Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Ogólnym celem wykorzystania oprogramowania do analizy obrazu oraz biologii rozwoju jest uzyskanie danych ilościowych dla modeli mechanistycznych procesów biologicznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak: w jaki sposób można ilościowo analizować fenotypy mutantów? Główną zaletą tej metodologii jest to, że umożliwia ona badaczom identyfikację zmian w procesach biologicznych i zjawiskach rozwojowych w sposób obiektywny.

Choć tę metodę można wykorzystać do uzyskania wglądu w rozwój i morfogenezę sea elegance, można ją również zastosować do innych organizmów modelowych, takich jak josepha. Rekonstrukcję kształtu komórek za pomocą IOD zaprezentuje CINA Leman, doktorantka w moim laboratorium. Po zainstalowaniu programu IM MOD otwórz powłokę eunuch i wpisz Im mod w oknie IM mod. Wybierz plik z odpowiednimi surowymi danymi, z których ma zostać wygenerowany model 3D, a następnie użyj okna informacyjnego, aby zlokalizować dół i górę obiektów w oknie zap.

W oknie informacji ponownie obrysuj kontury komórek, tworząc pierwszy kontur na górnej płaszczyźnie każdej komórki i dbając o stworzenie nowego obiektu dla każdej z nich. Następnie przesuń się w dół w osi Z i utwórz nowy kontur dla każdej płaszczyzny Z, a następnie stwórz nowy obiekt dla każdej komórki. Po obrysowaniu odpowiedniej liczby komórek do modelu, otwórz okno widoku modelu, aby sprawdzić obiekty i ich kontury.

Następnie na pasku narzędzi widoku modelu należy wybrać opcję edycji i obiekty. Otworzy się odpowiednie okno edycyjne, aby zamodelować wszystkie komórki jako obiekty wypełnione i zamknięte. Jako typ danych rysunkowych należy wybrać siatkę, a jako styl rysowania – wypełnienie.

Kliknij opcję meshing i zaznacz pole cap. Następnie zaznacz wszystkie niezbędne obiekty i kliknij mesh. Program wygeneruje obiekty bryłowe z zestawów konturów.

Zmień skalę Z w oknie podglądu, aby w razie potrzeby dostosować czynnik próbkowania Z. Następnie w menu edycji wybierz opcję widoku, aby obracać obiekty 3D, zapisując zrzuty ekranu lub filmy z komórkami, w zależności od potrzeb, w celu śledzenia obiektów z fluorescencyjnych nagrań poklatkowych. Używając najpierw programu NDR, przekonwertuj surowe dane do pliku TIFF.

Następnie otwórz plik. W programie EndDrop wybierz ikonę przeglądarki 2D i kliknij ikonę dopasowania zakresu (fit range), aby dostosować histogram w menu danych.

Wybierz plik, nazwę, obraz, zestaw i kanał, a następnie ustaw rozdzielczość X, Y, Z i wprowadź wartości X, Y oraz Z. Aby adnotować jądra komórkowe, przejdź do płaszczyzny zainteresowania i ponownie wybierz przeglądarkę 2D. Następnie wybierz lineage z menu rozwijanego i wybierz nową linię (new lineage).

Kliknij i przeciągnij kursor na wybrany jądro komórkowy, aby go oznaczyć. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na jądro i wybierz opcję „zmień nazwę cząstki” (rename particle). Z menu rozwijanego wprowadź nazwę dla cząstki, a następnie przeciągnij ikonę strzałki, aby zmienić średnicę okręgu.

Następnie kliknij prawą ikonę, aby zaznaczyć płaszczyznę centralną jądra. Aby przejść dalej w czasie i w płaszczyźnie, wybierz opcje klatek i Z na dolnym pasku narzędzi, a następnie odpowiednio dostosuj pozycję lub rozmiar okręgu zaznaczającego jądro, aż do momentu podziału śledzonej komórki. Po zaobserwowaniu podziału komórki zaznacz jądra komórek potomnych i kliknij ikonę okien, aby przełączyć się na tryb śledzenia linii komórkowej.

Użytkownik zaznacza wszystkie trzy jądra jednocześnie i wybiera opcję powiązania z rodzicem (associate parent) w ustawieniach linii komórkowej (lineage). Następnie, po śledzeniu wszystkich komórek, należy kliknąć nazwę pliku i przełączyć się na odpowiedni kanał. Zaznaczanie pozostałości podziału komórkowego w celu ilościowej analizy przepływu korowego przy użyciu oprogramowania do symetrii prędkości obrazu cząsteczek (particle image velocity symmetry software).

