Mikrodysekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydła Drosophila

W niniejszym artykule przedstawiamy dokładny opis mikrodysekcji laserowej stosowanej w celu uzyskania porównywanego profilowania transkryptu RNA wyciszonych i wyciszonych obszarów dysku skrzydła drosophila. Podejście to wymaga jako materiału biologicznego, ręcznie wypreparowanych dysków obrazowych Drosophila jako głównego wyposażenia, mikro dyssektora laserowego. Używamy maszyny LI A-L-L-M-D 6 000 oraz maszyny do PCR w czasie rzeczywistym.

Użyliśmy BioRad iq. Wymaganych jest pięć małych narzędzi, to: wklęsła płytka, mały pędzel do mikrodysekcji, kleszcze do zawieszania zjeżdżalni, pingi owadów, zamontowane na igłach strzykawek, metalowa rama z membraną dla zwierząt, małe plastikowe rurki. Ta metoda obejmuje następujące kroki.

Krok pierwszy: skrzyżowanie dwóch odpowiednich linii transgenicznych oph w celu wyzwolenia zlokalizowanego i specyficznego wyciszenia genów w potomstwie przy użyciu systemu GAL four UAS. Krok drugi, aby leczyć ramy rozwarstwienia. Krok trzeci, aby skonfigurować mikro dyssektor laserowy.

Krok czwarty, aby ręcznie pobrać wyimaginowane dyski skrzydeł od larwalnego potomstwa krzyżówki genetycznej. Krok piąty, aby wykonać mikrodysekcję laserową określonych obszarów dysków imaginalnych oznaczonych GFP. Krok szósty, profilowanie transkrypcji równoważnych obszarów wyciszonych i niestałych obszarów dysku, pozwoli na ustalenie efektów wywołanych przez wyciszenie interesującego Cię genu.

Nazwijmy to genem X Profilowanie transkrypcji in vivo będzie wymagało ekstrakcji RNA z mikro wypreparowanych obszarów, kontroli dokładności ręcznej sekcji, oceny ekspresji GFP w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R, kwantyfikacji ekspresji przypuszczalnego. Cele genu ciszy w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym lub poprzez przeprowadzenie analizy mikromacierzy. Teraz więcej szczegółów na każdym kroku.

Pierwszy krok, krzyżówka genetyczna. Krzyżówka genetyczna obejmuje transgeniczne szczepy GAL four UAS i koncentruje się na uzyskaniu wyciszonych dysków wyobrażeniowych w potomstwie larw. Wszechstronny system GAL four pozwala na wyzwolenie specyficznego i zlokalizowanego wyciszania genów przez interferencję RNA.

Jeden szczep wprowadza do krzyżówki transgen sterownika, który wyraża GAL four w określonym wzorcu czasowym lub przestrzennym. oraz reporter A-U-A-S-G-F-P, który umożliwia wizualizację domeny czterech wyrażeń GAL. Drugi szczep wprowadza transgen reagujący UAS, który wyraża RNA wyciszający spinkę do włosów, zdolny do specyficznego celowania w gen X po ekspresji w komórce.

Ten RNA jest rozszczepiany w celu wytworzenia małego interferującego RNA, który jest w stanie specyficznie wyciszyć wybrany gen X w potomstwie tej krzyżówki. Transgen wyciszający UAS jest transkrybowany tylko w tych komórkach, w których występuje ekspresja białka GAL four, wywołując w ten sposób ograniczone przestrzennie wyciszenie genu X. Wśród różnorodnych zastosowań skupiliśmy się na profilowaniu transkryptu RNA w dysku skrzydła wyciszonym przez czterocylindrowy sterownik Grailed GAL, który kieruje specyficzne wyciszenie w tylnym przedziale.

Obszar ciszy jest zaznaczony przez ekspresję transgenu U-A-S-G-F-P. W przedziale tylnym. Dwa zdarzenia zostaną wywołane ekspresją GGFP i wyciszeniem genu x.

Krok drugi, leczenie ramek rozwarstwiających w celu zahamowania aktywności RNA. Umyj szkiełka ramy i narzędzia do wycinki wodą DEPC przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej i pozostaw do wyschnięcia w sterylnej komorze. Aby zahamować aktywność RNA, użyj zupełnie nowej probówki o pojemności 50 ml, która jest już wolna od RNA, wypełnionej wodą DEPC z kleszczami umieszczonymi w probówce, wiszącym suwakiem i ramką dla zwierząt.

Oba potrzebne do mikrodysekcji. Zamknij tubkę, odwróć ją do góry nogami, a następnie pozostaw do reakcji na co najmniej godzinę. W temperaturze pokojowej, godzinę później, przenieś wodę DEPC do innej rurki za pomocą kleszczy.

Przytrzymaj szkiełka wewnątrz rury, aby nie spadły. Następnie pozwól szkiełkom wyschnąć wewnątrz tuby. Krok trzeci, konfiguracja mikrodyskcji.

Po pierwsze, włącz wszystkie potrzebne urządzenia, żarówkę fluorescencyjną, mikroskop i oprogramowanie do mikrosekcji. Okno ostrzegawcze przypomni Ci o włączeniu również lasera. Zrób to i pozwól laserowi się rozgrzać, podczas gdy Ty zakończysz konfigurację mikrodystektu.

Teraz nadszedł czas, aby przygotować dołki, w których można pobrać tkankę. Ciąć. Sprzęt do wycinania laserowego Leica LMD 6 000 umożliwia załadowanie do czterech probówek w celu pobrania różnych próbek. Do naszych celów potrzebujemy tylko dwóch rurek.

