Name: Mikrodysekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydła Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: Poznaj mikrodysekcję laserową do profilowania ekspresji genów w komórkach dysku skrzydła Drosophila. Ta metoda umożliwia badanie regulacji genów w kontekście mikroekologii tkanek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Chiara Campanelli oraz Centrum Kompetencji AMRA na Uniwersytecie Neapoli Federico II w Neapolu we Włoszech za udostępnienie mikrosekcji laserowej, a panu Vincenzo Vicidomini za ogromną pomoc w przygotowaniu animacji 3D.

Część 1. Przygotowanie tarczek imaginarnych skrzydeł Drosophila poddanych specyficznej i zlokalizowanej interferencji RNA (RNAi).
Jako materiału biologicznego użyto tarczek skrzydłowych Drosophila uzyskanych z larw transgenicznych poddanych lokalnemu i specyficznemu wyciszeniu genów za pomocą systemu GAL4/UAS 1. Potomstwo larwalne pochodzi z krzyżówki genetycznej dwóch linii rodzicielskich: jednej niosącej sterownik GAL4 oraz drugiej niosącej responder UAS. Oprócz ekspresji GAL4 w określonym wzorcu czasowym i/lub przestrzennym, linia sterownika niesie reporter UAS-GFP, który umożliwia wizualizację domeny ekspresji GAL4. Linia respondera UAS wykazuje, pod kontrolą sekwencji UAS, ekspresję spinki ryżowej wyciszającego RNA (hpRNA) zdolnej do specyficznego celowania w wybrany gen zainteresowania (oznaczony jako gen X) 2. Po ekspresji w komórce, hpRNA X jest rozcinane w celu wytworzenia krótkich interferujących RNA (siRNA) zdolnych do specyficznego wyciszenia wybranego genu. W potomstwie larwalnym, niosącym oba transgeny sterownika i respondera, konstrukt UAS-silencing jest transkrybowany tylko w tych komórkach, które wykazują ekspresję białka GAL4, co pozwala na indukcję przestrzennie ograniczonego wyciszenia wybranego genu X.
Spośród wielu możliwych zastosowań, wykorzystaliśmy to podejście do wyciszenia wybranego genu będącego przedmiotem naszych zainteresowań (gen X) pod kontrolą drivera engrailed-GAL4 (en), który może wywołać specyficzne wyciszenie w tylnym przedziale krążka skrzydłowego 3, którego obszar był oznakowany ekspresją transgenu UAS-GFP.
Wyciszone imaginalne krążki skrzydłowe wypreparowano ręcznie, dbając o usunięcie otaczających tkanek zanieczyszczających, w szczególności przylegających tchawek. Każdy wyizolowany krążek skrzydłowy przeniesiono następnie szybko i delikatnie na uprzednio potraktowaną, wolną od RNaz ramkę do preparowania w celu natychmiastowej mikrodysekcji laserowej wybranych obszarów.
Część 2. Mikrosekcja laserowa wybranych obszarów z wyciszonego (tylnego) i niewyciszonego (przedniego) przedziału tarczki skrzydła.
Po umieszczeniu krążka skrzydłowego na membranie przeprowadzono mikrodysekcję laserową określonych obszarów z przedziałów wyciszonych (tylny; znakowany GFP) i niewyciszonych (przedni; nieznakowany GFP). Wykonano to poprzez wyznaczenie obszaru, który mógłby łatwo zmieścić się zarówno po stronie dodatniej pod kątem GFP, jak i ujemnej pod kątem GFP krążka. Za pomocą mikrodysektora najpierw skupiono wiązkę lasera na tkance GFP-dodatniej, wykonując cięcie wzdłuż wybranego obrysu. Mikrodysektor wykonuje cięcie z wybraną prędkością i mocą, jednak możliwe jest ręczne doprecyzowanie cięcia, aż wybrany obszar tkanki wpadnie do znajdującej się poniżej probówki. Probówka ta zawiera niewielką objętość TRI Reagent, dzięki czemu tkanka GFP-dodatnia jest gotowa do późniejszej ekstrakcji RNA.
Następnie przenieśliśmy obszar cięcia na przeciwległą, GFP-ujemną stronę tarczy skrzydła, aby wyciąć równoważny obszar z nieuwyciszonej, GFP-ujemnej tkanki. Ponownie, po automatycznym cięciu, przystąpiliśmy do jego ręcznego dopracowania. Po zakończeniu cięcia tkankę GFP-ujemną również odzyskano w odczynniku TRI, przygotowując ją do ekstrakcji RNA.
Część 3. Ekstrakcja RNA i profilowanie transkrypcyjne z mikrodysekcyjnych obszarów tkanki.
Probiówki wirowano, aby oddzielić ciecz od zakrętki, a następnie dodano TRI Reagent do objętości 1 ml i przeprowadzono ekstrakcję RNA zgodnie ze standardowym protokołem dla TRI Reagent. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, procedurę wycinania powtórzono na 100 dyskach skrzydłowych imaginalnych. Przy wyjściowym materiale obejmującym 100 obszarów o powierzchni około 5000 μm2 każdy, uzyskano 1,5 μg RNA. Dokładność manualnej dysekcji zweryfikowano następnie poprzez sprawdzenie ekspresji GFP w próbkach wyciszonych i niewyciszonych za pomocą RT-PCR, wykorzystując Super Script III (Invitrogen) do syntezy cDNA z Random Hexamers. Następnie przeprowadzono analizy ilościowe w celu określenia poziomów ekspresji wyciszonego genu X oraz domniemanych celów jego szlaku regulacyjnego, stosując Real Time RT-PCR z użyciem Master Mix (Invitrogen).

