Name: Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metody śledzenia i ilościowego określania procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source. Technika ta umożliwia bezstronną analizę fenotypów mutacyjnych i morfogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

1. Przygotowanie zarodków C. elegans do mikroskopii poklatkowej przy użyciu mikrogranulek
<ol>
	<li>Przenieś ciężarne dorosłe robaki za pomocą szpikulca (drut platynowy) do kropli buforu M9 i usuń bakterie, najpierw energicznie mieszając, a następnie przenosząc każdego robaka do sąsiedniej kropli M9 za pomocą rzęsy zamontowanej na końcówce wykałaczki/pipety lub użyj spiczastej szklanej kapilary.</li>
	<li>Rozcieńczyć dyspersję zawierającą kulki polistyrenowe o średnicy 20 μm 10-krotnie w buforze M9 (1 l buforu M9 zawiera 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, a po autoklawowaniu (20 min, 120 °C) dodać dodatkowy 1 ml 1 M roztworuMgSO4</li>).
	<li>Przygotuj pipetę doustną z dowolnego rodzaju cienkiej szklanej kapilary (np. kapilar do pomiaru temperatury topnienia lub kapilar używanych do wyciągania igieł iniekcyjnych), kawałka gumy, silikonu lub rurki z podobnego materiału o długości około 0,5 m (najlepiej przezroczystej), końcówki do pipety o pojemności 200 μl, pokrywki probówki do PCR o pojemności 200 μl, filtra hydrofobowego do małych strzykawek (np.., o wielkości porów 0,2-0,45 μm i średnicy 15-50 mm z nylonu, PTFE lub podobnego materiału) oraz końcówka do pipety o pojemności 1000 μl. Ten rodzaj pipety do ust zapewnia, że żaden materiał biologiczny nie może mieć kontaktu z eksperymentatorem.</li>
	<li>Zmontuj pipetę, wkładając końcówkę pipety o pojemności 200 μl końcówką do przodu do rurki i zatkaj ją pokrywką probówki do PCR, która ma centralną perforację dopasowaną do średnicy użytej kapilary. Do wygenerowania perforacji można użyć bardzo spiczastego szydła lub igły preparacyjnej.</li>
	<li>Narysuj cienką kapilarnę i włóż ją do perforacji. Włóż filtr do drugiego końca rurki i włóż końcówkę pipety o pojemności 1000 μl jako ustnik (Rysunek 1).</li>
	<li>Rozbioruj dorosłe osobniki, przecinając robaki poprzecznie na sromie czystą żyletką lub skalpelem. 
	UWAGA: Zwykle wiele zarodków zostanie wydalonych po ścięciu. Jeśli jednak potrzebne są wczesne zarodki, czasami trzeba je uwolnić z tuszy za pomocą rzęsy lub spiczastej igły.</li>
	<li>Odpipetować jedną kroplę rozcieńczonej dyspersji kulek polistyrenowych (~4 μl) na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24x60 mm i przenieść zarodki do tej kropli za pomocą pipety doustnej.</li>
	<li>Ostrożnie umieść małą (np. 18x18 lub 20x20 mm) szklankę nakrywkową na wierzchu kropli i upewnij się, że kropla całkowicie się rozproszyła. 
	UWAGA: Kropla powinna być również na tyle mała, aby nie dotykać krawędzi małego szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Uszczelnij uchwyt upłynnioną wazeliną. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na stronę szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24x60 mm i przejdź do sekcji "Mikroskopia poklatkowa".</li>
</ol>
2. Przygotowanie dorosłych zwierząt C. elegans do mikroskopii poklatkowej przy użyciu nanokulek
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, protokół dotyczący montowania dorosłych zwierząt jest adaptacją protokołu z ref. 18. Dzięki temu protokołowi możliwe jest wykonanie długotrwałej poklatkowej mikroskopii konfokalnej dorosłych zwierząt.
