Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis mikrosekcji laserowej zastosowanej w celu porównawczego profilowania transkrypcyjnego RNA z obszarów wyciszonych i niewyciszonych w tarczce skrzydła Drosophila. Podejście to wymaga w ramach materiału biologicznego ręcznie wypreparowanych tarczek obrazowych Drosophila, a jako główny sprzęt – mikrosektora laserowego. Wykorzystujemy urządzenie LI A-L-L-M-D 6, 000 oraz system do reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

Użyliśmy urządzenia BioRad iq. Wymagane są pięć małych narzędzi: płytka wklęsła, mały pędzelek, pęseta do mikrodysekcji, szkiełko do metody wiszącej kropli, piny do owadów zamontowane na igłach strzykawki, metalowa ramka z membraną PET oraz małe probówki plastikowe. Metoda ta obejmuje następujące kroki.

Krok pierwszy: skrzyżowanie dwóch odpowiednich linii transgenicznych oph w celu wywołania lokalnego i specyficznego wyciszenia genów w potomstwie z wykorzystaniem systemu GAL4/UAS. Krok drugi: przygotowanie ramek do sekcji. Krok trzeci: konfiguracja laserowego mikrodisektora.

Krok czwarty: ręczne pobranie tarczek imaginalnych skrzydeł z potomstwa larwalnego krzyżówki genetycznej. Krok piąty: wykonanie mikrodysekcji laserowej specyficznych obszarów tarczek imaginalnych znakowanych GFP. Krok szósty: profilowanie transkrypcyjne równoważnych obszarów regionów wyciszonych i niewyciszonych tarczki pozwoli na ustalenie efektów wywołanych wyciszeniem badanego genu.

Profilowanie transkrypcji in vivo genu X będzie wymagać ekstrakcji RNA z obszarów mikrodysekcji, kontroli dokładności manualnej dysekcji, oceny ekspresji GFP w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R, a także kwantyfikacji ekspresji domniemanych celów wyciszonego genu w obu próbkach za pomocą real-time R-T-P-C-R lub poprzez przeprowadzenie analizy mikromacierzy. Poniżej znajdują się szczegóły dotyczące każdego etapu.

Pierwszy krok to krzyżówka genetyczna. Krzyżówka genetyczna obejmuje transgeniczne szczepy GAL4 UAS i ma na celu uzyskanie wyciszonych tarczek wyobraźnych u potomstwa larwalnego. Wszechstronny system GAL4 pozwala na wywołanie specyficznego i zlokalizowanego wyciszania genów poprzez interferencję RNA.

Jeden szczep wprowadza do krzyżówki transgen sterujący, który wykazuje ekspresję GAL4 w określonym wzorcu czasowym lub przestrzennym, oraz reporter UAS-GFP, który umożliwia wizualizację domeny ekspresji GAL4. Drugi szczep wprowadza transgen respondera UAS, który koduje wyciszające RNA w formie spinki (hairpin RNA), zdolne do specyficznego targetowania genu X po jego ekspresji w komórce.

RNA to jest cięte w celu wygenerowania krótkiego interferującego RNA, który jest zdolny do specyficznego wyciszenia wybranego genu X w potomstwie tego krzyżowania. Transgen wyciszający UAS jest transkrybowany tylko w tych komórkach, które wykazują ekspresję białka GAL4, co indukuje przestrzennie ograniczone wyciszenie genu X. Wśród wielu zastosowań skoncentrowaliśmy się na profilowaniu transkryptów RNA w dysku skrzydłowym wyciszonym przez sterownik Grailed GAL4, który kieruje specyficzne wyciszenie w przedziale tylnym.

Region wyciszenia jest oznakowany ekspresją transgenu U-A-S-G-F-P. W przedziale tylnym zostaną wywołane dwa zdarzenia: ekspresja GGFP oraz wyciszenie genu x.

