Name: Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych point-of-care. Technika wielowarstwowa umożliwia równoległą produkcję wielu urządzeń dla badań akademickich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Tufts i hojny dar od dr Jamesa Kanagy'ego. Materiał ten opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr. (DGE-1325256), który został przyznany S.C.F. D.J.W. był wspierany przez stypendium GAANN Departamentu Edukacji Stanów Zjednoczonych. Dziękujemy dr Jeremy'emu Schonhornowi (JanaCare), dr Jasonowi Rolandowi (Carbon3D) i Rachel Deraney (Brown University) za pomoc w opracowaniu projektu trójwymiarowego urządzenia mikroprzepływowego i testu immunologicznego opartego na papierze.

1. Przygotowanie warstw urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru
<ol>
	<li>Przygotuj wzory warstw papieru, nylonu i kleju za pomocą programu do projektowania graficznego. 6 Każda warstwa może mieć inny wzór. 
	UWAGA: Wzór może zawierać otwory wyrównujące, które nie są wymagane do funkcjonalnego testu immunologicznego opartego na papierze, ale pomagają w powtarzalnym wytwarzaniu urządzeń trójwymiarowych. Rozmieszczenie tych otworów będzie się różnić, jeśli urządzenia są montowane pojedynczo, w paskach lub jako pełne arkusze. Program używany do projektowania wzorów może się różnić w zależności od wybranej techniki tworzenia wzorów (np. fotolitografia, druk woskowy lub cięcie). 6</li>
	<li>Spryskaj obszar roboczy roztworem 70% (v/v) etanolu i wody. Wytrzyj obszar roboczy czystym ręcznikiem papierowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie warstw papieru: dodawanie próbek, przechowywanie koniugatu, inkubacja i warstwy myjące
<ol>
	<li>Przygotuj warstwy wysokiej jakości bibuły filtracyjnej za pomocą dużego noża do papieru stołowego. Wytnij standardowy arkusz papieru na papier o standardowym rozmiarze, aby ułatwić tworzenie wzorów za pomocą drukarki na stały atrament (wosk). Na przykład z jednego arkusza o wymiarach 460 x 570 mm2 można uzyskać 4 arkusze papieru US Letter (8,5 x 11 cali2). Z papierem należy zawsze obchodzić się w czystych rękawicach, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
	<li>Załaduj wycięty arkusz papieru chromatograficznego do tacy drukarki. Wydrukuj wcześniej zaprojektowane warstwy (patrz rysunek 1). 
	UWAGA: Wzór można wydrukować bezpośrednio na tym arkuszu za pomocą automatycznego podawania. Aby uniknąć zacięć papieru, należy drukować tylko jeden arkusz papieru na raz. W przypadku wszystkich warstw użyj ustawień drukowania "Ulepszone".</li>
</ol>
3. Przygotowanie warstwy membrany nylonowej: Warstwa przechwytująca
<ol>
	<li>Pokrój rolkę membrany nylonowej na arkusze (7.5 x 10 cali2) za pomocą stołowego noża do papieru. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z nylonową membraną, aby zachować jej integralność i chronić przed rozerwaniem. Niewykorzystany materiał należy przechowywać w szafie eksykatora, ponieważ membrany nylonowe są wrażliwe na wilgoć. 
	UWAGA: Arkusze cięte są węższe niż papier US Letter. Ponieważ membrany nylonowe są cienkie i delikatne, nie mogą być przetwarzane bezpośrednio przez drukarkę i wymagają wsparcia. Szczegóły omówiono poniżej.</li>
	<li>Za pomocą drukarki woskowej wydrukuj wzór warstwy przechwytywania na kawałku papieru do kopiowania i przyklej go do kasetonu świetlnego, aby służył jako przewodnik do pozycjonowania nylonowej membrany. Kaseton świetlny pomaga w wyrównaniu wielu warstw.</li>
	<li>Umieść czysty arkusz papieru do kopiowania na poprzednio wydrukowanym arkuszu papieru do kopiowania. Przyklej czystą kartkę papieru do kasetonu, ale nie sklejaj ze sobą dwóch arkuszy.</li>
	<li>Umieść wycięty arkusz nylonowej membrany na czystym kawałku papieru do kopiowania. Upewnij się, że membrana zakrywa obszar wydruku dolnej warstwy papieru do kopiowania. Przyklej wszystkie cztery strony nylonowej membrany do czystego arkusza papieru do kopiowania. 
	UWAGA: Upewnij się, że nylonowa membrana jest płaska i gładka, aby nie było problemów z drukowaniem (np. zacięcia papieru lub nierównomierne drukowanie wosku). Wosk może być drukowany na taśmie, na której membrana nylonowa jest przymocowana do papieru do kopiowania. W takim przypadku obszary, w których nylon nie jest w pełni wzorzysty z powodu pokrycia taśmą, należy wyrzucić. Do przyszłych przygotowań można użyć większych kawałków membrany nylonowej, aby uniknąć tego błędu drukowania.</li>
	<li>Załaduj arkusz nylonowej membrany (podparty przymocowanym do niej papierem do kopiowania) do tacy drukarki podawanej ręcznie. Drukuj tylko jeden arkusz membrany nylonowej na raz. 
	UWAGA: Nie są wymagane żadne czynności przygotowawcze dla warstwy kleksów, ponieważ nie jest ona wzorzysta.</li>
</ol>
4. Tworzenie barier hydrofobowych w warstwie drukowanej
<ol>
	<li>Przyklej wydrukowane warstwy do akrylowej ramy, aby równomiernie podgrzać nad i pod warstwą po umieszczeniu w grawitacyjnym piecu konwekcyjnym. Nylonową membranę należy przykleić taśmą do arkusza nośnego papieru do kopiowania, aż wosk się stopi i utworzą się bariery hydrofobowe. 
	UWAGA: Rama akrylowa to wykonany, wycinany laserowo kawałek tworzywa akrylowego o grubości 1/2 ". Zastosowano dwa rozmiary ram w zależności od ilości produkowanych urządzeń. Zewnętrzna krawędź mniejszej ramy ma wymiary 11 5/8" x 2 3/4", a wewnętrzny otwór ramy ma wymiary 10 3/8" x 1 3/4". Zewnętrzna krawędź większej ramy ma wymiary 11 5/8" x 8 7/8", a wewnętrzny otwór ramy ma wymiary 10 1/4" x 7 7/8". Otwarta, wewnętrzna przestrzeń pozwala na równomierne roztopienie wosku na całej grubości papieru.</li>
	<li>Umieść warstwy w piekarniku w temperaturze 150 °C na 30 sekund, aż wosk rozpuści się w grubości papieru. Upewnij się, że wosk przeniknął przez grubość papieru, odwracając go i sprawdzając, czy w projekcie nie ma niedoskonałości. 
	UWAGA: Piekarniki z wymuszonym obiegiem powietrza lub płyty grzejne mogą być również używane do topienia stałego atramentu woskowego. Czas topnienia lub temperatury mogą się różnić w zależności od metody ogrzewania.</li>
	<li>Usuń papierową i nylonową membranę z ramy akrylowej. Usuń również nylonową membranę z arkusza nośnego papieru do kopiowania.</li>
</ol>
5. Przygotowanie warstw adhezyjnych
