Name: Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj nieinwazyjną technikę obrazowania optycznego MMP in vivo z użyciem aktywowalnych sond fluorescencyjnych w modelach zapalenia. Metoda jest szybka, tania i pozwala na długoterminowe monitorowanie procesów biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danielowi Bukali, Natalie Altmeyer i Funda Cay za doskonałe wsparcie techniczne. Dziękujemy Jonathanowi Cottonowi, Gregowi Bowdenowi i Paulowi Soubiranowi za redakcję manuskryptu. Prace te były wspierane przez Fundację Wernera Siemensa i Wydział Medyczny Uniwersytetu Eberharda Karola w Tybindze ("Promotionskolleg") oraz przez DFG za pośrednictwem CRC 156 (projekt C3).

Wszystkie procedury opisane w tym artykule, były zgodne z wytycznymi i międzynarodowymi standardami opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Komisji Krajowej w Tybindze, Niemcy. 8 - 12 tygodniowe myszy BALB/c i C57BL/6 były trzymane w świetle przez 12 godzin: 12 godzin: cyklu ciemnego i umieszczono w IVC i znormalizowanych warunkach środowiskowych w temperaturze 22 ± 1 °C w grupach od 2 do 5 osób z dostępem do wody i pożywienia ad libitum.
1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Rozcieńczyć barwnik OI do obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni zgodnie z odpowiednią kartą katalogową bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Aktywowany barwnik OI (komercyjna sonda ze wzbudzeniem przy 680 nm) do pomiaru MMP in vivo jest gotowy do użycia w stężeniu 20 nmol w 1,5 ml 1x PBS. Przed użyciem delikatnie wstrząśnij lub zmieszaj roztwór. Barwnik OI może być przechowywany w temperaturze 2 - 8 °C do 6 miesięcy, jeśli jest chroniony przed światłem.</li>
	<li>Do wstrzyknięć dożylnych (dożylnych) należy przygotować cewnik dożylny. Użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 20 j. (0,5 ml) wypełnionej 0,9% roztworem soli fizjologicznej (zawierającej 10 jednostek iniekcyjnych heparyny w 50 ml) i igłą o rozmiarze 30 przymocowaną do cewnika polietylenowego. Wstrzyknąć zalecaną dawkę 2 nmol barwnika OI na mysz.</li>
</ol>
2. Indukcja reumatoidalnego zapalenia stawów i przewlekła reakcja nadwrażliwości kontaktowej
<ol>
	<li>Reumatoidalne zapalenie stawów:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100 μL surowicy (uzyskanej od myszy K/BxN 10) zawierającej przeciwciała (AB) przeciwko izomerazy glukozo-6-fosforanowej (GPI) 1:1 z 1x PBS (200 μL) w celu wywołania RZS. Rozcieńczoną surowicę przechowywać w temperaturze -80 °C. Szczegółowe procedury indukcji RZS są opisane przez Monach i wsp.8.</li>
		<li>Aby wywołać RZS, delikatnie podnieś każdą mysz za ogon i wstrzyknij 200 μl rozcieńczonej surowicy dootrzewnowej (i.p.) w dniu 0 eksperymentu. Po wstrzyknięciu należy umieścić mysz bezpośrednio z powrotem w klatce.</li>
		<li>Opcjonalnie zmierz średnicę kostki każdej kostki przed wstrzyknięciami AB i zdefiniuj "wynik artretycznego" (ryc. 1A). Kontynuuj pomiar obrzęku kostki codziennie do 6 dnia po GPI-surowicy za pomocą mechanicznego urządzenia pomiarowego (mikrometru).</li>
		<li>Wstrzyknąć aktywowany barwnik OI (krok 1.1 - 1.2), aby zmierzyć in vivo aktywność MMP dożylnie do żyły ogonowej myszy RZS w 5 dniu po wstrzyknięciu surowicy GPI oraz do żyły ogonowej myszy kontrolnych. Eksperymenty z obrazowaniem optycznym należy wykonać 24 godziny po iniekcji żyły ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja nadwrażliwości kontaktowej:
	<ol>
		<li>W celu uczulenia myszy C57BL/6 należy przygotować 5% roztwór TNCB rozpuszczony w mieszaninie acetonu i oleju w proporcji 4:1.</li>