Krok drugi, przygotowanie ramek do sekcji w celu zahamowania aktywności RNaz. Płucz szkiełka z ramkami oraz narzędzia do sekcji w wodzie z DEPC przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie pozostaw je do wyschnięcia w komorze sterylnej. Aby zahamować aktywność RNaz, użyj nowej, wolnej od RNaz probówki o pojemności 50 ml, wypełnionej wodą z DEPC; za pomocą pincety umieść w probówce szkiełko do kropli wiszącej oraz ramkę PET.

Oba są niezbędne do mikrodysekcji. Zamknij probówkę, odwróć ją do góry dnem, a następnie pozostaw do reakcji na co najmniej jedną godzinę. W temperaturze pokojowej, po godzinie, przenieś wodę z DEPC do drugiej probówki za pomocą pęsety.

Przytrzymaj preparaty wewnątrz probówki, aby nie wypadły. Następnie pozostaw preparaty do wyschnięcia w probówce. Krok trzeci: przygotowanie do mikrodyssekcji.

W pierwszej kolejności należy włączyć wszystkie niezbędne urządzenia: lampę fluorescencyjną, mikroskop oraz oprogramowanie do mikrodysekcji. Pojawi się okno ostrzegawcze z przypomnieniem o konieczności włączenia lasera. Należy to zrobić i pozwolić laserowi się rozgrzać podczas kończenia przygotowań do mikrodysekcji.

Nadszedł czas na przygotowanie dołków, w których zostaną zebrane wycinki tkanek. Urządzenie do cięcia laserowego Leica LMD 6,000 umożliwia załadowanie do czterech probówek w celu zebrania różnych próbek. Do naszych potrzeb wystarczą dwie probówki.

Jedna służy do zbierania tkanki wyciszonej z dodatnim sygnałem GFP, a druga do zbierania tkanki niewyciszonej z ujemnym sygnałem GFP za pomocą mikropipety. Napełnij oba korki probówek 20 µL roztworu TRI reagent w celu zabezpieczenia RNA. Teraz mikrodissektor jest gotowy do użycia. Krok czwarty: ręczna dyssekcja tarczek wyobrażeniowych skrzydeł z larw Drosophila.

Wyizoluj krążki skrzydłowe z potomstwa larwalnego otrzymanego zgodnie z wcześniejszym opisem, upewniając się, że inne tkanki nie zanieczyszczą krążków. Aby osiągnąć ten cel, zastosowane podejście do sekcji znacznie różni się od metody powszechnie stosowanej do pobierania całości wszystkich pierwotnych krążków. Najpierw przemyj larwę w roztworze Ringera, aby usunąć przylegającą pożywkę. Następnie przenieś ją na preparat z kroplą wiszącą i natychmiast odetnij głowę, pociągając aparat gębowy w dół.

Używając szpilek entomologicznych, ostrożnie odseparuj pozostałe tkanki. Czerwona obrys wskazuje tarczki skrzydłowe imaginalne przeznaczone do pobrania. Usuń przylegające tkanki z tarczek szybko i delikatnie. Przenieś każdą wyizolowaną tarczkę skrzydłową do ramki do sekcji w celu natychmiastowego przecięcia.

Procedurę tę należy powtarzać aż do uzyskania łącznej liczby stu krążków skrzydeł. Krok piąty, laserowa mikrodysekcja określonych obszarów krążków skrzydeł znakowanych GFP. Gdy oryginalny krążek skrzydła znajdzie się na membranie, można przystąpić do wycinania.

Umieść ramkę w uchwycie, a następnie zamocuj uchwyt na stole zmotoryzowanym. Odszukaj oryginalny krążek skrzydłowy, korzystając z LMD 6,000 jako ze zwykłego mikroskopu. Ustaw ostrość i wyznacz linię cięcia.

