Name: Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Odkryj metodę LM RNA-seq do analizy ekspresji genów w specyficznych domenach komórkowych kukurydzy. Technika ta pozwala ilościowo określić akumulację transkryptów w mikroskopijnych obszarach liścia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują S. Hake za ciągłą współpracę i stymulowanie dyskusji na temat rozwoju liguli. Praca ta jest wspierana przez National Science Foundation Grants MCB 1052051 i IOS-1848478.

UWAGA: Napraw tkankę do analizy histologicznej w tym samym czasie, w którym tkanka jest ustalana dla LM. Zbadaj wybarwione skrawki pod kątem cech morfologicznych, które poprowadzą później LM. Porównując mutanta z typem dzikim, przeprowadź hybrydyzację in situ lub immunolokalizację, aby zdefiniować domenę, w której dochodzi do ekspresji interesującego genu (w tym przypadku lg1).
1. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Sadzonki kukurydzy uprawiane są na równinach do dwóch tygodni w standardowych warunkach6.</li>
	<li>Wypreparuj wierzchołki pędów dla odcinków bocznych (ryc. 4).
	<ol>
		<li>Wyciąć sadzonkę tuż poniżej linii gleby.</li>
		<li>Za pomocą żyletki usuń cienkie plasterki z podstawy łodygi (nacięcia 1, ryc. 4A), aż zobaczysz owal łodygi otoczony jednym lub dwoma dojrzałymi liśćmi (ryc. 4B).</li>
		<li>Wykonaj kolejne cięcie około 10 mm powyżej podstawy (cięcie 2, Rysunek 4A). Ten 10-milimetrowy segment będzie zawierał SAM i zawiązki młodych liści.</li>
		<li>Obróć segment 10 mm tak, aby podstawa była skierowana do góry. Wykonaj dwa cięcia równolegle do osi bocznej, tak aby uzyskać wycinek tkanki o grubości 2-3 mm (nacięcia 3 i 4, ryc. 4B). Wyrzuć dwie zewnętrzne części i zachowaj środkową kromkę do utrwalenia i osadzenia. 
		UWAGA: Zewnętrzne liście można przyciąć i wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napraw tkankę i proces osadzania.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wszystkie materiały, które mają być użyte w kolejnych krokach, są wolne od RNazy. Roztwory należy traktować pirowęglanem dietylu (DEPC) (1 ml DEPC na litr roztworu. Inkubować przez noc z okazjonalnym wstrząsaniem i autoklawować). Piecz szklane naczynia w piekarniku w temperaturze 200 °C lub wyższej przez co najmniej 6 godzin i traktuj plastikowe naczynia roztworem do odkażania RNazy.</li>
		<li>Dzień 1: Zanurz plastry tkanki w ~ 10 ml Farmer's fix (3:1 Etanol: kwas octowy) w szklanej fiolce na lodzie. Po wypreparowaniu wszystkich próbek należy zastosować próżnię, aby usunąć pęcherzyki powietrza i ułatwić penetrację utrwalacza. Trzymaj pod próżnią przez 10 minut, a następnie powoli zwalniaj odkurzacz. Wymienić utrwalacz i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Dzień 2: Inkubować w następujących seriach roztworów, po ~10 ml każdy, po 1 godzinie każdy, wszystkie delikatnie wstrząsając; 85% etanol w 4 °C, 95% etanol w 4 °C, 100% etanol w 4 °C, 100% etanol w 4 °C, 100% etanol w 4 °C, etanol 1:1: ksyleny w temperaturze pokojowej, 100% ksyleny w temperaturze pokojowej, 100% ksylenów w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Ksyleny są toksyczne przez kontakt i wdychanie. Pracuj pod wyciągiem i używaj odpowiednich rękawic.</li>
		<li>Dodać osadzanie w tkance parafinowej do około połowy objętości ksylenów i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Dzień 3: Przenieść fiolkę do piekarnika o temperaturze 60 °C, aż granulki się rozpuszczą. Odlej roztwór i zastąp świeżo stopionym podłożem do zatapiania tkanek. Zmieniaj podłoże jeszcze dwa razy w ciągu dnia.</li>
		<li>Dzień 4: Raz rano należy zmienić podłoże do zatapiania tkanek. Przywrócić piekarnik do 60 °C do popołudnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bloki odlewane
	<ol>
		<li>Umieść formy do zatapiania na gorącej płycie stacji zatapiania tkanek. Za pomocą kleszczy przenieś próbki tkanek do form do zatapiania powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Uzupełnij formę stopioną parafiną i umieść pierścień do zatapiania na wierzchu formy. Przenieś na zimną płytę, aż parafina zastygnie. Bloki parafiny przechowywać w temperaturze 4 °C w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja i przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Wytnij odcinki 10 μm na mikrotomie25.</li>
	<li>Sprawdź wstążki i wybierz sekcje mediany. Sekcje środkowe to te, które zawierają SAM, który pojawia się jako kopuła komórek otoczona zawiązkami liści.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na zjeżdżalniach.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka nadające się do LM (bez RNaz lub upieczone) na podgrzewaczu do szkiełek o temperaturze 42 °C i nałóż kilka kropli 50% roztworu etanolu, aby przykryć szkiełko.</li>
		<li>Pływaj sekcje na roztworze etanolu, aż sekcje się rozszerzą. 