<ol>
	<li>Przygotować 1,5% (w/v) roztwór agarozy w buforze M9, zagotować (1 min, 100 °C w łaźni wodnej lub kuchence mikrofalowej). Nie zaleca się stosowania wyższych stężeń agarozy, ponieważ może to prowadzić do wytłoczenia jelita i/lub części gonady.</li>
	<li>Przyklej 2-3 warstwy taśmy na dwa szkiełka mikroskopowe każda. Umieść szkiełko bez taśmy między dwoma slajdami za pomocą taśmy.</li>
	<li>Użyj końcówki pipety i umieść jedną kroplę gorącego roztworu agarozy na środku środkowego szkiełka. Szybko umieść kolejny slajd na kropli, tak aby był podtrzymywany przez warstwy taśmy z każdej strony. W ten sposób powstanie okrągła i płaska podkładka agarowa o średnicy około 10 mm.</li>
	<li>Umieść kroplę roztworu kulek o długości 100 nm (nierozcieńczonego, który zawiera 2,6% (w/v)) na podkładkę. Przenieś 1-10 oczyszczonych dorosłych robaków do kropli za pomocą wykałaczki. Uszczelnić szkłem nakrywkowym o wymiarach 18x18 mm i wazeliną, jak wyjaśniono w protokole 1.</li>
</ol>
3. Mikroskopia poklatkowa
<ol>
	<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku mikroskopowym lub kanapkę ze szkłem nakrywkowym. Użyj jasnego pola przy małym powiększeniu (obiektywy 5x lub 10x), aby zlokalizować próbkę. 
	UWAGA: Ogranicz ekspozycję na światło niebieskie tak bardzo, jak to możliwe (w szczególności w przypadku zarodków C. elegans), np. nie używaj mikroskopii epifluorescencyjnej do znalezienia/wyogniskowania próbki, ale zamiast tego użyj jasnego pola.</li>
	<li>Zmień na większe powiększenie (obiektywy 40x lub 60x), ustaw ostrość próbki (albo płaszczyzna centralna, albo górna/dolna płaszczyzna próbki, w zależności od oprogramowania do akwizycji).</li>
	<li>Ustaw interwały próbkowania na 30 płaszczyzn w odstępach 1 μm rejestrowanych co 1 minutę. W przypadku, gdy dostępny jest zautomatyzowany stolik xy lub xyz, wiele spotów może być rejestrowanych w jednej sesji. Przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne i ponownie sprawdź ostrość. 
	UWAGA: Staraj się unikać używania dużych mocy lasera, a raczej używaj nieco dłuższych czasów naświetlania przy bardzo niskich intensywnościach. Zmierz pozyskane obrazy od razu, albo w programie do akwizycji obrazu, albo w ImageJ, aby uniknąć nasycenia, które przycina zakres dynamiki, a także oznacza nadmierną ekspozycję na promieniowanie.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie serii poklatkowej. 
	UWAGA: Aby wykluczyć analizowanie artefaktów, zacznij od długich (3-10 min) odstępów czasu między skanowaniem próbki i stopniowo zwiększaj próbkowanie czasowe do żądanych interwałów. Czas rozwoju, jak również punkty końcowe w obu przypadkach powinny być podobne podczas przeprowadzania analizy statystycznej. Ponadto często konieczna jest ocena wskaźników fototoksyczności i przeżywalności. Dlatego odzyskaj próbkę z mocowania po długotrwałej mikroskopii poklatkowej i sprawdź, czy nadal się rozwijają/żyją.</li>
</ol>
4. Rekonstrukcja modelu 3D Cell Shape za pomocą IMOD
UWAGA: Oprogramowanie IMOD jest dostępne na stronie internetowej IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. Instalacja oprogramowania jest tam opisana. W przypadku korzystania z systemu operacyjnego Windows należy zainstalować zestaw narzędzi Unix, który można również znaleźć jako pakiet na stronie internetowej IMOD. Co więcej, na stronie IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html) dostępny jest doskonale skompilowany wstęp do 3dmod.
<ol>
	<li>Otwórz powłokę uniksową i wpisz "imod". Otworzy się okno IMOD. Wybierz plik z nieprzetworzonymi danymi (najlepiej ułożonym w stos tifem lub podobnym), z którego chcesz wygenerować model 3D.</li>
	<li>Zlokalizuj dolną i górną część obiektów w oknie ZaP za pomocą okna informacyjnego (narzędzie do przewijania w górę i w dół).</li>
	<li>Rozpocznij śledzenie konturów komórek. Co ważne, upewnij się, że każda komórka jest jednym obiektem. Zacznij od górnej płaszczyzny każdej komórki i utwórz tam pierwszy kontur za pomocą okna informacyjnego. Przewiń w dół w polu z i utwórz nowy kontur dla każdej płaszczyzny z.</li>
	<li>Zrób to samo dla tylu komórek, ile potrzeba do modelowania w 3D. Nie zapomnij utworzyć nowego obiektu, gdy zaczynasz od nowej komórki. 
