Name: Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę syntezy nanoczujników magnetofluorescencyjnych do szybkiego wykrywania bakterii E. coli O157:H7. Technika łączy relaksację magnetyczną i fluorescencję, umożliwiając przenośne i ekonomiczne badania przesiewowe patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez K-INBRE P20GM103418, Kansas Soybean Commission (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 i PSU polymer chemistry startup fund, wszystkie do SS. Dziękujemy kamerzyście uniwersyteckiemu, panu Jacobowi Anselmiemu, za jego wyjątkową pracę nad filmem. Dziękujemy również Panu Rogerowi Heckertowi i Pani Kathie Heckert za ich hojne wsparcie dla badań.

1.Synteza i funkcjonalizacja wieloparametrycznych magnetofluorescencyjnych nanosensorów (MFnS).
<ol>
	<li>Synteza superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (IONP)
	<ol>
		<li>Aby przygotować się do syntezy IONP, przygotuj następujące 3 roztwory: roztwór 1: FeCl3 (0,70 g) i FeCl2 w H2O (2 ml), roztwór 2: NH4OH (2,0 ml, 13,4 M) w H2O (15 ml) i roztwór 3: kwas poliakrylowy (0,855 g) w H2O (5 ml).</li>
		<li>Dodać 90 μl 2 M kwasu solnego (HCl) do roztworu 1, a następnie natychmiast wymieszać z roztworem 2, wirując z prędkością 875 obr./min. Następnie dodaj rozwiązanie 3. Kontynuuj wirowanie przez 60 minut.</li>
		<li>Wirować przez 20 minut przy 1.620 x g. Odwirowywać supernatant przez 20 min przy 2.880 g.</li>
		<li>Oczyszczać końcowy supernatant za pomocą dializy. Dodać supernatant do worka dializacyjnego (MWCO 6−8 K) i umieścić go w zlewce zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (pH = 7,4) i pręt wirowy. Pozostaw do namoczenia przez 12 godzin, zastępując świeżym buforem co 2-3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Koniugacja przeciwciał specyficznych dla celu z powierzchnią IONP
	<ol>
		<li>Przygotować następujące cztery roztwory: Roztwór A: 5 mg chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) w 250 μl buforu MES [kwas 2-(N-(N-morfolino)etanosulfonowy] (0,1 M, pH = 6,8), Roztwór B: 3 mg N-hydroksysukcynimidu (NHS) w 250 μl buforu MES (0,1 M, pH = 6,8), Roztwór C: 5 μg IgG1, mAb E. coli w 225 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,4) i roztwór D: 4 ml IONP (5,0 mmol) w 1 ml PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Dodać bufor kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do roztworu A, a następnie natychmiast dodać roztwór A do roztworu D małymi porcjami w ciągu 15 s, odwracając roztwór po każdym dodaniu w celu wymieszania.</li>
		<li>Natychmiast zacznij dodawać roztwór B do roztworu D małymi krokami przez trzy minuty. Mieszaj, odwracając roztwór po każdym dodaniu.</li>
		<li>Dodawać roztwór C do roztworu w odstępach co 5 μl, odwracając roztwór po każdym dodaniu w celu wymieszania.</li>
		<li>Pozostawić reakcję do kontynuowania przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Oczyść powstałe JONP sprzężone z Ab za pomocą kolumny magnetycznej za pomocą PBS (pH = 7,4, końcowe [Fe] = 3,5 mmol) w celu usunięcia wszelkich niesprzężonych przeciwciał.
		<ol>
			<li>Umyj kolumnę magnetyczną PBS (1 ml). Przymocuj kolumnę do płyty magnetycznej i dodaj roztwór IONP.</li>
			<li>Ponownie umyć kolumnę magnetyczną PBS (1 ml). Usuń kolumnę magnetyczną z płyty magnetycznej. Dodaj PBS do kolumny i zbierz roztwór. Przechowywać w temperaturze 4 °C</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kapsułkowanie fluorescencyjnego barwnika nadchloranu 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI) w powłoce kwasu poliakrylowego (PAA) JONP sprzężonych z przeciwciałami przy użyciu metody dyfuzji rozpuszczalnikowej.