		UWAGA: Pływające sekcje na roztworze etanolu, a nie na wodzie, utrzymują RNA w stanie wytrąconym, zmniejszając degradację RNA.</li>
		<li>Przechylić, przesunąć i usunąć nadmiar roztworu etanolu przez zassanie za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Używaj niestrzępiących się chusteczek, aby usunąć nadmiar roztworu etanolu.</li>
		<li>Suszyć szkiełka w temperaturze 42 °C przez kilka godzin lub przez noc. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odparafinować szkiełka w dniu użytkowania.
	<ol>
		<li>Przygotuj trzy szklane słoiki Coplin zawierające: 100% ksylenów (ksyleny I), 100% ksylenów (ksyleny II) i 100% etanolu (~50 ml każdego roztworu).</li>
		<li>Używając czystych kleszczy do przenoszenia szkiełek, zanurz szkiełka w ksylenach I na 2 minuty, ksylenach II na 2 minuty i 100% etanolu na 1 minutę.</li>
		<li>Odcedź szkiełka na niestrzępiących się chusteczkach i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikrodysekcja próbek ostrza, języczka i pochewki z Plastochron 7 Primordia Liści
<ol>
	<li>Zabezpiecz szkiełka na stoliku mikroskopu LM. Użyj pięciu lub sześciu slajdów dla każdej repliki, wykorzystując pięć sekcji na każdą prowadnicę. 
	UWAGA: Łączenie tkanek dla pojedynczej kontrpróby zilustrowano na rysunku 5.</li>
	<li>Zbadaj slajdy i zidentyfikuj pięć najbardziej medianowych sekcji na każdym slajdzie, używając wierzchołka SAM jako centralnego punktu odniesienia. 
	UWAGA: Można to zrobić przy małym powiększeniu, zwykle wystarczy obiektyw 5X.</li>
	<li>Używając obiektywu 10X lub 20X, określ położenie języczka na zawiązku liścia plastochron 7 każdej sekcji. Języczek będzie widoczny jako guzek wystający z przyosiowej powierzchni zawiązka liścia. Zaznacz tę pozycję za pomocą narzędzia do rysowania w oprogramowaniu LM; Wybierz ikonę ołówka, przesuń kursor w odpowiednie miejsce, a następnie kliknij i przeciągnij mysz, aby rysować. 
	UWAGA: Obiektyw 10X lub 20X jest odpowiedni do tego i kolejnych kroków. W przypadku stosowania odcinków bocznych, dwie strony każdego zawiązka liścia będą obecne w każdej sekcji (ryc. 2A).</li>
	<li>Za pomocą linijki i prostokątnego narzędzia do rysowania zmierz prostokąty o wysokości 100 μm wyśrodkowane na języczku każdej sekcji (czerwone prostokąty, rysunek 2A, 2B). Będzie to próbka "Ligule".
	<ol>
		<li>Aby użyć narzędzia linijki, wybierz ikonę linijki, przesuń kursor na jeden koniec mierzonego obiektu, kliknij i przeciągnij, aby zmierzyć obiekt. Długość linijki zostanie pokazana na ekranie.</li>
		<li>Aby narysować prostokąt, wybierz ikonę prostokąta, przesuń kursor do punktu, który będzie jednym z rogów prostokąta, kliknij i przeciągnij, aby narysować prostokąt o odpowiednim rozmiarze. Możesz też wybrać narzędzie do rysowania linii prostych i narysować cztery linie proste.</li>
		<li>Zmierz prostokąty o średnicy 100 μm umieszczone 50 μm powyżej i poniżej prostokąta "Ligule". 
		UWAGA: Będą to odpowiednio próbki "Ostrze" i "Pochwa" (zielone i niebieskie prostokąty, rysunek 2A, 2B). Na podstawie naszych danych histologicznych prostokąt o wielkości 100 μm obejmuje cały obszar liguli. Wybrano porcje ostrza i pochwy o równoważnej wielkości, aby zapewnić pobranie podobnych ilości tkanki dla każdej z nich. Zastosowano przekładki o grubości 50 μm, aby upewnić się, że żadna tkanka obszaru liguli nie zostanie przypadkowo włączona do mikrodysekcji ostrza lub pochewki.</li>
	</ol>
	</li>
	Mikroanaliza zmierzonych prostokątów (Rysunek 2D-2F)7,8,9, zbierając próbki Ligule, Blade i Strap w oddzielnych probówkach.<li> Użyj funkcji cięcia laserowego, aby przeciąć przekrój tkanki wzdłuż konturu wybranej domeny. Użyj funkcji katapulty, aby zepchnąć prostokąt tkanki ze szkiełka do pokrywy rurki (Rysunek 2D-2F).</li>
</ol>
4. Mikrodysekcja próbek naskórka osiowego ostrza, liguli i pochewki z Plastochron 7 Primordia liści
<ol>
	<li>Wybierz sekcje i za pomocą linijki zmierz segmenty o wysokości 100 μm wyśrodkowane na języczku plastochron 7, jak opisano w sekcji 3 (powyżej).