<ol>
	<li>Wzorzec dwustronnych arkuszy folii samoprzylepnych za pomocą zrobotyzowanego plotera nożowego, korzystając z przygotowanych wcześniej plików projektowych (krok 1.1). Zabezpiecz odsłoniętą powierzchnię klejącą za pomocą arkusza woskowej wkładki. 
	UWAGA: Dwustronny klej powinien być ozdobiony otworami, które umożliwiają przepływ próbki przez warstwy jako ciągłą ścieżkę płynną. Woskowy pas ochronny jest łatwy do usunięcia z kleju i służy do ochrony go przed zanieczyszczeniem i rozdarciem podczas cięcia. Wycinarka laserowa lub prasa matrycowa mogą być również używane do modelowania warstw folii samoprzylepnych.</li>
</ol>
6. Podkład warstw urządzenia za pomocą kleju
<ol>
	<li>Spryskaj kaseton świetlny roztworem 70% (v/v) etanolu i wody. Wytrzyj czystym ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Przyklej wzorzystą warstwę papieru lub nylonowej membrany, którą należy przykleić do kasetonu świetlnego zadrukowaną stroną do dołu.</li>
	<li>Oderwij jedną stronę wkładki ochronnej od wzorzystego arkusza kleju i przymocuj ją do warstwy papieru lub membrany nylonowej. Użyj kasetonu świetlnego, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie wzorów. Ściśnij razem. Umieść częściowo zmontowane urządzenie w szlafroku ochronnym. 
	UWAGA: Poślizg ochronny to zagięty kawałek podkładu z folii do laminowania, który chroni urządzenia przed zanieczyszczeniem lub uszkodzeniem, zapewniając, że nie stykają się one z rolkami laminatora.</li>
	<li>Przepuść powstały dwuwarstwowy zespół przez automatyczny laminator, aby całkowicie docisnąć klej i papier do siebie, usuwając wszelkie kieszenie powietrza z przylegających warstw. 
	UWAGA: Kieszenie powietrzne między warstwami urządzenia mogą zakłócać integralność urządzenia i odtwarzalność odprowadzania wilgoci, powodując nieszczelności.</li>
</ol>
7. Traktowanie warstwy sprzężonej odczynnikami do testów immunologicznych przed montażem urządzenia
<ol>
	<li>Przyklej warstwę sprzężoną do ramy akrylowej w taki sposób, aby strefa hydrofilowa, która ma być poddana zabiegowi, była zawieszona i nie stykała się z ramą.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl 100 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do strefy hydrofilowej na warstwie sprzężonej. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut. 
	UWAGA: Ta objętość wystarcza tylko do zwilżenia strefy papieru. Rozwiązanie BSA pomaga zapobiegać agregacji nanocząstek koloidalnych podczas procesu suszenia, co ułatwi uwalnianie nanocząstek, gdy papier i odczynniki są ponownie uwodnione przez próbkę.</li>
	<li>Dodać 5 μl koloidalnej nanocząstki złota 5 O.D. sprzężonej z przeciwciałem anty-β-hCG i powtórzyć proces suszenia. 
	UWAGA: Jednostki stężenia koloidalnych nanocząstek złota są często wyrażane jako gęstość optyczna (O.D.) mierzona przez absorbancję przy λ = 540 nm. Nie jest wymagana żadna obróbka podkładki przed montażem urządzenia w rozdziale 10.</li>
</ol>
8. Leczenie kanału bocznego odczynnikiem do testów immunologicznych przed montażem urządzenia
<ol>
	<li>Przyklej boczną warstwę kanału do ramy akrylowej tak, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą.</li>
	<li>Dodać 10 μl środka blokującego (5 mg/ml mleka beztłuszczowego i 0,1% (v/v) Tween 20 w 1x PBS) w celu leczenia kanału bocznego. Powtórzyć ten sam proces suszenia (2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut) jako warstwę sprzężoną.</li>
</ol>
9. Traktowanie warstwy wychwytującej odczynnikami do testów immunologicznych przed montażem urządzenia
<ol>
	<li>Warstwa wychwytywania taśmy na ramie akrylowej w taki sposób, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą.</li>
	<li>Warstwę wychwytującą należy poddać działaniu 5 μl przeciwciała anty-α-hCG o stężeniu 1 mg/ml, a następnie pozostawić próbkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie przez 8 minut w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Dodać 2 μl środka blokującego (5 mg/ml mleka beztłuszczowego i 0,1% (v/v) Tween 20 w 1x PBS). Powtórz proces suszenia warstwy wychwytującej. 
	UWAGA: Ta ilość jest odpowiednia do powlekania papierów bez zasłaniania porów membrany nylonowej, co może się zdarzyć, gdy zostanie użyta zbyt duża ilość środka blokującego.</li>
</ol>
10. Montaż trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru
<ol>
	<li>Przyklej warstwę prania do kasety świetlnej (zadrukowaną stroną skierowaną do góry). Jeśli używane są otwory wyrównujące, usuń je z kolejnych warstw za pomocą ręcznego narzędzia do dziurkowania.</li>
	<li>Usuń folię ochronną z tyłu warstwy wychwytującej, aby odsłonić klej. Wyrównaj warstwę wychwytywania nad warstwą zmywającą, używając otworów wyrównujących jako prowadnicy. Dociśnij obie warstwy do siebie. Unikaj dotykania stref hydrofilowych, aby zminimalizować zanieczyszczenie lub uszkodzenie urządzenia. Do pomocy w montażu można użyć pęsety.</li>
	<li>Usuń folię ochronną z tyłu warstwy inkubacyjnej, aby odsłonić klej. Wyrównaj warstwę inkubacji nad warstwą wychwytywania i ściśnij je razem. Kontynuuj dodawanie warstw w ten sposób, aż wszystkie aktywne warstwy zostaną złożone.</li>
	<li>Umieść częściowo zmontowane urządzenie w szkiełku ochronnym i mocno przymocuj warstwy do siebie za pomocą laminatora.</li>
	<li>Usuń folię ochronną z tyłu warstwy myjącej i przymocuj warstwę blot do dolnej części urządzenia. Powtórzyć krok laminowania 10.4, aby zakończyć montaż trójwymiarowego urządzenia mikroprzepływowego na bazie papieru. Wytnij żądaną liczbę urządzeń z pasków lub arkuszy w pełni zmontowanych urządzeń za pomocą nożyczek. 
	UWAGA: Przy użyciu podobnego podejścia można przygotować pełne arkusze urządzeń, paski urządzeń lub pojedyncze urządzenia.</li>
</ol>
11. Przeprowadzanie testu immunologicznego na papierze
<ol>
	<li>Dodać 20 μl próbki do strefy hydrofilowej znajdującej się na górze urządzenia (tj. warstwy próbki).</li>
	<li>Poczekaj, aż próbka całkowicie wsiąknie do urządzenia, a następnie dodaj 15 μl buforu do przemywania (0,05% v/v Tween 20 w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Po całkowitym wchłonięciu pierwszej porcji buforu do płukania do urządzenia, dodać drugą 15 μl porcji buforu do płukania. 