	<ol>
		<li>Do 4 ml IONPs dodać kroplami 2,0 μl barwnika DiI (2 mmol) w 100 μL DMSO z ciągłym mieszaniem przy 1100 obr./min.</li>
		<li>Otrzymany roztwór należy dializować (MWCO 6-8 KDa, 12 h) w stosunku do PBS, tworząc końcowy roztwór MFnS o końcowym stężeniu żelaza [Fe] = 2 mmol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka MFnS
	<ol>
		<li>Do analizy spektrofotometrycznej należy użyć czytnika płytek w celu wykrycia zamkniętego w kapsułkach barwnika DiI z emisją fluorescencji przy 595 nM.</li>
		<li>Dynamiczne rozpraszanie światła
		<ol>
			<li>Umieść próbkę roztworu MFnS w zetasizerze, aby określić średni rozmiar i ładunek powierzchniowy MFnS. 
			Uwaga: W tym przypadku stwierdzono, że średni rozmiar i ładunek powierzchniowy funkcjonalnych MFnS wynosi odpowiednio 77,09 nm i -22,3 mV.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla bakterii i przygotowanie roztworu podstawowego
<ol>
	<li>Hodowla bakterii
	<ol>
		<li>Uwodnić liofilizowany granulat (E. coli O157:H7) w 1 ml bulionu odżywczego, a następnie dodać dodatkowe 5 ml bulionu.</li>
		<li>Nanieść 100 μl tego roztworu na płytkę agarową i smugować smugami za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Po 24 godzinach wybierz izolowaną kolonię z płytki agarowej i dodaj ją do 15 ml bulionu hodowlanego. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin, monitorując wartość gęstości optycznej (absorbancja przy 600 nm).</li>
		<li>Po uzyskaniu wartości gęstości optycznej 0,1 należy przerwać hodowlę i wykonać seryjne rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Seryjne rozcieńczenia
	<ol>
		<li>Dodaj 900 μl bulionu odżywczego do ośmiu sterylnych probówek do mikrowirówek.</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesiny bakteryjnej do pierwszej probówki (rozcieńczenie 10-1).</li>
		<li>Pobrać 100 μl z pierwszej probówki i dodać ją do drugiej, aby uzyskać rozcieńczenie 10-2. Kontynuować ten wzór dla pozostałych probówek, kończąc końcowym rozcieńczeniem 10-8.</li>
		<li>Przenieść 100 μl z każdej probówki na oddzielne płytki agarowe i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnego dnia policz jednostki tworzące kolonie (CFU) na każdej płytce. Wybierz płytkę z ~100 CFUs. Użyj odpowiednich rozcieńczeń do dalszych eksperymentów (100 μL = ~100 CFUs). 
		Uwaga: Tutaj było to rozcieńczenie 10-6, które dało ~100 CFUs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Szybkie wykrywanie E. coli O157:H7 za pomocą MFnS
<ol>
	<li>Zwiększ różne roztwory PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) z rosnącą ilością 10-6 bakterii, co daje CFU w zakresie od 1-100. Dodać stałą ilość MFnS (100 μl) do tych roztworów.</li>
	<li>Utwórz jeden roztwór podstawowy, który zawiera tylko PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) i MFnS (100 μL).</li>
	<li>Roztwory inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przenieś poszczególne roztwory do relaksometru magnetycznego (0,47 Tesli) i zapisz zmiany czasów relaksacji (T2) względem CFU w każdym roztworze.
	<ol>
		<li>Aby zarejestrować zmiany wartości T2, należy rozpocząć od zmierzenia wartości T2 roztworu podstawowego, który zawiera tylko PBS i MFnS.