		<li>Myszy C57BL/6 należy znieczulić za pomocą 1,5% izofluranu odparowanego w 100% tlenu (1,5 l/min). Gdy myszy zostaną znieczulone, umieść je w samodzielnie wykonanym stożku na nos (wycięta strzykawka polietylenowa o pojemności 5 ml, podłączona do probówki z izofluranem o stężeniu 1,5% obj.) i utrzymuj znieczulenie. Nałóż maść do oczu weterynarza na znieczulone zwierzęta, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Ostrożnie ogol brzuch (2 x 2 cm) za pomocą małego trymera do sierści zwierzęcej. Należy unikać zranień skóry, ponieważ może to prowadzić do niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych u zwierzęcia i może wpłynąć na wyniki badania.</li>
		<li>Nanieść powoli 80 μl 5% roztworu TNCB na ogolony obszar brzucha za pomocą pipety o pojemności 100 μl, aby uczulić zwierzę. Delikatnie umieść mysz z powrotem w klatce, uważając, aby oczy myszy nie stykały się z pościelą, aby uniknąć uszkodzenia rogówki i uniknąć niskiej temperatury ciała podczas fazy rekonwalescencji.</li>
		<li>Sześć dni po uczuleniu przygotuj 1% roztwór TNCB (rozpuszczony w mieszaninie acetonu i oleju w stosunku 9:1) i nałóż 20 μl na prawe ucho za pomocą pipety, aby wywołać ostry i przewlekły CHSR. 1
		<ol>
			<li>Zacznij od pierwszego wyzwania po obu stronach prawego ucha z 20 μl 1% roztworu TNCB za pomocą pipety 100 μl i powtarzaj prowokację co drugi dzień do pięciu razy (15 dzień po uczuleniu), aby wywołać CHR (Figura 1B). Codziennie mierz grubość ucha za pomocą mikrometrycznego urządzenia pomiarowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wstrzyknąć aktywowany barwnik OI (komercyjna sonda ze wzbudzeniem przy 680 nm) (krok 1.1-1.2) w celu zmierzenia aktywności MMP in vivo u myszy CHR 12 godzin po prowokacji. Wykonuj eksperymenty z obrazowaniem optycznym 24 godziny po wstrzyknięciu żyły ogonowej (i.v.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt do obrazowania optycznego
<ol>
	<li>Przełącz karmę myszy (co najmniej 3 dni przed obrazowaniem) na karmę o niskiej lub niefluorescencji (np. bez manganu), aby uniknąć zakłóceń autofluorescencji (około 700 nm) z sygnałem fluorescencji użytych środków OI.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej i znieczulenie za pomocą 1,5% obj. izofluranu odparowanego z tlenem (1,5 l/min) (tlen można zastąpić powietrzem, ale musi być standaryzowany w ramach jednego eksperymentu).</li>
	<li>Gdy mysz jest widocznie znieczulona, umieść ją w samodzielnie wykonanym stożku na nos (zbudowanym z wyciętej strzykawki polietylenowej o pojemności 5 ml, połączonej z rurką izofluranu o stężeniu 1,5% obj.) i utrzymuj znieczulenie.</li>
	<li>Ostrożnie ogolić zwierzę w miejscu docelowym (2 cm x 2 cm) za pomocą małego trymera do sierści zwierzęcej. Należy unikać zranień skóry, ponieważ może to prowadzić do niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych u zwierzęcia i może wpłynąć na wyniki badania. 
	UWAGA: Włosy mogą absorbować sygnał fluorescencyjny podczas OI (w zależności od szczepu myszy, obserwuje się większą lub mniejszą absorpcję) w zależności od obszaru zainteresowania (ROI).</li>
	<li>W przypadku wstrzyknięcia dożylnego umieść ogon myszy w podgrzanej wodzie, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych, delikatnie oczyść skórę w miejscu wstrzyknięcia alkoholem i zacznij od umieszczenia cewnika w dystalnym miejscu ogona. Umieścić "przeciętą" krawędź igły pod kątem 20° w żyle ogonowej i sprawdzić prawidłowe umieszczenie cewnika poprzez ponowne zawieszenie strzykawki.</li>
	<li>Jeśli cewnik jest umieszczony prawidłowo, wymienić strzykawkę i wstrzyknąć sondę OI (2 nmol). Po wstrzyknięciu wymienić strzykawkę i wstrzyknąć 25 μl 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby całkowicie usunąć martwą objętość rurki polietylenowej. 
