Chirurgia zastawkowa, cewnikowanie prawego serca i morfometria naczyniowa w modelu szczurzym dla tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem
11 lutego 2017
Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie modelu tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem (PAH) u szczurów oraz procedury analizy głównych hemodynamicznych i histologicznych punktów końcowych w tym modelu.
Ogólnym celem tych procedur jest stworzenie modelu tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem u szczurów oraz analiza jego głównych hemodynamicznych i histologicznych punktów końcowych za pomocą cewnikowania prawego serca i morfometrii naczyń. Przedstawiamy stworzenie szczurzego modelu nadciśnienia płucnego związanego z przepływem, który charakteryzuje się nową przebudową naczyń typu intymnego, podobną do ludzkiego tętniczego nadciśnienia płucnego, i która jest indukowana przez klinicznie dobrze rozpoznany czynnik wyzwalający, a mianowicie zwiększony przepływ krwi w płucach. Cechy te przyczynią się do lepszego przełożenia wyników uzyskanych w tym modelu na chorobę człowieka.
Przedstawiono również standaryzowane metody oceny hemodynamicznej i charakterystyki histopatologii z wykorzystaniem morfometrii ilościowej. Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku odkrycia i oceny nowych strategii leczenia i pozwalają na ocenę specyficznego wpływu na hemodynamikę płuc i morfologię naczyń. Procedury zademonstrują Annemieke Smit-Van Oosten i Michel Weij, mikrochirurdzy z tego laboratorium.
Przed rozpoczęciem zabiegu należy wyszorować skórę znieczulonego szczura sześciobaczkiem chlorkowym w celu dezynfekcji i wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę w celu znieczulenia pooperacyjnego. Następnie użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej wzdłuż brzucha, zaczynając jeden centymetr poniżej przepony, rozciągając się tuż nad genitaliami. Przenieś jelita na sterylną gazę zwilżoną 0,9% solą fizjologiczną na lewą stronę zwierzęcia i przykryj narząd bardziej mokrą, sterylną gazą.
Użyj nowych wacików, aby oddzielić błony łączące aortę brzuszną i żyłę główną poniżej otaczających tkanek. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczyków odłamkowych, aby usunąć okołonaczyniowy tłuszcz aortalny tuż nad rozwidleniem po prawej stronie aorty, w którą zostanie wprowadzona igła. Następnie oddziel aortę i żyłę główną od dwóch milimetrów powyżej miejsca, miejsca wprowadzenia igły, aby stworzyć miejsce na zacisk rzutnika.
Teraz umieść luźny szew 5-O wokół aorty i umieść zacisk Kochera na szwie, aby wytworzyć napięcie na ligaturze powyżej nacięcia. Umieść zacisk rzutnika tuż nad szwem i użyj nowej zamiany, aby ścisnąć żyłę główną tak dystalnie, jak to możliwe, aby zablokować przepływ. Następnie zegnij igłę o rozmiarze 18 do kąta 45 stopni ze skosem skierowanym na zewnątrz i trzymając igłę pod kątem 90 stopni względem zwierzęcia, włóż końcówkę igły do aorty tuż nad rozwidleniem ze skosem skierowanym w lewo.
Wypreparuj błony otaczające aortę i żyłę główną na tyle, aby zapewnić dobrą widoczność obszaru wprowadzania zastawki, ponieważ nadmierne rozwarstwienie spowoduje nieszczelność zastawki. Manipuluj końcówką igły w lewo i włóż igłę do żyły głównej, aż będzie można ją zaobserwować w naczyniu. Aby zapobiec zakrzepicy, użyj nowego bawełnianego wacika, aby wypchnąć pozostałą krew z aorty przez miejsce wkłucia i użyj sterylnej gazy, aby wysuszyć obszar wokół zastawki.
Usunąć igłę i natychmiast nałożyć kroplę kleju tkankowego na miejsce nakłucia. Następnie zdejmij zacisk z aorty i ręcznie zwolnij więzadło na aorcie promixal do zastawki. Żyła główna dystalna do zastawki powinna stać się jaskrawoczerwona i powodować turbulencje w miejscu zastawki.
Po zweryfikowaniu zastawki należy przywrócić jelita do jamy brzusznej i użyć wchłanialnych szwów 4-0, aby zamknąć warstwy mięśni i skóry. Następnie przewietrz zwierzę 100% tlenem w celu odzyskania znieczulenia. W celu cewnikowania prawego serca zdezynfekuj szyję sześciordzeniem chlorkowym i użyj ostrza skalpela numer 10, aby wykonać 1,5-centymetrowe nacięcie po prawej brzusznej stronie szyi od prawego obojczyka do kości żuchwy.
Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek, aby rozprowadzić tkankę, a następnie użyj pęsety, aby delikatnie rozsunąć tkankę, aż pojawi się żyła szyjna. Wypreparuj błony wokół żyły szyjnej za pomocą kleszczy odłamkowych. Następnie umieść luźny szew 5-O wokół naczynia i przyklej ligaturę do maski wentylacyjnej, aby zwiększyć napięcie żyły.