		<ol>
			<li>Umieścić roztwór w relaksometrze magnetycznym. Otwórz odpowiednie oprogramowanie, wybierz ustawienie "Relaksacja T2" i naciśnij "zmierz".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po zebraniu linii bazowej T2 zmierz wartości T2 dodatkowych roztworów, które zostały wzbogacone różnymi stężeniami bakterii. 
		Uwaga: Zmiana T2 jest równoważna wartości wyjściowej T2 odjętej od wzbogaconego T2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć próbki z relaksometru magnetycznego i odwirować probówki o stężeniu 2880 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić granulki bakteryjne w 100 μl PBS (1X, pH 7,4).</li>
	<li>Dodać 80 μl każdej reprodukcji do płytki 96-dołkowej i zarejestrować intensywność fluorescencji przy 595 nM. 
	Uwaga: Testy można powtarzać przy użyciu różnych rozpuszczalników, w tym wody z jeziora, mleka i innych, zgodnie z opisem w sekcji wyników</li>
</ol>

<ol><li>Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+methods+for+the+detection+of+foodborne+bacterial+pathogens%3A+principles%2C+applications%2C+advantages+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations.</a> Front Microbiol. 5, 770(2014).</li>
<li>Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+of+water+resources+by+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Contamination of water resources by pathogenic bacteria.</a> AMB Express. 4, 51(2014).</li>
<li>Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+rapid+detection+methods+for+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).</li>
<li>Heithoff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecies+variation+in+the+emergence+of+hyperinfectious+bacterial+strains+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002647(2012).</li>
<li>Ishii, S., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+in+the+Environment%3A+Implications+for+Water+Quality+and+Human+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health.</a> Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).</li>
<li>Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus+serovar+O3%3AK6+as+cause+of+unusually+high+incidence+of+food-borne+disease+outbreaks+in+Taiwan+from+1996+to+1999%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999.</a> J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+methods+for+the+rapid+detection+and+identification+of+four+pathogenic+Legionella+spp.+and+two+Legionella+pneumophila+subspecies+based+on+the+gene+amplification+of+gyrB%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).</li>
<li>Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+multiplex+PCR+for+simultaneous+detection+of+five+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens.</a> J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).</li>
<li>LeBlanc, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+gears+for+an+influenza+pandemic%3A+validation+of+a+duplex+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+simultaneous+detection+and+confirmatory+identification+of+pandemic+%28H1N1%29+2009+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).</li>
<li>Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+bead-based+multiplex+PCR+assay+for+combined+subtyping+and+oseltamivir+resistance+genotyping+%28H275Y%29+of+seasonal+and+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+influenza+A%2FH1N1%2F2009+antibodies+in+human+serum%3A+a+simple+virus-free+ELISA+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method.</a> PLoS One. 5 (4), e10176(2010).</li>
<li>Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+surface+plasmon-enhanced+fluorescence+spectroscopy+biosensor+for+ultrasensitive+detection+of+E.+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7.</a> Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+visual+detection+of+highly+pathogenic+Streptococcus+suis+serotype+2+isolates+by+use+of+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification.</a> J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).</li>
<li>Han, F., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+potentially+virulent+Vibrio+vulnificus+strains+in+raw+oysters+by+quantitative+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+pathogenic+bacteria+and+screening+of+phage-derived+peptides+using+microcantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers.</a> Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).</li>
<li>Banerjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Magneto-fluorescent+Nanosensors+for+the+Ultrasensitive+Detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7.</a> ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).</li>
<li>Shelby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+magnetic+relaxation+nanosensors%3A+an+unparalleled+%26%2334%3Bspin%26%2334%3B+on+influenza+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled &#34;spin&#34; on influenza diagnosis.</a> Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).</li>
<li>Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Digit+Pathogen+and+Attomolar+Detection+with+the+Naked+Eye+Using+Liposome-Amplified+Plasmonic+Immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay.</a> Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).</li>
<li>Farnleitner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+detection+of+Escherichia+coli+contamination+in+polluted+river+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water.</a> Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).</li>
<li>Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-enhanced+Raman+scattering+based+ligase+detection+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction.</a> J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).</li>
<li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+bacteria+quantification+using+immunomagnetic+separation+and+electrochemical+detection+of+guanine-labeled+secondary+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads.</a> Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).</li>
<li>Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step%2C+nanoparticle-mediated+bacterial+detection+with+magnetic+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation.</a> Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).</li>
<li>Meeker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Photothermal+and+Antibiotic+Killing+of+Biofilm-Associated+Staphylococcus+aureus+Using+Targeted+Antibiotic-Loaded+Gold+Nanoconstructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs.</a> ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtractive+inhibition+assay+for+the+detection+of+E.+coli+O157%3AH7+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+bioassay+for+single+bacterial+cell+quantitation+using+bioconjugated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).</li>
</ol>

Wykazane zastosowanie tej nanotechnologii nie zostało jeszcze zatwierdzone przez FDA.