	UWAGA: Istnieje wiele różnych sposobów śledzenia konturów i kilka pomocnych wtyczek. Szczegółowe informacje można znaleźć na stronie internetowej IMOD i samouczkach online. W przedstawionym tutaj przypadku użyto ustawienia domyślnego.</li>
	<li>Otwórz okno "Widok modelu", aby sprawdzić obiekty i ich kontury.</li>
	<li>Na pasku narzędzi "Widok modelu" wybierz "Edycja" -"Obiekty". Otworzy się odpowiednie okno edycji.</li>
	<li>Aby modelować komórki jako wypełnione i zamknięte obiekty, wybierz "Siatka" jako "Typ danych rysowania" i "Wypełnienie" jako "Styl rysowania". Kliknij "Siatka" w przewijanym zaznaczeniu w lewym dolnym rogu okna. Zaznacz opcję "Czapka" w zaznaczeniu w prawym dolnym rogu. Zaznacz tyle obiektów, ile potrzeba, i kliknij "Mesh All". Program wygeneruje obiekty bryłowe ze stosów konturów. Współczynnik próbkowania Z można dostosować, zmieniając "Skalę Z" w oknie "Widok".</li>
	<li>Przesuń/obróć obiekt 3D ("Edycja" - "Widok") i zapisz migawki lub filmy ("Plik" -"Snap Tiff As ... " lub "Film/Montaż").</li>
</ol>
5. Śledzenie fluorescencyjnie oznakowanych struktur za pomocą Endrova
UWAGA: Aby śledzić pozostałości po podziałach komórek, użyj szczepu z markerem błony jądrowej lub plazmatycznej do identyfikacji komórek (np. H2B, PH-PLC-d1) i markerem pozostałości po podziale komórki (np. NMY-2, ZEN-4). Marker błony jądrowej lub plazmatycznej jest ważny dla określenia, która komórka dziedziczy pozostałość po podziale komórki.
<ol>
	<li>Aby zapewnić szybkie ładowanie i łatwość użycia, surowe dane muszą zostać przekonwertowane na plik tiff (np. w ImageJ). Następnie otwórz Endrov i załaduj plik do analizy, wybierając opcję "Załaduj plik" z menu plików. Kliknij ikonę "Przeglądarka 2D" na pasku narzędzi.</li>
	<li>Dostosuj histogram, klikając ikonę "Dopasuj zakres" (niebieska ikona w prawym dolnym rogu ekranu Endrova). Ustaw rozdzielczość XYZ, przechodząc do "Dane" -"nazwa pliku"-"Zestaw obrazów" -"Kanał"-"Ustaw rozdzielczość XYZ". Wpisz wartości dla X, Y i Z, np. 5, 5, 1, jeśli rozdzielczość X i Y wynosi 0,2 μm i próbkuj co 1 μm w Z.</li>
	<li>Aby oznaczyć jądra, przejdź do płaszczyzny zainteresowania i kliknij "Przeglądarka 2D". Wybierz "Pochodzenie" z menu rozwijanego i wybierz "Nowe pochodzenie".</li>
	<li>Klikając i przeciągając jądro, można je oznaczyć. Aby nazwać jądro, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zmień nazwę cząstki" z menu rozwijanego. Aby zwiększyć lub zmniejszyć średnicę okręgu, przeciągnij ikonę strzałki, która pojawia się po lewej stronie zaznaczonego okręgu. Aby zaznaczyć środkową płaszczyznę jądra, kliknij prawą ikonę. Podczas korzystania ze znacznika błony plazmatycznej można narysować dużą kulę, która pokryje większość komórki.</li>
	<li>Aby poruszać się w czasie i płaszczyźnie, wybierz opcje "Ramka" i "Z" na dolnym pasku narzędzi. Po przejściu do następnego punktu czasowego dostosuj odpowiednio położenie lub rozmiar okręgu oznaczającego jądro. Powtarzaj to, aż śledzona komórka się podzieli.</li>
	<li>Gdy nastąpi podział komórki, zaznacz jądra potomne i przełącz się na "Przeglądarkę linii". Można to wybrać, klikając ikonę "Windows" na górnym pasku narzędzi. Zaznacz wszystkie trzy jądra jednocześnie, przejdź do opcji "Pochodzenie" na górnym pasku narzędzi i wybierz "Skojarz rodzica".</li>
	<li>Po zakończeniu śledzenia komórek przełącz się na kanał oznaczający pozostałość podziału komórki do śledzenia. Aby przełączyć kanały, kliknij nazwę pliku w lewym dolnym rogu paska narzędzi. Pozostałość po podziale komórki (lub dowolną inną strukturę) można śledzić w sposób opisany powyżej dla jądra.</li>
	<li>Po powrocie do oprogramowania po zamknięciu należy przejść do "Przeglądarka 2D" -"Pochodzenie"-"Edycja" i kliknąć numer pochodzenia, który będzie edytowany.</li>
</ol>
6. Analiza przepływu aktomyozyny korowej za pomocą PIVlab
UWAGA: PIVlab jest darmowym oprogramowaniem od: http://pivlab.blogspot.de/; można go wywołać z poziomu środowiska wiersza poleceń Matlaba, wpisując PIVlab_GUI. Podczas pracy z PIVlab zaleca się zapisanie serii obrazów w osobnym folderze.
