Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie naszego procesu wytwarzania trójwymiarowych urządzeń opartych na papierze, których używamy jako platformy do opracowywania testów immunologicznych w miejscu opieki nad pacjentem. Metoda ta zapewnia opartą na papierze platformę mikrofluidyczną z niezawodnym procesem produkcyjnym, dzięki czemu czas i wysiłek można przeznaczyć na opracowywanie testów zamiast na projektowanie urządzeń. Główną zaletą naszej techniki jest to, że pozwala ona na przygotowanie wielu urządzeń równolegle i w ilości pożądanej dla akademickich projektów badawczych.

Ogólnie rzecz biorąc, nowi użytkownicy będą mieli problemy z tą metodą, ponieważ istnieje wiele zmiennych, które należy wziąć pod uwagę podczas produkcji urządzeń, takich jak prawidłowe wyrównanie warstw. Błędy mogą skutkować nieprawidłowym działaniem urządzeń. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ montaż może być trudny do wyobrażenia przy użyciu tylko szczegółów zawartych w rękopisach.

Najpierw przygotuj warstwy wysokiej jakości bibuły filtracyjnej, przycinając arkusz papieru na standardowy rozmiar papieru, aby ułatwić tworzenie wzorów za pomocą drukarki woskowej. Załaduj wycięty arkusz papieru do zasobnika drukarki. Następnie wydrukuj wcześniej zaprojektowane warstwy.

Następnie pokrój standardowy rząd membrany nylonowej na arkusze za pomocą noża do papieru stołowego, zachowując szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z nylonową membraną, aby zachować jej integralność i chronić przed rozdarciem. Niewykorzystany materiał należy przechowywać w szafie eksykatora, ponieważ membrany nylonowe są wrażliwe na wilgoć. Za pomocą drukarki woskowej wydrukuj wzór warstwy przechwytywania na kawałku papieru do kopiowania i przyklej go do kasetonu świetlnego, aby służył jako przewodnik do pozycjonowania nylonowej membrany.

Następnie umieść czysty arkusz papieru do kopiowania na poprzednio wydrukowanym arkuszu papieru do kopiowania. Przyklej czystą kartkę papieru do kasetonu, ale nie sklejaj ze sobą dwóch arkuszy. Teraz umieść wycięty arkusz nylonowej membrany na czystym arkuszu papieru do kopiowania, upewniając się, że membrana zakrywa zadrukowany obszar dolnej warstwy papieru do kopiowania.

Przyklej wszystkie cztery strony membrany nylonowej do czystego arkusza papieru do kopiowania. Załaduj arkusz nylonowej membrany wsparty na przymocowanym do niego papierze do kopiowania do tacy drukarki podawanej ręcznie. Następnie drukuj po jednym arkuszu nylonowej membrany na raz.

Przyklej wydrukowane warstwy do akrylowej ramy, aby równomiernie podgrzać nad i pod warstwą po umieszczeniu w grawitacyjnym piecu konwekcyjnym. Teraz umieść warstwy w piekarniku w temperaturze 150 stopni Celsjusza na 30 sekund, aż wosk wtopi się w grubość papieru. Po wyjęciu papieru z piekarnika upewnij się, że wosk przeniknął przez grubość papieru, odwracając go i sprawdzając, czy nie ma niedoskonałości w projekcie.

Usuń papierową i nylonową membranę z ramy akrylowej. Następnie usuń nylonową membranę z arkusza nośnego papieru do kopiowania za pomocą noża do papieru. Wzór dwustronnych arkuszy folii samoprzylepnych za pomocą zrobotyzowanego plotera nożowego z wcześniej przygotowanymi plikami projektowymi.

Następnie przyklej warstwę papieru wzorzystego, którą należy przykleić klejem, do pudełka świetlnego zadrukowaną stroną do dołu. Oderwij jedną stronę wkładki ochronnej od arkusza wzoru kleju. Dociśnij do siebie arkusz wzoru kleju i warstwę papieru.

Następnie umieść częściowo zmontowane urządzenie w ślizgu ochronnym. Następnie przepuść powstały dwuwarstwowy zespół przez automatyczny laminator, aby całkowicie docisnąć klej i papier do siebie, usuwając wszelkie kieszenie powietrza z przylegających warstw. Przyklej warstwę sprzężoną do ramy akrylowej tak, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą.

Dodaj 2,5 mikrolitra BSA i jeden X PBS do strefy hydrofilowej na warstwie sprzężonej. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, suszyć ją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj pięć mikrolitrów pięciu nanocząstek złota koloidalnego OD sprzężonych z przeciwciałem anty-beta hCG, a następnie powtórz proces suszenia.