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby w pełni funkcjonalny MFnS był tak prosty, jak to tylko możliwe. Istnieje jednak wiele kluczowych punktów, w których zmiana protokołu może być przydatna, w zależności od końcowego celu użytkownika. Na przykład zastosowanie różnych przeciwciał pozwoliłoby na celowanie w wiele innych patogenów. Ponadto protokół ten nie ogranicza się do stosowania przeciwciał jako cząsteczek docelowych. Każda cząsteczka, która ma specyficzne powinowactwo wiązania do...

Uporczywe występowanie skażenia bakteryjnego zarówno w komercyjnie produkowanych źródłach żywności, jak i wody stworzyło zapotrzebowanie na coraz szybsze i bardziej specyficzne platformy diagnostyczne. 1,2 Niektóre z najczęstszych zanieczyszczeń bakteryjnych odpowiedzialnych za zanieczyszczenie żywności i wody pochodzą z rodzajów Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus i Escherichia. 3,4 Skażenie bakteryjne tymi patogenami często powoduje objawy takie jak gorączka,, zapalenie żołądka i jelit oraz biegunka. 4 Zanieczyszczenie źródeł wody często ma drastyczne i negatywne skutki dla społeczności bez dostępu do wystarczająco przefiltrowanej wody, a zanieczyszczenie żywności doprowadziło do dużej liczby chorób i prób wycofania produktu. 5,6
Aby zmniejszyć występowanie chorób spowodowanych skażeniem bakteryjnym, podjęto szereg wysiłków w celu opracowania metod, dzięki którym woda i żywność mogą być efektywnie skanowane przed sprzedażą lub spożyciem. 3 Techniki takie jak PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP),13,14 między innymi,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 są ostatnio używane do wykrywania różnych patogenów. W porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli bakteryjnej, techniki te są znacznie bardziej skuteczne pod względem specyficzności i czasu. Jednak techniki te nadal zmagają się z wynikami fałszywie dodatnimi i ujemnymi, skomplikowanymi procedurami i kosztami. 1,3,25 Właśnie z tego powodu wieloparametryczne magnetofluorescencyjne nanoczujniki (MFnS) są proponowane jako alternatywna metoda wykrywania bakterii.
Te nanosensory unikalnie łączą ze sobą modalności relaksacji magnetycznej i fluorescencji, co pozwala na stworzenie platformy podwójnej detekcji, która jest zarówno szybka, jak i dokładna. Wykorzystując E. coli O157:H7 jako zanieczyszczenie próbki, wykazano zdolność MFnS do wykrycia zaledwie 1 jtk w ciągu kilku minut. Przeciwciała specyficzne dla patogenu są stosowane w celu zwiększenia swoistości, a połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej pozwala na wykrywanie i ilościowe określanie zanieczyszczeń bakteryjnych zarówno w zakresie niskiego, jak i wysokiego zanieczyszczenia. 16 W przypadku skażenia bakteryjnego, nanosensory będą roić się wokół bakterii ze względu na zdolność przeciwciał specyficznych dla patogenu do celowania. Wiązanie między magnetycznymi nanoczujnikami a bakteriami ogranicza interakcję między magnetycznym rdzeniem żelaza a otaczającymi go protonami wody. Powoduje to wydłużenie czasu relaksacji T2, rejestrowanego przez relaksometr magnetyczny. Wraz ze wzrostem stężenia bakterii w roztworze nanoczujniki rozpraszają się wraz ze wzrostem liczby bakterii, co skutkuje niższymi wartościami T2. I odwrotnie, emisja fluorescencji będzie rosła proporcjonalnie do stężenia bakterii, ze względu na zwiększoną liczbę nanoczujników bezpośrednio związanych z patogenem. Wirowanie próbek i izolacja osadu bakteryjnego pozwoli zachować tylko nanocząstki bezpośrednio przyczepione do bakterii, usuwając wszelkie swobodnie unoszące się nanoczujniki i bezpośrednio korelując emisję fluorescencji z liczbą bakterii obecnych w roztworze. Schematyczne przedstawienie tego mechanizmu przedstawiono na rysunku 1.