Za miejscem wprowadzenia umieść luźną ligaturę wokół naczynia. Następnie za pomocą uchwytów kleszczy lekko zgnij końcówkę igły o rozmiarze 20 ze skosem skierowanym do wewnątrz i wprowadź końcówkę igły do żyły. Szybko umieść kaniulę zawierającą cewnik w naczyniu i wyjmij igłę, zamykając dolną ligaturę wokół kaniuli, aby zabezpieczyć kaniulę na miejscu.
Teraz przeprowadź kaniulę i cewnik do żyły szyjnej, manewrując kaniulą pod obojczykiem, aby wejść do prawego przedsionka. Skieruj końcówkę kaniuli w stronę serca, aby wejść do prawej komory. Na monitorze przyłóżkowym powinna pojawić się krzywa ciśnienia w prawej komorze łóżka.
Gdy krzywa ciśnienia w prawej komorze jest stała, zapisz skurczowe i rozkurczowe ciśnienie w prawej komorze i manipuluj końcówką kaniuli w lewo i do góry. Przesuń cewnik w obrębie kaniuli, a następnie wsuń cewnik do głównej tętnicy płucnej. Gdy krzywa ciśnienia w tętnicy płucnej jest stała, zapisz skurczowe, rozkurczowe i średnie ciśnienie w tętnicy płucnej.
Następnie przesuwaj cewnik w kaniuli, aż kulka na końcu cewnika zaklinuje się w tętnicy płucnej. Spadek krzywej ciśnienia należy obserwować na monitorze przyłóżkowym. Gdy krzywa ciśnienia klina jest stała, zapisz ciśnienie skurczowe, rozkurczowe i średnie ciśnienie klinowe.
Następnie powoli odciągnij cewnik i kierując się krzywymi na monitorze przyłóżkowym, zapisz odpowiednie wartości ciśnienia PA i RV. Gdy cewnik dotrze do prawej komory, lekko pociągnij kaniulę i cewnik do tyłu i zmierz średnie ciśnienie w prawym przedsionku. W tym reprezentatywnym eksperymencie, 28 dni po podaniu MCT i zwiększonym przepływie krwi w płucach, obserwuje się średni wzrost skurczowej prawej komory, skurczowej tętnicy płucnej i średniego ciśnienia w tętnicy płucnej.
Stosunek masy prawej komory do lewej komory i przegrody znacznie wzrasta od 14 dnia po leczeniu do etapu niewydolności prawej komory, co wskazuje na przerost prawej komory. Stosunek mokrej do suchej wątroby jest również znacznie zwiększony na etapie niewydolności prawej komory, co wskazuje na obrzęk wątroby, a także zastoinową niewydolność prawej komory. Umięśnienie naczyń międzygrobikowych zwiększa się stopniowo podczas progresji nadciśnienia tętniczego w tętnicy płucnej, przy czym prawie połowa naczyń wykazuje całkowite media mięśniowe do 14 dnia po leczeniu w prawie wszystkich tętniczkach umięśnionych w końcowej fazie choroby.
Co więcej, zmiany w obrębie błony środkowej są po raz pierwszy obserwowane w 21 dniu, przy czym około 65% wszystkich tętniczek wykazuje warstwę neo-wewnętrzną pod koniec progresji choroby. Powoduje to postępującą niedrożność naczyń krwionośnych, w której w końcowej fazie choroby dochodzi do zamknięcia do 60% światła. Po opanowaniu techniki te można ukończyć w 20 minut na technikę.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak echokardiografia lub pętla objętości ciśnienia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji prawej komory. Po opracowaniu technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się tętniczym nadciśnieniem płucnym do zbadania wpływu zwiększonego przepływu krwi na układ naczyniowy płuc. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć model tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem u szczurów i jak analizować jego główne hemodynamiczne i histologiczne punkty końcowe
.Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje procedurę chirurgiczną służącą do stworzenia modelu nadciśnienia tętniczego płuc (PAH) indukowanego przepływem u szczurów, wraz z metodami analizy parametrów hemodynamicznych i histologicznych. Model ten naśladuje cechy ludzkiego PAH, co usprawnia badania translacyjne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Badania nad nadciśnieniem płucnym
- Techniki chirurgiczne w modelach zwierzęcych
Wstęp
- Nadciśnienie tętnicze płuc indukowane przepływem stanowi istotny problem zdrowotny.
- Modele zwierzęce są niezbędne do zrozumienia mechanizmów choroby i testowania metod leczenia.
- Niniejsze badanie koncentruje się na modelu szczura, który odzwierciedla ludzkie PAH.
- Zstandardyzowane metody oceny są kluczowe dla powtarzalności wyników.
Cel badania
- Stworzenie wiarygodnego modelu szczura do badania PAH indukowanego przepływem.
- Analiza zmian hemodynamicznych i przebudowy naczyniowej.
- Ułatwienie odkrywania nowych strategii leczenia PAH.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne stworzenie przecieku w celu indukcji PAH.
- Cewnikowanie prawej komory serca w celu oceny hemodynamicznej.