Przyklej boczną warstwę kanału do ramy akrylowej tak, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą. Dodaj 10 mikrolitrów środka blokującego, aby potraktować kanał boczny, a następnie powtórzyć ten sam proces suszenia, który jest stosowany w przypadku warstwy sprzężonej. Następnie przyklej warstwę wychwytującą do ramy akrylowej tak, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą.

Potraktuj warstwę wychwytywania pięcioma mikrolitrami przeciwciała anty-alfa hCG. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, suszyć ją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez osiem minut. Dodaj dwa mikrolitry środka blokującego, a następnie powtórz ten sam proces suszenia, który jest używany do warstwy wychwytywania.

Przyklej warstwę prania do kasety świetlnej zadrukowaną stroną skierowaną do góry. Jeśli używane są otwory wyrównujące, usuń je z kolejnych warstw za pomocą ręcznego dziurkacza. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy wychwytującej, aby odsłonić klej.

Wyrównaj warstwę wychwytującą nad warstwą myjącą, używając otworów wyrównujących jako prowadnicy, a następnie ściśnij obie warstwy razem i unikaj dotykania stref hydrofilowych, aby zminimalizować zanieczyszczenie lub uszkodzenie urządzenia. Następnie usuń folię ochronną z tyłu warstwy inkubacyjnej, aby odsłonić klej. Wyrównaj warstwę inkubacji nad warstwą wychwytywania i ściśnij je razem.

Kontynuuj dodawanie warstw w ten sposób, aż wszystkie aktywne warstwy zostaną złożone. Teraz umieść częściowo zmontowane urządzenie w szkiełku ochronnym i mocno przymocuj warstwy do siebie za pomocą laminatora. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy myjącej i przymocuj warstwę blot do dolnej części urządzenia.

Po laminowaniu, aby zakończyć montaż trójwymiarowego urządzenia mikroprzepływowego na bazie papieru, wytnij żądaną liczbę urządzeń z arkuszy w pełni zmontowanych urządzeń za pomocą nożyczek. Dodać 20 mikrolitrów pozytywnej próbki kontrolnej buforu hCG do strefy hydrofilowej na górze urządzenia. Gdy próbka całkowicie wsiąknie do urządzenia, dodaj 15 mikrolitrów buforu do mycia.

Po tym, jak pierwsza porcja buforu do płukania całkowicie wsiąknie do urządzenia, dodaj drugą 15 mikrolitrów porcji buforu do płukania. Aby ujawnić wyniki testu, oderwij trzy górne warstwy urządzenia za pomocą pęsety, aby odsłonić warstwę wychwytywania. Metoda drukowania woskiem może być stosowana do tworzenia barier hydrofobowych w urządzeniach mikroprzepływowych na bazie papieru i wytwarza ścieżki płynowe o powtarzalnych wymiarach, co ma kluczowe znaczenie dla testów o powtarzalnej wydajności i czasie trwania.

Skuteczność papierowego testu immunologicznego hCG wykazano, wykonując równolegle 35 dodatnich i 35 ujemnych testów. Współczynnik zmienności dla każdego zestawu danych określono na 1% dla testów przeprowadzonych przy użyciu próbek ujemnych i 3% dla testów wykonanych przy użyciu próbek dodatnich. Rozbieżność między warstwami składającymi się na kanał inkubacyjny i strefę wychwytu może spowodować powstanie nieregularnego wzoru w sygnale dodatnim, co może skutkować błędną interpretacją sygnału jakościowego.

Jeśli wosk nie zostanie wydrukowany w wystarczającej ilości lub nie dopuści się do całkowitego stopienia przez grubość papieru, integralność powstałych barier hydrofobowych może zostać naruszona i doprowadzić do nieszczelności wewnątrz urządzenia. Testy, które trwają dłużej niż oczekiwano, mogą wskazywać na nieprawidłowe działanie w produkcji urządzenia. Papierowe urządzenia mikroprzepływowe zapewniają naukowcom wszechstronną platformę do opracowywania tanich testów analitycznych w miejscu opieki nad pacjentem.

Chociaż istnieje wiele zastosowań, podejście, które tutaj demonstrujemy, skutkuje ogólną architekturą urządzenia do wykonywania testów immunologicznych, które mają kluczowe znaczenie w opiece zdrowotnej. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby sprawdzić, czy nie ma niedoskonałości podczas procesu produkcyjnego i przed traktowaniem warstw drogimi odczynnikami biochemicznymi. Po opanowaniu ta metoda, od drukowania warstw po składanie warstw poddanych obróbce, może być wykorzystana do przygotowania arkusza funkcjonalnych testów immunologicznych w ciągu dwóch godzin.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać trójwymiarowe urządzenia papierowe i czuć się na tyle komfortowo, aby dostosować tę platformę do innych rodzajów testów.