	<ol>
		<li>Zaznacz tylko nadosiowe komórki naskórka z każdego segmentu "ostrza" i "osłonki" o wysokości 100 μm (zielone i niebieskie zaznaczenia, rysunek 2C), obrysowując je za pomocą narzędzia do rysowania. Naskórek jest zewnętrzną warstwą komórkową; strona adaksjalna jest tą, która znajduje się najbliżej SAM.</li>
		<li>Do próbki "Ligule" należy wybrać tylko komórki powstającego guzka liguli, jak opisano w sekcji 3.3 (czerwony wybór, rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikropreparować wybrane obszary, pobierając próbki naskórka ostrza, języczka i pochewki w oddzielnych probówkach, jak opisano w sekcji 3.5.</li>
</ol>
5. Mikrodysekcja Primordii Plastochron 6 z lg1-R i rodzeństwa typu dzikiego
<ol>
	<li>Uprawiaj segregujące rodziny zmutowanych (lg1-R) i roślin typu dzikiego.</li>
	<li>Napraw i przetwórz wierzchołki strzeleckie dla LM, zgodnie z opisem w sekcjach 1.2-1.4. Napraw wierzchołki pędów typu dzikiego i zmutowanego w osobnych fiolkach, aby je rozdzielić. Próbki z tego samego sadzenia powinny być utrwalone i przetworzone do hybrydyzacji in situ.</li>
	<li>Określ, gdzie lg1 jest transkrybowany w rodzeństwie typu dzikiego, wykonując hybrydyzację lg1 in situ6,26,27. Zmierz pozycję akumulacji transkryptu lg1 od podstawy zawiązka liścia w wielu próbkach (ryc. 1E).</li>
	<li>Na podstawie danych z hybrydyzacji in situ wybierz część zawiązka liści, która obejmuje region, w którym lg1 jest transkrybowany. W tym przypadku 400-900 μm od podstawy plastochronu 6 zawiązków liściowych (fioletowe prostokąty, ryc. 2A).</li>
	<li>Mikrodysekcja wybranej części zawiązków liści, jak opisano w sekcji 3.5, zbierając próbki lg1-R i typu dzikiego w oddzielnych probówkach.</li>
</ol>
6. Zastosuj bufor do ekstrakcji RNA
<ol>
	<li>Nałożyć 50 μl buforu do ekstrakcji RNA na mikrowypreparowaną tkankę i przystąpić ekstrakcję RNA. Kontynuuj ekstrakcję RNA, amplifikację RNA, budowę biblioteki, sekwencjonowanie i analizę bioinformatyczną zgodnie z opisem w reference6.</li>
</ol>

<ol><li>Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liguleless-1+gene+acts+tissue+specifically+in+maize+leaf+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development.</a> Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).</li>
<li>Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+during+normal+and+liguleless-1+maize+leaf+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development.</a> Development. 110 (3), 985-1000 (1990).</li>
<li>Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((liguleless1+encodes+a+nuclear-localized+protein+required+for+induction+of+ligules+and+auricles+during+maize+leaf+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis.</a> Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).</li>
<li>Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).</li>
<li>Moon, J., Candela, H., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Liguleless+narrow+mutation+affects+proximal-distal+signaling+and+leaf+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth.</a> Development. 140 (2), 405-412 (2013).</li>
<li>Johnston, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+Analyses+Indicate+That+Maize+Ligule+Development+Recapitulates+Gene+Expression+Patterns+That+Occur+during+Lateral+Organ+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation.</a> Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).</li>
<li>Schmid, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), e29685(2012).</li>
<li>Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+cells+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of cells from plant tissues.</a> Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).</li>
<li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%2C+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types%3A+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Brooks, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS Genet. 5 (5), e1000476(2009).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+abscission+zone+transcriptome+profiling+reveals+new+candidates+for+abscission+control%3A+enhanced+retention+of+floral+organs+in+transgenic+plants+overexpressing+Arabidopsis+ZINC+FINGER+PROTEIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li>
<li>Eveland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+modules+controlling+maize+inflorescence+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture.</a> Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).</li>
<li>Takacs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+maize+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the maize shoot apical meristem.</a> Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).</li>
<li>Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+apical+meristem+and+cotyledon+formation+during+Arabidopsis+embryogenesis%3A+interaction+among+the+CUP-SHAPED+COTYLEDON+and+SHOOT+MERISTEMLESS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes.</a> Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).</li>
<li>Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CUP-SHAPED+COTYLEDON+genes+in+gynoecium+and+ovule+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).</li>
<li>Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CUP-SHAPED+COTYLEDON1+gene+of+Arabidopsis+regulates+shoot+apical+meristem+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation.</a> Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).</li>