Ta platforma MFnS została zaprojektowana z myślą o badaniach przesiewowych w miejscu opieki nad pacjentem, co skutkuje tanimi i przenośnymi cechami. MFnS są stabilne w temperaturze pokojowej i są wymagane tylko w bardzo niskich stężeniach do dokładnego wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych. Ponadto po syntezie korzystanie z MFnS jest proste i nie wymaga korzystania z przeszkolonych specjalistów w tej dziedzinie. Wreszcie, ta platforma diagnostyczna pozwala na wysoce konfigurowalne targetowanie, zapewniając środki, za pomocą których ta jedna platforma może być używana do wykrywania wszelkiego rodzaju patogenów w wielu różnych ustawieniach.

<table><tbody><tr><td>Czterowodny chlorek żelaza</td><td>Fisher Scientific</td><td>I90-500</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas poliakrylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Fisher Scientific AC157270250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-E. coli O111&nbsp;</td><td>sera care</td><td>5310-0352</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-E. coli O157:H7 [P3C6]&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab75244</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td>Difco</td><td>233000</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizowany granulat E. coli O157:H7 ATCC</td><td></td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny relaksomteter&nbsp;</td>Czytnik płytek <td>Bruker</td><td>mq20</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>NANO-ZS90</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Kolumna magnetyczna <td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Wirówka QuadroMACS</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka serii Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>(accuSpin Micro 17)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem modelu podłogowego</td><td>SHEL LAB</td><td>SSI5</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Metler Toledo</td><td>ME104E</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Otwarta huśtaczka</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-765</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie e. coli o157:h7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterokrwotoczna Escherichia coli O157:H7 została powiązana zarówno z chorobami przenoszonymi przez wodę, jak i przez żywność, i pozostaje zagrożeniem, pomimo stosowanych obecnie metod badania żywności i wody. Podczas gdy konwencjonalne metody wykrywania bakterii, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i testy immunoenzymatyczne (ELISA), mogą specyficznie wykrywać zanieczyszczenia chorobotwórcze, wymagają one intensywnego przygotowania próbki i długich okresów oczekiwania. Ponadto praktyki te wymagają wyrafinowanych przyrządów i ustawień laboratoryjnych i muszą być wykonywane przez przeszkolonych specjalistów. W niniejszym dokumencie zaproponowano protokół prostszej techniki diagnostycznej, która charakteryzuje się unikalnym połączeniem parametrów magnetycznych i fluorescencyjnych w platformie opartej na nanocząstkach. Proponowane wieloparametryczne nanoczujniki magnetofluorescencyjne (MFnS) mogą wykrywać zanieczyszczenie E. coli O157:H7 przy obecności zaledwie 1 jednostki tworzącej kolonie w roztworze w czasie krótszym niż 1 godzina. Ponadto zweryfikowano zdolność MFnS do zachowania wysokiej funkcjonalności w złożonych mediach, takich jak mleko i woda z jeziora. Zastosowano również dodatkowe testy swoistości, aby zademonstrować zdolność MFnS do wykrywania tylko określonych bakterii docelowych, nawet w obecności podobnych gatunków bakterii. Połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej pozwala na wykrywanie i kwantyfikację zanieczyszczenia patogenami w szerokim zakresie stężeń, wykazując wysoką skuteczność zarówno we wczesnym, jak i późnym etapie wykrywania zanieczyszczeń. Skuteczność, przystępność cenowa i przenośność MFnS sprawiają, że są one idealnym kandydatem do badań przesiewowych pod kątem zanieczyszczeń bakteryjnych w miejscu opieki nad pacjentem w szerokim zakresie zastosowań, od zbiorników wodnych po żywność pakowaną komercyjnie.