	UWAGA: Bufor płuczący całkowicie wsiąkł do urządzenia, gdy kropla płynu zniknęła, nie widać menisku na powierzchni papieru. Oznaczenie uznaje się za zakończone, gdy druga podwielokrotność buforu do przemywania całkowicie dostanie się do urządzenia.</li>
	<li>Aby ujawnić wyniki testu, oderwij trzy górne warstwy urządzenia za pomocą pęsety, aby odsłonić warstwę wychwytywania.
	<ol>
		<li>Zinterpretuj wyniki testu jakościowo, obserwując obecność lub brak koloru. Alternatywnie, można zobrazować warstwę odczytu za pomocą skanera biurkowego i użyć oprogramowania lub algorytmów do przetwarzania obrazu w celu ilościowego określenia wyników i scharakteryzowania rozkładu intensywności w strefie wykrywania. 20</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).</li>
<li>Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac901071p">Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices.</a> Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%3A+microfluidic+paper-based+analytical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices.</a> Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).</li>
<li>Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent developments in paper-based microfluidic devices.</a> Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).</li>
<li>Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+paper-based+microfluidics%3A+Current+status+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends.</a> Biomicrofluidics. 6, 011301(2012).</li>
<li>Lisowski, P., Zarzycki, P. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3779795/">Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends.</a> Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).</li>
<li>Pollock, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based+multiplexed+transaminase+test+for+low-cost%2C+point-of-care+liver+function+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing.</a> Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129(2012).</li>
<li>Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+paper-based+analytical+device+for+particulate+metals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals.</a> Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).</li>
<li>Weaver, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper+analytical+devices+for+fast+field+screening+of+beta+lactam+antibiotics+and+antituberculosis+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+telemedicine+for+developing+regions%3A+camera+phones+and+paper-based+microfluidic+devices+for+real-time%2C+off-site+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis.</a> Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li>
<li>Vella, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac203434x">Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick.</a> Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).</li>
<li>Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+paper-based+microfluidic+devices+with+commercial+electrochemical+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers.</a> Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).</li>
<li>Martinez, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+diagnostic+devices+made+from+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable diagnostic devices made from paper and tape.</a> Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+machine%22+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper machine" for molecular diagnostics.</a> Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+architecture+for+three-dimensional%2C+patterned+paper+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays.</a> Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).</li>
<li>Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2016/AY/c6ay01558a#!divAbstract">Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture.</a> Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).</li>
<li>Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((patterned-paper+immunoassay+for+detection+of+malaria+and+dengue+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever.</a> Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).</li>
<li>Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Derda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PLoS ONE. 6 (5), e18940(2011).</li>
<li>Mace, C. R., Deraney, R. N. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-013-1314-6">Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices.</a> Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).</li>
<li>Liu, H., Crooks, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+paper+microfluidic+devices+assembled+using+the+principles+of+origami%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).</li>
<li>Kalish, B., Tsutsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Adhesive+patterning+to+construct+3D+paper+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53805(2016).</li>
<li>Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+sensitive%2C+and+quantitative+electrochemical+detection+method+for+paper+analytical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices.</a> Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).</li>
<li>Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+method+for+prototyping+three-dimensional%2C+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).</li>
<li>Kalish, B., Tsutsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+adhesive+enables+construction+of+nonplanar+three-dimensional+paper+microfluidic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits.</a> Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).</li>
<li>Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-ply+channels+for+faster+wicking+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Identyfikacja powtarzalnej strategii wytwarzania jest istotnym elementem opracowywania testów. 22 Stosujemy podejście sekwencyjne, warstwa po warstwie do produkcji trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru. W przeciwieństwie do metod, które wykorzystują techniki składania lub origami do produkcji urządzeń wielowarstwowych z jednego arkusza papieru 23,24, produkcja addytywna oferuje szereg zalet: (i) Wiele materiałów możn...

