Name: Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej izolacji kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca szczura. Technika ta zwiększa wydajność badań kardiologicznych i zmniejsza koszty eksperymentalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania za wsparcie techniczne L. Rinaldiego, S. Schäffera, D. Reitza, H. Thomasa i A. Webera. Autorzy pragną również podziękować dr E. Martinsonowi za obszerną korektę i redakcję językową manuskryptu. Badania były wspierane przez grant Uniwersytetu w Giessen Anschubsfinanzierung dla M. Aslama i D. Gündüza.

<ol><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiovascular diseases.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li>
<li>Barbieri, S. S., Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+cooperates+with+interleukin-1beta+to+alter+beta-catenin+trafficking+in+vascular+endothelium+resulting+in+increased+permeability+and+induction+of+cyclooxygenase-2+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo.</a> FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).</li>
<li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. (28), (2009).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+extracellular+ATP+protects+against+acute+reperfusion+injury+in+rat+heart+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells.</a> Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).</li>
<li>Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+metabolism+in+cultured+adult+rat+cardiac+fibroblasts%3A+response+to+angiotensin+II+and+aldosterone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone.</a> J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).</li>
<li>Shahzad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+postconditioning+protection+of+cardiomyocytes+against+acute+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Stabilizes+Microvascular+Endothelial+Barrier+Function+via+Phosphatidylinositol+3-Kinase%2FAkt-Mediated+Rac1+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation.</a> Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).</li>
<li>Lipps, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+fragment+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+triggers+pro-inflammatory+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro.</a> J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).</li>
<li>Abdallah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Ca2%2B+cycling+and+mitochondrial+permeability+transition+pores+promotes+reperfusion-induced+injury+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes.</a> J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ticagrelor+on+endothelial+calcium+signalling+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function.</a> Thromb Haemost. , (2016).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+ATP+and+adenosine+on+barrier+function+of+rat+coronary+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature.</a> J Mol.Cell Cardiol. , (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

W artykule opisano powtarzalny protokół izolacji i hodowli miocytów serca, komórek śródbłonka i fibroblastów. Protokół ten opisuje jednoczesną i wysokiej jakości izolację głównych typów komórek tkanki serca, tj. kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów, a nie tylko jednego typu komórek. Krytycznym etapem procedury izolacji jest prawidłowe trawienie tkanki serca. Jeśli trawienie jest niekompletne, nadal można uzyskać dużą liczbę miocytów, ale ich jakość jest bardzo słaba i są one w większości nadmiernie ...

Modele gryzoni od dawna są używane jako narzędzia do poszerzania naszego zrozumienia fizjologii układu sercowo-naczyniowego w zdrowiu i chorobie. 1 Chociaż te modele zwierzęce pozwalają nam zrozumieć patofizjologię choroby na poziomie narządów oraz analizować farmakokinetykę i farmakodynamikę różnych środków farmakologicznych stosowanych w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju chorób sercowo-naczyniowych i wkładu określonego typu komórek wymaga użycia in vitro modele hodowli komórkowych. W tym celu opracowano różne unieśmiertelnione linie komórkowe z układu sercowo-naczyniowego; 2,3 Jednak świeżo wyizolowane komórki pierwotne są fizjologicznie i funkcjonalnie bardziej istotne dla żywych tkanek i organizmów.
Serce jest wszechstronnym organem zawierającym wszystkie główne typy komórek układu sercowo-naczyniowego, a serce szczura jest nadal powszechnie używanym modelem do zrozumienia fizjologii układu sercowo-naczyniowego. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat opisano różne metody izolacji poszczególnych typów komórek z tkanki serca; 4,5,6,7 Jednak metody te koncentrują się tylko na izolacji jednego konkretnego typu komórki, co skutkuje utratą innych typów komórek, które nie mogą być już używane do analizy komórkowej. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który umożliwia jednoczesną i wysokiej jakości izolację głównych typów komórek tkanki serca, tj. kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów. Wszystkie te typy komórek mogą być używane w różnych konfiguracjach eksperymentalnych8,9,10 oraz do analizy interakcji komórka-komórka tego samego zwierzęcia.

