Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source
December 16th, 2015
Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.
Ogólnym celem wykorzystania oprogramowania do analizy obrazu i biologii rozwoju jest uzyskanie danych ilościowych do mechanistycznych modeli procesów biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób można analizować ilościowo zmutowane fenofenotypy? Główną zaletą tej metodologii jest to, że zapewnia ona badaczom możliwość identyfikowania zmian w procesach biologicznych i zjawiskach rozwojowych w sposób bezstronny.
Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w rozwój i morfogenezę elegancji morskiej, może być również zastosowana do innych organizmów modelowych, takich jak josepha, Demonstrując rekonstrukcję kształtu komórki za pomocą IOD będzie CINA Leman, doktorantka w moim laboratorium. Po zainstalowaniu programu IM MOD otwórz powłokę eunucha i wpisz Im mod w oknie IM mod. Wybierz plik z odpowiednimi danymi pierwotnymi, z których chcesz wygenerować model 3D i użyj okna informacyjnego, aby zlokalizować dolną i górną część obiektów w oknie zap.
W oknie informacyjnym ponownie obrysuj kontury komórek, tworząc pierwszy kontur na górnej płaszczyźnie każdej komórki i uważaj, aby utworzyć nowy obiekt dla każdej komórki. Następnie przewiń w dół w Z i utwórz nowy kontur dla każdej płaszczyzny Z, a następnie utwórz nowy obiekt dla każdej komórki. Po obrysowaniu tylu komórek, ile jest odpowiednie dla modelu, otwórz okno widoku modelu, aby sprawdzić obiekty i ich kontury.
Następnie na pasku narzędzi widoku modelu wybierz opcję Edytuj i obiekty. Otworzy się odpowiednie okno edycji, w którym można zamodelować wszystkie komórki jako wypełnione i zamknięte obiekty. Wybierz siatkę jako typ danych rysowania i wypełnienie jako styl rysowania.
Kliknij siatkę i zaznacz limit opcji. Następnie zaznacz tyle obiektów, ile potrzeba, i kliknij siatkę. Cały program będzie generował obiekty bryłowe ze stosów konturów.
Zmień skalę Z w oknie widoku, aby w razie potrzeby dostosować współczynnik próbkowania Z. Następnie w menu edycji wybierz widok, aby obrócić obiekty 3D, zapisując odpowiednio migawki lub filmy komórek, aby śledzić obiekty z fluorescencyjnych nagrań poklatkowych. Korzystając z raportu o niedostarczeniu, najpierw przekonwertuj nieprzetworzone dane na plik TIFF.
Następnie otwórz plik. W końcu spadek. Wybierz ikonę przeglądarki 2D i kliknij ikonę zakresu dopasowania, aby dostosować histogram w menu danych.
Wybierz plik, nazwę, obraz, zestaw, kanał i ustaw rozdzielczość X, Y, Z, a następnie wprowadź wartości X, Y i Z. Aby opisać jądra, przejdź do płaszczyzny zainteresowania i ponownie wybierz przeglądarkę 2D. Następnie wybierz pochodzenie z menu rozwijanego i wybierz nowe pochodzenie.
Kliknij i przeciągnij na interesujące Cię jądro na rynek. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy jądro i wybierz zmień nazwę cząstki. Z menu rozwijanego wprowadź nazwę cząstki, a następnie przeciągnij ikonę strzałki, aby zmienić średnicę okręgu.
Następnie kliknij prawą ikonę, aby zaznaczyć środkową płaszczyznę jądra. Następnie, aby przejść w czasie i płaszczyźnie, wybierz opcje ramki i Z na dolnym pasku narzędzi i dostosuj położenie lub rozmiar okręgu oznaczającego jądro, aż śledzona komórka się podzieli. Gdy zaobserwuje się podział komórki, zaznacz jądra potomne i kliknij ikonę okna, aby przełączyć się na linię.