Papier jest powszechnie dostępny w różnych formułach lub gatunkach, może być funkcjonalizowany w celu dostrojenia swoich właściwości i może transportować płyny autonomicznie poprzez działanie kapilarne lub odprowadzanie wilgoci. Jeśli papier jest pokryty substancją hydrofobową (np. photoresist1 lub wax2), przepuszczalność płynów może być kontrolowana przestrzennie w obrębie warstwy papieru. Na przykład nałożona próbka wodna może być kierowana do wielu różnych stref w celu reakcji z odczynnikami chemicznymi i biochemicznymi przechowywanymi w papierze. Wykazano, że te papierowe urządzenia mikroprzepływowe są użyteczną platformą do opracowywania przenośnych i niedrogich testów analitycznych3,4,5,6,7. Zastosowania urządzeń mikroprzepływowych opartych na dokumentach papierowych obejmują diagnostykę w miejscu opieki nad pacjentem8, monitorowanie zanieczyszczeń środowiska9, wykrywanie podrabianych leków10 oraz zdecentralizowaną opiekę zdrowotną (lub "telemedycynę") w ustawieniach ograniczonych zasobów11.
Wiele warstw wzorzystego papieru można połączyć w zintegrowane urządzenie, gdzie strefy hydrofilowe z sąsiednich warstw (tj. powyżej lub poniżej) łączą się, tworząc ciągłe sieci płynów, których wloty i wyloty mogą być sprzężone lub pozostawione niezależne. 12 Każda warstwa może zawierać unikalny wzór, który umożliwia przestrzenne rozdzielanie odczynników i wykonywanie wielu testów na jednym urządzeniu. Powstałe w ten sposób trójwymiarowe urządzenie mikroprzepływowe jest nie tylko zdolne do odprowadzania płynów, aby umożliwić testy analityczne (np. testy czynnościowe wątroby13 i elektrochemiczne wykrywanie małych cząsteczek14), ale może również obsługiwać wiele zaawansowanych funkcji (np. zawory15 i proste maszyny16) wspólne dla tradycyjnych podejść mikroprzepływowych. Co ważne, ponieważ papier odprowadza płyny poprzez działanie kapilarne, urządzenia te mogą być obsługiwane przy minimalnym wysiłku ze strony użytkownika.
Ponieważ odczynniki mogą być przechowywane w trójwymiarowej architekturze urządzenia opartego na papierze, skomplikowane protokoły mogą być zredukowane do pojedynczego dodania próbki wodnej do urządzenia. Niedawno wprowadziliśmy ogólną trójwymiarową architekturę urządzenia, która może być wykorzystana do opracowania testów immunologicznych na bazie papieru przy użyciu techniki druku woskowego do tworzenia wzorzystych warstw. 17,18 Badania te koncentrowały się na tym, w jaki sposób aspekty związane z konstrukcją urządzenia - liczba użytych warstw, skład warstw i wzór trójwymiarowej sieci mikroprzepływowej - kontrolowały ogólną wydajność testu immunologicznego. Ostatecznie udało nam się wykorzystać te zasady projektowania, aby ułatwić szybki rozwój multipleksowanego testu immunologicznego19. W tym manuskrypcie wcześniej opracowany test immunologiczny dla ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG; hormon ciążowy)17 jest używany jako przykład ilustrujący strategie, które opracowaliśmy dla montażu i produkcji trójwymiarowych testów immunologicznych opartych na papierze. W związku z tym skupiamy się na montażu i obsłudze urządzenia, a nie na opracowywaniu testu.
W teście immunologicznym typu sandwich, który jest formatem używanym do wykrywania hCG, przeciwciało wychwytujące specyficzne dla jednej podjednostki hormonu jest powlekane na stałym substracie, który jest następnie blokowany w celu ograniczenia niespecyficznej adsorpcji próbki lub jakiegokolwiek kolejnego odczynnika. Substratem tym jest najczęściej polistyrenowa płytka mikrodołkowa (np. do testu immunoenzymatycznego lub ELISA). Próbkę dodaje się następnie do studzienki i pozostawia do inkubacji przez pewien czas. Po dokładnym przemyciu dodaje się przeciwciało specyficzne dla drugiej podjednostki hCG i pozostawia do inkubacji. To przeciwciało detekcyjne może być sprzężone z cząstką koloidalną, enzymem lub fluoroforem w celu wytworzenia mierzalnego sygnału. Studzienka jest ponownie myta przed interpretacją wyników testu (np. za pomocą czytnika płytek). Podczas gdy zestawy komercyjne opierają się na tym czasochłonnym, wieloetapowym procesie, wszystkie te kroki można szybko wykonać w papierowych urządzeniach mikroprzepływowych przy minimalnej interwencji użytkownika.
Urządzenie używane do testu immunologicznego hCG składa się z sześciu aktywnych warstw, które są, od góry do dołu, używane do dodawania próbki, przechowywania koniugatu, inkubacji, wychwytywania, mycia i osuszania (Rysunek 1). Warstwa dodawania próbki jest wykonana z jakościowej bibuły filtracyjnej. Ułatwia wprowadzenie próbki ciekłej i zabezpiecza odczynniki w warstwie sprzężonej przed zanieczyszczeniem z otoczenia lub przypadkowym kontaktem ze strony użytkownika. Warstwa sprzężona (jakościowa bibuła filtracyjna) zawiera odczynnik wytwarzający kolor (np. przeciwciało znakowane złotem koloidalnym) do testu immunologicznego. Warstwa inkubacyjna (jakościowa bibuła filtracyjna) umożliwia próbce przemieszczanie się poprzecznie w płaszczyźnie bibuły, aby ułatwić wiązanie analitu z odczynnikami przed dotarciem do następnej warstwy, warstwy wychwytującej. Warstwa wychwytująca (membrana nylonowa) zawiera ligandy specyficzne dla analitu zaadsorbowanego w materiale. Po zakończeniu testu warstwa ta zostaje odsłonięta, aby umożliwić wizualizację gotowego immunokompleksu. Warstwa płucząca (jakościowa bibuła filtracyjna) wciąga nadmiar płynów, w tym wolne odczynniki sprzężone, z powierzchni warstwy wychwytującej do warstwy blot (gruba bibuła chromatograficzna). Sześciowarstwowe urządzenie jest utrzymywane razem przez pięć warstw wzorzystego, dwustronnego kleju: cztery warstwy trwałego kleju utrzymują integralność zmontowanego urządzenia, a jedna warstwa usuwalnego kleju ułatwia odklejanie się urządzenia w celu sprawdzenia wyników testu immunologicznego na warstwie wychwytującej.
Na potrzeby tego manuskryptu, używamy tylko negatywnych i pozytywnych próbek kontrolnych hCG (odpowiednio 0 mIU/ml i 81 mIU/mL), aby dostarczyć reprezentatywne wyniki papierowego testu immunologicznego, co pozwala na dedykowaną dyskusję na temat związku między metodami produkcji a wydajnością urządzenia. Oprócz pokazania, jak skutecznie wytwarzać urządzenia, zwracamy uwagę na kilka błędów produkcyjnych, które mogą prowadzić do awarii urządzenia lub nieodtwarzalnych wyników testów. Protokół i dyskusja szczegółowo opisane w tym manuskrypcie dostarczą naukowcom cennych informacji na temat tego, jak projektowane i wytwarzane są papierowe testy immunologiczne. Chociaż koncentrujemy się na testach immunologicznych, przewidujemy, że przedstawione tutaj wytyczne będą szeroko przydatne w produkcji trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru.