<ol>
	<li>Rozpocznij nową sesję z "Menu Plik". Załaduj pliki obrazów, klikając przycisk "Załaduj obrazy".</li>
	<li>Wybierz styl sekwencjonowania 1-2, 2-3, ... i przejdź do katalogu zawierającego sekwencję żądanych obrazów. Wybierz obrazy i kliknij przycisk "Dodaj" i zaimportuj.</li>
	<li>Przejdź do "Ustawienia analiz" i wybierz "Wykluczenia (ROI,Maska)". Możesz też nacisnąć "Ctrl + E". Użyj przycisku "Narysuj maskę (maski) dla bieżącej klatki", aby dezaktywować niepożądaną część obrazu (tj. obszar poza zarodkiem).</li>
	<li>Wybierz "Ustawienia PIV" z menu "Ustawienia analiz". Możesz też nacisnąć "Ctrl + S". Wybierz "Deformacja okna FFT" jako żądany algorytm PIV. 
	UWAGA: Szybka transformacja Fouriera (FFT) zmniejsza koszt obliczeń, ale jest zalecana tylko wtedy, gdy sygnał jest znacznie powyżej szumu i jeśli przemieszczenie badanych cząstek nie przekracza połowy analizowanego obszaru przejścia (patrz 6.5).</li>
	<li>Wprowadź następujące wartości dla trzech przebiegów, które są obszarem przesłuchania dla intensywności korelacji krzyżowej między kolejnymi obrazami: Przebieg 1: Obszar przesłuchania 64 pikseli z krokiem 32. Przebieg 2: Obszar przesłuchania o długości 32 pikseli z krokiem 16. Wybierz opcję "liniowe" z menu rozwijanego Deformacja okna. Wybierz metodę Gaussa 2*3-punktową do szacowania przemieszczenia subpikseli.</li>
	<li>Wybierz "Analizuj!" z menu Analiza i użyj przycisku "Analizuj wszystkie klatki", aby rozpocząć analizę.</li>
	<li>Do przetwarzania końcowego wybierz "Walidacja wektora" z menu "Przetwarzanie końcowe" i ustaw próg filtra odchylenia standardowego (Odch.Ancyjna) na 7 i zastosuj do wszystkich klatek.</li>
	<li>Wybierz "Określ parametry / zmień dane" z menu "Wykres". Wybierz "Wektory [px/klatka]" z menu rozwijanego. Dostosuj płynność wektorów i filtra górnoprzepustowego i zastosuj do wszystkich klatek.</li>
	<li>Aby obliczyć średnie wektory wszystkich ramek, ustaw "Używane ramki" na 1:end i kliknij przycisk "Oblicz średnie wektory".</li>
</ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li>
<li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+growth+in+4D%3A+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li>
<li>Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li>
<li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rotational+cortical+flow%2C+asymmetric+midbody+positioning%2C+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533(2014).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endrov%3A+an+integrated+platform+for+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li>
<li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIVlab+-+Towards+User-friendly%2C+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Research+Software%22%5BJournal%5D)">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30(2014).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
<li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li>
<li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li>
<li>Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165(2014).</li>
<li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li>
<li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li>
<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li>
<li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li>
<li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope%3A+variability+of+development+and+regional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li>
</ol>

Badania w laboratorium CP są finansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) oraz Klaster Badawczy LOEWE Sieci Ubikwityny. CP jest dodatkowo wspierany przez Program Ramowy Unii Europejskiej nr 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

Dzięki śledzeniu obiektów w trakcie rozwoju, w szczególności śledzeniu jądrowym, możliwe było wyjaśnienie centralnych mechanizmów wzorcowania embriogenezy C. elegans 1,23,24. Rozszerzając tę strategię na wyższą przepustowość, udało się ostatnio odkryć dodatkowe reguły wzorców i zaproponować metodę dedukowania reguł wzorców de novo10. Jednak w przypadku wielu mutantów dokładne wady wzoru są nadal nieznane. Opisane tutaj metody są narzędziami, które mogą być pomocne w ich wyjaśnieniu...