Mechanizm działania MFnS przedstawiono na Rysunku 1. Agregacja MFnS wokół powierzchni zanieczyszczeń bakteryjnych zakłóca oddziaływania między rdzeniami magnetycznymi MFnS a otaczającymi je jądrami wodoru. W wyniku tej agregacji wartości relaksacji magnetycznej wzrastają. Wraz ze wzrostem stężenia zanieczyszczeń bakteryjnych stopień agregacji maleje, a zmiana wartości T2 ulega zmniejszeniu. Dlatego kluczowe jest wprowadzenie modalności fluorescencyjnej. Wraz ze wzrostem stężenia bakterii nas...

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Głównym celem niniejszego protokołu jest zaprojektowanie i synteza dwumodalnych nanoczujników zdolnych do wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych, takich jak E.coli O157:H7. Magnetyczno-fluorescencyjne nanoczujniki syntetyzuje się poprzez funkcjonalizację nanocząsteczek tlenku żelaza w procedurze dwuetapowej. W pierwszym kroku przeciwciała celujące są sprzęgane z powierzchnią nanocząsteczki.Następnie barwnik fluorescencyjny jest wprowadzany do jego kodowania. Połączenie tych modalności umożliwia szybką i czułą detekcję zanieczyszczeń bakteryjnych zarówno w roztworach o niskim, jak i wysokim stężeniu. W obecności niewielkiej ilości bakterii nanosensory będą gromadzić się wokół nich dzięki celowaniu skoniugowanych przeciwciał.To skupianie zmienia oddziaływania magnetycznego rdzenia nanoczujników z otaczającymi protonami wody, co umożliwia czułe wykrywanie zmian wartości relaksacji magnetycznej. Wraz ze wzrostem stężenia zanieczyszczeń bakteryjnych w roztworach, zjawisko skupiania maleje, a zdolność metody magnetycznej do ilościowego określenia stopnia zanieczyszczenia ulega zmniejszeniu. Jednakże, wraz ze wzrostem stężenia bakterii, wzrasta również emisja fluorescencyjna bionanoczujników.Z tego powodu istotne jest połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej. Kombinacja ta umożliwiła wykrycie zaledwie jednej jednostki tworzącej kolonię E.coli O157:H7 w ciągu kilku minut. Pierwszym krokiem w syntezie nanoczujników magnetofluorescencyjnych jest przygotowanie roztworu soli żelaza składającego się z chlorku dwuwartościowego i trójwartościowego żelaza.Żelazo zapewni nanoczujnikom rdzeń magnetyczny, który umożliwi ich dostosowanie do platform relaksacji magnetycznej. Dodatkowo wymagane są roztwory kwasu poliakrylowego oraz wodorotlenku amonu. Do roztworu soli żelaza wprowadza się kwas solny, a następnie dodaje go do roztworu wodorotlenku amonu podczas mieszania w wirówce typu vortex.Na koniec dodaje się roztwór kwasu poliakrylowego, a otrzymaną mieszaninę poddaje się mieszaniu w wirówce vortex przez kolejną godzinę, podczas gdy reakcja trwa nadal. Powstały roztwór wiruje się w celu wytrącenia większych cząsteczek i wyizolowania nanocząstek o rozmiarze mniejszym niż 100 nanometrów. Następnie roztwór poddaje się dializie przez noc w celu oczyszczenia.Kolejnym krokiem jest koniugacja przeciwciał celujących do powłoki z kwasu poliakrylowego nowo zsyntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza. Wymagane materiały obejmują bufor MES, EDC, NHS oraz wybrane przeciwciała. W pierwszej kolejności do roztworu nanocząstek dodaje się EDC, następnie NHS, a na koniec przeciwciało.Następnie mieszaninę umieszcza się na mieszalniku laboratoryjnym na trzy godziny, aby reakcja mogła być kontynuowana. Roztwór oczyszcza się przy użyciu kolumny