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

W odniesieniu do bazowych poziomów ekspresji w przednich i tylnych przedziałach niewyciszonych krążków skrzydeł, stwierdzono, że aktywność wybranego genu X uległa zmniejszeniu do 40% po wyciszeniu. Przeciwnie, jeden z jego domniemanych celów (geny Y) wykazał znaczną nadekspresję (7-krotny wzrost), co skłoniło nas do zweryfikowania hipotezy, że jest on regulowany negatywnie przez gen X.
Wnioskujemy, że opisane powyżej podejście eksperymentalne może zostać z sukcesem zastosowane do walidacji do...

<table><tbody><tr><td>woda z DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina główna (Master Mix)</td><td>Invitrogen</td><td>11761100</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq</td><td>Fermentas</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Szczepy much&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Linie Drosophila z wyciszaniem UAS można uzyskać z kolekcji RNAi VDRC &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;Kolekcja linii sterujących GAL4 jest dostępna w Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana&lt;em&gt;, &lt;/em&gt;USA).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Prosimy o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;Wymagany sprzęt obejmuje mikrosekcjoner laserowy (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Narzędzia&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia materiałów na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej i naturalnego stylu protokołów badawczych.&quot;&gt;Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzel, pęsetę do mikrodysekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne osadzone na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 0,5 ml, 0,25 ml).&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przygotowania wiernego i precyzyjnego tłumaczenia na język polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, terminologii specjalistycznej oraz struktury protokołów badawczych.&quot;&gt;Linie Drosophila z wyciszeniem UAS można uzyskać z kolekcji RNAi VDRC &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;Kolekcja linii sterujących GAL4 jest dostępna w Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana&lt;em&gt;, &lt;/em&gt;USA).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać treść źródłową do przetłumaczenia. Czekam na tekst z jove_content.&quot;&gt;Wymagane wyposażenie obejmuje mikrosekcjoner laserowy (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Narzędzia&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrodyssekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne zamocowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET oraz probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Wymagany sprzęt obejmuje: laserowy mikrosekcjoner (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Narzędzia&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy (jove_content), który należy przetłumaczyć. Po otrzymaniu treści przygotuję tłumaczenie zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji naukowej i terminologii specjalistycznej.&quot;&gt;Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pincetę do mikrosekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne zamocowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy (jove_content), który należy przetłumaczyć. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia naukowego zgodnie z Twoimi wytycznymi.&quot;&gt;Wymagane wyposażenie obejmuje mikrodissektor laserowy (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Narzędzia&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy, który należy przetłumaczyć. Czekam na treść z JoVE do tłumaczenia na język polski.&quot;&gt;Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrodysekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne osadzone na igłach strzykawki, ramki metalowe z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok JoVE&quot;&gt;Narzędzia&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrosekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne zamocowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 0,5 ml, 0,25 ml).&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści JoVE, jestem gotowy do przełożenia materiałów naukowych i edukacyjnych na język polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej oraz naturalnego stylu protokołów badawczych.&quot;&gt;Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrodysekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne osadzone na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET oraz probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego drosophila