Narysuj owalny obszar, który zmieści się po obu stronach dysku: po stronie pozytywnej pod kątem GFP oraz po stronie przeciwnej. Wybierz nakrętkę probówki, do której chcesz zebrać część pozytywną pod kątem GFP. Naciśnij przycisk Start cut.

Mikrosekcjoner przystępuje do wycinania tkanki z prędkością i mocą ustawionymi wcześniej poprzez wybór funkcji przesuwania i cięcia. Proces wycinania można dopracować ręcznie, aż do momentu oddzielenia się niewybranego fragmentu tkanki. Animacja 3D przedstawia przebieg cięcia mikrosekcjonerem, podczas którego wiązka lasera jest ogniskowana na tkance, wykonując nacięcie wzdłuż wyznaczonego obrysu.

Po wykonaniu cięcia fragment tkanki wpada do wybranej zakrętki probówki, a w konsekwencji do tri Reagent. Po pierwszym cięciu przesuń obszar cięcia na drugą stronę tarczki skrzydłowej, aby wyciąć równoważny obszar ujemny pod kątem GFP. Przed przystąpieniem do nowego cięcia upewnij się, że wybrałeś inną zakrętkę probówki, aby oddzielić tkanki dodatnie pod kątem GFP od ujemnych pod kątem GFP.

Po automatycznym cięciu naciśnij przycisk start cut. Przystąp do ręcznego doprecyzowania cięcia, zgodnie z instrukcją przedstawioną w animacji 3D przed drugim cięciem. Zmotoryzowany stół przesuwa wybrany kapturek probówki pod obszar cięcia.

Wiązka lasera ogniskuje się na tkance wzdłuż wybranego obwodu, a po wykonaniu cięcia fragment tkanki wpada do wybranej zakrętki probówki zawierającej odczynnik Tri. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, procedurę powtórzono na stu krążkach skrzydeł imaginalnych. Po zebraniu próbek należy wyładować probówki.

Jest to delikatny etap, podczas którego można utracić wszystkie dotychczasowe postępy w pracy. Należy zatem zachować ostrożność. Zamknij zakrętkę do góry nogami i kontynuuj eksperyment.

To jest próbka z tkanką wykazującą pozytywną ekspresję GFP. To jest druga próbka z tkanką wykazującą negatywną ekspresję GFP. Krok szósty, profilowanie transkrypcyjne.

Wirować probówki, aby oddzielić ciecz od zakrętki, a następnie dodać odczynnik Try do objętości 1 mL. Przeprowadzić ekstrakcję RNA zgodnie ze standardowym protokołem z użyciem odczynnika Try z stu obszarów o powierzchni około 5 000 µm² każdy. Uzyskana wydajność wyniosła 1,5 µg RNA.

Użyliśmy superscript three w vitrogen do syntezy CD NA z random hexa. Dokładność manualnej dyssekcji kontrolowano poprzez sprawdzenie ekspresji GFP w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R. Jak pokazano na żelu z ilościowego R-T-P-C-R.

Oceniono poziomy ekspresji wyciszonego genu X wraz z poziomami potencjalnych celów szlaku regulacyjnego pośredniczonego przez gen X. Schemat ten przedstawia przykład poziomów ekspresji genu X oraz jednego z jego potencjalnych celów. Nazwijmy go genem Y w odniesieniu do jego podstawowych poziomów ekspresji w przednio-tylnych przedziałach nieukonsolidowanych krążków skrzydeł.

Stwierdzono, że aktywność wybranego genu X została zredukowana do 40% po wyciszeniu. W przeciwieństwie do niego, jeden z jego domniemanych celów, gen Y, wykazał znaczną nadrzędną regulację (wzrost siedmiokrotny), co skłoniło nas do potwierdzenia hipotezy, że był on regulowany negatywnie przez gen X. Wyciągamy wniosek, że opisane powyżej podejście eksperymentalne może zostać z powodzeniem zastosowane do walidacji domniemanych celów w różnych ścieżkach regulacyjnych.