Dzięki stałym ulepszeniom białek fluorescencyjnych, inżynierii genomu, mikroskopii świetlnej oraz oprogramowania i sprzętu komputerowego, możliwe jest teraz rejestrowanie rozwoju wielu organizmów modelowych w niespotykanej dotąd rozdzielczości czasoprzestrzennej. Dzięki temu badacze mogą zadawać pytania, na które wcześniej nie można było odpowiedzieć, lub ponownie przyjrzeć się znanym procesom rozwojowym w celu poszukiwania przeoczonych aspektów. Postęp ten zapoczątkował dziedzinę ilościowej biologii rozwoju, której celem jest przekształcenie jakościowych, nieformalnych modeli w modele ilościowe poprzez dokładne pomiary i analizy statystyczne.
Śledzenie komórek i struktur subkomórkowych umożliwiło uzyskanie ilościowych modeli rozwoju embrionalnego, aktywności układu nerwowego lub podziału komórek1-12. Śledząc pozostałości po podziałach komórkowych we wczesnym okresie rozwoju zarodka C. elegans, mogliśmy niedawno odkryć, że podążają one stereotypową ścieżką i stanowią ważne czynniki polaryzujące13,14.
Tutaj prezentowane są protokoły, które udostępniają ilościowe podejścia do biologii rozwojowej dla laików. Nacisk kładziony jest na trzy proste, ogólnodostępne narzędzia, które można wdrożyć w każdym laboratorium, które ma dostęp do standardowej mikroskopii konfokalnej i komputerów. Obejmują one protokół do generowania kształtów komórek 3D, protokół do śledzenia pozostałości po podziałach komórek oraz protokół do ilościowego opisu dynamiki aktomiozyny korowej. Nicienie C. elegans są używane jako przykładowy przypadek, jednak omówione tutaj metody i narzędzia są odpowiednie do różnych pytań w innych modelach biologicznych, np. hodowanych komórkach, eksplantatach tkanek, organoidach lub sferoidach, innych zarodkach itp.
Generalnie, niektóre z przedstawionych tutaj analiz można również wykonać za pomocą popularnego narzędzia open source ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; lub FIJI, wersji ImageJ z 'dołączonymi bateriami', http://fiji.sc/Fiji), dla której dostępnych jest wiele wtyczek do różnych analiz ilościowych. Jednak omawiane tutaj programy są przeznaczone do rozwiązywania konkretnych problemów.
Po pierwsze, IMOD, pakiet do przetwarzania, modelowania i wyświetlania obrazów, może być używany do rekonstrukcji 3D przekrojów szeregowych z mikroskopii elektronowej lub świetlnej15. IMOD zawiera również narzędzia do przeglądania danych 3D z dowolnej orientacji. Po drugie, Endrov, program Java przeznaczony do wykonywania analizy obrazu, przetwarzania danych i adnotacji sieci lub ścieżek (między innymi) w oparciu o rozszerzoną architekturę wtyczek, z kompatybilnością z wtyczkami ImageJ16. Zawiera ponad 140 operacji przetwarzania obrazu i rozszerzalny interfejs użytkownika, w którym model i surowe dane są wyświetlane oddzielnie. Jego kod źródłowy można znaleźć pod adresem https://github.com/mahogny/Endrov. Po trzecie, PIVlab, narzędzie MATLAB do cyfrowej prędkości obrazu cząstek, które pozwala użytkownikowi na ilościową i jakościową analizę pól przepływu cząstek17. Korzystanie z tych programów wymaga licencji MATLAB, która zawiera Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab to program przeznaczony do ilościowego opisu przepływu. Oblicza rozkład prędkości, wielkość, wirowość, dywergencję lub ścinanie w parach lub seriach obrazów. W tym celu koreluje krzyżowo małe obszary obrazów (zwane "przejściami" w sekcji protokołu) pary obrazów, aby uzyskać najbardziej prawdopodobne przemieszczenie cząstek. Ta korelacja krzyżowa daje macierz korelacji, którą można analizować w dziedzinie przestrzeni lub częstotliwości przy użyciu odpowiednio bezpośredniej korelacji krzyżowej lub szybkiej transformacji Fouriera (FFT).