<li>Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+duplicate+genes+narrow+sheath1+and+narrow+sheath2+encode+a+conserved+homeobox+gene+function+in+a+lateral+domain+of+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems.</a> Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).</li>
<li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Birnbaum, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318 (5851), 801-806 (2007).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).</li>
<li>Jackson, D., Veit, B., Hake, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43253604_Expression_of_maize_KNOTTED1_related_homeobox_genes_in_the_shoot_apical_meristem_predicts_patterns_of_morphogenesis_in_the_vegetative_shoot">Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot.</a> Development. 120, 405-413 (1994).</li>
<li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+for+the+precise+localization+of+transcripts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants.</a> J Vis Exp. (57), e3328(2011).</li>
<li>Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+global+RNA+amplification+and+its+use+for+high-throughput+transcript+analysis+of+laser-microdissected+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Plant+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm.</a> Int J Plant Genomics. , 61028(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Projekt eksperymentalny jest krytycznym czynnikiem w eksperymentach sekwencyjnych RNA. Kluczowymi kwestiami są dokładna dziedzina (dziedziny) i etap rozwoju (etapy) rozwoju, które mają być analizowane, oraz porównania, które zostaną dokonane. Ważne jest, aby myśleć w kategoriach porównań, ponieważ wynikiem jest zazwyczaj lista genów, które są DE między dwoma lub więcej warunkami. Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów, ważne jest, aby zmieniać tylko jedną zmienną na raz. Na przykład, porównując różne domeny li...

Liść kukurydzy stanowi idealny model do badania tworzenia się pól rozwojowych podczas morfogenezy, ponieważ posiada wyraźną granicę między blaszką a pochwą, która umożliwia analizę genetyczną (Rysunek 1A). W wczesnych etapach rozwoju liścia liniowy pas mniejszych komórek, pas przedligularny (PLB), poddziela prymordium liścia na domeny przedblaszkowe i przedpochewne. Z PLB rozwijają się przypominająca frędzlę liguła oraz trójkątne uszka (Rysunek 1A, C, D). Przesiewy genetyczne pozwoliły zidentyfikować mutacje zaburzające granicę między blaszką a pochwą. Na przykład recesywne mutacje liguleless1 (lg1) powodują zanik liguły i uszek1,2,3,4 (Rysunek 1B). Hybrydyzacja in situ wykazała, że transkrypty lg1 gromadzą się w PLB i rozwijającej się ligule, co czyni ten gen doskonałym markerem rozwoju liguły5,6 (Rysunek 1E).
<img alt="Anatomia roślin w zakresie struktur liścia; schemat przedstawia blaszkę, uszko, języczek, pochwę oraz przekroje tkanek." src="/files/ftp_upload/55004/55004fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Typy dzikie i liguleless1-R liście kukurydzy (A) Region granicy między blaszką a pochwą dojrzałego liścia typu dzikiego, wykazujący struktury języczka i uszek. (B) Obszar graniczny między blaszką a pochwą u dojrzałych liguleless1-R liść wykazujący brak struktur języczkowej i uszaków. Liście na zdjęciach A i B zostały przecięte wzdłuż żyłki środkowej. (C) Przekrój podłużny przez primordium liścia typu dzikiego. Próbka została opracowana i zabarwiona do analizy histologicznej. Początkująca ligula jest widoczna jako wybrzuszenie wystające poza płaszczyznę liścia (grot strzałki). (DPrzekrój podłużny przez pryzmordium liścia typu dzikiego. Próbkę przygotowano do mikroskopii świetlnej (LM) zgodnie z opisem w tekście. Grot strzałki wskazuje inicjującą ligulę.E) lg1 in situ hybrydyzacja podłużnego przekroju bocznego wierzchołka pędu. Gwiazdki oznaczają lg1 akumulacja transkryptu w PLB primordium liścia P6. Strzałki wskazują podstawę primordium P6. Pasek oznacza pomiar od podstawy primordium do PLB. Paski skali na A i B = 20 mm. Paski skali na C-E = 100 µmRysunek zmodyfikowano na podstawie literatury6(Copyright American Society of Plant Biologists). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55004/55004fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
W niniejszym badaniu zastosowano metodę LM RNA-Seq w celu zidentyfikowania zestawu genów wykazujących różnicową ekspresję (DE) na granicy między blaszką a pochwą w stosunku do innych części prymordium liścia, a także w celu zidentyfikowania genów z DE u mutantów lg1-R w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. LM RNA-Seq jest metodą kwantyfikacji akumulacji transkryptywnej w konkretnych komórkach lub domenach komórkowych7. Systemy LM łączą laser i mikroskop z cyfrowym aparatem fotograficznym. Przecięta tkanka jest montowana na szkiełkach i oglądana pod mikroskopem. Oprogramowanie LM zazwyczaj zawiera narzędzia do rysowania, które pozwalają użytkownikowi wyznaczyć obrys dowolnego wybranego obszaru do mikrodysekcji. Laser wykonuje cięcie wzdłuż linii, a wybrana tkanka zostaje wyrzucona z szkiełka do probówki zawieszonej nad nim. Metoda LM umożliwia precyzyjną mikrodysekcję domen, w tym konkretnych warstw komórkowych, a nawet pojedynczych komórek8,9. Następnie z mikrodysektowanej tkanki można wyizolować RNA. W kolejnym kroku komponent RNA-Seq wykorzystuje sekwencjonowanie następnej generacji do sekwencjonowania bibliotek cDNA wytworzonych z wyizolowanego RNA10,1.
