Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy
5 marca 2017
Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.
Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie akumulacji transkryptu w określonych komórkach lub domenach komórkowych, tak aby można było dokonać porównań między różnymi domenami lub między równoważnymi domenami w próbkach zmutowanych i dzikich typów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób określa się domeny narządów lub jak określone mutacje wpływają na ekspresję genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że akumulację transkryptu można określić ilościowo w niewielkich, precyzyjnie zdefiniowanych domenach, które są zbyt małe, aby można je było ręcznie wypreparować.
Przed rozpoczęciem tej procedury należy wyhodować płaskie sadzonki kukurydzy w standardowych warunkach do wieku dwóch tygodni. Aby wyciąć wierzchołki pędów na boczne odcinki, najpierw wytnij sadzonkę tuż poniżej linii gleby. Następnie użyj żyletki, aby usunąć cienkie plasterki z podstawy łodygi, aż zobaczysz owal spokoju otoczony jednym lub dwoma dojrzałymi liśćmi.
Wykonaj kolejne cięcie około 10 milimetrów nad podstawą. Ten 10-milimetrowy segment zawiera merystem wierzchołkowy pędu w zawiązkach młodych liści. Obróć 10-milimetrowy segment tak, aby podstawa była skierowana do góry.
Wykonaj dwa cięcia równolegle do osi bocznej, aby uzyskać poślizg tkanki o grubości od dwóch do trzech milimetrów. Wyrzuć dwie zewnętrzne części i zachowaj środkową kropelkę do utrwalenia i osadzenia. Zanurz plasterek tkanki w około 10 mililitrach utrwalonych w szklanej fiolce na lodzie.
Po wycięciu wszystkich próbek należy zastosować próżnię, aby usunąć pęcherzyki powietrza i ułatwić penetrację utrwalacza. Przytrzymaj odkurzacz przez 10 minut, a następnie powoli zwolnij próżnię. Wymień utrwalacz i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie wstrząsając.
Następnego dnia kontynuuj przetwarzanie tkanek do zatopienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odlewać bloki parafinowe, umieść formy do zatapiania na płycie grzejnej stacji zatapiania tkanek i za pomocą kleszczy przenieś próbki tkanek do form do zatapiania powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Umieść pierścień do osadzania na górze formy.
Uzupełnij każdą foremkę stopioną parafiną. Przenieś formy na zimną płytę, aż parafina zastygnie. Przechowuj bloki parafiny w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Skrawki są wycinane z bloków parafiny na mikrotomie zgodnie ze standardowymi procedurami, a do montażu wybierane są środkowe sekcje zawierające merystem wierzchołkowy pędu. Aby zamontować sekcje na szkiełkach, umieść slajdy, które są wolne od RNaz lub upieczone na podgrzewaczu do szkiełków o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Nałóż kilka kropli 50% roztworu etanolu, aby pokryć każde szkiełko.
Delikatnie ułóż sekcje na szkiełku i unieś je na roztworze etanolu, aż się rozszerzą. Następnie przechylić szkiełko i usunąć nadmiar roztworu etanolu przez zasysanie za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Używaj niestrzępiących się chusteczek, aby usunąć nadmiar roztworu etanolu.
Suszyć szkiełka w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez kilka godzin lub przez noc. Gdy szkiełka wyschną, przechowuj je w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odparafinować szkiełka w dniu mikrodysekcji.
Przygotuj trzy szklane słoiki Coplin, dwa słoiki zawierające około 50 mililitrów 100% ksylenów i jeden słoik zawierający około 50 mililitrów 100% etanolu. Zanurz szkiełka w ksylenach jeden na dwie minuty, ksylenach dwóch na dwie minuty i 100% etanolu na jedną minutę. Odcedź szkiełka na niestrzępiących się chusteczkach i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy zabezpieczyć szkiełka na stoliku mikroskopu laserowego do mikrodysekcji. Kluczowym czynnikiem sukcesu mikrodysekcji laserowej w eksperymentach RNasic jest wykorzystanie markerów morfologicznych i molekularnych do wyboru precyzyjnych domen do mikrodysekcji. Zbadaj szkiełka za pomocą obiektywu 5X i zidentyfikuj pięć najbardziej medianowych sekcji na każdym slajdzie, używając wierzchołka merystema wierzchołkowego pędu jako centralnego punktu odniesienia.
