Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania salmonelli na świeżych produktach

Ogólnym celem tej procedury jest połączenie pobierania próbek świeżych produktów za pomocą taśmy klejącej z wykrywaniem molekularnym całych komórek gatunków salmonelli za pomocą szybkiej fluorescencji w hybrydyzacji C d, znanych również jako ryby. Osiąga się to poprzez uprzednie nałożenie taśmy klejącej na żądany materiał i ekstrakcję komórek związanych powierzchnią. Taśmy ładunku ogniw mogą być analizowane bezpośrednio lub poddawane wzbogacaniu w fazę stałą lub ciekłą.

Drugim etapem procedury jest taśma, samoutrwalenie i odwodnienie w serii etanolowej dla komórek nawiązanych do bulionu lub wzbogaconych w nim. Drugi etap polega na utrwaleniu komórek w zawiesinie, a następnie zawieszeniu komórek w buforze magazynowym za pomocą rezu. Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie szybkiego etapu hybrydyzacji na taśmie przy użyciu koktajlu sondy oligonukleotydowej specyficznego dla salmonelli, a następnie usunięcie nadmiaru sondy za pomocą płukania buforem płuczącym dla próbek analizowanych za pomocą faksu, etap rybny przeprowadza się w zawiesinie, a nadmiar sondy można usunąć za pomocą prostego etapu rozcieńczania przed analizą.

Ostatnim krokiem procedury jest przeciwbarwienie zhybrydyzowanych komórek związanych taśmą za pomocą DPI i zbadanie ich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W przypadku analiz opartych na faktach nie jest potrzebna plama przeciwna. Ostatecznie metoda ta zapewnia środki do wizualnego lub cytometrycznego wykrywania gatunków salmonelli, które mogą być obecne w próbkach świeżych produktów.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy czytałem o włoskiej grupie, która stosowała podobne podejście do badania społeczności bakteryjnych na rzymskich reliktach z kamienia lotniczego. Ale r i ja prowadziliśmy dyskusję na temat tej pracy na zajęciach, które prowadziłem na temat szybkich metod w mikrobiologii żywności. Kilka tygodni później wybuchła epidemia salmonelli, która przeniosła się na świeże produkty, ostatecznie powodując zachorowanie prawie 1500 osób w 43 różnych stanach.

Chociaż nasze eksperymentalne podejście oferuje szybką i praktyczną drogę wykrywania określonych typów bakterii na świeżych produktach, jest ono również wystarczająco przenośne, aby umożliwić testowanie w terenie lub w środowisku produkcji żywności. Zacznij od wybrania taśmy, która ma być używana do próbkowania. Niektóre opcje obejmują dostępną na rynku taśmę grzybową lub kontakt, które są sterylne, a także zapakowane w celu ułatwienia użycia.

Za pomocą markera permanentnego narysuj centymetrowe kwadraty po zdrowej stronie 10-centymetrowego kawałka taśmy klejącej, używając sterylnego aluminiowego szablonu. Będzie to służyć jako wizualny przewodnik do odnotowania, która część taśmy została użyta do pobrania próbki żywności lub powierzchni środowiskowej z pętli taśmy w kształcie CS z lepką stroną skierowaną w stronę powierzchni, z którą ma być pobrane próbka. Aby to zrobić, przytrzymaj lepkie końce kciukiem i środkowym palcem i przyłóż palec wskazujący do narysowanego kwadratu z tyłu taśmy.

Umieść taśmę na powierzchni, z której chcesz pobrać próbkę i delikatnie dociśnij zaznaczony obszar do powierzchni, nie zwalniając krawędzi taśmy. Użyj palca wskazującego, aby upewnić się, że lepka strona taśmy w pełni styka się z powierzchnią próbki. Unikanie pęcherzyków powietrza przy użyciu równomiernego ruchu.

Powoli odciągnij taśmę od próbki. Fizyczna ekstrakcja drobnoustrojów związanych z powierzchnią mocuje ładunek komórki. Przyklej lepką stroną do góry na szklanym szkiełku mikroskopowym Używając zwykłej przezroczystej taśmy biurowej, upewnij się, że taśma jest odpowiednio napięta i rozciągnięta, aby powstała płaska, niepomarszczona powierzchnia.

Pomoże to zminimalizować problemy z deformacją lub zwijaniem się taśmy. Podczas późniejszego ogrzewania. Podczas hybrydyzacji umieść taśmę zadrukowaną do dołu na płytkach xylozy do krojenia tertylu czwartego lub XLT czterech agro, tak aby próbkowane komórki miały bezpośredni kontakt z powierzchnią agri, aby ułatwić usunięcie taśmy z powierzchni agri.

Po wzbogaceniu, szablonowa część taśmy stykająca się z próbką jest umieszczana równo z powierzchnią agri, a jeden koniec taśmy jest luźno przylegany. Ścianki boczne płytek szalki Petriego są odwrócone, aby uniknąć kondensacji i inkubowane w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Aby umożliwić wystarczający wzrost gatunków salmonelli, długość okresu inkubacji potrzebna do wzbogacenia komórek do wykrywalnego poziomu będzie zależała od początkowych poziomów zanieczyszczenia salmonellą.