<table><tbody><tr><td>anty-vWF</td><td>Santa Cruz Biotech.</td><td>SC-14014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>Carnitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Creatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dil-AC-LDL</td><td>Thermo Scientific</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór EDTA (0,2 M)</td><td>Biochrome AG</td><td>L2113</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do zatapiania</td><td>Citiflour</td><td>AF1-25</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z komórek śródbłonka MV2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Biochrome AG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Serva Chemicals</td><td>47991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Abbott</td><td>TU 061219</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Roche/Sigma</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium (proszek)</td><td>Biochrome AG</td><td>T061</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało antyszczurze CD31 (TLD-3A12)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-81051</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór NaCl (0,9%), Sterylne</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td>30820080</tr><tr><td>Pan mysz Koraliki IgG (Dynabeads)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA) 4% roztwór</td><td>Santa Cruz Biotech.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) 1x&nbsp;</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne do tworzyw sztucznych</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>4933</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>7873</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu (2 N)</td> <td>Merck</td><td>109136</td><td></td></tr><tr><td>sterylny system filtracji</td><td>Thermo Scientific</td><td>5660020</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Woda, sterylna</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Szczur jest ważnym modelem zwierzęcym wykorzystywanym w badaniach sercowo-naczyniowych, a komórki serca szczura są rutynowo wykorzystywane do analizy in vitro molekularnych mechanizmów progresji chorób sercowo-naczyniowych, takich jak przerost mięśnia sercowego, zwłóknienie i miażdżyca. Chociaż podjęto kilka prób ze zmiennym powodzeniem, aby opracować unieśmiertelnione linie komórkowe z układu sercowo-naczyniowego, aby zrozumieć te mechanizmy komórkowe, komórki pierwotne oferują bardziej naturalne i zbliżone do in vivo środowisko do takich badań. Dlatego różne laboratoria pracujące nad określonym typem komórek opracowały protokoły izolowania poszczególnych typów komórek serca szczurów, które są przedmiotem zainteresowania. Brakuje jednak protokołu, który pozwalałby na izolację więcej niż jednego typu komórek. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który umożliwia izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu i umożliwia ich wykorzystanie do analiz komórkowych. Pozwala to na jak najefektywniejsze wykorzystanie dostępnych zasobów, co może pozwolić na oszczędność czasu i obniżenie kosztów badań.

Procedura izolacji pozwala na uzyskanie wydajności 70 - 80% żywych, prętowatych, prążkowanych kardiomiocytów (Rysunki 2A i 2C), które mogą być wykorzystane w planowanych eksperymentach. W naszym laboratorium kardiomiocyty są rutynowo stosowane do analizy sygnalizacji Ca2+. Rysunek 5A przedstawia oscylacje wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia [Ca2+]i w odpowiedzi na niedokrwienie/reperfuzję w kardio...