<table><tbody><tr><td>Illustrator CC</td><td>Adobe</td><td></td><td>do projektowania wzorów warstw papieru i kleju</td></tr><tr><td>Drukarka Xerox ColorQube 8580</td><td>Amazon</td><td>B00R92C9DI</td><td>do drukowania wzorów wosku na warstwach papieru i Nylon</td></tr><tr><td>Isotemp Piec grzewczo-suszący ogólnego przeznaczenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0509</td><td>do topienia wosku w papierze</td></tr><tr><td>Artograph LightTracer</td><td>Amazon</td><td>B000KNHRH6</td><td>aby pomóc w wyrównaniu warstw</td></tr><tr><td>Laminator Apache AL13P</td><td>Amazon</td><td>B00AXHSZU2</td><td>do laminowania warstw</td></tr><tr><td>razem Ploter tnący Graphtec CE6000</td><td>Graphtec America</td><td>CE6000-40</td><td>do modelowania folii samoprzylepnych</td></tr><tr><td>Gilotyna do papieru Swingline</td><td>Amazon</td><td>B0006VNY4C</td><td>do cięcia papieru lub urządzeń</td></tr><tr><td>Skaner fotograficzny Epson Perfection V500</td><td>Amazon</td><td>B000VG4AY0</td><td>do skanowania obrazów warstwy odczytu</td></tr><tr><td>ekonomicznej szczypiec do dziurkowania</td><td>McMaster-Carr</td><td>3488A9</td><td>w celu usunięcia otworów wyrównujących&nbsp;</td></tr><tr><td>Bibuła chromatograficzna Whatman, klasa 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1004917</td><td></td></tr><tr><td>bibuła chromatograficzna Fisherbrand (gruba)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-4</td><td>do działania jako warstwa klesów</td></tr><tr><td>Immunodyne ABC (0,45 &mikro; m rozmiar porów )</td><td>Pall Corporation</td><td>NBCHI3R</td><td>funkcjonować jako materiał do wychwytywania warstwy</td></tr><tr><td>usuwalny/trwały klej dwustronny wkładka</td><td>FLEXcon</td><td>DF021621</td><td>ułatwiająca odklejanie</td></tr><tr><td>trwała dwustronna wkładka samoprzylepna</td><td>FLEXcon</td><td>DF051521</td><td></td></tr><tr><td>woskowa wkładka</td><td>FLEXcon</td><td>FLEXMARK 80 D/F PFW LINER</td><td>do pomocy w tworzeniu wzoru</td></tr><tr><td>kleju akrylowego arkusz</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K266&nbsp;</td><td>do wytworzenia ramy</td></tr><tr><td>arkusze samoprzylepne</td><td>Fellowes</td><td>CRC52215</td><td>do stosowania jako absolutny etanol poślizgowy</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>do dezynfekcji</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej</td> w miejscu pracy <td>AMRESCO</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Sekisui Diagnostics OSOM hCG Kontrola moczu</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-071-066</td><td>do stosowania jako próbki</td></tr> <tr><td>dodatnie i ujemneprzeciwciało monoklonalne anty-&beta;-hCG koniugatat złota koloidalnego (klon 1)</td><td>Arista Biologicals&nbsp;</td><td>CGBCG-0701</td><td>w leczeniu sprzężonego</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-&alfa-hCG kozy</td><td>warstwy Arista Biologicals&nbsp;</td><td>ABACG-0500</td><td>do obróbki warstwy wychwytującej</td></tr><tr><td>10X sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXLP0031B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Papier samodzielnie odprowadza płyny dzięki działaniu kapilarnemu. Dzięki wzorzystemu papierowi z barierami hydrofobowymi można kontrolować i kierować transportem płynów w obrębie warstwy papieru. Co więcej, układanie wielu warstw wzorzystego papieru tworzy wyrafinowane trójwymiarowe sieci mikroprzepływowe, które mogą wspierać rozwój testów analitycznych i bioanalitycznych. Papierowe urządzenia mikroprzepływowe są niedrogie, przenośne, łatwe w użyciu i nie wymagają do działania żadnego zewnętrznego sprzętu. W związku z tym są one bardzo obiecujące jako platforma do diagnostyki przyłóżkowej. W celu właściwej oceny użyteczności i wydajności analitycznej wyrobów papierowych należy opracować odpowiednie metody zapewniające odtwarzalność ich wytwarzania w skali odpowiedniej dla warunków laboratoryjnych. W tym manuskrypcie opisano metodę wytwarzania ogólnej architektury urządzenia, która może być używana do testów immunologicznych opartych na papierze. Wykorzystujemy formę wytwarzania przyrostowego (laminowanie wielowarstwowe) do przygotowania urządzeń, które składają się z wielu warstw wzorzystego papieru i wzorzystego kleju. Oprócz zademonstrowania prawidłowego użycia tych trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych opartych na papierze z testem immunologicznym na ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG), omówiono błędy w procesie produkcyjnym, które mogą skutkować awariami urządzeń. Spodziewamy się, że takie podejście do produkcji urządzeń opartych na papierze znajdzie szerokie zastosowanie w rozwoju aplikacji analitycznych zaprojektowanych specjalnie dla środowisk o ograniczonych zasobach.