Po pożądanym okresie wzbogacania otwórz płytkę agarową, taśma zachowa swoją lepkość podczas inkubacji. Delikatnie dociśnij taśmę do agaru za pomocą palca wskazującego, aby zapewnić maksymalny odzysk powstałych mikrokolonii Na styku agaru z taśmą chwyć taśmę od krawędzi przymocowanej do ścianki szalki Petriego i usuń ją powolnym, równomiernym ruchem. Używając ogólnej przezroczystej taśmy biurowej, zamontuj taśmę ładującą ogniwo lepką stroną do góry na szkiełku mikroskopowym, aby uzyskać płaską, niepomarszczoną powierzchnię.

Utrwalanie na komorze taśmowej należy wykonywać przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, pokrywając obszar kontaktu próbki 500 mikrolitrami 10% neutralnej buforowanej forminy. Wyrzuć utrwalacz do zamykanego pojemnika pod kapturem chemicznym, aby zminimalizować narażenie na drażniące lub toksyczne opary, umyj taśmę raz na jeden x sól fizjologiczna buforowana fosforanem lub PBS, delikatnie zalewając powierzchnię taśmy PBS, odwodnić próbkę. Korzystając z progresywnej serii etanolu, przygotuj do hybrydyzacji i mycia przed hybrydyzacją, używając komercyjnego filtra roztworów biologii molekularnej za pomocą strzykawki o średnicy 22 mikrometrów i podgrzej hybrydyzacyjne i myjące do 55 stopni Celsjusza.

Dodać znakowane fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowe do wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego w celu uzyskania końcowego stężenia sondy wynoszącego pięć nanogramów na mikrolitr, nałożyć szablonowy obszar kontaktu próbki taśmy z 300 mikrolitrami buforu hybrydyzacyjnego zawierającego koktajl sondy i zhybrydyzowane komórki związane taśmą w wilgotnej, szczelnie zamkniętej komorze inkubacyjnej ustawionej na 55 stopni Celsjusza dla inkubatora z bezpośrednim kontaktem, takie jak instrument w trybie suwakowym hybrydyzowany przez 15 minut. Po hybrydyzacji szkiełka są usuwane, a sonda zawierająca nakładkę buforu hybrydyzacji jest odrzucana. Krótko i delikatnie spłukać podgrzanym buforem myjącym, pipetując.

Niewielka objętość buforu na pochylonym szkiełku umożliwia wyschnięcie szkiełek na powietrzu w celu wykrycia gatunków salmonelli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na szkiełku nałóż około 10 mikrolitrów tarczy wektorowej H 1200, pożywki montażowej zawierającej dpi, jądrową plamę przeciwplamistą inkubować w ciemności przez 10 minut. Umieść olejek immersyjny na pokrywie, wsuń i zbadaj próbki za pomocą obiektywu olejowego o dużym powiększeniu.

Filtr DPI służy do ustawiania ostrości próbki. Mikroskop jest następnie przełączany na odpowiedni filtr, a komórki salmonelli są oceniane wizualnie zgodnie z ich zieloną lub czerwoną fluorescencją, w zależności od tego, jaki barwnik jest używany do oznaczania sond. Detekcja przednia Przenieś zawieszone próbki PBS do pięciomililitrowych probówek do pobierania próbek z okrągłym dnem i zbadaj za pomocą cytometru przepływowego ze wzbudzeniem przy 647 nanometrach.

Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Pobieranie próbek terica serowar Ty Murium z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora za pomocą taśmy klejącej ułatwia bezpośrednią analizę po rybach za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej. Taśmy przetworzono pod kątem szybkiej fluorescencji w hybrydyzacji C 2 przy użyciu kombinacji sond DNA specyficznych dla salmonelli i znakowano Texas Red, w zależności od początkowego lokalnego stężenia komórek salmonelli na taśmie.

Wzbogacanie w fazę stałą przyniosło wyniki od izolowanych mikrokolonii do zlewającego się wzrostu. Próbki pobrane z taśmy można było analizować za pomocą połączonej cytometrii ryb i cytometrii przepływowej, bezpośrednio po pobraniu próbki lub po pięciogodzinnej powierzchni cieczy. Mini wzbogacanie kultur w temperaturze 35 stopni Celsjusza.

Chociaż opisaliśmy zastosowanie techniki tape fish dla bezpieczeństwa żywności, metoda ta ma również duży potencjał do zastosowania w innych dyscyplinach, w tym w mikrobiologii środowiskowej, patologii roślin czy mikrobiologii klinicznej. Równolegle z tą procedurą można przeprowadzać dodatkowe eksperymenty, takie jak testy biochemiczne lub PCR, na wzbogacaniu fazy stałej lub ciekłej z próbek ekstrahowanych taśmą. Testy mogą być wykorzystywane do udzielania odpowiedzi na pytania dotyczące salmonelli, która może być obecna, pytania, które wykraczają poza zakres procedury rybnej.