specyficzne dla tkanek i etapów wzorce odpowiedzi hormonalnej podczas informacji. Metoda analizy całego wierzchowca umożliwiła przeprowadzenie jakościowych i ilościowych analiz ekspresji białek fluorescencyjnych w zawiązkach liści kukurydzy, co wskazuje na skuteczność tej metody w badaniu zawiązków liści kukurydzy, które są trudne do zobrazowania ze względu na ich fałdowaną budowę.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem obrazowania primordiów liści kukurydzy, które naturalnie zwijają się, co utrudnia ich analizę. Badacze przedstawiają udoskonalone protokoły przygotowywania przekrojów poprzecznych oraz rozwiniętych preparatów całych primordiów, co umożliwia lepsze obrazowanie fluorescencyjne i konfokalne.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia roślin
- Rozwój liści kukurydzy
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Primordia liści kukurydzy są osłonięte i zwinięte, co utrudnia ich badanie.
- Zrozumienie anatomii i rozwoju tych struktur jest kluczowe dla badań w dziedzinie biologii roślin.
- Tradycyjne metody obrazowania były ograniczone ze względu na morfologię primordiów.
Zastosowane metody
- Protokoły wykonywania przekrojów poprzecznych przy użyciu ściągacza do izolacji.
- Metody rozwijania całych primordiów liści z wykorzystaniem przezroczystej dwustronnej nanotaśmy.
- Techniki obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego w celu wizualizacji.
Główne wyniki
- Poprawiona dokładność w poprzecznym cięciu i rozwijaniu primordiów liści.
- Wyniki wskazały na różnice w rozwoju primordium związane z konkretnymi mutantami genetycznymi.
- Zastosowane metody umożliwiły systematyczne badanie wzorców ekspresji hormonów w primordiach liści.
Wnioski
- Badanie przedstawia skuteczne techniki wizualizacji i analizy prymordiów liści kukurydzy.
- Metody te mają zastosowanie w szerszych badaniach nad rozwojem liści traw oraz w badaniach anatomicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna wizualizacja i kwantyfikacja prymordiów liści kukurydzy są kluczowe dla wczesnego odkrywania cech rozwoju roślin oraz w genomice funkcjonalnej. Udoskonalone protokoły sekcjonowania i rozwijania umożliwiają niezawodne obrazowanie tkanek głęboko osłoniętych, co wspiera badania oparte na hipotezach oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w procesach biotechnologii roślin uprawnych. Metody te zwiększają pewność predykcyjną w przesiewaniu fenotypowym i walidacji cech dla gatunków traw.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę szlaków rozwojowych u kukurydzy i innych traw.
- Wspiera walidację funkcjonalną genetycznych i hormonalnych celów we wczesnym rozwoju liści.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie systematycznej analizy fenotypów mutantów.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze i priorytetyzacji cech.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Standaryzuje przygotowanie próbek biologicznych do procesów obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.
- Zwiększa powtarzalność i umożliwia ilościową ocenę wzorców ekspresji reporterów.
- Przygotowuje zwalidowane systemy tkankowe do późniejszego screeningu i analizy fenotypowej.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków chemicznych lub perturbacji genetycznych na rozwój liści.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki obrazowania z cechami istotnymi z punktu widzenia chorób lub znaczenia agronomicznego u traw.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedklinyczną walidację cech w programach ulepszania roślin uprawnych.
- Dostarcza danych skorygowanych o ryzyko, które służą do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju w procesach opracowywania cech.
- Umożliwia uzyskanie wglądu w mechanizmy, które wspierają translacyjne strategie biomarkerów w systemach roślinnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejsze protokoły pozycjonują przygotowanie próbek oraz obrazowanie jako kluczowe etapy łączące wczesną fazę odkryć, przesiewy fenotypowe i przedkliniczną walidację cech w procesach biotechnologii roślin.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków poprzez wizualizację cech anatomicznych i rozwojowych.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne przygotowanie próbek do ilościowych analiz obrazowych.
- Analityka: Dostarcza pomiarów i odczytów o wysokiej rozdzielczości do analizy porównawczej warunków genetycznych lub terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy dane obrazowe z walidacją cech i dopasowaniem biomarkerów w procesach ulepszania roślin uprawnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody obrazowania trudnych tkanek roślinnych w wielu projektach i gatunkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji cech i celów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów obrazowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową w programach rozwoju cech.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój wysokowartościowych cech.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w preparatyce roślin oraz w mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury obrazującej oraz narzędzi do przygotowania próbek.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania próbek i obrazowania.
- Może być wymagana adaptacja procedury dla różnych gatunków traw lub morfologii tkanek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość tkanek oraz konieczność precyzyjnej manipulacji manualnej.