Kluczowe zalety LM RNA-seq to możliwość ilościowego określenia akumulacji transkryptów w precyzyjnie zdefiniowanych obszarach oraz zdolność do jednoczesnego profilowania całego transkryptomu7. Technika ta jest szczególnie odpowiednia do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych, w których obszar zainteresowania jest często mikroskopijny. Wcześniejsze badania wykorzystywały LM w połączeniu z technologią mikromacierzy do badania procesów rozwojowych u roślin9,12,13. RNA-Seq daje korzyść w postaci ilościowego określenia transkryptów w szerokim zakresie dynamicznym, w tym genów o niskim poziomie ekspresji, i nie wymaga wcześniejszej informacji o sekwencji10,1. Co więcej, LM RNA-Seq ma potencjał do wskazania genów istotnych dla rozwoju, które mogą zostać pominięte w badaniach mutagennych ze względu na redundancję genetyczną lub letalność mutanta z utratą funkcji.
Geny istotne dla rozwoju, takie jak narrow sheath1 (ns1) i cup-shaped cotyledon2 (cuc2), często wykazują specyficzne wzorce ekspresji ograniczone do tylko jednej lub kilku komórek17,18,19,20. Wiele z nich ulega ekspresji wyłącznie w wczesnych etapach rozwoju, a nie w dojrzałym organie. Podczas analizy całych organów lub dużych obszarów transkrypty specyficzne dla tych komórek ulegają rozcieńczeniu i mogą nie zostać wykryte w konwencjonalnych analizach. Dzięki umożliwieniu analizy precyzyjnie zdefiniowanych obszarów, LM RNA-Seq pozwala na identyfikację i kwantyfikację tych genów specyficznych dla tkanek.
Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces opisanych tutaj eksperymentów były szczegółowa analiza histologiczna, która pomogła w wyborze odpowiedniego stadium rozwojowego i obszaru do analizy, oraz precyzyjny pomiar domen komórkowo-tkankowych dla LM. Aby zapewnić pobieranie równoważnych domen dla wszystkich powtórzeń, tkankę pobierano z primordiów liści na tym samym etapie rozwoju, a mikrodysekcjowane domeny mierzono względem punktów orientacyjnych morfologicznie, takich jak wyłaniająca się ligula (Rycina 2). Znane jest, że niektóre geny są eksprymowane w gradiencie od wierzchołka do nasady liścia. Dzięki pomiarowi precyzyjnych domen zminimalizowano zmienność wynikającą z pobierania próbek z różnych miejsc wzdłuż osi proksymalno-dystalnej liścia (Rycina 3A). Poprzez mikrodysekcję domen o tej samej wielkości zredukowano również zmienność wynikającą z różnic w rozcieńczeniu transkryptów specyficznych dla danych komórek (Rycina 3B). Do wszystkich mikrodysekcji wykorzystano boczne przekroje podłużne wierzchołka pędu. Są to przekroje prostopadłe do osi żyłka środkowy-brzeg (Rycina 4). Stosowanie wyłącznie przekrojów obejmujących SAM zapewnia analizę równoważnych obszarów bocznych primordiów liści.
W próbkach przetworzonych i przekrojonych do badania za pomocą LM, pierwszym morfologicznym objawem wzrostu języczka jest wybrzuszenie po stronie adaksjalnej, powstałe w wyniku periklinalnych podziałów komórek w epidermie adaksjalnej (Rycina 1D, Rycina 2). Ustalono, że powstający języczek można wiarygodnie zidentyfikować na etapie primordiów liści w siódmym plastochronie. Interesowały nas geny ekspresjonowane w całym regionie języczka, w tym w powstającym języczku oraz w komórkach położonych bezpośrednio dystalnie, z których utworzy się uszko. Aby zapewnić wybór równoważnych obszarów tkanek, wybrzuszenie języczka posłużyło jako punkt orientacyjny pod względem morfologicznym i do badania LM wybrano prostokąt o szerokości 10 µm, wycentrowany na wybrzuszeniu języczka (Rycina 2A, 2B). Z tych samych primordiów liści wybrano prostokąty o analogicznej wielkości z obszarów przedliściowych i przedpochwowych.