Sprzęt używany tutaj to mikroskop odwrócony wyposażony w tarczę Nipkow ("wirującą"), EMCCD, standardowe lasery półprzewodnikowe 488 i 561 nm oraz 20-krotne powietrzne lub 40-krotne lub 60-krotne płaskie/apochromatyczne obiektywy olejowe lub wodne. Możliwe jest jednak również wykonywanie obrazowania poklatkowego za pomocą innych metod obrazowania, np. mikroskopii laserowej ze skanowaniem punktowym, liniowym lub arkuszowym, mikroskopii wielofotonowej, a także mikroskopii epifluorescencyjnej połączonej z dekonwolucją lub oświetleniem strukturalnym. Zaletą korzystania z systemu dyskowego Nipkow jest niezwykle szybka akwizycja obrazu, zwłaszcza jeśli dostępny jest tryb strumieniowy (ciągły ruch i skanowanie obiektu w wymiarze z). Ponadto, aby poprawić rozdzielczość, można użyć 1,5-krotnego przedłużacza powiększającego przed EMCCD.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Mikroskop stereoskopowy do preparowania i montażu</td></tr><tr><td>mikrosfer polistyrenowych Polybead,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Montaż zarodka</td></tr><tr><td>20 &mikro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery polistyrenowe Polybead,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Montaż dla dorosłych zwierząt</td></tr><tr><td>0,1 i mikro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Mocowanie dla dorosłych zwierząt</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Mocowanie zarodków/dorosłych</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Mocowanie zarodków</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Usuwanie zarodków</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Rurka do pipety doustnej</td></tr><tr><td>30 mm Filtr membranowy PTFE</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filtr do pipety doustnej</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Końcówka pipety do pipety doustnej</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Montaż zarodka/dorosłego</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>Montaż dla dorosłych zwierząt</td></tr><tr><td>Di-wodorofosforan potasu</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>Bufor M9 Fosforan</td></tr><tr><td>di-sodowy</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>Bufor M9</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>Bufor M9</td></tr><tr><td>System konfokalny VisiScope Spinning Disc</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>Mikroskopia konfokalna</td></tr></tbody></table>

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u c. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Ilościowe uchwycenie procesów rozwojowych jest kluczowe dla uzyskania modeli mechanistycznych oraz kluczowe dla identyfikacji i opisu zmutowanych fenotypów. Przedstawiono tu protokoły przygotowania zarodków i dorosłych zwierząt C. elegans do krótko- i długoterminowej mikroskopii poklatkowej oraz metody śledzenia i oznaczania ilościowego procesów rozwojowych. Wszystkie przedstawione metody oparte są na szczepach C. elegans dostępnych w Centrum Genetyki Caenorhabditis oraz na oprogramowaniu open-source, które można łatwo wdrożyć w dowolnym laboratorium, niezależnie od zastosowanego systemu mikroskopowego. Pokazano rekonstrukcję trójwymiarowego modelu komórki przy użyciu oprogramowania do modelowania IMOD, ręczne śledzenie znakowanych fluorescencyjnie struktur subkomórkowych za pomocą wielofunkcyjnego programu do analizy obrazu Endrov oraz analizę korowego przepływu kurczliwego za pomocą PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB). Omówiono również, w jaki sposób metody te można również zastosować do ilościowego uchwycenia innych procesów rozwojowych w różnych modelach, np. śledzenia komórek i linii, śledzenia przepływu pęcherzyków.

Z wykorzystaniem protokołów 2, 3 i 4 wykonuje się obrazowanie poklatkowe gonad dorosłych osobników C. elegans typu dzikiego (szczep OD58 (unc-119(ed3) III; ltIs38[pAA1; pie-1::GFP::PH(PLC1delta1) + unc-119(+)]), wykazujący ekspresję markera błony z promotora linii zarodkowej). Koncentrując się na zakręcie gonady, z danych mikroskopowych generowany jest model 3D komórek zarodkowych (Rycina 2). Model ten pozwala na analizę zmian wielkości komórek podczas ich przejścia z ramienia dystalnego do prok...