Przeglądarka zaznacza wszystkie trzy jądra jednocześnie i wybiera stowarzyszonego rodzica pod opcją pochodzenia. Następnie, gdy wszystkie komórki zostaną śledzone, kliknij nazwę pliku i przełącz się na kanał. Oznaczanie pozostałości po podziale komórki w celu ilościowej analizy przepływu w korze mózgowej za pomocą oprogramowania do symetrii prędkości obrazu cząstek.
Załaduj nowe pliki obrazów do pif lab i wybierz styl sekwencjonowania. 1, 2, 2, 3. Następnie przejdź do katalogu zawierającego sekwencję żądanych obrazów.
Wybierz obrazy i kliknij dodaj, aby zaimportować obrazy. Następnie w obszarze Ustawienia analizy wybierz pozycję Wykluczenia. Maska ROI i użyj przycisku.
Narysuj maski dla bieżącej klatki, aby dezaktywować niepożądaną część obrazów w ustawieniach analizy. Ponownie wybierz ustawienia PIF i wybierz szybką deformację okna transformacji Fouriera jako żądany algorytm PIF. W przypadku pierwszego przebiegu wprowadź wartość obszaru przesłuchania wynoszącą 64 piksele z krokiem 32 przebiegów drugich.
Wprowadź wartość obszaru przesłuchania wynoszącą 32 piksele z krokiem 16. Następnie wybierz liniową z menu rozwijanego deformacji okna i wybierz metodę Gaussa dwa na trzy punkty do oszacowania przemieszczenia subpikseli. Teraz wybierz opcję Analizuj z menu Analiza i wybierz opcję Analizuj wszystkie klatki po przekształceniu, wybierz opcję Walidacja wektorowa z menu przetwarzania końcowego i zastosuj próg filtru odchylenia standardowego wynoszący siedem do wszystkich klatek z menu wykresu.
Wybierz parametry pochodne. Modyfikuj dane, a następnie wektory, piksele na klatkę i dostosuj gładkość wektorów i filtr górnoprzepustowy. Po zastosowaniu tych dopasowań do wszystkich ramek, ustaw używane klatki na jedną, aby zakończyć.
Na koniec kliknij przycisk obliczania średnich wektorów, aby zmierzyć średnie wektory wszystkich ramek, skupiając się na zwrocie gonady dzikiego typu C elegancji dorosłych dorosłych, jak właśnie pokazano. Na podstawie danych mikroskopowych generowany jest model 3D komórek rozrodczych, co pozwala na analizę zmian wielkości komórek, które zachodzą podczas tranzytu komórek od dystalnego do bliższego ramienia cus za pomocą dwukolorowej mikroskopii poklatkowej. Modele uzyskane przez liniowe białka fuzyjne histonów i miozynę niemięśniową w NDR ilustrują stereotypowy wzorzec dziedziczenia pozostałości po podziale komórki.
Co więcej, na podstawie danych liniowych w tym eksperymencie można uzyskać ślady dla każdej komórki L i pozostałości po podziale komórki oraz korelację z czasem podziału komórki. Przeprowadzono krótkoterminową mikroskopię poklatkową z wysoką rozdzielczością czasową korowej miozyny niemięśniowej dwójki w celu oceny różnic w dynamice korowego przepływu polaryzacyjnego między zarodkami typu dzikiego a zubożonymi dla rzędu gtpa aktywującego białko RGA trzy zgodnie z oczekiwaniami. Przepływ w zarodkach typu dzikiego odbywał się głównie wzdłuż osi długiej zarodka.
Podczas gdy przepływ w zarodku interferencyjnym RGA był prostopadły do tej osi, co łatwo wynika z analizy. Po opanowaniu ręcznej segmentacji złożonych obiektów i śledzenia komórek podczas rozwoju embrionalnego można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli jest to prawidłowe, podczas próby Wykonaj śledzenie komórek i obiektów. Ważne jest, aby pamiętać o ustawieniu odpowiedniej rozdzielczości czasowej, aby nie stracić obiektu podczas analizy za pomocą trzech opisanych tutaj narzędzi.