Analizy roślin mutantów liguleless stanowiły inne wyzwanie; mutanty lg1-R nie tworzą liguli, w związku z czym cecha morfologiczna ta nie mogła zostać wykorzystana do wyboru regionu do LM. Zamiast tego określono domenę akumulacji transkrypcin lg1 w primordiach liści typu dzikiego i zdefiniowano obszar obejmujący tę domenę. Te wstępne analizy przeprowadzono na siewkach z tej samej partii, które wykorzystano do analizy końcowej, ponieważ wcześniejsze prace wykazały, że lokalizacja PLB różni się w zależności od warunków wzrostu. Hybrydyzacja in situ wykazała, że transkrypty lg1 kumulują się w PLB primordiów liści P6 (Rycina 1E). Wybrano obszar od 40-900 µm od podstawy primordiów liści, który obejmował domenę ekspresji lg1 (fioletowe prostokąty, Rycina 2A) i pobrano te równoważne regiony z roślin typu dzikiego oraz mutantów lg1-R. Aby zminimalizować różnice w tle genetycznym i warunkach wzrostu podczas porównywania akumulacji transkrypcin w roślinach lg1-R i typu dzikiego, wykorzystano segregujące rodziny mutantów i ich rodzeństwa typu dzikiego.

<table><tbody><tr><td>Pirowęglan dietylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220</td><td>Stosowany do leczenia roztworów RNaza</td></tr><tr><td>Żyletki&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td>Roztwór do dekontaminacji RNazy</td></tr><tr><td>Absolut etanolu 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane - 22 ml</td><td>VWR</td><td>470206-384</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny klasy histologicznej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy podstawowe, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>VWR</td><td>15154-072</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie do zatapiania</td><td>VWR</td><td>15154-303</td><td></td></tr><tr><td>Saszetki z żelem krzemionkowym</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71206-01</td><td>Środek osuszający do przechowywania bloków parafinowych</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0503</td><td>Piekarnik musi utrzymywać temperaturę 60 & stopni; C</td></tr><tr><td>Stacja osadzania parafiny</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica&nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do szkiełek</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71317-10</td><td></td></tr><tr><td>Słoiki z kopliny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70316-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodysektor laserowy</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES&trade; Wycieraczki do delikatnych zadań</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Niestrzępiące się chusteczki do odprowadzania nadmiaru roztworów ze szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Szkiełko membranowe 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9041-000</td><td>Szkiełka do mikrodysekcji laserowej</td></tr><tr><td>Samoprzylepna nasadka 200 nieprzezroczysta</td><td>Zeiss</td><td>415190-9181-000</td><td>Rurki do mikrodysekcji laserowej</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej rna-seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Geny odgrywające ważną rolę w rozwoju często mają przestrzennie i/lub czasowo ograniczone wzorce ekspresji. Często te transkrypty genów nie są wykrywane lub nie są identyfikowane jako wyrażane różnicowo (DE) w analizach transkryptomicznych całych organów roślinnych. Laserowa mikrodysekcja RNA-Seq (LM RNA-Seq) jest potężnym narzędziem do identyfikacji genów, które są DE w określonych domenach rozwojowych. Jednak wybór domen komórkowych do mikrodysekcji i porównania oraz dokładność mikrodysekcji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentów. W tym miejscu przedstawiono dwa przykłady ilustrujące rozważania projektowe dotyczące eksperymentów transkryptomicznych; analiza sekwencyjna LM RNA w celu identyfikacji genów, które są DE wzdłuż osi proksymalno-dystalnej liści kukurydzy, oraz drugi eksperyment w celu identyfikacji genów, które są DE w mutantach bezjęzycznych1-R (lg1-R) w porównaniu z typem dzikim. Kluczowymi elementami, które przyczyniły się do sukcesu tych eksperymentów, były szczegółowe analizy histologiczne i hybrydyzacyjne in situ analizowanego regionu, selekcja zawiązków liści na równoważnych etapach rozwoju, wykorzystanie morfologicznych punktów orientacyjnych do wyboru regionów do mikrodysekcji oraz mikrodysekcja precyzyjnie zmierzonych domen. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół analizy domen rozwojowych za pomocą LM RNA-Seq. Przedstawione tu dane obrazują, w jaki sposób region wybrany do mikrodysekcji wpłynie na uzyskane wyniki.