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Ogólnym celem wykorzystania oprogramowania do analizy obrazu oraz biologii rozwoju jest uzyskanie danych ilościowych dla modeli mechanistycznych procesów biologicznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak: w jaki sposób można ilościowo analizować fenotypy mutantów? Główną zaletą tej metodologii jest to, że umożliwia ona badaczom identyfikację zmian w procesach biologicznych i zjawiskach rozwojowych w sposób obiektywny.Choć tę metodę można wykorzystać do uzyskania wglądu w rozwój i morfogenezę sea elegance, można ją również zastosować do innych organizmów modelowych, takich jak josepha. Rekonstrukcję kształtu komórek za pomocą IOD zaprezentuje CINA Leman, doktorantka w moim laboratorium. Po zainstalowaniu programu IM MOD otwórz powłokę eunuch i wpisz Im mod w oknie IM mod. Wybierz plik z odpowiednimi surowymi danymi, z których ma zostać wygenerowany model 3D, a następnie użyj okna informacyjnego, aby zlokalizować dół i górę obiektów w oknie zap.W oknie informacji ponownie obrysuj kontury komórek, tworząc pierwszy kontur na górnej płaszczyźnie każdej komórki i dbając o stworzenie nowego obiektu dla każdej z nich. Następnie przesuń się w dół w osi Z i utwórz nowy kontur dla każdej płaszczyzny Z, a następnie stwórz nowy obiekt dla każdej komórki. Po obrysowaniu odpowiedniej liczby komórek do modelu, otwórz okno widoku modelu, aby sprawdzić obiekty i ich kontury.Następnie na pasku narzędzi widoku modelu należy wybrać opcję edycji i obiekty. Otworzy się odpowiednie okno edycyjne, aby zamodelować wszystkie komórki jako obiekty wypełnione i zamknięte. Jako typ danych rysunkowych należy wybrać siatkę, a jako styl rysowania – wypełnienie.Kliknij opcję meshing i zaznacz pole cap. Następnie zaznacz wszystkie niezbędne obiekty i kliknij mesh. Program wygeneruje obiekty bryłowe z zestawów konturów.Zmień skalę Z w oknie podglądu, aby w razie potrzeby dostosować czynnik próbkowania Z. Następnie w menu edycji wybierz opcję widoku, aby obracać obiekty 3D, zapisując zrzuty ekranu lub filmy z komórkami, w zależności od potrzeb, w celu śledzenia obiektów z fluorescencyjnych nagrań poklatkowych. Używając najpierw programu NDR, przekonwertuj surowe dane do pliku TIFF.Następnie otwórz plik. W programie EndDrop wybierz ikonę przeglądarki 2D i kliknij ikonę dopasowania zakresu (fit range), aby dostosować histogram w menu danych.Wybierz plik, nazwę, obraz, zestaw i kanał, a następnie ustaw rozdzielczość X, Y, Z i wprowadź wartości X, Y oraz Z. Aby adnotować jądra komórkowe, przejdź do płaszczyzny zainteresowania i ponownie wybierz przeglądarkę 2D. Następnie wybierz lineage z menu rozwijanego i wybierz nową linię (new lineage).Kliknij i przeciągnij kursor na wybrany jądro komórkowy, aby go oznaczyć. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na jądro i wybierz opcję „zmień nazwę cząstki” (rename particle). Z menu rozwijanego wprowadź nazwę dla cząstki, a następnie przeciągnij ikonę strzałki, aby zmienić średnicę okręgu.Następnie kliknij prawą ikonę, aby zaznaczyć płaszczyznę centralną jądra. Aby przejść dalej w czasie i w płaszczyźnie, wybierz opcje klatek i Z na dolnym pasku narzędzi, a następnie odpowiednio dostosuj pozycję lub rozmiar okręgu zaznaczającego jądro, aż do momentu podziału śledzonej komórki. Po zaobserwowaniu podziału komórki zaznacz jądra komórek potomnych i kliknij ikonę okien, aby przełączyć się na tryb śledzenia linii komórkowej.Użytkownik zaznacza wszystkie trzy jądra jednocześnie i wybiera opcję powiązania z rodzicem (associate parent) w ustawieniach linii komórkowej (lineage). Następnie, po śledzeniu wszystkich komórek, należy kliknąć nazwę pliku i przełączyć się na odpowiedni kanał. Zaznaczanie pozostałości podziału komórkowego w celu ilościowej analizy przepływu korowego przy użyciu oprogramowania do symetrii prędkości obrazu cząsteczek (particle image velocity symmetry software).Wczytaj nowe pliki obrazów w programie pif lab i wybierz styl sekwencjonowania. 