	UWAGA: Czas półtrwania tkanki użytego barwnika OI (komercyjnej sondy ze wzbudzeniem przy 680 nm) do pomiaru aktywności MMP in vivo wynosi 72 godziny. Aby zapewnić całkowite usunięcie objawów, nie zaleca się ponownego wstrzykiwania barwnika wcześniej niż 7 dni po wcześniejszym wstrzyknięciu.</li>
</ol>
4. Obrazowanie optyczne
<ol>
	<li>Umieść arkusz folii lub papieru w czarnym pudełku skanera OI na środku pola widzenia (FOV).</li>
	<li>Ustaw protokół pomiarowy i wybierz odpowiednią długość fali (wzbudzenie: 680 ± 10 nm i emisję: 700 ± 10 nm) oraz parametry obrazowania. 
	UWAGA: W niektórych systemach OI konfiguracja dla kilku barwników do obrazowania jest wstępnie zdefiniowana.</li>
	<li>Aby wybrać właściwy protokół obrazowania fluorescencyjnego, otwórz oprogramowanie do obrazowania (dostarczone przez producenta) i zainicjuj system. Większość kamer CCD musi schłodzić się do temperatury roboczej, a to może zająć 10 minut. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, poczekaj, aż system będzie gotowy.</li>
	<li>Obserwuj, jak rozwija się panel sterowania akwizycją systemu obrazowania in vivo, a każda wybrana para filtrów będzie reprezentować jeden obraz w sekwencji. W takim przypadku należy uzyskać jeden obraz z parami filtrów dla barwnika komercyjnego o długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 680 ± 10 nm i 700 ± 10 nm, a następnie rozpocząć pomiar (Naciśnij "Sekwencja pozyskiwania"). Bardziej szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji producenta.</li>
	<li>Odpowiednio oznacz obrazy i zapisz informacje w oknie "Edytuj etykiety obrazów", które pojawi się po "Pobierz sekwencję".</li>
	<li>Wykonaj skan wyjściowy każdego zwierzęcia przed wstrzyknięciem barwnika OI lub użyj naiwnych zwierząt kontrolnych w celu rozróżnienia sygnału tła.</li>
	<li>h po wstrzyknięciu barwnika OI do żyły ogonowej, umieść zwierzęta w środku pola widzenia, w pozycji do pomiaru najwyższego sygnału w systemie OI i rozpocznij pomiary. 
	UWAGA: Ważne: Hipotermia może znacząco wpłynąć na dystrybucję środków do obrazowania. Upewnij się, że stage jest podgrzany do 37 °C, aby uniknąć hipotermii zwierzęcia. Obrazowanie można wykonywać jednocześnie na zwierzętach w grupach od 1 do 5 myszy. Wybierz rozmiar FOV w zależności od liczby zwierząt do zmierzenia w tym samym czasie. Możesz zrobić zdjęcie w jasnym polu, aby sprawdzić, czy każda mysz jest widoczna.</li>
</ol>
5. Analiza danych
UWAGA: Przeprowadź analizę danych za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów zgodnie z protokołem producenta.