Stosując schemat LM przedstawiony na Rysunku 2, dla każdej powtórki w przypadku LM wszystkich warstw komórek pobrano około 1 00 0-1 50 00 µm2 tkanki (Rysunek 5), a dla LM epidermy adaksjalnej 20 0 µm2 na powtórkę. W przypadku LM prymordiów liści lg1-R oraz typu dzikiego dla każdej powtórki pobrano około 2 50 00 µm2 tkanki. Dwie rundy liniowej amplifikacji RNA pozwoliły uzyskać ilości RNA w zakresie mikrogramów dla...

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie akumulacji transkryptu w określonych komórkach lub domenach komórkowych, tak aby można było dokonać porównań między różnymi domenami lub między równoważnymi domenami w próbkach zmutowanych i dzikich typów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób określa się domeny narządów lub jak określone mutacje wpływają na ekspresję genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że akumulację transkryptu można określić ilościowo w niewielkich, precyzyjnie zdefiniowanych domenach, które są zbyt małe, aby można je było ręcznie wypreparować.Przed rozpoczęciem tej procedury należy wyhodować płaskie sadzonki kukurydzy w standardowych warunkach do wieku dwóch tygodni. Aby wyciąć wierzchołki pędów na boczne odcinki, najpierw wytnij sadzonkę tuż poniżej linii gleby. Następnie użyj żyletki, aby usunąć cienkie plasterki z podstawy łodygi, aż zobaczysz owal spokoju otoczony jednym lub dwoma dojrzałymi liśćmi.Wykonaj kolejne cięcie około 10 milimetrów nad podstawą. Ten 10-milimetrowy segment zawiera merystem wierzchołkowy pędu w zawiązkach młodych liści. Obróć 10-milimetrowy segment tak, aby podstawa była skierowana do góry.Wykonaj dwa cięcia równolegle do osi bocznej, aby uzyskać poślizg tkanki o grubości od dwóch do trzech milimetrów. Wyrzuć dwie zewnętrzne części i zachowaj środkową kropelkę do utrwalenia i osadzenia. Zanurz plasterek tkanki w około 10 mililitrach utrwalonych w szklanej fiolce na lodzie.Po wycięciu wszystkich próbek należy zastosować próżnię, aby usunąć pęcherzyki powietrza i ułatwić penetrację utrwalacza. Przytrzymaj odkurzacz przez 10 minut, a następnie powoli zwolnij próżnię. Wymień utrwalacz i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie wstrząsając.Następnego dnia kontynuuj przetwarzanie tkanek do zatopienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odlewać bloki parafinowe, umieść formy do zatapiania na płycie grzejnej stacji zatapiania tkanek i za pomocą kleszczy przenieś próbki tkanek do form do zatapiania powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Umieść pierścień do osadzania na górze formy.Uzupełnij każdą foremkę stopioną parafiną. Przenieś formy na zimną płytę, aż parafina zastygnie. Przechowuj bloki parafiny w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Skrawki są wycinane z bloków parafiny na mikrotomie zgodnie ze standardowymi procedurami, a do montażu wybierane są środkowe sekcje zawierające merystem wierzchołkowy pędu. Aby zamontować sekcje na szkiełkach, umieść slajdy, które są wolne od RNaz lub upieczone na podgrzewaczu do szkiełków o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Nałóż kilka kropli 50% roztworu etanolu, aby pokryć każde szkiełko.Delikatnie ułóż sekcje na szkiełku i unieś je na roztworze etanolu, aż się rozszerzą. Następnie przechylić szkiełko i usunąć nadmiar roztworu etanolu przez zasysanie za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Używaj niestrzępiących się chusteczek, aby usunąć nadmiar roztworu etanolu.Suszyć szkiełka w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez kilka godzin lub przez noc. Gdy szkiełka wyschną, przechowuj je w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odparafinować szkiełka w dniu mikrodysekcji.Przygotuj trzy szklane słoiki Coplin, dwa słoiki zawierające około 50 mililitrów 100% ksylenów i jeden słoik zawierający około 50 mililitrów 100% etanolu. Zanurz szkiełka w ksylenach jeden na dwie minuty, ksylenach dwóch na dwie minuty i 100% etanolu na jedną minutę. Odcedź szkiełka na niestrzępiących się chusteczkach i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej.Aby rozpocząć tę procedurę, należy zabezpieczyć szkiełka na stoliku mikroskopu laserowego do mikrodysekcji. Kluczowym czynnikiem sukcesu mikrodysekcji laserowej w eksperymentach RNasic jest wykorzystanie markerów morfologicznych i molekularnych do wyboru precyzyjnych domen do mikrodysekcji. Zbadaj szkiełka za pomocą obiektywu 5X i zidentyfikuj pięć najbardziej medianowych