Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura
19 maja 2017
Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.
Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne wyizolowanie żywotnych kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca szczura do ich indywidualnych analiz in vitro. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego dotyczące mechanizmów sygnalizacyjnych związanych z przerostem serca, uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwiennym, funkcją śródbłonka i zwłóknieniem serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie główne komórki serca mogą być izolowane jednocześnie, co potencjalnie zmniejsza związane z tym koszty badań i liczbę zwierząt doświadczalnych.
Po jednym przepłukaniu wodą destylowaną i jednym 50 mililitrowym przepłukaniem pożywki Powella, zastąp pożywkę 80 mililitrami świeżej pożywki Powella i użyj szklanej pipety Pasteura ze szklanego cylindra, aby w sposób ciągły perfaktorować pożywkę karbogenem. Następnie użyj dwóch par cienkich zakrzywionych kleszczyków, aby zamontować świeżo pobrane serce szczura przez aortę na systemie perfuzyjnym Langendorffa i umieść koniec kaniuli systemu perfuzyjnego między pierwszą gałęzią aorty a zastawką aortalną. Zamocuj aortę za pomocą zacisku krokodylowego.
Otwórz zastawkę kaniuli, a następnie przymocuj serce za pomocą szwu chirurgicznego. Pozwól, aby 35 mililitrów pożywki perfuzyjnej przeszło przez kroplę serca, usuwając resztki krwi. Umieść lejek zbiorczy pod sercem i uruchom pompę perystaltyczną, aby recyrkulować medium perfuzyjne z lejka zbiorczego do zbiornika.
Dodaj roztwór kolagenazy do pożywki perfuzyjnej i perfunduj serce roztworem kolagenazy z recyrkulacją przez 30 minut. Pod koniec trawienia użyj nożyczek, aby usunąć serce z systemu Langendorffa i umieścić je na szklanej szalce Petriego. Teraz usuń zarówno przedsionki, jak i resztki tkanki tłuszczowej z serca.
Aby uniknąć zanieczyszczenia komórek nabłonka, użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie oderwać osierdzie. Przetnij serce na środku i umieść połówki w rozdrabniaczu do tkanek. Zmiel serce dwa do trzech razy i przenieś kawałki tkanki do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 12 mililitrów buforu trawiennego z perfuzji Langendorffa.
Trawić fragmenty tkanek w łaźni wodnej przez pięć do 10 minut, od czasu do czasu mieszając za pomocą pięciomililitrowej jednorazowej plastikowej pipety. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sito o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać układ perfuzyjny co najmniej jednym litrem wody destylowanej, a następnie 100 mililitrami 0,1 normalnego wodorotlenku sodu przez 30 minut, a następnie przepłukać system kolejnymi dwoma do trzech litrów wody destylowanej i osuszyć aparat przepłukanym powietrzem.
Zbierz przefiltrowane komórki przez odwirowanie i za pomocą jednorazowej pipety ostrożnie przenieś komórkę śródbłonka i fibroblasty zawierające supernatant do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Zawiesić osad w sześciu mililitrach roztworu wapnia jeden. Po jednej minucie zbierz komórki za pomocą drugiego wirowania i ponownie zawieś osad w sześciu mililitrach roztworu wapnia dwa.
Po jednej minucie rozcieńczyć zawiesinę komórkową z dodatkiem 12 mililitrów roztworu wapnia trzy i dobrze wymieszać, delikatnie przechylając. Po kolejnym odwirowaniu ponownie zawieś osad w 20 mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża CCT. Następnie podajcie jeden mililitr komórek do każdej z 20 sterylnych 35-milimetrowych naczyń do hodowli komórkowych wstępnie pokrytych lamininą i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych bez dwutlenku węgla, zastępując pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki CCT, aby usunąć martwe komórki po dwóch godzinach.
Teraz odwiruj komórkę śródbłonka i fibroblasty zawierające supernatant i ponownie zawieś osad w 1,5 mililitra buforu do izolacji komórek śródbłonka. Przenieś komórki do dwumililitrowej probówki z próbką i dodaj mysie przeciwciało anty-szczurze CD31 do komórek na 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją od końca do końca. Pod koniec inkubacji dodaj koraliki IGG Pan anty-mysie na 20 w inkubacji w czterech stopniach Celsjusza, z rotacją od końca do końca.