<ol>
	<li>Do pomiarów RA należy użyć skalibrowanej jednostki emisji fotonów, jak pokazano na rysunku 2, podczas gdy przewlekłe CHSR są obrazowane jako intensywność sygnału w procentach (wydajność).</li>
	<li>Aby ręcznie narysować ROI, użyj tabliczki narzędziowej. Do analizy obrazów RA należy użyć ustandaryzowanego okręgu, umieszczonego wokół najwyższego sygnału we wszystkich kostkach i łapach każdego zwierzęcia. Aby przeanalizować CHSR, umieść ROI wokół całego prawego i lewego ucha zgodnie z obrazem jasnego pola.</li>
	<li>Aby zmierzyć emisję fotonów lub wartości intensywności sygnału w określonym narysowanym ROI, naciśnij "zmierz". System dostarczy wartości w wylosowanym ROI do opisowej analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+psoriasis+and+psoriatic+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis.</a> Ann Rheum Dis. 64, 26(2005).</li>
<li>Harris, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis.+Pathophysiology+and+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy.</a> N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).</li>
<li>Lee, D. M., Weinblatt, M. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11567728">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).</li>
<li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>Pap, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+pattern+of+membrane-type+matrix+metalloproteinases+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).</li>
<li>Firestein, G. S., Paine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromelysin+and+tissue+inhibitor+of+metalloproteinases+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium.</a> Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).</li>
<li>Schwenck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+detects+acute+and+chronic+contact+hypersensitivity+reactions+and+enables+monitoring+of+the+antiinflammatory+effects+of+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine.</a> Mol Imaging. 13, (2014).</li>
<li>Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+K%2FBxN+arthritis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">The K/BxN arthritis model.</a> Curr Protoc Immunol. 15, 22(2008).</li>
<li>Zelmer, A., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+fluorescence+imaging+of+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Noninvasive fluorescence imaging of small animals.</a> J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).</li>
<li>Kouskoff, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+disease+provoked+by+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity.</a> Cell. 87 (5), 811-822 (1996).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cell+proliferation+enables+the+detection+of+the+extent+of+experimental+rheumatoid+arthritis+by+3%27-deoxy-3%27-18f-fluorothymidine+and+small-animal+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET.</a> J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).</li>
<li>Schwenck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+Cerenkov+luminescence+imaging.+Applications+in+small+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nuklearmedizin%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research.</a> Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).</li>
<li>Mahling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+pO2+Probe+and+%5B18F%5D-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside+%28%5B18F%5DFAZA%29+PET+Study+Reveals+Anesthesia-Induced+Impairment+of+Oxygenation+and+Perfusion+in+Tumor+and+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle.</a> PLoS One. 10 (4), 0124665(2015).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+breathing+affects+3%27-deoxy-3%27-18F-fluorothymidine+uptake+in+mouse+models+of+arthritis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer.</a> J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthetics+on+3%27-%5B18F%5Dfluoro-3%27-deoxythymidine+%28%5B18F%5DFLT%29+uptake+in+animal+models+of+cancer+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation.</a> Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).</li>
<li>Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+for+evaluating+the+efficacy+of+edaravone+after+transient+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice.</a> Brain Res. 1397, 66-75 (2011).</li>
<li>Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+molecular+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+abdominal+aortic+aneurysms+correlates+with+treatment+effects+on+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate.</a> Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction.</a> Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).</li>
<li>Wallis de Vries, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Multispectral+near-infrared+fluorescence+molecular+imaging+of+matrix+metalloproteinases+in+a+human+carotid+plaque+using+a+matrix-degrading+metalloproteinase-sensitive+activatable+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe.</a> Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).</li>
<li>Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tumors+with+protease-activated+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes.</a> Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).</li>
<li>Cortez-Retamozo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+inflammation+and+treatment+response+in+a+mouse+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation.</a> J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).</li>
<li>McIntyre, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+fluorogenic+proteolytic+beacon+for+in+vivo+detection+and+imaging+of+tumour-associated+matrix+metalloproteinase-7+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity.</a> Biochem J. 377, 617-628 (2004).</li>
<li>Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+matrix+metalloproteinase-7+activity+in+vivo+using+a+proteolytic+nanobeacon%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon).</a> Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).</li>
<li>Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+activatable+cell+penetrating+peptides+for+targeting+protease+activity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer.</a> Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).</li>
<li>Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+targeting+of+MMP-2%2F9+activatable+cell-penetrating+imaging+probes+is+caused+by+tumor-independent+activation%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation).</a> J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).</li>
<li>Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-metalloproteinases+as+imaging+targets+for+inflammatory+activity+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques.</a> J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+18F-labelled+derivative+of+the+MMP+inhibitor+CGS+27023A+for+PET%3A+radiosynthesis+and+initial+small-animal+PET+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Radiat+Isot%22%5BJournal%5D)">A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies.</a> Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).</li>
<li>Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+fluorescence-labeled+MMP+inhibitor+to+image+tumor+MMP+activity+in+vivo+in+comparison+to+an+MMP-activatable+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe.</a> Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarmin+S100A8%2FS100A9+as+a+biomarker+for+molecular+imaging+of+local+inflammatory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity.</a> Nat Commun. 5, 4593(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

OI jest bardzo użytecznym, szybkim i niedrogim narzędziem do nieinwazyjnego obrazowania molekularnego in vivo w badaniach przedklinicznych. Szczególną zaletą OI jest zdolność do monitorowania wysoce dynamicznych procesów, takich jak reakcje zapalne. Co więcej, OI pozwala śledzić przebieg choroby przez dłuższy czas, od dni do tygodni.
