Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oczyszczenie i charakterystyka wypełnionych enzymem pęcherzyków zewnętrznej błony bakteryjnej w celu ich wykorzystania jako reagentów katalitycznych in vitro. Ta technika izolacji enzymów pozwala na odzyskiwanie bakteryjnych OMV z pośrodków hodowlanych, a następnie wykorzystanie ich do prowadzenia bezkomórkowej katalizy związku organofosforowego. Celowe pakowanie wewnątrz bakteryjnych OMV znacząco poprawia stabilność enzymu w szerokim zakresie warunków reakcji i przechowywania, w przeciwieństwie do tradycyjnych technik, które często prowadzą do stopniowej i ciągłej utraty aktywności enzymatycznej.

Zastosowania tej techniki obejmują pakowanie białek istotnych w wielu dziedzinach, takich jak opracowywanie środków terapeutycznych, remediacja czy tworzenie bezkomórkowych układów katalitycznych. Choć niniejszy protokół szczegółowo opisuje oczyszczanie OMV z E.coli, techniki te, po zmodyfikowaniu strategii pakowania, mogą być łatwo wykorzystane do oczyszczania OMV z różnych kultur komórek mikrobowych. Po wygenerowaniu pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) w bakteriach zgodnie z protokołem tekstowym, należy odwirować nienaruszone podłoło hodowlane bakterii przy 7 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 15 minut.

Usunąć i zachować supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulatu komórkowego. Następnie poddać supernatant drugiemu wirowaniu, aby upewnić się, że z pożywki usunięto wszystkie bakterie. W celu usunięcia agregatów białkowych i dużych elementów komórkowych z zachowanego pożywki hodowlanej, naciągnąć roztwór do sterylnej strzykawki o pojemności od 10 do 50 mililitrów.

Do końcówki strzykawki przyłącz filtr o rozmiarze porów 0,45 mikrona. Następnie wciśnij tłok i zbierz przefiltrowaną ciecz do nowej probówki. Alternatywnie można przefiltrować pożywkę hodowlaną za pomocą filtracji próżniowej, przenosząc ją do sterylnego urządzenia do filtracji.

Podłącz urządzenie do pompy próżniowej lub aspiratora zlewozmywakowego w celu wytworzenia podciśnienia. Przenieś przefiltrowane medium do nowego naczynia. Aby wyizolować OMV, przenieś przefiltrowane medium hodowlane do probórek do ultrawirowania.

Wiruj medium przy przyspieszeniu około 150 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny, używając rotora dopasowanego do wykorzystywanych probówek. Natychmiast po ultracentryfugacji, aby uniknąć utraty masy osadu, oddziel odlane medium hodowlane pozbawione OMV od lekko brązowego osadu OMV, który może być lub nie być widoczny gołym okiem. Osad OMV utworzony po ultracentryfugacji może być jedynie słabo przylegający do ścianki probówki wirowej.

Podczas zlewania należy zachować ostrożność, aby nie zdezorganizować i nie zgubić osadu. Należy zachować nadsącz do późniejszego wykonania dynamicznej analizy rozpraszania światła w celu weryfikacji, czy cząsteczki OMV zostały całkowicie usunięte z medium. Do osadu należy dodać od 0,5 do jednego mililitra sterylnego, filtrowanego PBS o pH 7,4 lub innego filtrowanego buforu, zgodnie z potrzebami lub warunkami eksperymentu, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie ostrożnie pipetuj oczyszczony roztwór OMV, delikatnie mieszając, aby upewnić się, że cały osad został rozpuszczony. W celu wyznaczenia rozkładu wielkości OMV otwórz oprogramowanie DLS do śledzenia nanocząstek odpowiednie dla używanego urządzenia. Włącz mikroskop i wyczyść wszystkie powierzchnie mikroskopu oraz jednostki do śledzenia nanocząstek.

Używając sterylnej strzykawki o objętości jednego mililitra, należy wprowadzić około 0,5 mililitra próbki OMV bezpośrednio do okna obserwacyjnego urządzenia do śledzenia cząsteczek poprzez dolne złącze, dbając o to, aby pokryć całe okno obserwacyjne i nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza do systemu. Umieść jednostkę do śledzenia nanocząsteczek na stoliku mikroskopu i włącz laser. Następnie kliknij Capture w oprogramowaniu.

Dostosuj ostrość mikroskopu oraz położenie stolika, aby cząsteczki były widoczne na ekranie podglądu w oknie oprogramowania. Reguluj czas otwarcia migawki i wzmocnienie kamery, aż jasne cząsteczki będą wyraźnie widoczne na ciemnym tle. Ustaw czas akwizycji na 60 sekund, a następnie kliknij Record.