Pod koniec inkubacji kulek umieść komórki w stojaku magnetycznym na dwie minuty i użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć supernatant zawierający głównie fibroblasty. Zobacz fibroblasty na 10-centymetrowej naczyniu hodowlanym zawierającej 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek fibroblastów i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na jedną godzinę. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania do probówki z komórkami śródbłonka i zakryj probówkę.
Delikatnie potrząśnij komórkami cztery do pięciu razy, aby ponownie zawiesić koraliki. Następnie włóż rurkę z powrotem do magnesu i wyjmij bufor płuczący po jednej minucie. Po ostatnim płukaniu zastąp bufor płuczący jednym mililitrem pożywki do hodowli komórek śródbłonka MV2 i umieść komórki śródbłonka w jednym dołku na 12-dołkowej płytce w celu ich hodowli przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Pod koniec inkubacji fibroblastów przemyj przyłączone komórki odpowiednią objętością wstępnie podgrzanego PBS dwa do trzech razy. Następnie dodaj do komórek wstępnie podgrzaną, świeżą pożywkę do hodowli komórek fibroblastów i włóż fibroblasty z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp supernatant w hodowli komórek śródbłonka świeżą pożywką do hodowli komórek śródbłonka i włóż komórki z powrotem do inkubatora, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni, aż do częściowego zbieżności.
Następnie umyj kulturę dołączonych komórek fibroblastów świeżym, wstępnie podgrzanym PBS, jak właśnie pokazano, i nakarm komórki świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką. Procedura izolacji kardiomiocytów daje od 70 do 80% czystą, żywotną, prążkowaną, prążkowaną populację komórek serca. Następnie można przeprowadzić wewnątrzkomórkową analizę oscylacji wapnia izolowanych kardiomiocytów obciążonych furą AM, w odpowiedzi na repurfuzję niedokrwienną w kardiomiocytach, a także analizę zmian w sygnalizacji wapniowej w izolowanych kulkach magnetycznych komórkach śródbłonka i fibroblastach po dodaniu ATP.
Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu trzech godzin, jeśli działa prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu tego systemu perfuzyjnego i natychmiastowym zamocowaniu serca w systemie, gdy tylko będzie gotowe. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami sercowo-naczyniowymi do zbadania sygnalizacji zaangażowanej w różne patofizjologie układu sercowo-naczyniowego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć podstawowe zasady izolacji i hodowli komórek serca. Nie zapominaj, że praca z narzędziami chirurgicznymi i odczynnikami do hodowli komórkowych może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ostrożne korzystanie z narzędzi i używanie rękawiczek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół jednoczesnej izolacji żywych kardiomiocytów, komórek śródbłonka oraz fibroblastów z serc szczurzych. Metoda ta zwiększa wydajność izolacji komórek serca, co może przyczynić się do obniżenia kosztów badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
- Biologia komórki
- Techniki izolacji komórek serca
Wstęp
- Izolacja typów komórek serca jest kluczowa dla analiz in vitro.
- Zrozumienie mechanizmów sygnalizacyjnych w schorzeniach serca ma istotne znaczenie.
- Obecne metody często wymagają wielokrotnego przygotowania próbek.
- Niniejszy protokół ma na celu usprawnienie tego procesu.
Cel badania
- Izolacja głównych typów komórek serca z jednego preparatu serca szczura.
- Umożliwienie oddzielnej analizy kardiomiocytów, komórek śródbłonkowych i fibroblastów.
- Zmniejszenie kosztów eksperymentalnych i liczby wykorzystywanych zwierząt.
Zastosowane Metody
- Perfuzja serca szczura z użyciem medium Powella.
- Wykorzystanie systemu perfuzji Langendorffa.
- Ciągła perfuzja medium nasyconym karbogenem.
- Izolacja komórek za pomocą zoptymalizowanych technik wypłukiwania.
Główne wyniki
- Skuteczna jednoczesna izolacja głównych typów komórek serca.
- Wysoka żywotność izolowanych komórek do dalszych analiz.
- Zmniejszenie liczby zwierząt niezbędnych do prowadzenia badań.
- Potencjał do znaczących oszczędności kosztów w procedurach eksperymentalnych.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia wydajną metodę izolacji komórek serca.