OI ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami obrazowania in vivo , takimi jak pozytonowa tomografia emisyjna (PET) lub rezonans magnetyczny ...

Choroby autoimmunologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) lub łuszczyca pospolita, są klasyfikowane jako reakcje nadwrażliwości typu opóźnionego (DTHR). 1 RZS jest powszechną chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się nadżerkowym zapaleniem błony maziowej i niszczeniem stawów. 2 Zapalenie stawów wykazuje infiltrację i proliferację komórek zapalnych, zwiększoną ekspresję komórek prozapalnych, co prowadzi do powstawania łuszczycy, niszczenia chrząstek i kości. 3,4 Rozszczepienie cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, przez metaloproteinazy macierzy (MMP), jest niezbędne do konwersji tkanek i angiogenezy oraz powoduje ich niszczenie. 5,6 Reakcje nadwrażliwości kontaktowej (CHR) charakteryzują się agregacją neutrofili prowadzącą do wybuchu oksydacyjnego. 7 Podobnie jak w przypadku RZS, MMP w CHR biorą udział w przemianie tkanek, migracji komórek i angiogenezie w celu wywołania przewlekłego stanu zapalnego.
Aby zbadać RZS, użyto mysiego modelu wstrzykiwania izomerazy glukozo-6-fosforanowej (GPI) w surowicy. 8 Surowica od transgenicznych myszy K/BxN zawierających przeciwciała przeciwko GPI, została wstrzyknięta naiwnym myszom BALB/c, po czym w ciągu 24 godzin zaczęło rozwijać się reumatyczne zapalenie z maksimum obrzęku kostki w 6 dniu po wstrzyknięciu surowicy GPI (patrz 1.1). Aby przeanalizować przewlekłą CHR, myszy C57BL / 6 uczulono trinitrochlorobenzenem (TNCB) na brzuchu. Prawe ucho było poddawane próbie do 5 razy, począwszy od 1 tygodnia po uczuleniu (patrz również 1.1 i 1.2).
Nieinwazyjne OI dla małych zwierząt to technika oparta na badaniu in vivo sygnałów fluorescencyjnych, chemiluminescencyjnych i bioluminescencyjnych, które są głównie wykorzystywane w badaniach przedklinicznych. Uzyskane dane półilościowe dają wgląd w mechanizmy molekularne w narządach i tkankach zdrowych i chorych eksperymentalnych modeli zwierzęcych oraz umożliwiają podłużne pomiary kontrolne (np. w celu oceny profili odpowiedzi terapeutycznej in vivo). Dużą zaletą badań podłużnych jest zmniejszenie liczby zwierząt, ponieważ te same zwierzęta mogą być mierzone w badaniach uzupełniających w kilku punktach czasowych, zamiast używać różnych myszy w każdym punkcie czasowym. Rozdzielczość OI pozwala na szczegółowe obrazowanie funkcjonalne narządów, a nawet mniejszych struktur tkankowych u zwierząt doświadczalnych.
Zastosowanie specyficznych filtrów wzbudzenia i emisji o wąskim spektrum transmisji, ochrony przed rozproszonym światłem przez odporną na światło "ciemną skrzynkę" oraz czułej kamery CCD, która jest chłodzona w wielu urządzeniach do -70 °C, pozwala na bardzo szczegółowe i czułe pomiary sygnałów fluorescencyjnych.
