Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne wyizolowanie żywotnych kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca szczura do ich indywidualnych analiz in vitro. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego dotyczące mechanizmów sygnalizacyjnych związanych z przerostem serca, uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwiennym, funkcją śródbłonka i zwłóknieniem serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie główne komórki serca mogą być izolowane jednocześnie, co potencjalnie zmniejsza związane z tym koszty badań i liczbę zwierząt doświadczalnych.

Po jednym przepłukaniu wodą destylowaną i jednym 50 mililitrowym przepłukaniem pożywki Powella, zastąp pożywkę 80 mililitrami świeżej pożywki Powella i użyj szklanej pipety Pasteura ze szklanego cylindra, aby w sposób ciągły perfaktorować pożywkę karbogenem. Następnie użyj dwóch par cienkich zakrzywionych kleszczyków, aby zamontować świeżo pobrane serce szczura przez aortę na systemie perfuzyjnym Langendorffa i umieść koniec kaniuli systemu perfuzyjnego między pierwszą gałęzią aorty a zastawką aortalną. Zamocuj aortę za pomocą zacisku krokodylowego.

Otwórz zastawkę kaniuli, a następnie przymocuj serce za pomocą szwu chirurgicznego. Pozwól, aby 35 mililitrów pożywki perfuzyjnej przeszło przez kroplę serca, usuwając resztki krwi. Umieść lejek zbiorczy pod sercem i uruchom pompę perystaltyczną, aby recyrkulować medium perfuzyjne z lejka zbiorczego do zbiornika.

Dodaj roztwór kolagenazy do pożywki perfuzyjnej i perfunduj serce roztworem kolagenazy z recyrkulacją przez 30 minut. Pod koniec trawienia użyj nożyczek, aby usunąć serce z systemu Langendorffa i umieścić je na szklanej szalce Petriego. Teraz usuń zarówno przedsionki, jak i resztki tkanki tłuszczowej z serca.

Aby uniknąć zanieczyszczenia komórek nabłonka, użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie oderwać osierdzie. Przetnij serce na środku i umieść połówki w rozdrabniaczu do tkanek. Zmiel serce dwa do trzech razy i przenieś kawałki tkanki do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 12 mililitrów buforu trawiennego z perfuzji Langendorffa.

Trawić fragmenty tkanek w łaźni wodnej przez pięć do 10 minut, od czasu do czasu mieszając za pomocą pięciomililitrowej jednorazowej plastikowej pipety. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sito o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać układ perfuzyjny co najmniej jednym litrem wody destylowanej, a następnie 100 mililitrami 0,1 normalnego wodorotlenku sodu przez 30 minut, a następnie przepłukać system kolejnymi dwoma do trzech litrów wody destylowanej i osuszyć aparat przepłukanym powietrzem.

Zbierz przefiltrowane komórki przez odwirowanie i za pomocą jednorazowej pipety ostrożnie przenieś komórkę śródbłonka i fibroblasty zawierające supernatant do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Zawiesić osad w sześciu mililitrach roztworu wapnia jeden. Po jednej minucie zbierz komórki za pomocą drugiego wirowania i ponownie zawieś osad w sześciu mililitrach roztworu wapnia dwa.

Po jednej minucie rozcieńczyć zawiesinę komórkową z dodatkiem 12 mililitrów roztworu wapnia trzy i dobrze wymieszać, delikatnie przechylając. Po kolejnym odwirowaniu ponownie zawieś osad w 20 mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża CCT. Następnie podajcie jeden mililitr komórek do każdej z 20 sterylnych 35-milimetrowych naczyń do hodowli komórkowych wstępnie pokrytych lamininą i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych bez dwutlenku węgla, zastępując pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki CCT, aby usunąć martwe komórki po dwóch godzinach.

Teraz odwiruj komórkę śródbłonka i fibroblasty zawierające supernatant i ponownie zawieś osad w 1,5 mililitra buforu do izolacji komórek śródbłonka. Przenieś komórki do dwumililitrowej probówki z próbką i dodaj mysie przeciwciało anty-szczurze CD31 do komórek na 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją od końca do końca. Pod koniec inkubacji dodaj koraliki IGG Pan anty-mysie na 20 w inkubacji w czterech stopniach Celsjusza, z rotacją od końca do końca.

Pod koniec inkubacji kulek umieść komórki w stojaku magnetycznym na dwie minuty i użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć supernatant zawierający głównie fibroblasty. Zobacz fibroblasty na 10-centymetrowej naczyniu hodowlanym zawierającej 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek fibroblastów i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na jedną godzinę. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania do probówki z komórkami śródbłonka i zakryj probówkę.

Delikatnie potrząśnij komórkami cztery do pięciu razy, aby ponownie zawiesić koraliki. Następnie włóż rurkę z powrotem do magnesu i wyjmij bufor płuczący po jednej minucie. Po ostatnim płukaniu zastąp bufor płuczący jednym mililitrem pożywki do hodowli komórek śródbłonka MV2 i umieść komórki śródbłonka w jednym dołku na 12-dołkowej płytce w celu ich hodowli przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Pod koniec inkubacji fibroblastów przemyj przyłączone komórki odpowiednią objętością wstępnie podgrzanego PBS dwa do trzech razy. Następnie dodaj do komórek wstępnie podgrzaną, świeżą pożywkę do hodowli komórek fibroblastów i włóż fibroblasty z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp supernatant w hodowli komórek śródbłonka świeżą pożywką do hodowli komórek śródbłonka i włóż komórki z powrotem do inkubatora, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni, aż do częściowego zbieżności.

Następnie umyj kulturę dołączonych komórek fibroblastów świeżym, wstępnie podgrzanym PBS, jak właśnie pokazano, i nakarm komórki świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką. Procedura izolacji kardiomiocytów daje od 70 do 80% czystą, żywotną, prążkowaną, prążkowaną populację komórek serca. Następnie można przeprowadzić wewnątrzkomórkową analizę oscylacji wapnia izolowanych kardiomiocytów obciążonych furą AM, w odpowiedzi na repurfuzję niedokrwienną w kardiomiocytach, a także analizę zmian w sygnalizacji wapniowej w izolowanych kulkach magnetycznych komórkach śródbłonka i fibroblastach po dodaniu ATP.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu trzech godzin, jeśli działa prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu tego systemu perfuzyjnego i natychmiastowym zamocowaniu serca w systemie, gdy tylko będzie gotowe. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami sercowo-naczyniowymi do zbadania sygnalizacji zaangażowanej w różne patofizjologie układu sercowo-naczyniowego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć podstawowe zasady izolacji i hodowli komórek serca. Nie zapominaj, że praca z narzędziami chirurgicznymi i odczynnikami do hodowli komórkowych może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ostrożne korzystanie z narzędzi i używanie rękawiczek.