sekcji na każdym slajdzie, używając wierzchołka merystema wierzchołkowego pędu jako centralnego punktu odniesienia.Następnie użyj obiektywu 10X lub 20X, aby określić położenie języczka na plastochronowym zawiązku siedmiu liści każdej sekcji. Języczek będzie widoczny jako guzek wystający z przyosiowej powierzchni zawiązka liścia. Użyj narzędzia do rysowania w oprogramowaniu do mikrodysekcji laserowej, aby zaznaczyć tę pozycję.Wybierz ikonę rysowania odręcznego, przesuń kursor w odpowiednie miejsce, a następnie kliknij i przeciągnij myszą, aby narysować. Następnym krokiem jest użycie linijki i prostokątnego narzędzia do rysowania do zmierzenia 100 prostokątów o wysokości mikrometrów wyśrodkowanych na ligule każdej sekcji jako próbek liguli. Aby użyć narzędzia linijki, wybierz ikonę linijki, przesuń kursor na jeden koniec obszaru, który ma być mierzony, a następnie kliknij i przeciągnij, aby zmierzyć region.Długość linijki zostanie pokazana na ekranie. Użyj linijki, aby zmierzyć 100-mikrometrowy segment wyśrodkowany na języczku. Aby narysować prostokąt, wybierz narzędzie do rysowania linii prostych i narysuj cztery linie proste.W ten sam sposób zmierz prostokąty o długości 100 mikrometrów umieszczone 50 mikrometrów powyżej i poniżej prostokąta liguli. Będą to próbki ostrza i pochwy. Mikropreparuj zmierzone prostokąty za pomocą funkcji cięcia laserowego, aby przeciąć przekrój tkanki wzdłuż konturu wybranej domeny, oraz funkcji katapulty, aby przesunąć prostokąt tkanki ze szkiełka do pokrywy rurki.Zbierz próbki liguli, ostrza i osłony w oddzielnych probówkach. Tę samą procedurę należy zastosować do mikrodysekcji próbek naskórka ostrzowego, ligulowego i osłonkowego z plastochronu siedmiolistnego primordiów. Na koniec nałóż bufor do ekstrakcji RNA na mikrowypreparowaną tkankę i przystąp do ekstrakcji RNA, amplifikacji RNA, budowy biblioteki, sekwencjonowania i analizy bioinformatycznej, jak opisano w manuskrypcie.Kiedy przeanalizowano akumulację transkryptu i wszystkie warstwy komórek obszaru ostrza, języczka i osłonki, znaleziono 2 359 genów o zróżnicowanej ekspresji. W obszarach adaksjalnego ostrza naskórka, języczka i pochewki znaleziono 3 128 genów o zróżnicowanej ekspresji. Mikrodysekcja laserowa, RLM, sekwencjonowanie RNA i analizy hybrydyzacji in situ dały spójne wyniki, co ilustrują te reprezentatywne geny.Karykatury po lewej stronie ilustrują LM wszystkich warstw komórek, a kreskówki po prawej ilustrują LM tylko naskórka adaksjalnego. Groty strzałek na obrazach wskazują wyłaniające się języczki. Akumulacja transkryptu jednego liguli była znacznie wyższa w ligule zarówno we wszystkich warstwach komórek, jak i w naskórkowym LM. Wąska osłonka pierwsza była znacznie podwyższona w regionie liguli zarówno we wszystkich warstwach komórkowych LM, jak i w naskórku adaksjalnym LM i gromadzi się specyficznie na końcu wyłaniającego się ligula.Gen o nieznanej funkcji miał wyższą średnią liczbę przeliczeń w LM naskórka liguli niż we wszystkich warstwach LM.Transkrypt ten najsilniej gromadzi się w komórkach naskórka. Czwarty gen, Zm PIN1a, nie ulegał istotnej zróżnicowanej ekspresji w analizie wszystkich warstw komórkowych, ale był znacznie podwyższony w ligule w analizie tylko naskórka. Jego wysoka ekspresja w tkance naczyniowej mogła zakłócić różnice w akumulacji transkryptu w naskórku, gdy zebrano wszystkie warstwy komórek.Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać, że wybór domen komórkowych do mikroanalizy i porównania oraz dokładność mikrosekcji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentów.

experimental-design-for-laser-microdissection-rna-seq-lessons-from-an

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Kwantyfikacja podziału i ekspansji komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu całej rośliny. W tym miejscu przedstawiamy protokół obliczania parametrów komórkowych określających tempo wzrostu liści kukurydzy i podkreślamy wykorzystanie tych danych do badania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez kierowanie strategiami pobierania próbek specyficznymi dla danego etapu rozwoju.

Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Odkryj metodę LM RNA-seq do analizy ekspresji genów w specyficznych domenach komórkowych kukurydzy. Technika ta pozwala ilościowo określić akumulację transkryptów w mikroskopijnych obszarach liścia.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Przeglądaj więcej filmów