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeniczność tkanek okazuje się być czynnikiem ograniczającym ilość informacji, jakie można uzyskać z próbek biologicznych, co utrudnia dalsze analizy. Biorąc pod uwagę złożone i dynamiczne powiązania komórkowe istniejące w wielu tkankach, w celu odtworzenia oddziaływań in vivo podczas szczegółowej analizy molekularnej, konieczna jest możliwość analizy specyficznych populacji komórek w ich naturalnym kontekście. Mikrodysekcja laserowa pozwala na osiągnięcie tego celu, umożliwiając jednoznaczną identyfikację i skuteczne wyizolowanie interesujących komórek pod bezpośrednią kontrolą mikroskopową przy jednoczesnym zachowaniu integralności molekularnej. Zastosowaliśmy tę technologię do analizy ekspresji genów w określonych obszarach rozwijającego się krążka skrzydłowego Drosophila, który stanowi korzystny model badawczy w zakresie kontroli wzrostu, różnicowania komórek i organogenezy. Larwalne krążki imaginalne są przedwcześnie podzielone na przednie i tylne oraz grzbietowe i brzuszne przedziały przez granice restrykcji linii komórkowej. Wykorzystując indukowalny binarny system ekspresji GAL4-UAS, każdy z tych przedziałów może zostać specyficznie oznakowany w muchach transgenicznych wykazujących ekspresję transgenu UAS-GFP pod kontrolą odpowiedniego konstruktu drivera GAL4. W krążkach transgenicznych profil ekspresji genów dla dyskretnych podzbiorów komórek może zostać precyzyjnie określony po mikrodysekcji laserowej, przy wykorzystaniu fluorescencyjnego sygnału GFP do prowadzenia cięcia laserowego.
Wśród wielu zastosowań analitycznych skupiliśmy się na profilowaniu transkryptów RNA po lokalnej interferencji RNA (RNAi). Dzięki rozwojowi technologii RNAi, znakowanie GFP można połączyć z lokalnym wyciszeniem (knockdown) konkretnego genu, co pozwala na określenie odpowiedzi transkrypcyjnej określonej populacji komórek na specyficzne wyciszenie genu. Aby zwalidować to podejście, wypreparowaliśmy równoważne obszary tarczki z przedziału tylnego (znakowanego ekspresją GFP) oraz przedniego (nieznakowanego) po regionalnym wyciszeniu w przedziale P genu, który w pozostałych obszarach ulega ekspresji powszechnej. RNA wyekstrahowano z mikropreparowanych obszarów wyciszonych i niewyciszonych, a porównujące profilowanie ekspresji genów określono za pomocą ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym. Wykazujemy, że metoda ta może być skutecznie stosowana do dokładnej transkryptomiki podzbiorów komórek w tarczkach imaginalnych Drosophila. W rzeczywistości, podczas gdy przygotowanie całej tarczki jako źródła RNA zazwyczaj zakłada homogeniczność komórek, wiadomo, że ekspresja transkrypcyjna może się znacznie różnić w obrębie tych struktur w wyniku informacji pozycyjnej. Wykorzystanie lokalnego fluorescencyjnego sygnału GFP do prowadzenia cięcia laserowego pozwala na przeprowadzenie dokładniejszych analiz transkrypcyjnych, które można z korzyścią zastosować w różnych obszarach, w tym do profilowania transkrypcyjnego odrębnych linii komórkowych w ich naturalnym kontekście.

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Heterogeniczność tkanek okazała się czynnikiem ograniczającym ilość informacji, jakie można uzyskać z próbek biologicznych, ...

