Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Głównym celem tego protokołu jest zaprojektowanie i zsyntetyzowanie dwumodalnych nanoczujników zdolnych do wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych, takich jak E. coli O157:H7. Nanoczujniki magnetofluorescencyjne są syntetyzowane przez funkcjonalizację nanocząstek tlenku żelaza w dwuetapowej procedurze. Po pierwsze, przeciwciała celujące są sprzężone z powierzchnią nanocząstki.

Następnie barwnik fluorescencyjny jest ładowany do jego kodowania. Połączenie tych modalności pozwala na szybkie i czułe wykrywanie zanieczyszczeń bakteryjnych zarówno w roztworach o niskim, jak i wysokim stężeniu. W obecności niewielkiej ilości bakterii nanoczujniki będą roić się wokół bakterii ze względu na celowanie w sprzężone przeciwciała.

Rój ten zmienia oddziaływania jądra magnetycznego nanosensorów z otaczającymi je protonami wodnymi, co pozwala na czułe wykrywanie zmian wartości relaksacji magnetycznej. Wraz ze wzrostem stężenia zanieczyszczeń bakteryjnych w roztworach zmniejsza się rój, a zdolność modalności magnetycznej do ilościowego określania zanieczyszczenia jest zmniejszona. Jednak wraz ze wzrostem stężenia bakterii rośnie również fluorescencyjne przesyłanie bionanoczujników.

Z tego powodu ważne jest połączenie modalności magnetycznych i fluorescencyjnych. Kombinacja ta pozwoliła na wykrycie zaledwie jednej jednostki tworzącej kolonię E.coli O157:H7 w ciągu kilku minut. Pierwszym krokiem w systezie nanoczujników magnetofluorescencyjnych jest przygotowanie roztworu soli żelaza składającego się zarówno z chlorku żelaza, jak i chlorku żelaza.

Żelazko wyposaży nanosensory w rdzeń magnetyczny, co pozwoli na jego adaptację do magnetycznych platform relaksacyjnych. Dodatkowe potrzebne roztwory to kwas poliakrylowy i wodorotlenek amonu. Kwas solny jest wprowadzany do roztworu soli żelaza, który jest następnie dodawany do roztworu wodorotlenku amonu podczas wirowania.

Na koniec dodaje się roztwór kwasu poliakrylowego, a powstałą mieszaninę wiruje się przez dodatkową godzinę, podczas gdy reakcja trwa. Otrzymany roztwór jest odwirowywany w celu wytrącenia większych cząsteczek i wyizolowania nanocząstek o wielkości mniejszej niż 100 nanometrów. Roztwór jest następnie dializowany przez noc w celu oczyszczenia.

Kolejnym krokiem jest koniugacja przeciwciał ukierunkowanych na kodowanie kwasu poliakrylowego nowo zsyntetyzowanych nanocząstek kwasu żelazowego. Potrzebne materiały to bufor MES, EDC, NHS i wybrane przeciwciała. Najpierw do roztworu nanocząstek dodaje się EDC, następnie NHS, a na końcu przeciwciało.

Mieszaninę umieszcza się następnie na mikserze stołowym na trzy godziny, podczas gdy reakcja jest kontynuowana. Roztwór oczyszcza się za pomocą kolumny magnetycznej. Namagnesowana kolumna wychwytuje nanocząstki, umożliwiając wydostanie się tylko swobodnie unoszącym się przeciwciałom.

Następnie kolumnę przemuje się buforem PBS i zbiera sprzężone nanosensory. Nanocząstki są następnie gotowe do dodania barwnika fluorescencyjnego, zapewniając drugą kluczową modalność wykorzystywaną do wykrywania. Jedną z najważniejszych cech naszego nanosensora jest połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej, co jest ważne z wielu powodów.

Po pierwsze, połączenie tych metod pozwala każdej z nich na wzajemne sprawdzanie drugiej, co znacznie zmniejsza ryzyko wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych, co jest jedną z największych przeszkód, z jakimi borykają się obecnie różne platformy diagnostyczne. Po drugie, połączenie tych metod znacznie poszerza zakres, w którym możemy nie tylko wykryć, ale także określić ilościowo skażenie bakteryjne. Ostatnim etapem przygotowania nanosensorów jest enkapsulacja barwnika fluorescencyjnego w kodowaniu nanocząstki.

Osiąga się to po prostu poprzez dodanie barwnika do roztworu podczas wirowania, a następnie pozostawienie dalszego czasu na dyfuzję barwnika do kodowania nanoczujnika. W pełni funkcjonalne nanoczujniki są następnie dializowane po raz ostatni w celu oczyszczenia. W celu scharakteryzowania nanoczujników, rozmiar i przesyłanie fluorescencji są rejestrowane za pomocą zetasizera i czytnika płytek fluorescencyjnych.

Niewielką próbkę nanoczujnika dodaje się do roztworu wodnego kuwety i umieszcza w zetasizerze w celu zarejestrowania wielkości. Do analizy fluorescencyjnej próbkę nanosensora umieszcza się na 96-dołkowej płytce i wkłada do czytnika płytek fluorescencyjnych. Idealnie byłoby, gdyby nanoczujniki miały średnicę około 70 nanometrów i fluorescencyjną przesłaność 575 nanometrów.