- Morfometria ilościowa do analizy histopatologicznej.
- Ustandaryzowane protokoły dezynfekcji i analgezji w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt.
Główne wyniki
- Skuteczne stworzenie modelu PAH indukowanego przepływem u szczurów.
- Charakterystyka zmian hemodynamicznych po operacji.
- Identyfikacja przebudowy naczyniowej typu intimalnego.
- Ustanowienie wiarygodnych metod do przyszłych badań.
Wnioski
- Model szczurzy skutecznie symuluje warunki ludzkiego PAH.
- Ustandaryzowane metody zwiększają wiarygodność wyników.
- Model ten może pomóc w ocenie nowych podejść terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy protokół ustanawia szczurzy model nadciśnienia tętniczego płuc indukowanego przepływem, który odzwierciedla progresję choroby u ludzi, umożliwiając przedkliniczną ocenę kandydatów terapeutycznych ukierunkowanych na przebudowę naczyń. Poprzez połączenie oceny hemodynamicznej z ilościową morfometrią naczyniową, podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w procesach odkrywania leków na nadciśnienie płucne. Powtarzalność modelu oraz jego zgodność translacyjna zwiększają pewność prognostyczną przy podejmowaniu decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnych fazach programów kardioonkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z zależnym od przepływu przebudowywaniem naczyń i tworzeniem się zmian neointimalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany system walidacji funkcjonalnej celów terapeutycznych poprzez mierzalne punkty końcowe hemodynamiczne i histologiczne.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez modelowanie klinicznie istotnego czynnika wyzwalającego — zwiększonego przepływu krwi w płucach — powiązanego z ciężkimi fenotypami PAH.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie istotnych dla choroby tkanek tętnicy płucnej, odpowiednich do późniejszych badań przesiewowych związków oraz analizy biomarkerów.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza pomiary grubości ściany, stosunków grubości ściany do światła oraz wskaźników niedrożności, co umożliwia ocenę zależności dawka-odpowiedź i profilowanie związków.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ustanawia odtwarzalny schemat morfometrii naczyniowej, który można skalować w ramach wielu ramion badania i cykli testowania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Odzwierciedla przypominające ludzkie przebudowy naczyniowe typu intimalnego oraz postępujące zamykanie naczyń, co wzmacnia ciągłość translacyjną.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę wpływu związków zarówno na ciśnienia hemodynamiczne, jak i na morfologię naczyniową, co zmniejsza niejednoznaczność w określaniu mechanizmu działania.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera monitorowanie podłużne od wczesnej hipertrofii błony środkowej po końcowe zmiany neointimalne, co dostarcza informacji dla decyzji o przejściu do kolejnych etapów z uwzględnieniem oceny ryzyka.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje hemodynamiczną ocenę funkcjonalną z strukturalną analizą naczyniową, sytuując ją pomiędzy walidacją celu a przedklinicznymi badaniami skuteczności w procesach odkrywania leków w nadciśnieniu płucnym.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków indukowanych przepływem i wyjaśnia mechanizmy napędzające hipertrofię błony środkowej oraz tworzenie się neointimy.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki morfometrii naczyniowej, które wspierają rzetelną ocenę związków chemicznych w różnych laboratoriach.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty hemodynamiczne (ciśnienie RV, ciśnienie PA, ciśnienie zaklinowania) i morfometryczne (grubość ściany, wynik niedrożności) do porównawczej analizy stanów chorobowych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne zmiany naczyniowe z przedklinicznymi stadiami choroby poprzez ocenę histopatologiczną zgodną z progresją PAH u ludzi.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy zestandaryzowaną platformę chirurgiczną i analityczną, którą można zastosować do wielu modalności terapeutycznych i klas celów w badaniach sercowo-naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez powiązanie zwiększonego przepływu płucnego z mierzalną przebudową naczyniową i upośledzeniem czynnościowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom tworzenia przecieku, cewnikowania i morfometrii.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez modelowanie klinicznie zwalidowanego wyzwalacza PAH i rejestrowanie wczesnej patologii naczyniowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efekty wpływające zarówno na funkcję hemodynamiczną, jak i strukturę naczyniową.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii w tworzeniu przecieków naczyniowych oraz cewnikowania prawej komory serca u modeli gryzoni.
- Zależne od precyzyjnych instrumentów, w tym igieł 18-G i 20-G, kaniul z cewnikami zakończonymi kulką oraz mikroskopów sekcyjnych.
- Wymaga zstandaryzowanej opieki pooperacyjnej i protokołów analgezji w celu zapewnienia spójności modelu i zgodności z zasadami dobrostanu zwierząt.
- Obejmuje kroki zależne od przeszkolenia, takie jak weryfikacja przecieku poprzez obserwację turbulencji oraz potwierdzenie ciśnienia zaklinowania podczas cewnikowania.
- Ograniczone przez złożoność techniczną chirurgii przeżyciowej obejmującej dwie procedury, co może wpływać na przepustowość w wysokowydajnych kampaniach przesiewowych.