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis mikrosekcji laserowej zastosowanej w celu porównawczego profilowania transkrypcyjnego RNA z obszarów wyciszonych i niewyciszonych w tarczce skrzydła Drosophila. Podejście to wymaga w ramach materiału biologicznego ręcznie wypreparowanych tarczek obrazowych Drosophila, a jako główny sprzęt – mikrosektora laserowego. Wykorzystujemy urządzenie LI A-L-L-M-D 6, 000 oraz system do reakcji PCR w czasie rzeczywistym.Użyliśmy urządzenia BioRad iq. Wymagane są pięć małych narzędzi: płytka wklęsła, mały pędzelek, pęseta do mikrodysekcji, szkiełko do metody wiszącej kropli, piny do owadów zamontowane na igłach strzykawki, metalowa ramka z membraną PET oraz małe probówki plastikowe. Metoda ta obejmuje następujące kroki.Krok pierwszy: skrzyżowanie dwóch odpowiednich linii transgenicznych oph w celu wywołania lokalnego i specyficznego wyciszenia genów w potomstwie z wykorzystaniem systemu GAL4/UAS. Krok drugi: przygotowanie ramek do sekcji. Krok trzeci: konfiguracja laserowego mikrodisektora.Krok czwarty: ręczne pobranie tarczek imaginalnych skrzydeł z potomstwa larwalnego krzyżówki genetycznej. Krok piąty: wykonanie mikrodysekcji laserowej specyficznych obszarów tarczek imaginalnych znakowanych GFP. Krok szósty: profilowanie transkrypcyjne równoważnych obszarów regionów wyciszonych i niewyciszonych tarczki pozwoli na ustalenie efektów wywołanych wyciszeniem badanego genu.Profilowanie transkrypcji in vivo genu X będzie wymagać ekstrakcji RNA z obszarów mikrodysekcji, kontroli dokładności manualnej dysekcji, oceny ekspresji GFP w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R, a także kwantyfikacji ekspresji domniemanych celów wyciszonego genu w obu próbkach za pomocą real-time R-T-P-C-R lub poprzez przeprowadzenie analizy mikromacierzy. Poniżej znajdują się szczegóły dotyczące każdego etapu.Pierwszy krok to krzyżówka genetyczna. Krzyżówka genetyczna obejmuje transgeniczne szczepy GAL4 UAS i ma na celu uzyskanie wyciszonych tarczek wyobraźnych u potomstwa larwalnego. Wszechstronny system GAL4 pozwala na wywołanie specyficznego i zlokalizowanego wyciszania genów poprzez interferencję RNA.Jeden szczep wprowadza do krzyżówki transgen sterujący, który wykazuje ekspresję GAL4 w określonym wzorcu czasowym lub przestrzennym, oraz reporter UAS-GFP, który umożliwia wizualizację domeny ekspresji GAL4. Drugi szczep wprowadza transgen respondera UAS, który koduje wyciszające RNA w formie spinki (hairpin RNA), zdolne do specyficznego targetowania genu X po jego ekspresji w komórce.RNA to jest cięte w celu wygenerowania krótkiego interferującego RNA, który jest zdolny do specyficznego wyciszenia wybranego genu X w potomstwie tego krzyżowania. Transgen wyciszający UAS jest transkrybowany tylko w tych komórkach, które wykazują ekspresję białka GAL4, co indukuje przestrzennie ograniczone wyciszenie genu X. Wśród wielu zastosowań skoncentrowaliśmy się na profilowaniu transkryptów RNA w dysku skrzydłowym wyciszonym przez sterownik Grailed GAL4, który kieruje specyficzne wyciszenie w przedziale tylnym.Region wyciszenia jest oznakowany ekspresją transgenu U-A-S-G-F-P. W przedziale tylnym zostaną wywołane dwa zdarzenia: ekspresja GGFP oraz wyciszenie genu x.Krok drugi, przygotowanie ramek do sekcji w celu zahamowania aktywności RNaz. Płucz szkiełka z ramkami oraz narzędzia do sekcji w wodzie z DEPC przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie pozostaw je do wyschnięcia