Jeden, aby zebrać tkankę pozytywnej ciszy GFP, drugi w celu zebrania ujemnej tkanki jednolitej GFP z mikro pecem. Napełnij obie nakrętki probówki 20 mikrolitrami roztworu triodczynnika, aby zachować RNA. Teraz mikrodysket jest gotowy do użycia Krok czwarty, ręczne wypreparowanie krążków obrazowania skrzydeł z larw joof.

Wyizoluj krążki skrzydeł od potomstwa larw uzyskanego zgodnie z wcześniejszym opisem i upewnij się, że inne tkanki nie zanieczyszczają krążków Aby osiągnąć ten cel, podejście do sekcji jest zupełnie inne niż powszechnie stosowane do zbierania większości wszystkich oryginalnych krążków. Najpierw umyj larwę w roztworze Ringera, aby usunąć przylegające podłoże. Następnie przenieś go do wiszącego suwaka i odetnij głowę, natychmiast ciągnąc usta w dół.

Używając szpilek do owadów, ostrożnie wypreparuj inne tkanki. Czerwony kontur pokazuje wyimaginowane dyski skrzydeł do zebrania. Utrzymuj krążki wolne od przylegającej tkanki szybko i delikatnie Przenieś każdą izolowaną tarczę skrzydełkową do ramy preparacyjnej w celu natychmiastowego cięcia.

Procedurę tę należy powtarzać, aż do osiągnięcia całkowitej liczby stu krążków skrzydeł. Krok piąty, laserowa mikrodysekcja określonych obszarów dysków skrzydeł oznaczonych GFP. Gdy oryginalna tarcza skrzydła znajdzie się na membranie, możesz przystąpić do cięcia.

Umieść ramę na uchwycie i zamocuj uchwyt na zmotoryzowanej scenie. Poszukaj oryginalnej tarczy skrzydłowej, używając LMD 6,000 jako zwykłego mikroskopu. Skoncentruj się na nim i ustaw cięcie.

Narysuj owalny obszar, który będzie pasował po obu stronach dysku, dodatnim GFP i drugim. Wybierz nasadkę probówki, w której chcesz zebrać dodatnią część GFP. Naciśnij przycisk Start cut.

Mikro dyssektor Kontynuuje cięcie tkanki z prędkością i mocą, które ustawiłeś wcześniej, wybierając funkcję przesuwaj i tnij. Możesz udoskonalić cięcie ręcznie, aż niezaznaczony kawałek tkanki spadnie. Animacja 3D pokazuje, co dzieje się pod mikro cięciem dyssektorowym, laser skupia się na tkance Wykonując cięcie wzdłuż wybranego obwodu.

Po wykonaniu cięcia kawałek tkanki wpada do wybranej nakrętki probówki, a następnie do odczynnika tri. Po pierwszym cięciu przesuń obszar cięcia po drugiej stronie tarczy skrzydła, aby wyciąć równoważny obszar ujemny GFP. Przed przystąpieniem do nowego cięcia należy wybrać inną nasadkę probówki, aby oddzielić tkanki GFP dodatnie od ujemnych GFP.

Naciśnij przycisk rozpoczęcia cięcia po automatycznym cięciu. Przejdź do ręcznego poprawiania cięcia, jak pokazano w animacji 3D przed drugim cięciem. Zmotoryzowany stolik przesuwa wybraną nasadkę rury pod obszar cięcia.

Wiązka lasera skupia się na tkance przeciętej wzdłuż wybranego obwodu, a po wykonaniu cięcia kawałek tkanki wpada do wybranej nakrętki probówki zawierającej odczynnik Tri. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, powtórzyliśmy procedurę na stu wyimaginowanych dyskach skrzydeł. Po pobraniu próbek rozładuj probówki.

Jest to delikatny krok, który może sprawić, że stracisz całą pracę, którą wykonałeś do tej pory. Więc bądź ostrożny. Zamknij nasadkę do góry nogami i kontynuuj eksperyment.

To jest ten z tkanką GFP-dodatnią. To jest drugi z tkanką ujemną GFP. Krok szósty, profilowanie transkrypcji.

Zakręć probówkami, aby odłączyć płyn od nakrętki i dodaj odczynnik Try do jednego mililitra. Wykonaj ekstrakcję RNA zgodnie ze standardowym protokołem odczynnika try ze stu obszarów o powierzchni około 5 000 mikrometrów kwadratowych każdy. Nasza wydajność wyniosła 1,5 mikrograma RNA.

Używamy indeksu górnego trzy in vitrogen do syntezy CD NA z losową heksą. Dokładność ręcznego preparowania była kontrolowana poprzez sprawdzenie ekspresji GFP w dwóch próbkach za pomocą R-T-P-C-R. Jak wykazano w żelu z ilościowym R-T-P-C-R.

Oceniliśmy poziomy ekspresji genu ciszy X wraz z możliwymi domniemanymi celami szlaku regulacyjnego, w którym pośredniczy gen X. Ten diagram przedstawia przykład poziomów ekspresji genu X i jednego z jego przypuszczalnych celów. Nazwij je genami Y w odniesieniu do ich podstawowych poziomów ekspresji w przednich tylnych przedziałach niesolidnych dysków skrzydeł.

Stwierdzono, że aktywność wybranego genu X zmniejszyła się do 40% po wyciszeniu. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że jeden z jego domniemanych celów, gen Y, znacznie zwiększył siedmiokrotny wzrost, co doprowadziło nas do potwierdzenia hipotezy, że był negatywnie regulowany przez gen X. Wnioskujemy, że wyżej opisane podejście eksperymentalne można z powodzeniem zastosować do walidacji przypuszczalnych celów na różnych szlakach regulacyjnych.