- Wspiera on badania nad przerostem serca oraz schorzeniami powiązanymi.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w różnych analizach sercowo-naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Niniejszy protokół umożliwia jednoczesną izolację trzech głównych typów komórek serca z jednego serca szczura, co zwiększa efektywność wykorzystania zasobów w procesach badawczych nad układem sercowo-naczyniowym. Dzięki ograniczeniu liczby wykorzystywanych zwierząt oraz czasu przygotowania, metoda ta wspiera kosztowo efektywną walidację celów oraz badania mechanistyczne w modelach przerostu, włóknienia i uszkodzenia reperfuzyjnego. Metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnych etapach odkryć, dostarczając fizjologicznie istotnych komórek pierwotnych do oceny ryzyka w badaniach nad szlakami sygnałowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych dla typu komórek mechanizmów sygnalizacyjnych w szlakach przerostu i włóknienia mięśnia sercowego.
- Wartość operacyjna: Dostarcza oczyszczone pierwotne kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty do funkcjonalnej oceny ryzyka celów terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera wgląd w mechanizmy indukowanej lekami kardiotoksyczności oraz odpowiedź terapeutyczną w różnych typach komórek.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie żywotnych, pręcikowatych kardiomiocytów z zachowaną zdolnością do wewnątrzkomórkowych oscylacji wapnia na potrzeby odczytów w testach funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane przygotowanie komórek śródbłonka oraz fibroblastów do hodowli współdzielonych lub platform przesiewowych prowadzonych równolegle.
- Wartość skalowalności: Pozwala na uzyskanie z jednego serca liczby komórek wystarczającej do zapełnienia wielu szalek 35mm oraz płytek 12-dołkowych w celu przeprowadzenia powtarzalnych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wspiera analizę zmian w sygnalizacji wapniowej istotną dla chorób w odpowiedzi na bodźce w postaci ATP oraz niedokrwienia i reperfuzji.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia bezpośrednie porównanie efektów działania leków w kardiomiocytach, komórkach śródbłonka i fibroblastach pochodzących od tego samego zwierzęcia.
- Łagodzenie ryzyka: Redukuje zmienność biologiczną poprzez zastosowanie dopasowanych pierwotnych komórek z jednego źródła w celu ograniczania ryzyka mechanistycznego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w continuum odkryć – od walidacji celu po przedkliniczne profilowanie mechanistyczne – umożliwiając równoległą analizę kluczowych typów komórek serca. Wspiera ona badania przesiewowe oparte na hipotezach, dostarczając oczyszczonych komórek do testów przepływu jonów wapnia, kurczliwości oraz angiogenezy. Przepływ pracy generuje ilościowe wyniki, takie jak procenty przeżywalności i pomiary przejściowych stężeń wapnia, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w procesie optymalizacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia wyjaśnienie szlaków w sygnalizacji hipertroficznej i włóknistej poprzez analizę wyizolowanych pierwotnych komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza komórki gotowe do analizy, o czystości i żywotności na poziomie 70-80%, do przesiewania związków w modelach chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Analityka: Umożliwia analizę oscylacji wapnia wewnątrzkomórkowego poprzez ładowanie fura AM w celu oceny odpowiedzi funkcjonalnych na bodźce, takie jak ATP i reperfuzja.
- Badania translacyjne: Wspiera funkcjonalne odczyty zgodne z biomarkerami w komórkach śródbłonka i fibroblastach po wyzwaniu niedokrwiennym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę izolacji do walidacji celów sercowo-naczyniowych w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez umożliwienie mechanistycznego ograniczania ryzyka w trzech kluczowych typach komórek serca.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie komórek, ograniczając zmienność i poprawiając powtarzalność w obrębie eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Obniża koszt pojedynczego eksperymentu oraz liczbę wykorzystywanych zwierząt, wspierając optymalizację zasobów w całym portfolio.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka dzięki zintegrowanemu profilowaniu skuteczności i bezpieczeństwa specyficznego dla poszczególnych typów komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie perfuzji Langendorffa oraz technik enzymatycznego trawienia tkanek.
- Zależne od dostępu do systemów perfuzyjnych, rozdrabniaczy tkanek i sprzętu do separacji magnetycznej.
- Wymaga standaryzacji przygotowania odczynników, w tym kolagenazy, roztworów wapnia oraz pośrodków hodowlanych specyficznych dla danego typu komórek.
- Wiąże się z koordynacją międzyzespołową w zakresie operacji, izolacji i hodowli w celu zapewnienia terminowej realizacji prac.
- Ograniczone koniecznością wykorzystania świeżej tkanki i natychmiastowego przetwarzania w celu utrzymania żywotności i wydajności komórek.