Poprzez użycie środków fluorescencyjnych z widmami wzbudzenia i emisji w oknie fluorescencji bliskiej podczerwieni (650 - 950 nm), stosunek sygnału do szumu może ulec znacznej poprawie. Okno fluorescencji bliskiej podczerwieni charakteryzuje się stosunkowo niską absorpcją sygnału przez hemoglobinę i wodę oraz niską autofluorescencją tła. 9 Pozwala to na penetrację do 2 cm w tkance małych zwierząt. Sondy OI mogą zwracać się bezpośrednio do celu (np. za pomocą przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie) lub mogą być aktywowane w tkance docelowej (np. przez proteazy). Aktywowane sondy OI są optycznie ciche w swojej nieaktywowanej formie dzięki transferowi energii rezonansowej Förstera (FRET) do ugrupowania gaszącego, które przenosi energię wzbudzenia w cząsteczce do innej domeny. Jeśli barwnik zostanie rozszczepiony (na przykład przez proteazę), energia nie jest już przenoszona w cząsteczce, a sygnał fluorescencyjny może zostać wykryty przez OI. Pozwala to na zaprojektowanie sond OI o wysokiej specyficzności dla różnych procesów biologicznych i doskonałym stosunku sygnału do szumu.
Poniższy protokół szczegółowo wyjaśnia przygotowanie zwierząt, pomiary OI za pomocą aktywowanej sondy OI do obrazowania aktywności MMP-2, -3, -9 i -13 in vivo oraz dwa eksperymentalne modele zapalenia (RA, CHR).

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>maść okulistyczna&nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td> strzykawka insulinowa <td>z izofluranem</td></tr><tr><td>U40</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0,28 x 0,61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>rurka polietylenowa, średnica wewnętrzna 0,28 mm, średnica zewnętrzna 0,61&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Regularne igły do ukosowania BD, 30 g</td><td>Becton Dickinson & Co. Ltd.</td><td></td><td>Kaniula iniekcyjna 305106 30 G</td></tr><tr><td>RTA-0011 waporyzator izofluranowy</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC-Artagain</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papier do rysowania</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>System obrazowania optycznego</td></tr><tr><td>BD Regularne igły do ukosowania, 25 G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzen</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>fluorescencyjny barwnik obrazowy</td></tr><tr><td>Oditest&nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>pomiar mechaniczny</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td> <td>SASOL-Oil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BALB/C, C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories&nbsp;</td><td>-</td><td>Myszy używane do eksperymentów</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>Do rozcieńczania surowicy RA&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta (100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>Używany do aplikacji TNCB&nbsp;</td></tr><tr><td>Golarka&nbsp;</td><td>Wahl&nbsp;</td><td>9962</td><td>Maszynka do trymowania sierści zwierzęcej</td></tr><tr><td>Living Image&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania do pomiaru OI</td></tr></tbody></table>

nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności mmp przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Ten artykuł opisuje nieinwazyjną metodę obrazowania aktywności metaloproteinaz macierzy (MMP) za pomocą aktywowanej sondy fluorescencyjnej, za pomocą optycznego obrazowania fluorescencyjnego in vivo, w dwóch różnych mysich modelach zapalenia: reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA) i modelu reakcji nadwrażliwości kontaktowej (CHR). Światło o długości fali w oknie bliskiej podczerwieni (NIR) (650 - 950 nm) pozwala na głębszą penetrację tkanek i minimalną absorpcję sygnału w porównaniu z długościami fal poniżej 650 nm. Główną zaletą fluorescencji OI jest to, że jest tania, szybka i łatwa do wdrożenia w różnych modelach zwierzęcych.
Aktywowane sondy fluorescencyjne są optycznie ciche w swoich stanie nieaktywnym, ale stają się wysoce fluorescencyjne, gdy są aktywowane przez proteazę. Aktywowane MMP prowadzą do zniszczenia tkanek i odgrywają ważną rolę w postępie choroby w reakcjach nadwrażliwości typu opóźnionego (DTHR), takich jak RZS i CHR. Ponadto MMP są kluczowymi proteazami degradacji chrząstki i kości i są indukowane przez makrofagi, fibroblasty i chondrocyty w odpowiedzi na cytokiny prozapalne. Tutaj używamy sondy, która jest aktywowana przez kluczowe MMP, takie jak MMP-2, -3, -9 i -13 i opisujemy protokół obrazowania dla fluorescencji w bliskiej podczerwieni OI aktywności MMP u RA i myszy kontrolnych 6 dni po indukcji choroby, a także u myszy z ostrym (1x prowokacja) i przewlekłym (5x prowokacja) CHR na prawym uchu w porównaniu ze zdrowymi uszami.