magnetycznej. Kolumna magnetyczna wychwytuje nanocząsteczki, umożliwiając wypłukanie jedynie wolnych przeciwciał.Następnie kolumnę przemywa się buforem PBS i zbiera sprzężone nanoczujniki. Nanocząstki są wówczas gotowe do dodania barwnika fluorescencyjnego, który zapewnia drugą kluczową modalność wykorzystywaną w detekcji. Jedną z najważniejszych cech naszego nanoczujnika jest połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej, co jest istotne z wielu powodów.Po pierwsze, połączenie tych modalności pozwala na wzajemną weryfikację wyników, co znacznie zmniejsza ryzyko wystąpienia wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych, co stanowi jedną z największych przeszkód w przypadku różnych platform diagnostycznych stosowanych obecnie. Po drugie, połączenie modalności znacznie rozszerza zakres, w którym możemy nie tylko wykrywać, ale także kwantyfikować zanieczyszczenie bakteryjne. Ostatnim etapem przygotowania nanoczujników jest enkapsulacja barwnika fluorescencyjnego w powłoce nanocząsteczki.Osiąga się to po prostu poprzez dodanie barwnika do roztworu podczas mieszania w wortexie, a następnie pozostawienie go na pewien czas, aby barwnik mógł dyfundować do powłoki nanoczujnika. W pełni funkcjonalizowane nanoczujniki poddaje się następnie ostatniej dializie w celu oczyszczenia. W celu charakterystyki nanoczujników, za pomocą zetasizera oraz płytkowego czytnika fluorescencji rejestruje się ich rozmiar oraz emisję fluorescencji.Niewielką próbkę nanoczujnika dodaje się do roztworu wodnego w kuwecie, a następnie umieszcza w zetasizerze w celu pomiaru wielkości. Do analizy fluorescencji próbkę nanoczujnika nanosi się na płytkę 96-dołkową i umieszcza w czytniku płytek fluorescencyjnych. Idealnie nanoczujniki powinny mieć średnicę około 70 nm oraz emisję fluorescencji na poziomie 575 nm.Oprócz syntezy nanoczujników, konieczne jest hodowanie bakterii w celu zapewnienia bakteryjnych celów w laboratorium. Do przygotowania hodowli w bulionie odżywczym wykorzystuje się stok glicerynowy bakterii. Następnie roztwór ten poddaje się inkubacji.Po początkowym okresie inkubacji wykonuje się rozcieńczenia seryjne, aby uzyskać szeroki zakres stężeń bakterii. Sto mikrolitrów każdego stężenia wysiewa się na płytkę z pożywką Nutrient Agar, a następnie inkubuje przez 24 godziny. Po inkubacji zlicza się kolonie na każdej płytce w celu określenia liczby jednostek tworzących kolonie, czyli wartości CFU na ml każdego rozcieńczonego roztworu.Po przygotowaniu roztworów zapasowych bakterii można je wykorzystać wraz z przygotowanymi nanoczujnikami. Ważnym aspektem tego konkretnego serotypu bakterii, który odróżnia go od innych serotypów, jest fakt, że w przypadku zakażenia innymi serotypami wymagana jest duża liczba jednostek tworzących kolonie, aby doszło do infekcji. Jednak w przypadku tego konkretnego szczepu E.coli wystarczy od 10 do 100 CFU lub jednostek tworzących kolonie, aby wywołać zakażenie.Nasza technologia została opracowana w taki sposób, aby nie pominąć nawet pojedynczej kolonii w przypadku wystąpienia kontaminacji bakteryjnej. W celu przygotowania roztworów do odczytu w relaksometrze magnetycznym, najpierw do probówki Eppendorf pipetuje się 300 µL PBS. Następnie dodaje się próbkę zawiesiny bakterii, a po niej nanoczujniki.Następnie roztwór przenosi się do szklanej probówki i zakrywa kawałkiem parafilmu, aby