Uzyskanie powtarzalnych wyników analizy w trójwymiarowych papierowych urządzeniach mikroprzepływowych zależy od metody produkcji zapewniającej spójność między urządzeniami. W tym celu zidentyfikowano szereg procesów produkcyjnych i kwestii materiałowych, które omówiono tutaj w kontekście demonstracji papierowego testu immunoologicznego. Wykorzystujemy metodę druku woskowego do tworzenia barier hydrofobowych w papierowych urządzeniach mikroprzepływowych (Rysunek 2A).<sup c...

Szczegółowo opisujemy metodę wytwarzania trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych opartych na papierze do wykorzystania w rozwoju testów immunologicznych. Nasze podejście do montażu urządzeń to rodzaj wielowarstwowej, addytywnej produkcji. Demonstrujemy test immunologiczny typu sandwich, aby zapewnić reprezentatywne wyniki dla tego typu urządzeń opartych na papierze.

Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie procesu wytwarzania trójwymiarowych urządzeń na bazie papieru, które wykorzystujemy jako platformę do opracowywania testów immunoologicznych w punkcie opieki (point of care). Metoda ta zapewnia papierową platformę mikroprzepływową z niezawodnym procesem produkcji, dzięki czemu czas i wysiłek można skierować na opracowywanie testów zamiast na projektowanie urządzeń. Główną zaletą naszej techniki jest to, że pozwala ona na równoległe przygotowanie wielu urządzeń w ilości pożądanej w akademickich projektach badawczych.Zazwyczaj nowi użytkownicy napotykają trudności przy tej metodzie, ponieważ podczas wytwarzania urządzeń należy wziąć pod uwagę wiele zmiennych, takich jak prawidłowe wyrównanie warstw. Błędy mogą prowadzić do dysfunkcji urządzeń. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ proces montażu może być trudny do wyobrażenia sobie na podstawie samych szczegółów zawartych w publikacjach.W pierwszej kolejności należy przygotować warstwy jakościowego papieru filtracyjnego, wycinając arkusz papieru do standardowego rozmiaru, aby ułatwić nanoszenie wzorów za pomocą drukarki woskowej. Włóż wycięty arkusz papieru do tacy drukarki. Następnie wydrukuj wcześniej zaprojektowane warstwy.Następnie należy pociąć arkusz membrany nylonowej na mniejsze fragmenty za pomocą biurowego obcinaka do papieru, zachowując szczególną ostrożność podczas manipulowania membraną, aby nie uszkodzić jej struktury i zapobiec rozdarciu. Niewykorzystany materiał należy przechowywać w suszarce laboratoryjnej, ponieważ membrany nylonowe są wrażliwe na wilgoć. Za pomocą drukarki woskowej należy wydrukować wzór warstwy wychwytu na kartce papieru kserograficznego, a następnie przymocować ją taśmą do stołu świetlnego, aby służyła jako szablon do pozycjonowania membrany nylonowej.Następnie połóż czystą kartkę papieru kserograficznego na wcześniej wydrukowanej kartce. Przymocuj czystą kartkę taśmą do podświetlacza, ale nie sklejaj obu arkuszy ze sobą. Teraz połóż wycięty fragment membrany nylonowej na czystej kartce papieru, upewniając się, że membrana pokrywa obszar wydruku na spodniej warstwie papieru.Przyklej taśmą wszystkie cztery krawędzie membrany nylonowej do czystej kartki papieru kserograficznego. Włóż arkusz membrany nylonowej, podpartej przymocowaną do niej kartką papieru, do tacy ręcznego podawania drukarki. Następnie drukuj membrany nylonowe po jednej sztuce.Przyklej wydrukowane warstwy do akrylowej ramy, aby zapewnić równomierne ogrzewanie warstwy z obu stron po umieszczeniu w piecu z konwekcją grawitacyjną. Następnie umieść warstwy w piecu w temperaturze 150 °C przez 30 sekund, aż wosk wniknie w strukturę papieru. Po wyjęciu papieru z pieca upewnij się, że wosk przeniknął przez całą grubość papieru, odwracając go i sprawdzając, czy w projekcie nie ma niedoskonałości.Usuń papier oraz membranę nylonową z akrylowej ramki. Następnie oddziel membranę nylonową od podkładki z papieru kserograficznego za pomocą noża do papieru. Wytnij wzory w dwustronnych arkuszach folii klejącej, używając robotycznego plotera tnącego z wcześniej przygotowanymi plikami projektowymi.Następnie przyklej taśmą warstwę papieru z wzorem, która wymaga nałożenia kleju, do podświetlanego stołu roboczego stroną nadrukowaną do dołu. Oderwij jedną stronę folii ochronnej z arkusza kleju do wzorów. Dociśnij arkusz kleju do wzorów i warstwę papieru do siebie.Następnie umieść częściowo zmontowane urządzenie w ochronnym etui. Kolejno przeprowadź powstały dwuwarstwowy zespół przez automatyczną laminarkę, aby całkowicie docisnąć klej i papier do siebie, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza z sąsiadujących warstw. Przymocuj warstwę koniugatu taśmą do akrylowej ramki w taki sposób, aby strefa hydrofilowa, która ma zostać poddana obróbce, była zawieszona i nie stykała się z ramką.Dodaj 2,5 µL BSA i 1X PBS do strefy hydrofilowej na warstwie koniugatu. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, wysusz ją w temperaturze 65 °C przez pięć minut. Następnie dodaj 5 µL nanocząsteczek złota koloidalnego o gęstości optycznej 5 OD skoniugowanych z przeciwciałem anty-beta hCG, a następnie powtórz proces suszenia.Przyklej warstwę kanału bocznego do akrylowej ramki w taki sposób, aby hydrofilowa strefa poddawana obróbce była zawieszona i nie stykała się z ramką. Dodaj 10 µL środka blokującego w celu obróbki kanału bocznego, a następnie powtórz ten sam proces suszenia, który został zastosowany dla warstwy koniugatu. Następnie przyklej warstwę przechwytującą do akrylowej ramki w taki sposób, aby hydrofilowa strefa poddawana obróbce była zawieszona i nie stykała się z ramką.Warstwę wychwytującą potraktowano 5 µL przeciwciała anty-alpha hCG. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, wysuszono ją w temperaturze 65 °C przez 8 minut. Dodano 2 µL środka blokującego, a następnie powtórzono ten sam proces suszenia, który zastosowano dla warstwy wychwytującej.Przyklej warstwę płuczącą do lightboxa taśmą, tak aby strona z nadrukiem była skierowana do góry. Jeśli zastosowano otwory wyrównawcze, usuń je z kolejnych warstw za pomocą ręcznego dziurkacza. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy przechwytującej, aby odsłonić warstwę kleju.Ustaw warstwę przechwytującą nad warstwą płuczącą, korzystając z otworów wyrównawczych jako prowadnic, następnie dociśnij obie warstwy do siebie, unikając dotykania stref hydrofilowych, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia lub uszkodzenia urządzenia. Następnie usuń folię ochronną z tyłu warstwy inkubacyjnej, aby odsłonić warstwę klejącą. Ustaw warstwę inkubacyjną nad warstwą przechwytującą i dociśnij je do siebie.Kontynuuj dodawanie warstw w ten sposób, aż wszystkie warstwy aktywne zostaną złożone. Następnie umieść częściowo złożone urządzenie w ochronnym rękawie i mocno przymocuj warstwy do siebie za pomocą laminatora. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy płuczącej i przymocuj warstwę do blotowania do spodu urządzenia.Po laminowaniu w celu zakończenia montażu trójwymiarowego papierowego urządzenia mikroprzepływowego, wytnij pożądaną liczbę urządzeń z arkuszy w pełni zmontowanych urządzeń za pomocą nożyczek. Dodaj 20 µL próbki kontrolnej dodatniej buforu hCG do strefy hydrofilowej na górze urządzenia. Gdy próbka zostanie całkowicie wchłonięta przez urządzenie, dodaj 15 µL buforu płuczącego.Po całkowitym wniknięciu pierwszej porcji buforu płuczącego do urządzenia, dodaj drugą porcję 15 µL buforu płuczącego. Aby odczytać wyniki analizy, delikatnie oderwij pęsetą trzy górne warstwy urządzenia, aby odsłonić warstwę przechwytującą. Metoda druku woskiem może być wykorzystywana do tworzenia barier hydrofobowych w papierowych urządzeniach mikroprzepływowych i pozwala na uzyskanie kanałów przepływu o powtarzalnych wymiarach, co jest kluczowe dla analiz o powtarzalnej wydajności i czasie trwania.Wydajność papierowego testu immunoabsorpcyjnego na hCG wykazano, przeprowadzając równolegle 35 analiz dodatnich i 35 analiz ujemnych. Współczynnik zmienności dla każdego zbioru danych wyniósł 1% dla analiz wykonanych z użyciem próbek ujemnych oraz 3% dla analiz wykonanych z użyciem próbek dodatnich. Przesunięcie warstw tworzących kanał inkubacyjny i strefę wychwytu może spowodować powstanie nieregularnego wzoru sygnału dodatniego, co może prowadzić do błędnej interpretacji sygnału jakościowego.Jeśli wosk nie zostanie nadrukowany w wystarczającej ilości lub nie zostanie całkowicie stopiony przez całą grubość papieru, integralność powstałych barier hydrofobowych może zostać naruszona, co doprowadzi do wycieków wewnątrz urządzenia. Analizy, których wykonanie trwa dłużej niż oczekiwano, mogą wskazywać na wadliwe wykonanie urządzenia. Papierowe urządzenia mikroprzepływowe zapewniają badaczom wszechstronną platformę do opracowywania niskokosztowych testów analitycznych w punkcie opieki (point-of-care).Choć istnieje wiele zastosowań, zaprezentowane tutaj podejście prowadzi do stworzenia ogólnej architektury urządzenia do przeprowadzania testów immunoenzymatycznych, które mają kluczowe znaczenie w opiece zdrowotnej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o sprawdzaniu ewentualnych niedoskonałości w procesie wytwarzania oraz przed traktowaniem warstw kosztownymi odczynnikami biochemicznymi. Po opanowaniu tej metody — od drukowania warstw po montaż warstw poddanych obróbce — można w ciągu dwóch godzin przygotować arkusz funkcjonalnych testów immunoenzymatycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób wytwarzania trójwymiarowych urządzeń papierowych i czuć się na tyle pewnie, aby dostosować tę platformę do innych interesujących Cię typów analiz.