Wczytaj nowe pliki obrazów w programie pif lab i wybierz styl sekwencjonowania. 1, 2, 2, 3. Następnie przejdź do katalogu zawierającego sekwencję wybranych obrazów.

Wybierz obrazy i kliknij dodaj, aby zaimportować obrazy. Następnie w ustawieniach analizy wybierz wykluczenia. Maskę ROI i użyj przycisku.

Narysuj maski dla bieżącej klatki, aby dezaktywować niepożądane części obrazów w ustawieniach analizy. Ponownie wybierz ustawienia PIF i jako pożądany algorytm PIF wybierz deformację okna szybkiej transformaty Fouriera. Dla pierwszego przejścia wprowadź wartość obszaru odpytywania wynoszącą 64 pikseli z krokiem 32 dla drugiego przejścia.

Wprowadź wartość obszaru interogacyjnego wynoszącą 32 piksele z krokiem 16. Następnie z rozwijanego menu deformacji okna wybierz opcję liniową i wybierz metodę Gaussa dla dwóch na trzy punkty do estymacji przemieszczeń subpikselowych. Teraz z menu analizy wybierz analizuj, a następnie wybierz post-processing wszystkich klatek, z menu post-processingu wybierz walidację wektorów i z menu wykresu zastosuj próg filtra odchylenia standardowego wynoszący siedem do wszystkich klatek.

Wybierz parametry pochodne. Zmodyfikuj dane, a następnie wektory oraz liczbę pikseli na klatkę, a następnie dostosuj wygładzenie wektorów i filtr górnoprzepustowy. Po zastosowaniu tych ustawień do wszystkich klatek, ustaw zakres użytych klatek od pierwszej do ostatniej.

Na koniec kliknij przycisk calculate mean vectors, aby zmierzyć wektory średnie wszystkich klatek koncentrujących się na zakręcie gonady u dorosłych osobników C. elegans typu dzikiego, obrazowanych w sposób przedstawiony powyżej. Na podstawie danych z mikroskopii generowany jest model 3D komórek linii zarodkowej, co pozwala na analizę zmian wielkości komórek występujących podczas ich przemieszczania się z dystalnego do proksymalnego ramienia gonady przy użyciu dwukolorowej mikroskopii time-lapse. Modele uzyskane dzięki białkom fuzyjnym histonów oraz miozynie niemięśniowej w NDR ilustrują stereotypowy wzorzec podziału komórek i dziedziczenia remnantów.

Ponadto, na podstawie danych liniowych, w tym eksperymencie można uzyskać ścieżki dla każdej komórki L i pozostałości po podziale komórkowym oraz korelację z czasem podziału komórki. W celu oceny różnic w dynamice polarnego przepływu korowego między embrionami typu dzikiego a embrionami pozbawionymi białka RGA3 (białka aktywującego GTPazę z rodziny Rho), zgodnie z oczekiwaniami, przeprowadzono krótkoterminową mikroskopię time-lapse z wysoką rozdzielczością czasową dla korowej nie mięśniowej miozyny II. Przepływ w embrionach typu dzikiego przebiegał głównie wzdłuż długiej osi embrionu.

Podczas gdy przepływ w zarodku z interferencją RNA w fazie RGA3 był prostopadły do tej osi, co wyraźnie wynika z analizy PIP. Po opanowaniu techniki, manualna segmentacja złożonych obiektów i śledzenie komórek podczas rozwoju zarodkowego może zostać wykonane w ciągu kilku godzin, jeśli jest przeprowadzone prawidłowo, podczas prób śledzenia komórek i obiektów. Ważne jest, aby ustawić odpowiednią rozdzielczość czasową, aby nie zgubić obiektu podczas analizy z wykorzystaniem trzech opisanych tutaj narzędzi.

Analizę statystyczną można również przeprowadzić w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące zmienności lub po prostu w celu porównania różnych embrionów. Wdrożenie oprogramowania do ilościowej analizy obrazu umożliwia nam oraz innym biologom rozwoju badanie mechanizmów morfogenetycznych rozwoju na niespotykanym dotąd poziomie szczegółowości. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać zróżnicowany zestaw narzędzi programowych do przeprowadzenia ilościowej analizy obrazu.