1, 2, 2, 3. Następnie przejdź do katalogu zawierającego sekwencję wybranych obrazów.Wybierz obrazy i kliknij dodaj, aby zaimportować obrazy. Następnie w ustawieniach analizy wybierz wykluczenia. Maskę ROI i użyj przycisku.Narysuj maski dla bieżącej klatki, aby dezaktywować niepożądane części obrazów w ustawieniach analizy. Ponownie wybierz ustawienia PIF i jako pożądany algorytm PIF wybierz deformację okna szybkiej transformaty Fouriera. Dla pierwszego przejścia wprowadź wartość obszaru odpytywania wynoszącą 64 pikseli z krokiem 32 dla drugiego przejścia.Wprowadź wartość obszaru interogacyjnego wynoszącą 32 piksele z krokiem 16. Następnie z rozwijanego menu deformacji okna wybierz opcję liniową i wybierz metodę Gaussa dla dwóch na trzy punkty do estymacji przemieszczeń subpikselowych. Teraz z menu analizy wybierz analizuj, a następnie wybierz post-processing wszystkich klatek, z menu post-processingu wybierz walidację wektorów i z menu wykresu zastosuj próg filtra odchylenia standardowego wynoszący siedem do wszystkich klatek.Wybierz parametry pochodne. Zmodyfikuj dane, a następnie wektory oraz liczbę pikseli na klatkę, a następnie dostosuj wygładzenie wektorów i filtr górnoprzepustowy. Po zastosowaniu tych ustawień do wszystkich klatek, ustaw zakres użytych klatek od pierwszej do ostatniej.Na koniec kliknij przycisk calculate mean vectors, aby zmierzyć wektory średnie wszystkich klatek koncentrujących się na zakręcie gonady u dorosłych osobników C. elegans typu dzikiego, obrazowanych w sposób przedstawiony powyżej. Na podstawie danych z mikroskopii generowany jest model 3D komórek linii zarodkowej, co pozwala na analizę zmian wielkości komórek występujących podczas ich przemieszczania się z dystalnego do proksymalnego ramienia gonady przy użyciu dwukolorowej mikroskopii time-lapse. Modele uzyskane dzięki białkom fuzyjnym histonów oraz miozynie niemięśniowej w NDR ilustrują stereotypowy wzorzec podziału komórek i dziedziczenia remnantów.Ponadto, na podstawie danych liniowych, w tym eksperymencie można uzyskać ścieżki dla każdej komórki L i pozostałości po podziale komórkowym oraz korelację z czasem podziału komórki. W celu oceny różnic w dynamice polarnego przepływu korowego między embrionami typu dzikiego a embrionami pozbawionymi białka RGA3 (białka aktywującego GTPazę z rodziny Rho), zgodnie z oczekiwaniami, przeprowadzono krótkoterminową mikroskopię time-lapse z wysoką rozdzielczością czasową dla korowej nie mięśniowej miozyny II. Przepływ w embrionach typu dzikiego przebiegał głównie wzdłuż długiej osi embrionu.Podczas gdy przepływ w zarodku z interferencją RNA w fazie RGA3 był prostopadły do tej osi, co wyraźnie wynika z analizy PIP. Po opanowaniu techniki, manualna segmentacja złożonych obiektów i śledzenie komórek podczas rozwoju zarodkowego może zostać wykonane w ciągu kilku godzin, jeśli jest przeprowadzone prawidłowo, podczas prób śledzenia komórek i obiektów. Ważne jest, aby ustawić odpowiednią rozdzielczość czasową, aby nie zgubić obiektu podczas analizy z wykorzystaniem trzech opisanych tutaj narzędzi.Analizę statystyczną można również przeprowadzić w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące zmienności lub po prostu w celu porównania różnych embrionów. Wdrożenie oprogramowania do ilościowej analizy obrazu umożliwia nam oraz innym biologom rozwoju badanie mechanizmów morfogenetycznych rozwoju na niespotykanym dotąd poziomie szczegółowości. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać zróżnicowany zestaw narzędzi programowych do przeprowadzenia ilościowej analizy obrazu.

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Poznaj metody śledzenia i ilościowego określania procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source. Technika ta umożliwia bezstronną analizę fenotypów mutacyjnych i morfogenezy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Przeglądaj więcej filmów