Następnie użyj obiektywu 10X lub 20X, aby określić położenie języczka na plastochronowym zawiązku siedmiu liści każdej sekcji. Języczek będzie widoczny jako guzek wystający z przyosiowej powierzchni zawiązka liścia. Użyj narzędzia do rysowania w oprogramowaniu do mikrodysekcji laserowej, aby zaznaczyć tę pozycję.
Wybierz ikonę rysowania odręcznego, przesuń kursor w odpowiednie miejsce, a następnie kliknij i przeciągnij myszą, aby narysować. Następnym krokiem jest użycie linijki i prostokątnego narzędzia do rysowania do zmierzenia 100 prostokątów o wysokości mikrometrów wyśrodkowanych na ligule każdej sekcji jako próbek liguli. Aby użyć narzędzia linijki, wybierz ikonę linijki, przesuń kursor na jeden koniec obszaru, który ma być mierzony, a następnie kliknij i przeciągnij, aby zmierzyć region.
Długość linijki zostanie pokazana na ekranie. Użyj linijki, aby zmierzyć 100-mikrometrowy segment wyśrodkowany na języczku. Aby narysować prostokąt, wybierz narzędzie do rysowania linii prostych i narysuj cztery linie proste.
W ten sam sposób zmierz prostokąty o długości 100 mikrometrów umieszczone 50 mikrometrów powyżej i poniżej prostokąta liguli. Będą to próbki ostrza i pochwy. Mikropreparuj zmierzone prostokąty za pomocą funkcji cięcia laserowego, aby przeciąć przekrój tkanki wzdłuż konturu wybranej domeny, oraz funkcji katapulty, aby przesunąć prostokąt tkanki ze szkiełka do pokrywy rurki.
Zbierz próbki liguli, ostrza i osłony w oddzielnych probówkach. Tę samą procedurę należy zastosować do mikrodysekcji próbek naskórka ostrzowego, ligulowego i osłonkowego z plastochronu siedmiolistnego primordiów. Na koniec nałóż bufor do ekstrakcji RNA na mikrowypreparowaną tkankę i przystąp do ekstrakcji RNA, amplifikacji RNA, budowy biblioteki, sekwencjonowania i analizy bioinformatycznej, jak opisano w manuskrypcie.
Kiedy przeanalizowano akumulację transkryptu i wszystkie warstwy komórek obszaru ostrza, języczka i osłonki, znaleziono 2 359 genów o zróżnicowanej ekspresji. W obszarach adaksjalnego ostrza naskórka, języczka i pochewki znaleziono 3 128 genów o zróżnicowanej ekspresji. Mikrodysekcja laserowa, RLM, sekwencjonowanie RNA i analizy hybrydyzacji in situ dały spójne wyniki, co ilustrują te reprezentatywne geny.
Karykatury po lewej stronie ilustrują LM wszystkich warstw komórek, a kreskówki po prawej ilustrują LM tylko naskórka adaksjalnego. Groty strzałek na obrazach wskazują wyłaniające się języczki. Akumulacja transkryptu jednego liguli była znacznie wyższa w ligule zarówno we wszystkich warstwach komórek, jak i w naskórkowym LM. Wąska osłonka pierwsza była znacznie podwyższona w regionie liguli zarówno we wszystkich warstwach komórkowych LM, jak i w naskórku adaksjalnym LM i gromadzi się specyficznie na końcu wyłaniającego się ligula.
Gen o nieznanej funkcji miał wyższą średnią liczbę przeliczeń w LM naskórka liguli niż we wszystkich warstwach LM.Transkrypt ten najsilniej gromadzi się w komórkach naskórka. Czwarty gen, Zm PIN1a, nie ulegał istotnej zróżnicowanej ekspresji w analizie wszystkich warstw komórkowych, ale był znacznie podwyższony w ligule w analizie tylko naskórka. Jego wysoka ekspresja w tkance naczyniowej mogła zakłócić różnice w akumulacji transkryptu w naskórku, gdy zebrano wszystkie warstwy komórek.
Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać, że wybór domen komórkowych do mikroanalizy i porównania oraz dokładność mikrosekcji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na ilościowym określaniu akumulacji transkryptów w określonych domenach komórkowych u kukurydzy. Podkreśla znaczenie zrozumienia różnic w ekspresji genów na granicy blaszki liściowej-pochw i w mutacjach lg1-R w porównaniu z typem dzikimi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Ekspresja genów
- Transkryptyka
Tło
- Geny ważne dla rozwoju wykazują wzorce ekspresji komórkowej lub tkankowej.
- Zrozumienie tych wzorców jest kluczowe dla wnikliwego rozumienia specyfikacji domen narządów.
- Mutacje mogą znacząco wpływać na ekspresję genów, wpływając na procesy rozwojowe.
- Akumulację transkryptów można ilościowo określić w małych, określonych domenach.
Cel badania
- Zidentyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej-pochw u kukurydzy.
- Porównać ekspresję genów w mutacjach lg1-R z próbkami typu dzikiego.
- Przedstawić metodę analizy danych transkryptomicznych w biologii rozwojowej.
Zastosowanie metod
- Eksperymenty LM RNA-seq do analizy ekspresji genów.
- Sekcja wierzchołków pędów z sadzonek kukurydzy w celu przekrojów bocznych.
- Standardowe warunki wzrostu sadzonek kukurydzy przed eksperymentami.
- Ilościowe określenie akumulacji transkryptów w określonych domenach komórkowych.
Główne wyniki
- Identyfikacja genów o zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej-pochw.
- Porównanie ekspresji genów w mutacjach lg1-R względem próbek typu dzikiego.
- Demonstracja skuteczności metody w analizie małych domenach komórkowych.
- Wgląd w sposób, w jaki określone mutacje wpływają na ekspresję genów podczas rozwoju.
Wnioski
- Badanie dostarcza wartościowej metody analizy transkryptomicznej w biologii rozwojowej.
- Zrozumienie wzorców ekspresji genów może informować o rozwoju narządów i efektach mutacji.
- To podejście można zastosować do innych zjawisk rozwojowych poza kukurydzą.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser Microdissection RNA-Seq enables precise quantification of transcript accumulation in narrowly defined plant tissue domains, addressing the challenge of spatially restricted gene expression that is often masked in whole-organ analyses. This approach enhances predictive confidence in target validation by isolating the biological context of gene regulation, supporting risk-adjusted decisions in early discovery and functional genomics pipelines. Accurate domain selection and microdissection fidelity are critical for generating reproducible, actionable transcriptomic data that inform portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function in specific developmental domains, clarifying pathway roles.
- Supports biological de-risking by isolating the effects of mutations or perturbations on gene expression.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing spatially restricted differential expression.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing context-dependent gene activity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue domains for downstream transcriptomic workflows.
- Standardizes sample selection using morphological and molecular landmarks for reproducibility.
- Generates quantitative gene expression outputs suitable for comparative analysis.
- Enables reliable evaluation of candidate genes or pathways in defined biological contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic findings with disease-relevant or developmental biomarkers when applicable.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling precise domain-specific analyses.
- Provides mechanistic de-risking by clarifying the spatial context of gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, supporting both target validation and mechanistic studies in plant and potentially other model systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by quantifying transcripts in defined domains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression data for assay development and screening readiness.
- Analytics: Provides differential expression measurements that enable robust comparison across conditions or genotypes.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when spatial gene expression is relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics across diverse developmental or disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of transcriptomic analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying biological context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of targets based on spatial gene expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, microdissection, and transcriptomic analysis.
- Demands access to laser microdissection instrumentation and RNA-seq infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample selection and domain definition.
- May require adaptation for different tissue types or developmental stages.
- Precision in domain selection and microdissection is critical for data quality and interpretability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Tissue Fixation and Processing
3:03
Sectioning and Slide Preparation
4:57
Microdissection of Blade, Ligule, and Sheath Samples from Plastochron 7 Leaf Primordia
7:48
Results: Laser Microdissection RNA Sequencing Identifies Differentially Expressed Genes in Maize Leaf
9:38
Conclusion