Analiza statystyczna może być również przeprowadzona, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zmienności lub po prostu porównać różne zarodki. Wdrożenie oprogramowania do ilościowej analizy obrazu umożliwia nam i innym biologom rozwojowym, takim jak my, badanie morfogenetycznych mechanizmów rozwoju na niespotykanym dotąd poziomie szczegółowości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z różnorodnego zestawu narzędzi programowych do przeprowadzania ilościowej analizy obrazu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł prezentuje metody śledzenia i ilościowego określania procesów rozwojowych u C. elegans za pomocą narzędzi open-source. Obejmuje on rekonstrukcję 3D modeli kształtów komórek, ręczne śledzenie struktur subkomórkowych oraz analizę kortykalnego przepływu skurczu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Analiza obrazów
- Badania ilościowe
Tło
- Oprogramowanie do analizy obrazów pomaga w uzyskiwaniu ilościowych danych dotyczących procesów biologicznych.
- Metodologia pozwala na bezstronne identyfikowanie zmian w zjawiskach rozwojowych.
- Może być zastosowana do różnych organizmów modelowych poza C. elegans.
- Koncentracja na rekonstrukcji kształtów komórek i analizie fenotypów mutantów.
Cel badania
- Dostarczenie wglądu w rozwój i morfogenezę.
- Ilościowa analiza fenotypów mutantów.
- Demonstracja zastosowania narzędzi open-source w biologii rozwoju.
Zastosowane metody
- Instalacja programu IMOD do analizy obrazów.
- Wykorzystanie interfejsu IMOD do generowania modeli 3D z danych surowych.
- Ręczne śledzenie struktur subkomórkowych.
- Analiza kortykalnego przepływu skurczu.
Główne wyniki
- Udana rekonstrukcja 3D modeli kształtów komórek.
- Skuteczna identyfikacja struktur subkomórkowych.
- Ilościowa analiza procesów rozwojowych.
- Demonstrowana metodologia może być zastosowana do różnych organizmów.
Wnioski
- Prezentowane metody poprawiają zrozumienie biologii rozwoju.
- Narzędzia open-source ułatwiają bezstronne analizy procesów biologicznych.
- Potencjał do szerszej aplikacji w różnych kontekstach badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of developmental processes in C. elegans using open-source image analysis tools enables mechanistic de-risking and functional target validation in early discovery. These workflows provide unbiased, reproducible data critical for distinguishing mutant phenotypes and clarifying developmental pathways. Integrating such quantitative imaging approaches strengthens predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of developmental hypotheses and mutant phenotypes.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cell lineage and morphogenetic events.
- Facilitates functional target validation through unbiased phenotype quantification.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes assay outputs with reproducible, open-source analysis pipelines.
- Enables reliable tracking of subcellular structures and developmental events.
- Supports scalable screening of genetic or chemical perturbations in model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative imaging outputs with disease-relevant developmental models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mechanistic hypotheses.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust phenotypic data.
- Supports translational biomarker identification when developmental processes are disease-linked.
Pipeline & Workflow Integration
These open-source imaging and analysis methods integrate from early discovery through preclinical model validation, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative phenotyping.
- Discovery Biology: Quantitative image analysis supports hypothesis-driven interrogation of developmental mechanisms and mutant effects.
- Screening: Standardized tracking and measurement workflows enable reproducible comparison of experimental conditions.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as cell shape, lineage, and contractile flow metrics for statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of developmental phenotypes with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Open-source tools and protocols are adaptable across laboratories and model systems, supporting broad R&D reuse.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental biology studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability through open-source, platform-independent tools.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative image analysis and developmental biology.
- Needs access to microscopy systems and compatible computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and analysis pipelines.
- Adaptable to various model organisms and developmental systems with protocol adjustments.
- Manual segmentation and tracking may be time-intensive until proficiency is achieved.