fabrication-three-dimensional-paper-based-microfluidic-devices-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach.  Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie.  Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Pokazujemy użycie wzorzystych klejów aerozolowych do budowy 3D papierowych urządzeń mikroprzepływowych. Ta metoda nakładania kleju tworzy półtrwałe wiązania między warstwami, umożliwiając nieniszczący demontaż urządzeń jednorazowego użytku po użyciu i ułatwiając składanie złożonych struktur niepłaskich.

Wykorzystanie wzoru kleju do budowy urządzeń mikroprzepływowych z papieru 3D

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych z MY133-V2000 w celu wyeliminowania artefaktów, które często powstają w mikrokanałach z powodu niezgodności współczynników załamania światła między strukturami mikrokanalików a roztworem wodnym. Protokół ten wykorzystuje akrylowy uchwyt do ściskania zamkniętego urządzenia, poprawiając przyczepność zarówno chemicznie, jak i mechanicznie.

Produkcja urządzeń o dopasowanym współczynniku załamania światła dla mikrofluidyki biomedycznej

Ten projekt pozwala małym laboratoriom na opracowanie łatwej w użyciu platformy do produkcji precyzyjnych wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych. Platforma składa się z wydrukowanego w trzech wymiarach adaptera do ustawiania maski mikroskopowej, za pomocą którego uzyskano wielowarstwowe urządzenia mikroprzepływowe z błędami wyrównania &lt;10 μm.

Projekt i opracowanie trójwymiarowo drukowanego adaptera do wyrównywania maski mikroskopowej do wytwarzania wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Ten protokół opisuje prosty proces, który wykorzystuje wygodne plastikowe mikro-formy do prostych operacji mikrotłoczenia w celu wytworzenia mikrokanałów na nanofibrylowanym papierze celulozowym, osiągając minimalną szerokość 200 μm.

Mikrotłoczenie: wygodny proces wytwarzania mikrokanalików na mikrofluidyce na bazie papieru nanocelulozowego

Poznaj metodę wytwarzania trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych point-of-care. Technika wielowarstwowa umożliwia równoległą produkcję wielu urządzeń dla badań akademickich.

Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Przeglądaj więcej filmów