zapobiec parowaniu. Szklaną probówkę umieszcza się w większej probówce NMR, a następnie wprowadza do magnetycznego relaksometru. W celu uzyskania odczytu bazowego T2, zgodnie z przedstawionym schematem, stosuje się roztwór bazowy niezawierający bakterii, a jedynie nanoczujnik i PBS.Następnie roztwory zawierające różne stężenia bakterii są wprowadzane do magnetycznego relaksometru w celu przeprowadzenia analizy, a zmiany wartości T2 są wywołane wiązaniem nanosensorów z bakteriami. Jak pokazano, za pomocą tej metody w ciągu kilku minut można wykryć obecność nawet jednej jednostki tworzącej kolonię (CFU) bakterii. Jednakże, wraz ze wzrostem stężenia bakterii, odczyty MR stają się trudniejsze do skwantyfikowania, dlatego wykorzystanie danych o emisji fluorescencji jest równie istotne dla dokładnego oznaczenia ilości bakterii.Przed rozpoczęciem zbierania danych fluorescencyjnych próbkę należy najpierw odwirować. Roztwór przenosi się z probówki szklanej do probówki typu Eppendorf, a następnie poddaje wirowaniu. Pozwala to na oddzielenie bakterii wraz z przyłączonymi do nich nanoczujnikami od wolnych nanoczujników znajdujących się w roztworze.Następnik zostaje odrzucony, a osad bakteryjny resuspensowany w PBS. Na koniec próbkę można poddać analizie za pomocą emisji fluorescencji. Intensywność emisji będzie proporcjonalna do ilości nanoczujników pozostałych w roztworze, a tym samym do ilości obecnych bakterii.Jak widać, emisja fluorescencyjna nasila się wraz ze wzrostem stężenia bakterii, a metoda staje się również bardziej czuła. Dlatego połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej pozwala na detekcję i kwantyfikację zanieczyszczenia bakteryjnego zarówno we wczesnych, jak i późnych stadiach rozwoju. Oprócz wykrywania bakterii w prostych roztworach, takich jak PBS, nanoczujniki te posiadają również zdolność do funkcjonowania w bardziej złożonych mediach, takich jak woda jeziorna lub mleko.Ponadto nanoczujniki te przetestowano pod kątem swoistości w obecności bakterii nietarczowych oraz bakterii tarczowych inaktywowanych termicznie. Jak pokazano, nanoczujniki magnetofluorescencyjne wykazują znikomą lub żadną reakcję z bakteriami nietarczowymi lub nieżyjącymi ze względu na swoistość skoniugowanych przeciwciał. Świadczy to o ich skuteczności w detekcji konkretnych bakterii w obecności innych gatunków.Na koniec warto również zauważyć, że nanoczujniki te można łatwo dostosować do wykrywania innych patogenów. Nanoczujniki, takie jak te przygotowane w naszym laboratorium, można zsyntetyzować lub sformułować w ciągu jednego miesiąca. Praca w ciągu tego miesiąca pozwala uzyskać produkt, który może być wykorzystywany przez około 10 lat.

foodborne-pathogen-screening-using-magneto-fluorescent-nanosensor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony.  Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.

Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej

Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Poznaj metodę syntezy nanoczujników magnetofluorescencyjnych do szybkiego wykrywania bakterii E. coli O157:H7. Technika łączy relaksację magnetyczną i fluorescencję, umożliwiając przenośne i ekonomiczne badania przesiewowe patogenów.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7 (Wideo) | JoVE Journal

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Przeglądaj więcej filmów