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesna izolacja żywych kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca szczura do ich indywidualnych analiz in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny kardiologicznej dotyczące mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w przerost serca, uszkodzenie reperfuzyjne po niedokrwieniu, funkcję śródbłonka oraz włóknienie serca. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek serca, co potencjalnie pozwala na obniżenie kosztów badawczych i zmniejszenie liczby wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.Po przepłukaniu raz wodą destylowaną i raz 50 mililitrami pożywki Powella, należy wymienić pożywkę na 80 mililitrów świeżej pożywki Powella i za pomocą szklanej pipety Pasteura z cylindra szklanego stale napowietrzać pożywkę karbogenem. Następnie, używając dwóch par cienkich zakrzywionych pincet, należy zamocować świeżo pobrane serce szczura za aortę w systemie perfuzyjnym Langendorffa, umieszczając koniec kaniuli systemu perfuzyjnego pomiędzy pierwszym odgałęzieniem aorty a zastawką aortalną. Aortę należy przymocować zaciskiem typu krokodyl.Otwórz zawór kaniuli, a następnie unieruchom serce za pomocą szwu chirurgicznego. Pozwól, aby 35 ml medium perfuzyjnego przepłynęło przez serce kropla po kropli, usuwając pozostałości krwi. Umieść lejek zbiorczy pod sercem i uruchom pompę perystaltyczną, aby recyrkulować medium perfuzyjne z lejka zbiorczego do zbiornika.Dodaj roztwór kolagenazy do medium perfuzyjnego i perfunduj serce z użyciem recyrkulującego roztworu kolagenazy przez 30 minut. Po zakończeniu trawienia usuń serce z układu Langendorffa za pomocą nożyczek i umieść je w szklanej płytce Petriego. Następnie usuń oba przedsionki oraz wszelką pozostałą tkankę tłuszczową z serca.Aby uniknąć kontaminacji komórkami nabłonkowymi, należy użyć dwóch pincet, aby ostrożnie oddzielić osierdzie. Przeciąć serce wzdłuż osi środkowej i umieścić obie połowy w rozdrabniaczu do tkanek. Rozdrobić serce dwa do trzech razy, a następnie przenieść fragmenty tkanki do probówki stożkowej o pojemności 15 milliliter zawierającej 12 milliliters buforu trawiennego z perfuzji Langendorffa.Trawcie fragmenty tkanek w łaźni wodnej od pięciu do 10 minut, okazjonalnie mieszając zawiesinę za pomocą jednorazowej plastikowej pipety o pojemności pięciu mililitrów. Następnie przefiltrujcie zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 100 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłuczcie system perfuzyjny minimum jednym litrem wody destylowanej, a następnie 100 ml 0,1 N wodorotlenku sodu przez 30 minut, po czym przepłuczcie system kolejnymi dwoma do trzech litrami wody destylowanej i osuszcie aparat sprężonym powietrzem.Odwirować przefiltrowane komórki, a następnie za pomocą jednorazowej pipety ostrożnie przenieść supernatant zawierający komórki śródbłonka i fibroblasty do nowej probówki o pojemności 50 ml. Resuspendować osad w 6 ml roztworu wapnia nr 1. Po jednej minucie ponownie odwirować komórki i resuspendować osad w 6 ml roztworu wapnia nr 2.Po jednej minucie rozcieńczyć zawiesinę komórkową, dodając 12 mililitrów trzeciego roztworu wapnia, a następnie wymieszać poprzez delikatne przechylanie. Po kolejnym wirowaniu resuspender osad w 20 mililitrach uprzednio ogrzanego medium CCT. Następnie nanieść po jednym mililitrze komórek do każdej z 20 sterylnych 35-milimetrowych szalek do hodowli komórkowej uprzednio pokrytych lamininą i umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej bez dwutlenku węgla, wymieniając po dwóch godzinach medium na dwa mililitry świeżego medium CCT w celu usunięcia martwych komórek.Następnie odwiruj supernatant zawierający komórki śródbłonka i fibroblasty, a osad resuspenduj w 1,5 milliliters buforu do izolacji komórek śródbłonka. Przenieś komórki do probówki do próbek o pojemności dwóch mililitrów i dodaj do komórek przeciwciało mysie anty-szczurze CD31, po czym inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsius z rotacją końcową.Po zakończeniu inkubacji z kuleczkami umieść komórki w statywie magnetycznym na dwie minuty, a następnie za pomocą pipety o objętości 1 mL ostrożnie usuń supernatant zawierający głównie fibroblasty. Przenieś fibroblasty do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm zawierającego 10 mL pożywki do hodowli fibroblastów i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na jedną godzinę. Następnie do probówki z komórkami śródbłonka dodaj 1 mL buforu płuczącego i zamknij probówkę.Delikatnie potrząśnij komórkami cztery lub pięć razy, aby resuspender kuleczki. Następnie umieść probówkę ponownie w magnesie i po jednej minucie usuń bufor płuczący. Po ostatnim płukaniu zastąp bufor płuczący jednym mililitrem medium do hodowli komórek śródbłonka MV2, a następnie wysiej komórki śródbłonka do pojedynczej studni płytki 12-dołkowej w celu ich nocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórek.Po zakończeniu inkubacji fibroblastów, przemyć przytwierdzone komórki odpowiednią objętością podgrzanego PBS dwa lub trzy razy. Następnie dodać do komórek podgrzaną świeżą pożywkę do hodowli fibroblastów i przenieść fibroblasty z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowej. Następnego dnia zastąpić supernatant w hodowli komórek śródbłonka świeżą pożywką do hodowli komórek śródbłonka i przenieść komórki z powrotem do inkubatora, wymieniając pożywkę co dwa lub trzy dni, aż do osiągnięcia półstadiu konfluencji.Następnie należy wypłukać hodowlę przytwierdzonych fibroblastów świeżym, uprzednio ogrzanym PBS w sposób właśnie zademonstrowany, a następnie dostarczyć komórkom świeże, uprzednio ogrzane pożywkę. Procedura izolacji kardiomiocytów pozwala na uzyskanie populacji żywych, prętowych, prążkowanych komórek serca o czystości od 70 do 80%. Można następnie przeprowadzić analizę oscylacji wewnątrzkomórkowego wapnia w izolowanych kardiomiocytach obciążonych fura AM w odpowiedzi na reperfuzję po niedokrwieniu, a także analizę zmian w sygnalizacji wapniowej w komórkach śródbłonka i fibroblastach izolowanych za pomocą kulek magnetycznych po dodaniu ATP.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu trzech godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo przygotować system perfuzji i niezwłocznie utrwalić serce w systemie, gdy tylko będzie ono gotowe. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie kardiologii do zgłębiania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w różne patofizjologie układu sercowo-naczyniowego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat podstawowych zasad izolacji i hodowli komórek serca. Należy pamiętać, że praca z narzędziami chirurgicznymi oraz odczynnikami do hodowli komórkowych może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak uważne posługiwanie się narzędziami i stosowanie rękawiczek.

simultaneous-isolation-high-quality-cardiomyocytes-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisaliśmy typowy sposób izolacji i hodowli dorosłych miocytów serca szczura. Do trawienia i izolacji pojedynczych miocytów wykorzystuje się kolagenazę oraz proteazę. Miocyty hodowane zgodnie z tym protokołem spełniają większość wymagań eksperymentalnych.

Hodowla pierwotna kardiomiocytów dorosłego szczura

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli kardiomiocytów komorowych dorosłych szczurów (ARVC). Izolowany ARVC może być stosowany do krótko- i długotrwałej uprawy. Izolacja i hodowla ARVC może odegrać kluczową rolę w opracowywaniu nowych schematów leczenia chorób serca.

Izolacja i hodowla dorosłych kardiomiocytów szczurów

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Poznaj metodę jednoczesnej izolacji kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca szczura. Technika ta zwiększa wydajność badań kardiologicznych i zmniejsza koszty eksperymentalne.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Przeglądaj więcej filmów