Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie i scharakteryzowanie wypełnionych enzymami pęcherzyków bakteryjnej błony zewnętrznej do zastosowania jako odczynniki katalityczne in vitro. Ta technika izolacji enzymów umożliwia zbieranie bakteryjnych OMV z pożywek hodowlanych, a następnie wykorzystanie ich do przeprowadzenia bezkomórkowej katalizy związku fosforoorganicznego. Ukierunkowane pakowanie w bakteryjnych OMV znacznie poprawia stabilność enzymu w różnych warunkach reakcji i przechowywania, w przeciwieństwie do tradycyjnych technik, które często powodują stopniową i ciągłą utratę aktywności enzymu.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku pakowania białek mających znaczenie w wielu dziedzinach, takich jak rozwój terapii, remediacja lub rozwój bezkomórkowych systemów katalitycznych. Podczas gdy protokół ten szczegółowo opisuje oczyszczanie OMV z E. coli, techniki z modyfikacją strategii pakowania mogą być z łatwością wykorzystane do oczyszczania OMV z różnych kultur komórek drobnoustrojów. Po wytworzeniu pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV u bakterii zgodnie z protokołem tekstowym, należy odwirować nienaruszoną pożywkę bakteryjną w temperaturze 7 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.

Usunąć i zachować supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie przełóż supernatant przez drugie wirowanie, aby upewnić się, że wszystkie bakterie zostały usunięte z podłoża. Aby usunąć agregaty białkowe i duży materiał komórkowy z zapisanej pożywki hodowlanej, należy pobrać roztwór do sterylnej strzykawki o pojemności od 10 do 50 mililitrów.

Założyć filtr o średnicy 0,45 mikrona, aby zwabić koniec strzykawki. Następnie wciśnij tłok i zbierz przepływ do nowej rurki. Alternatywnie, przefiltruj próżniowo pożywkę hodowlaną, przenosząc ją do sterylnego aparatu filtracyjnego.

Podłącz urządzenie do pompy próżniowej lub aspiratora zlewu, aby wytworzyć ssanie. Przefiltrowane podłoże przenieść do nowego naczynia. Aby wyizolować OMV, należy przenieść przefiltrowaną pożywkę hodowlaną do probówek ultrawirówek.

Wiruj podłoże w temperaturze około 150 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny za pomocą wirnika odpowiadającego używanym rurkom. Bezpośrednio po ultrawirowaniu, aby uniknąć utraty masy osadu, zdekantować pożywkę hodowlaną zubożoną w OMV z lekko brązowego osadu OMV, który może, ale nie musi być widoczny gołym okiem. Osad OMV utworzony po ultrawirowaniu może być tylko luźno przylegający do pęcherzyka wirówkowego.

Podczas dekantacji należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że granulki nie zostaną przemieszczone i utracone. Zachowaj supernatant do późniejszego dynamicznego rozpraszania światła, aby sprawdzić, czy cząstki OMV zostały całkowicie zubożone z ośrodka. Dodać 0,5 do jednego mililitra sterylnego, przefiltrowanego PBS o pH 7,4 lub innego przefiltrowanego buforu, zgodnie z potrzebami lub warunkami doświadczalnymi, do osadu i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie ostrożnie odpipetować oczyszczony roztwór OMV, delikatnie mieszając, aby upewnić się, że cała osadka została rozpuszczona. Aby określić rozkład wielkości OMV, otwórz oprogramowanie do śledzenia nanocząstek DLS dla używanego instrumentu. Włącz mikroskop i wyczyść wszystkie powierzchnie mikroskopu i jednostki śledzącej nanocząsteczki.

Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra dodać około 0,5 mililitra próbki OMV bezpośrednio do viewokienko urządzenia do śledzenia cząstek przez dolną złączkę, uważając, aby zakryć całe okienko podglądu bez wstrzykiwania jakichkolwiek pęcherzyków powietrza do systemu. Umieść jednostkę śledzącą nanocząstki na stoliku mikroskopu i włącz laser. Następnie kliknij Przechwyć w oprogramowaniu.

Dostosuj ostrość mikroskopu i stolik, aby zwizualizować cząstki na ekranie podglądu znajdującym się w oknie oprogramowania. Dostosuj migawkę aparatu i wzmocnienie aparatu, aż jasne cząsteczki będą wyraźnie widoczne na ciemnym tle. Dostosuj czas przechwytywania do 60 sekund, a następnie kliknij przycisk Nagraj.