w komorze sterylnej. Aby zahamować aktywność RNaz, użyj nowej, wolnej od RNaz probówki o pojemności 50 ml, wypełnionej wodą z DEPC; za pomocą pincety umieść w probówce szkiełko do kropli wiszącej oraz ramkę PET.Oba są niezbędne do mikrodysekcji. Zamknij probówkę, odwróć ją do góry dnem, a następnie pozostaw do reakcji na co najmniej jedną godzinę. W temperaturze pokojowej, po godzinie, przenieś wodę z DEPC do drugiej probówki za pomocą pęsety.Przytrzymaj preparaty wewnątrz probówki, aby nie wypadły. Następnie pozostaw preparaty do wyschnięcia w probówce. Krok trzeci: przygotowanie do mikrodyssekcji.W pierwszej kolejności należy włączyć wszystkie niezbędne urządzenia: lampę fluorescencyjną, mikroskop oraz oprogramowanie do mikrodysekcji. Pojawi się okno ostrzegawcze z przypomnieniem o konieczności włączenia lasera. Należy to zrobić i pozwolić laserowi się rozgrzać podczas kończenia przygotowań do mikrodysekcji.Nadszedł czas na przygotowanie dołków, w których zostaną zebrane wycinki tkanek. Urządzenie do cięcia laserowego Leica LMD 6,000 umożliwia załadowanie do czterech probówek w celu zebrania różnych próbek. Do naszych potrzeb wystarczą dwie probówki.Jedna służy do zbierania tkanki wyciszonej z dodatnim sygnałem GFP, a druga do zbierania tkanki niewyciszonej z ujemnym sygnałem GFP za pomocą mikropipety. Napełnij oba korki probówek 20 µL roztworu TRI reagent w celu zabezpieczenia RNA. Teraz mikrodissektor jest gotowy do użycia. Krok czwarty: ręczna dyssekcja tarczek wyobrażeniowych skrzydeł z larw Drosophila.Wyizoluj krążki skrzydłowe z potomstwa larwalnego otrzymanego zgodnie z wcześniejszym opisem, upewniając się, że inne tkanki nie zanieczyszczą krążków. Aby osiągnąć ten cel, zastosowane podejście do sekcji znacznie różni się od metody powszechnie stosowanej do pobierania całości wszystkich pierwotnych krążków. Najpierw przemyj larwę w roztworze Ringera, aby usunąć przylegającą pożywkę. Następnie przenieś ją na preparat z kroplą wiszącą i natychmiast odetnij głowę, pociągając aparat gębowy w dół.Używając szpilek entomologicznych, ostrożnie odseparuj pozostałe tkanki. Czerwona obrys wskazuje tarczki skrzydłowe imaginalne przeznaczone do pobrania. Usuń przylegające tkanki z tarczek szybko i delikatnie. Przenieś każdą wyizolowaną tarczkę skrzydłową do ramki do sekcji w celu natychmiastowego przecięcia.Procedurę tę należy powtarzać aż do uzyskania łącznej liczby stu krążków skrzydeł. Krok piąty, laserowa mikrodysekcja określonych obszarów krążków skrzydeł znakowanych GFP. Gdy oryginalny krążek skrzydła znajdzie się na membranie, można przystąpić do wycinania.Umieść ramkę w uchwycie, a następnie zamocuj uchwyt na stole zmotoryzowanym. Odszukaj oryginalny krążek skrzydłowy, korzystając z LMD 6,000 jako ze zwykłego mikroskopu. Ustaw ostrość i wyznacz linię cięcia.Narysuj owalny obszar, który zmieści się po obu stronach dysku: po stronie pozytywnej pod kątem GFP oraz po stronie przeciwnej. Wybierz nakrętkę probówki, do której chcesz zebrać część pozytywną pod kątem GFP. Naciśnij przycisk Start cut.Mikrosekcjoner przystępuje do wycinania tkanki z prędkością i mocą ustawionymi wcześniej poprzez wybór funkcji przesuwania i cięcia. Proces wycinania można dopracować ręcznie, aż do momentu oddzielenia się niewybranego fragmentu tkanki. Animacja 3D przedstawia przebieg cięcia mikrosekcjonerem, podczas którego wiązka lasera jest ogniskowana na tkance, wykonując nacięcie wzdłuż wyznaczonego obrysu.Po wykonaniu cięcia