Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie obrazowania optycznego do wizualizacji aktywowanej sondy do oceny aktywności in vivo kluczowych metaloproteaz macierzy (MMP) w eksperymentalnych modelach zapalenia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmu biologicznego leżącego u podstaw chorób zapalnych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, tania i łatwa do nauczenia.

Ponadto dostępna jest szeroka gama sond do ukierunkowania na różne procesy biologiczne. W przypadku indukcji reumatoidalnego zapalenia stawów najpierw użyj mikrometru, aby zmierzyć wszystkie średnice kostek każdego zwierzęcia. Następnie delikatnie podnieś pierwszą mysz za ogon i wstrzyknij dootrzewnowo 200 mikrolitrów rozcieńczonej mysiej surowicy KBN zawierającej przeciwciała przeciwko izomerazy sześciofosforanowej glukozy lub GPI.

Następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce i mierz obrzęk kostki codziennie do szóstego dnia. W przypadku uczulenia nadwrażliwości kontaktowej użyj małego trymera do włosów zwierzęcych, aby ostrożnie ogolić obszar brzucha znieczulonej myszy o wymiarach dwa na dwa centymetry i użyj pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby nałożyć 80 mikrolitrów świeżo przygotowanego 5% roztworu TNCB na odsłoniętą skórę. Bardzo ważne jest, aby unikać zranienia skóry w dowolnym momencie zabiegu, ponieważ może to prowadzić do niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych u zwierzęcia i może wpłynąć na wyniki badania.

Delikatnie umieść zwierzę z powrotem w klatce, unikając niskiej temperatury ciała w fazie rekonwalescencji. Sześć dni później za pomocą pipety nałóż 20 mikrolitrów 1% roztworu TNCB po obu stronach prawego ucha, a następnie aplikuj 100 mikrolitrów 1% TNCB co drugi dzień przez okres do 10 dni i codziennie mierz grubość ucha. Aby zmierzyć aktywność MMP in vivo, najpierw delikatnie zmieszaj aktywowany barwnik do obrazowania optycznego i załaduj strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 mililitra dwoma nanomolami barwnika na mysz.

Następnie wyposaż kolejną strzykawkę w igłę o rozmiarze 30 przymocowaną do cewnika polietylenowego i umieść ogon pierwszej myszy w ciepłej wodzie. Gdy żyły się rozszerzą, wprowadzić cewnik z przeciętą krawędzią igły pod kątem 20 stopni po dystalnej stronie ogona do rozszerzonej żyły ogonowej i ponownie zawiesić strzykawkę, aby sprawdzić prawidłowe umiejscowienie cewnika. Jeśli cewnik jest prawidłowo ustawiony, wymień strzykawkę i wstrzyknij dwa nanomolowe elementy sondy.

Następnie zastąp strzykawkę z sondą do obrazowania optycznego strzykawką zawierającą 0,9% roztwór soli fizjologicznej i wstrzyknij 25 mikrolitrów soli fizjologicznej do żyły ogonowej, aby całkowicie usunąć martwą objętość rurki polietylenowej. Następnie ustaw skrzynkę skanera obrazowania optycznego na 37 stopni Celsjusza i umieść do pięciu myszy w pudełku skanera pośrodku pola view. 24 godziny po wstrzyknięciu otwórz oprogramowanie do obrazowania i zainicjuj system, pozwalając kamerze CCD ostygnąć do temperatury roboczej.

Gdy system jest gotowy, ustaw odpowiednie długości fal i parametry obrazowania zgodnie z kwiatem sondy obrazującej. Pojawi się panel sterowania akwizycją systemu obrazowania in vivo. Następnie kliknij przycisk pobierz sekwencję, aby rozpocząć pomiar.

Aby zapisać pozyskane obrazy, wybierz żądaną lokalizację zapisu. Dodatkowo więcej informacji można dodać w oknie edycji etykiet obrazów. Tutaj nasz wyraźnie wzmocniony sygnał fluorescencyjny można zaobserwować w przednich łapach i kostkach myszy z reumatoidalnym zapaleniem stawów w szóstym dniu po indukcji choroby, w porównaniu z minimalnym sygnałem obserwowanym u zwierząt kontrolnych.

Analiza biodystrybucji aktywności MMP w narządach zwierząt doświadczalnych i kontrolnych wykazuje silnie wzmocniony sygnał w kostkach i łapach przednich wyłącznie w stawach myszy z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Co ciekawe, wzmocniony sygnał MMP zaobserwowano również w obu nerkach myszy z reumatoidalnym zapaleniem stawów, podczas gdy wątroba i jelita wykazują silny sygnał MMP niezależnie od ich statusu reumatoidalnego zapalenia stawów. Podczas przewlekłej reakcji nadwrażliwości kontaktowej wywołanej przez pięć prowokacji TNCB do prawego ucha, w prawym uchu objętym stanem zapalnym wykazuje się znacznie zwiększoną aktywność MMP w porównaniu z lewym, zdrowym uchem kontrolnym.

Półilościowa analiza intensywności sygnału stawów i zdrowych kostek lub łap wykazuje siedmiokrotnie zwiększoną intensywność sygnału MMP w stawach skokowych z zapaleniem stawów przy trzykrotnie wyższym natężeniu sygnału MMP wykrytym w przednich łapach w porównaniu z nasileniem u zdrowych zwierząt. Uszy reagujące na nadwrażliwość kontaktową w przypadku ostrej i przewlekłej nadwrażliwości wykazują również znacznie zwiększony sygnał MMP nawet po zaledwie jednym prowokacji, która pozostaje podwyższona do piątego wyzwania. Metoda ta może być łatwo zaimplementowana w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych i pozwala na długoterminową obserwację podstawowych procesów biologicznych i terapii in vivo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każda sonda do obrazowania optycznego ma inną procedurę wstrzykiwania i czas wchłaniania. W związku z tym należy przeprowadzić badania podłużne dla każdej nowej sondy do obrazowania fluorescencyjnego i optycznego. Po opanowaniu tej techniki można wykonać u maksymalnie pięciu zwierząt w mniej niż 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Metoda ta jest w stanie zapewnić wgląd w mechanizmy zapalenia in vivo, ale może być również stosowana do badania innych chorób, takich jak rak czy neurodegeneracja. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z obrazowania optycznego in vivo za pomocą aktywowanej sondy obrazowania w modelach chorób zapalnych.