Po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu wprowadź temperaturę urządzenia z próbką, opisz próbkę, a po zakończeniu każdego pomiaru zapisz dane wideo w folderze wskazanym przez użytkownika. Pozostaw wszystkie parametry analizy w trybie automatycznego wykrywania i kliknij Process Sequence. Zapisz rozkład wielkości cząstek oraz ich stężenie wyrażone jako liczba cząstek na mililitr, zgodnie z wynikami wyznaczonymi przez oprogramowanie.

Aby określić zawartość białek w OMV, należy zastosować elektroforezę SDS-PAGE i analizę Western blot w celu oceny czystości OMV, produkcji enzymów oraz wydajności sieciowania SpyCatcher (SC) z SpyTag (ST). Niezbędne jest potwierdzenie ekspresji docelowych enzymów i białka kotwiczącego. Ekspresja białek rekombinowanych często okazuje się nieudana z wielu powodów, dlatego przed charakterystyką OMV należy potwierdzić pomyślną produkcję białka.

Aby przeprowadzić pomiar aktywności fosfotriesterazy (PTE), należy dodać 5 µL roztworu paraoksonu w buforze CHES (rozcieńczenie 1:1 000) do 5 µL oczyszczonych OMV w 90 µL buforu CHES. Odczyty absorbancji należy wykonywać przy 405 nm i 348 nm co 20 s przez około dwie godziny całkowitego czasu reakcji, aby monitorować powstawanie p-nitrofenolu, który jest chromogenicznym produktem rozkładu paraoksonu. Na koniec należy przeprowadzić analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym.

Przedstawiono tutaj przykłady morfologii oczyszczonych OMV z E.coli obrazowane za pomocą SEM. Wielkość OMV waha się od 50 do 250 nanometrów, co określono przy użyciu aparatury do śledzenia cząstek. Na tym wykresie przedstawiono bezwzględne stężenie OMV.

Gdy N-terminalny OMP-A-ST został współtransformowany z PTE-SC w obecności arabinozy i IPTG, zaobserwowano znaczny wzrost produkcji OMV w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Przedstawione tutaj analizy SDS-PAGE oraz Western Blots służą do dalszej charakterystyki zawartości białek w OMV oraz ekspresji białek rekombinowanych dla OMP-A-ST, natywnego OMP-A, PTE-SC oraz OMP-A-ST-PTE-SC. Na tej rycinie ogólne poziomy ekspresji PTE oraz wydajność pakowania do OMV w osadach komórkowych, supernatancie z UC oraz oczyszczonych osadach OMV z UC zostały określone poprzez pomiary prędkości początkowej z zastosowaniem paraoksonu jako substratu chromogenicznego.

W tym przypadku Triton X-100 został użyty do weryfikacji translokacji paraoksonu przez nienaruszone dwuwarstwy OMV. Różnica w aktywności z detergentem i bez niego była niewielka, co wskazuje, że paraokson swobodnie przenika przez endogenne pory w OMV. Wreszcie, jak pokazano w tym eksperymencie, dane kinetyczne PTE-SC zostały dopasowane do standardowego równania kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten dla N-końcowego OMP-A-ST współtransformowanego z PTE-SC w obecności arabinozy i IPTG oraz dla PTE-SC w obecności aktywacji arabinozą.

Po przygotowaniu i potwierdzeniu wszystkich konstruktów genetycznych, pakowanie enzymu oraz oczyszczanie OMV można przeprowadzić w ciągu dwóch dni. Trzeci dzień jest niezbędny do potwierdzenia i charakterystyki OMV w przypadku opracowania każdego nowego konstruktu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o weryfikacji norm bezpieczeństwa wszystkich materiałów oraz sprzętu do wirowania.

Ponadto istotne jest zweryfikowanie powodzenia każdego etapu przed przejściem do następnego. Opisane tutaj kroki charakterystyki można uzupełnić o inne w celu potwierdzenia pakowania enzymów i morfologii OMV. Stężenie białek, zawartość lipidów, stężenie LPS oraz wiele innych właściwości mogą różnić się w zależności od ładunku i warunków addycji, co może wpływać na dalsze zastosowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oczyszczać i charakteryzować OMV wypełnione enzymami, a także jak przeprowadzać wstępne testy w celu oceny aktywności ładunku enzymatycznego. Pamiętaj, że praca z bakteriami i odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak właściwa technika aseptyki oraz środki ochrony osobistej.