Oprócz syntezy nanoczujników, hodowla bakterii jest niezbędna do zapewnienia celów bakteryjnych w laboratorium. Zapas bakterii glicerolu służy do przygotowania kultury w bulionie odżywczym. Roztwór ten następnie pozostawia się do inkubacji.

Po początkowym okresie inkubacji przeprowadza się seryjne rozcieńczenia w celu uzyskania szerokiego zakresu stężeń bakterii. Sto mikrolitrów każdego stężenia umieszcza się na płytce ślimakowej z pożywką, a następnie inkubuje przez 24 godziny. Po tej inkubacji kolonie na każdej płytce są liczone w celu określenia jednostki tworzącej kolonię lub liczby CFU na promil każdego rozcieńczonego stada.

Teraz, gdy bakteryjne roztwory podstawowe zostały przygotowane, można je stosować w połączeniu z przygotowanymi nanoczujnikami. Jednym z ważnych aspektów tego konkretnego serotypu bakterii, który odróżnia go od innych serotypów, jest to, że załóżmy, że jeśli zostaniesz zarażony innymi serotypami, musisz mieć wiele jednostek tworzących kolonie, aby dostać infekcję. Ale w tym konkretnym przypadku E.coli od 10 do 100 CFU lub jednostek tworzących kolonie jest wystarczająco dobrych, aby wywołać infekcję.

Nasza technologia jest opracowana w taki sposób, że nie przegapisz ani jednego zakażenia bakteryjnego kolonii. W celu przygotowania roztworów do odczytu w relaksometrze magnetycznym, najpierw pipetuje się 300 mikrolitrów PBS do probówki Eppendorfa. Następnie dodaje się próbkę materiału bakteryjnego, a następnie dodaje się nanoczujniki.

Roztwór jest następnie przenoszony do szklanej probówki, a na wierzchu umieszcza się kawałek parafilmu, aby zapobiec parowaniu. Szklaną rurkę umieszcza się następnie w większej probówce NMR i wkłada do relaksometru magnetycznego. Roztwór podstawowy niezawierający bakterii, a jedynie nanoczujnik i PBS, służy do uzyskania podstawowego odczytu T2, jak pokazano.

Następnie roztwory zawierające różne stężenia bakterii są wprowadzane do relaksometru magnetycznego w celu analizy, a zmiany wartości T2 są spowodowane wiązaniem między nanoczujnikami a bakteriami. Jak pokazano, obecność zaledwie jednej bakteryjnej jtkośności można wykryć w ciągu kilku minut przy użyciu tej metody. Jednak wraz ze wzrostem stężenia bakterii odczyty MR są mniej mierzalne, dlatego wykorzystanie danych z submisji fluorescencyjnej jest również równoznaczne z dokładnym określeniem ilościowym bakterii.

Przed zebraniem danych fluorescencyjnych próbka musi najpierw zostać odwirowana. Roztwór przenosi się ze szklanej probówki do probówki Eppendorfa, a następnie odwirowuje. To oddziela bakterie i związane z nimi nanoczujniki od swobodnie unoszących się nanoczujników w roztworze.

Supernatent jest odrzucany, a osad bakteryjny jest ponownie zawieszany w PBS. Na koniec próbka może być analizowana za pomocą fluorescencyjnego przesyłania. Siła emisji będzie zależała od ilości nanoczujników pozostających w roztworze, a zatem także od ilości obecnych bakterii.

Jak widać, poddanie fluorescencyjne wzmacnia się wraz ze wzrostem stężenia bakterii, a także staje się ona bardziej wrażliwa. Z tego powodu połączenie modalności magnetycznej i fluorescencyjnej pozwala na wykrycie i ilościowe określenie zanieczyszczenia bakteryjnego zarówno we wczesnych, jak i późnych stadiach rozwojowych. Oprócz wykrywania bakterii w prostych rozwiązaniach, takich jak PBS, te nanoczujniki mają również zdolność do działania w bardziej złożonych mediach, takich jak woda w jeziorze lub mleko.

Co więcej, te nanoczujniki zostały przetestowane pod kątem swoistości w obecności bakterii niebędących przedmiotem zwalczania oraz bakterii docelowych inaktywowanych termicznie. Jak pokazano, nanoczujniki magnetofluorescencyjne mają niewielką lub żadną reakcję z nieukierunkowanymi lub nieożywionymi bakteriami ze względu na specyficzność sprzężonych przeciwciał. Świadczy to o ich skuteczności w wykrywaniu określonych bakterii w obecności innych gatunków.

Na koniec należy również zauważyć, że te nanoczujniki można łatwo dostosować do wykrywania innych patogenów. Możesz zsyntetyzować lub sformułować te nanoczujniki, które przeprowadziliśmy w naszym laboratorium w ciągu jednego miesiąca. Możesz to zrobić w ciągu jednego miesiąca, a ten jeden miesiąc produktu może dać ci około 10 lat stosowania.