fragment tkanki wpada do wybranej zakrętki probówki, a w konsekwencji do tri Reagent. Po pierwszym cięciu przesuń obszar cięcia na drugą stronę tarczki skrzydłowej, aby wyciąć równoważny obszar ujemny pod kątem GFP. Przed przystąpieniem do nowego cięcia upewnij się, że wybrałeś inną zakrętkę probówki, aby oddzielić tkanki dodatnie pod kątem GFP od ujemnych pod kątem GFP.Po automatycznym cięciu naciśnij przycisk start cut. Przystąp do ręcznego doprecyzowania cięcia, zgodnie z instrukcją przedstawioną w animacji 3D przed drugim cięciem. Zmotoryzowany stół przesuwa wybrany kapturek probówki pod obszar cięcia.Wiązka lasera ogniskuje się na tkance wzdłuż wybranego obwodu, a po wykonaniu cięcia fragment tkanki wpada do wybranej zakrętki probówki zawierającej odczynnik Tri. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, procedurę powtórzono na stu krążkach skrzydeł imaginalnych. Po zebraniu próbek należy wyładować probówki.Jest to delikatny etap, podczas którego można utracić wszystkie dotychczasowe postępy w pracy. Należy zatem zachować ostrożność. Zamknij zakrętkę do góry nogami i kontynuuj eksperyment.To jest próbka z tkanką wykazującą pozytywną ekspresję GFP. To jest druga próbka z tkanką wykazującą negatywną ekspresję GFP. Krok szósty, profilowanie transkrypcyjne.Wirować probówki, aby oddzielić ciecz od zakrętki, a następnie dodać odczynnik Try do objętości 1 mL. Przeprowadzić ekstrakcję RNA zgodnie ze standardowym protokołem z użyciem odczynnika Try z stu obszarów o powierzchni około 5 000 µm² każdy. Uzyskana wydajność wyniosła 1,5 µg RNA.Użyliśmy superscript three w vitrogen do syntezy CD NA z random hexa. Dokładność manualnej dyssekcji kontrolowano poprzez sprawdzenie ekspresji GFP w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R. Jak pokazano na żelu z ilościowego R-T-P-C-R.Oceniono poziomy ekspresji wyciszonego genu X wraz z poziomami potencjalnych celów szlaku regulacyjnego pośredniczonego przez gen X. Schemat ten przedstawia przykład poziomów ekspresji genu X oraz jednego z jego potencjalnych celów. Nazwijmy go genem Y w odniesieniu do jego podstawowych poziomów ekspresji w przednio-tylnych przedziałach nieukonsolidowanych krążków skrzydeł.Stwierdzono, że aktywność wybranego genu X została zredukowana do 40% po wyciszeniu. W przeciwieństwie do niego, jeden z jego domniemanych celów, gen Y, wykazał znaczną nadrzędną regulację (wzrost siedmiokrotny), co skłoniło nas do potwierdzenia hipotezy, że był on regulowany negatywnie przez gen X. Wyciągamy wniosek, że opisane powyżej podejście eksperymentalne może zostać z powodzeniem zastosowane do walidacji domniemanych celów w różnych ścieżkach regulacyjnych.

laser-microdissection-applied-to-gene-expression-profiling-subset

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów podzbioru komórek z dysku skrzydła Drosophila

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Czas ekspozycji na ligandy może mieć wpływ na ich konsekwencje rozwojowe. Tutaj pokazujemy, jak obrazować uwalnianie białka morfogenetycznego kości Drosophila (BMP) o nazwie Dpp z komórek dysku skrzydła.

Obrazowanie uwalniania DPP z dysku skrzydła Drosophila

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj mikrodysekcję laserową do profilowania ekspresji genów w komórkach dysku skrzydła Drosophila. Ta metoda umożliwia badanie regulacji genów w kontekście mikroekologii tkanek in vivo.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Przeglądaj więcej filmów