Po wyświetleniu monitu wprowadź przykładową temperaturę urządzenia, oznacz próbkę i zapisz dane wideo po zakończeniu każdego uruchomienia w folderze wyznaczonym przez użytkownika. Pozostaw wszystkie parametry analizy w trybie automatycznego wykrywania i kliknij przycisk Sekwencja procesu. Zapisuj rozkład wielkości i stężenie cząstek jako cząstki na mililitr, zgodnie z ustaleniami oprogramowania.

Aby określić zawartość białka OMV, użyj SDS-PAGE i Western Blot do oceny produkcji enzymów czystości OMV oraz wydajności SpyCatcher lub SC do SpyTag lub ST cross-link. Konieczne jest potwierdzenie ekspresji docelowych enzymów i białka kotwiczącego. Ekspresja rekombinowanych białek może być często nieudana z różnych powodów, a udana produkcja białka powinna zostać potwierdzona przed scharakteryzowaniem OMV.

Aby przeprowadzić test aktywności fosfotriesterazy lub PTE, dodaj pięć mikrolitrów rozcieńczenia paraoksonu w buforze CHES od jednego do 1,000 do pięciu mikrolitrów oczyszczonych OMV w 90 mikrolitrach CHES. Wykonuj odczyty absorbancji przy 405 nanometrach i 348 nanometrach co 20 sekund przez około dwie godziny całkowitego czasu reakcji, aby monitorować postęp chromogennego produktu rozpadu paraoksonu p-nitrofenolu. Na koniec przeprowadź analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym.

Pokazano tutaj przykłady morfologii oczyszczonych OMV z E. coli za pośrednictwem SEM. OMV mają rozmiar od 50 do 250 nanometrów, jak określono za pomocą oprzyrządowania do śledzenia cząstek. Na tym wykresie pokazane jest bezwzględne stężenie OMV.

Gdy N terminal OMP-A-ST był jednocześnie przekształcany z PTE-SC w obecności arabinozy i IPTG, zaobserwowano znaczny wzrost produkcji OMV w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Widoczne tutaj SDS-PAGE i Western Blot dodatkowo charakteryzują zawartość białka OMV i ekspresję rekombinowanego białka dla OMP-A-ST, natywnego OMP-A, PTE-SC i OMP-A-ST-PTE-SC. Na tym rysunku ogólne poziomy ekspresji PTE i wydajność pakowania OMV w granulkach komórkowych, supernatance UC i oczyszczonych granulkach UC OMV określono za pomocą początkowych pomiarów prędkości przy użyciu paraoksonu jako substratu chromogenicznego.

W tym przypadku Triton X-100 został wykorzystany do weryfikacji translokacji paraoksonu przez nienaruszone dwuwarstwy OMV. Różnica w aktywności z detergentem lub bez niego była niewielka, co wskazuje, że paraokson swobodnie przechodzi przez endogenne pory na OMV. Wreszcie, jak widać w tym eksperymencie, dane kinetyczne PTE-SC są zgodne ze standardowym równaniem kinetyki enzymu Michaelisa-Mentena dla N końcowego OMP-A-ST współtransformowanego z PTE-SC w obecności arabinozy oraz IPTG i PTE-SC w obecności aktywacji arabinozy.

Po wykonaniu i potwierdzeniu wszystkich konstruktów genetycznych, pakowanie enzymów i oczyszczanie OMV można przeprowadzić w ciągu dwóch dni. Trzeci dzień jest konieczny do potwierdzenia i scharakteryzowania OMV za każdym razem, gdy opracowywany jest nowy konstrukt. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zweryfikowaniu ocen bezpieczeństwa wszystkich materiałów i sprzętu do wirowania.

Dodatkowo ważne jest, aby zweryfikować powodzenie każdego kroku przed przejściem do następnego. Opisane tutaj etapy charakterystyki mogą być uzupełnione innymi w celu potwierdzenia upakowania enzymu i morfologii OMV. Stężenie białka, zawartość lipidów, stężenie LPS i wiele innych właściwości może się różnić w zależności od różnych obciążeń i warunków addukcji i może wpływać na dalsze zastosowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać i charakteryzować OMV wypełnione enzymami, a także przeprowadzać wstępne testy w celu oceny aktywności ładunku enzymu. Nie zapominaj, że praca z bakteriami i odczynnikami chemicznymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak właściwa technika aseptyczna i środki ochrony osobistej.