Aby wywołać reumatoidalne zapalenie stawów (RA) u naiwnych myszy BALB/c, w dniu 0 wykonano zwierzętom wstrzyknięcia i.p. autoprzeciwciał (rozcieńczenie 1:1 w 1x PBS) przeciwko GPI. Maksymalny stan zapalny (obrzęk stawów skokowych) w tym modelu RA indukowanym surowicą GPI występuje w 6. dniu po wstrzyknięciu11. W związku z tym w dniu 5 przygotowano 2 nmol aktywnego barwnika OI i wstrzyknięto go i.v. do żyły ogonowej myszy z zapaleniem stawów oraz z...

Ten artykuł wyjaśnia zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego za pomocą aktywowanej sondy do obrazowania optycznego do wizualizacji in vivo aktywności kluczowych metaloproteinaz macierzy w dwóch różnych eksperymentalnych modelach zapalenia.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie obrazowania optycznego do wizualizacji aktywowanej sondy w celu oceny aktywności in vivo kluczowych metaloproteinaz macierzy, czyli MMP, w eksperymentalnych modelach stanu zapalnego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące podstawowych mechanizmów biologicznych w chorobach zapalnych. Głównymi zaletami tej techniki są szybkość, niski koszt oraz łatwość opanowania.Ponadto dostępna jest szeroka gama sond ukierunkowanych na różne procesy biologiczne. W celu indukcji reumatoidalnego zapalenia stawów należy najpierw użyć mikrometru, aby zmierzyć średnice wszystkich stawów skokowych każdego zwierzęcia. Następnie należy delikatnie unieść pierwszą mysz za ogon i wstrzyknąć do jam brzusznej 200 µL rozcieńczonego surowicy mysiej KBN zawierającej przeciwciała przeciwko izomerazie glukozo-6-fosforanu lub GPI.Następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce i codziennie mierz obrzęk kostki aż do szóstego dnia. W celu uwrażliwienia na nadwrażliwość kontaktową użyj trymera do sierści małych zwierząt, aby ostrożnie ogolić obszar o wymiarach dwa na dwa centymetry na brzuchu znieczawionej myszy, a następnie za pomocą pipety 100

non-invasive-vivo-fluorescence-optical-imaging-inflammatory-mmp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę oceny infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego za pomocą tomografii fluorescencyjnej (FMT). Po wywołaniu zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą siarczanu sodu dekstranu (DSS), zwierzęciu wstrzykuje się przeciwciała, które rozpoznają marker glikoproteiny F4 / 80 na infiltrowanych makrofagach w okrężnicy. Mysz jest następnie obrazowana w urządzeniu FMT, w którym sygnały fluorescencji i odbicia są rekonstruowane w trójwymiarowy...

Wykorzystanie tomografii fluorescencyjnej do oceny zapalenia jelit myszy

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Opisujemy system wielokątowego rotacyjnego obrazowania optycznego (MAROI) do ilościowego oznaczania in vivo markera fluorescencyjnego dostarczanego przez nanopęcherzyki saposyny C (SapC)-dioleoilofosfatydyloseryny (DOPS). Wykorzystując mysie modele raka i zapalenia stawów, pokazujemy, w jaki sposób analiza krzywej sygnału MAROI może być wykorzystana do precyzyjnego mapowania i biologicznej charakterystyki procesów chorobowych.

In vivo (in vivo) Obrazowanie optyczne guzów mózgu i zapalenia stawów za pomocą fluorescencyjnych nanopęcherzyków SapC-DOPS

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Poznaj nieinwazyjną technikę obrazowania optycznego MMP in vivo z użyciem aktywowalnych sond fluorescencyjnych w modelach zapalenia. Metoda jest szybka, tania i pozwala na długoterminowe monitorowanie procesów biologicznych.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów