Name: Nowe metody badania kodowania smakowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metody badania kodowania smakowego u ćmy Manduca sexta przy użyciu in vivo rejestracji neuronów receptorowych i precyzyjnego dostarczania bodźców smakowych. Techniki te umożliwiają szczegółowe zrozumienie przetwarzania informacji smakowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z NIH-NICHD dla M.S. Dziękujemy G. Doldowi i T. Talbotowi z NIH-NIMH Instrumentation Core Facility za pomoc w zaprojektowaniu systemu dostarczania degustacji.

<ol><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gustotopic+Map+of+Taste+Qualities+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain.</a> Science. 333 (6047), (2011).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Sense+about+Taste%3A+From+Mammals+to+Insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common Sense about Taste: From Mammals to Insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li>
<li>Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+coding+logic+for+bitter+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and coding logic for bitter taste.</a> Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).</li>
<li>Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+for+mammalian+sweet+and+umami+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The receptors for mammalian sweet and umami taste.</a> Cell. 115 (3), 255-266 (2003).</li>
<li>Huang, A. L., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+logic+for+mammalian+sour+taste+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and logic for mammalian sour taste detection.</a> Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).</li>
<li>Pfaffmann, C., Carl, <a target="_blank" href="http://psycnet.apa.org/journals/amp/14/5/226/">The afferent code for sensory quality.</a> Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).</li>
<li>Lemon, C. H., Katz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1995451/">The neural processing of taste.</a> BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Coding+of+Individual+Chemicals+by+the+Gustatory+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System.</a> J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).</li>
<li>Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+Taste+Stimuli+Induce+Differential+Neural+Codes+in+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain.</a> PLoS ONE. 7 (7), e41597(2012).</li>
<li>Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+different+taste+cells+and+signaling+pathways+to+the+discrimination+of+%22bitter%22+taste+stimuli+by+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).</li>
<li>Kay, L. M., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+olfactory+systems+of+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(14)00153-6">Peripheral Coding of Taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+in+the+Mammalian+Gustatory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coding in the Mammalian Gustatory System.</a> Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).</li>
<li>Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+chemosensory+system+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+rewiew%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew.</a> Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).</li>
<li>Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+structures+involved+in+insect+gustation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central structures involved in insect gustation.</a> Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).</li>
<li>Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1051500206/abstract">Labellar taste organs of Drosophila melanogaster.</a> J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).</li>
<li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J Vis Exp. (84), e51355(2014).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila).</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>Descoins, C., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+responses+of+gustatory+sensilla+of+Mamestra+brassicae+%28Lepidoptera%2C+Noctuidae%29+larvae+to+three+ecdysteroids%3A+ecdysone%2C+20-hydroxyecdysone+and+ponasterone%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone.</a> A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).</li>
<li>Popescu, A., Couton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+central+projections+of+gustatory+receptor+neurons+on+the+antenna+of+the+noctuid+moth+Spodoptera+littoralis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis.</a> J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).</li>
<li>Morita, H., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generator+potential+of+insect+chemoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generator potential of insect chemoreceptor.</a> Science. 130 (3380), 922(1959).</li>
<li>Davis, N. T., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomy+of+the+sucking+pump+of+the+moth%2C+Manduca+sexta+%28Sphingidae%2C+Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera).</a> Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).</li>
<li>Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00298032">The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly.</a> Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).</li>
<li>Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).</li>
<li>Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-specific%2C+sex+pheromone-selective+projection+neurons+in+the+antennal+lobes+of+the+moth+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta.</a> J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).</li>
<li>Reiter, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReiter%2C+S+%22Gustatory+Information+Processing%22">Gustatory Information Processing</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true">https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true</a> (2014).</li>
<li>Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+Recording+Methods+to+Characterize+Neural+Activity+in+the+Locust+%28Schistocerca+Americana%29+Olfactory+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+noise+signature+to+optimize+spike-sorting+and+to+assess+neuronal+classification+quality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality.</a> J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).</li>
<li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Metrics+to+Accompany+Spike+Sorting+of+Extracellular+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals.</a> J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li>
<li>Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+sorting+of+multiple+unit+neuronal+signals+in+the+presence+of+anisotropic+and+non-Gaussian+variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability.</a> J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).</li>
<li>Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+memoir%3A+from+maps+to+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body memoir: from maps to models.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).</li>
<li>Naraghi, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+oscillations+in+the+mushroom+bodies+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust.</a> J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).</li>
<li>Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+representations+of+odors+in+an+olfactory+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal representations of odors in an olfactory network.</a> J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).</li>
<li>Perez-Orive, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+sparsening+of+odor+representations+in+the+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body.</a> Science. 297, 359-365 (2002).</li>
<li>Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(03)00535-X">Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system.</a> Neuron. 39, 991-1004 (2003).</li>
<li>Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+network+dynamics+and+the+coding+of+multidimensional+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Re+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals.</a> Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tu metody pozwalają na nagrania in vivo ze stosunkowo prostego zwierzęcia, Manduca sexta, w celu scharakteryzowania aktywności wielu, losowo wybranych GRN przez długi czas (przez ponad 2 godziny), przed, w trakcie i po podaniu degustacyjnym. Metody te pozwalają również na szybkie, sekwencyjne dostarczanie wielu bodźców degustacyjnych z precyzyjną kontrolą czasową, co jest przydatne do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw reprezentacji degustacji. Protokół ten został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób odpowiedzi GRN na degustatory są przekształcane, gdy są one przesyłane do ich postsynaptycznych neuronów docelowych (np. w SSE) poprzez monitorowanie GRN jednocześnie z monosynaptycznie połączonymi interneuronami 10. Dodatkowo, metody te mogą być dostosowane do potrzeb eksperymentatora, co pozwala na realizację złożonych paradygmatów w celu zbadania podstawowych aspektów kodowania smakowego.
Na początku naszych badań jednym z problemów technicznych, z którymi czasami musieliśmy się rozwiązywać, była niemożność wykrycia sygnałów impulsowych z nerwu szczękowego za pomocą drutów tetrodowych. Możliwe przyczyny tego są różne, ponieważ protokół sekcji jest trudny i konieczna jest pewna praktyka, aby uzyskać dobre przygotowanie. Po pierwsze, podczas sekcji nerwy szczękowe są łatwe do uszkodzenia, zwłaszcza podczas usuwania osłonki otaczającej tkankę nerwową. Po drugie, jeśli osłonka nie zostanie całkowicie usunięta, druty tetrody mogą nie być w stanie uzyskać dostępu do nerwu. W obu przypadkach rozpoczęcie nowego przygotowania jest często najłatwiejszym sposobem rozwiązania tych problemów. Po trzecie, może wystąpić problem z drutami tetrody. Można to sprawdzić, mierząc impedancję przewodów, która powinna wynosić ~270 kΩ przy 1kHz. Jeśli wartość impedancji przekracza ~300 kΩ, należy galwanizować przewody złotem, aby uzyskać pożądaną impedancję (patrz odniesienie 30). Po czwarte, sprzęt może być źle podłączony lub źle się zachowywać.
Innym możliwym problemem jest to, że sygnały impulsowe są rejestrowane, ale neuron(y) wydają się nie reagować na degustacje. Może to być spowodowane tym, że zarejestrowane neurony są niewrażliwe na dostarczony zestaw degustacji. Należy również pamiętać, że oprócz aksonów GRN, nerw szczękowy przenosi również włókna mechanosensoryczne. W ten sposób możliwe jest nagrywanie z neuronów mechanosensorycznych zamiast lub oprócz GRN. Jednak system dostarczania degustacji został zaprojektowany tak, aby zapewnić stały mechaniczny sygnał wejściowy przez cały czas trwania eksperymentu, co sprawia, że jest mało prawdopodobne, aby reakcje na degustację były zakłócone przez reakcje na mechaniczny składnik jego podania. Neurony, które reagują na niektóre, ale nie na inne smaki, lub w różny sposób na różne smaki, można jednoznacznie sklasyfikować jako GRN. Zalecamy stosowanie świeżo rozcieńczonych degustatorów, aby uniknąć różnic w stężeniu lub składzie degustacji spowodowanych degradacją związku lub odparowaniem rozpuszczalnika. Zalecamy również regularne czyszczenie systemu, aby uniknąć zanieczyszczenia przewodów i/lub przeszkód.
Innym możliwym problemem technicznym jest niekorzystny stosunek sygnału do szumu. Problem ten można często rozwiązać, ponownie chlorując lub regulując położenie elektrody uziemiającej kąpieli. Inne rozwiązania mogą wymagać ekranowania i zminimalizowania długości każdego połączenia elektrycznego w aparacie.
Na koniec należy zauważyć, że prawidłowa analiza danych uzyskanych za pomocą nagrań tetrody wymaga starannego sortowania spajków. Stwierdziliśmy, że w pełni zautomatyzowane metody są na ogół niewystarczające. Zalecamy zapoznanie się z literaturą dotyczącą sortowania spajków przed analizą danych tetrody 10,29,31,32,33.
Można zastosować alternatywy dla naszego protokołu sekcji. Tutaj opisaliśmy rozwarstwienie przez brzuszną część głowy, zapewniając dostęp do nerwów szczękowych i SSE, ale możliwe jest również uzyskanie dostępu do tych struktur poprzez preparację przez stronę grzbietową. Stwierdziliśmy, że przygotowanie od strony grzbietowej nie jest optymalne do wykonywania nagrań z tych struktur smakowych ze względu na ich głębokie położenie, ale to przygotowanie ma tę zaletę, że umożliwia nagrania ze struktur wyższego rzędu, takich jak ciało grzyba, obszar, który jest związany z integracją wielozmysłową, uczeniem się asocjacyjnym i przetwarzaniem pamięci 34. Skupiliśmy się na wykorzystaniu elektrod tetrodowych do nagrywania z nerwu szczękowego, ale, jak zilustrowaliśmy, do tego celu można również użyć standardowych wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod. Ponadto obie techniki można łączyć w celu jednoczesnego wykonywania nagrań z wielu obszarów mózgu 10. Literatura neurobiologiczna oferuje wiele przykładów modeli bezkręgowców, które okazały się potężnymi narzędziami do ujawniania podstawowych zasad przetwarzania sensorycznego, takich jak kodowanie węchowe, które mają zastosowanie zarówno do owadów, jak i kręgowców 35,36,37,38,39. Mamy nadzieję, że nasze metody doprowadzą do fundamentalnych nowych spostrzeżeń na temat kodowania smakowego.

Systemy smakowe i węchowe generują wewnętrzne reprezentacje substancji chemicznych w środowisku, powodując percepcję smaków i zapachów. Te zmysły chemiczne są niezbędne do wywoływania wielu zachowań krytycznych dla przetrwania organizmu, od znajdowania partnerów i posiłków po unikanie drapieżników i toksyn. Proces rozpoczyna się, gdy chemikalia środowiskowe oddziałują z receptorami znajdującymi się w błonach plazmatycznych komórek receptorów czuciowych; Komórki te, bezpośrednio lub poprzez interakcje z neuronami, przekazują informacje o tożsamości i stężeniu substancji chemicznych na sygnały elektryczne. Sygnały te są następnie przekazywane do neuronów wyższego rzędu i do innych struktur mózgu. Wraz z postępem tych etapów, pierwotny sygnał zawsze ulega zmianom, które promują zdolność organizmu do wykrywania, rozróżniania, klasyfikowania, porównywania i przechowywania informacji sensorycznych oraz do wyboru odpowiedniego działania. Zrozumienie, w jaki sposób mózg przekształca informacje o substancjach chemicznych w środowisku, aby jak najlepiej wykonywać różnorodne zadania, jest podstawowym pytaniem w neurobiologii.
Kodowanie smakowe zostało uznane za stosunkowo proste: szeroko rozpowszechniony pogląd zakłada, że każda cząsteczka chemiczna, która wywołuje smak ("smak") naturalnie należy do jednej z około pięciu podstawowych jakości smakowych (tj. słodkiej, gorzkiej, kwaśnej, słonej i umami) <klasa sup="xref">1. W owym "podstawowym ujęciu smakowym" zadaniem systemu smakowego jest ustalenie który z owych podstawowych smaków jest obecny. Co więcej, mechanizmy neuronalne leżące u podstaw podstawowej reprezentacji smaku w układzie nerwowym są niejasne i uważa się, że są regulowane przez "linię oznaczoną" 2,3,4,5,6 lub "wzorzec w poprzek włókna" 7,8 kod. W oznaczonym kodzie wiersza każda komórka czuciowa i każdy z jej neuronalnych zwolenników reaguje na pojedynczą jakość smaku, razem tworząc bezpośredni i niezależny kanał do wyższych ośrodków przetwarzania w ośrodkowym układzie nerwowym dedykowanych temu smakowi. W przeciwieństwie do tego, w kodzie wzoru włóknistego, każda komórka czuciowa może reagować na wiele cech smakowych, tak że informacje o degustacji są reprezentowane przez ogólną odpowiedź populacji neuronów czuciowych. Nie jest jasne, czy informacje smakowe są reprezentowane przez podstawowe gusta, przez oznaczone linie, czy przez jakiś inny mechanizm, i jest przedmiotem ostatnich badań 3,8,9,10,11,12. Nasze ostatnie badania sugerują, że system smakowy wykorzystuje czasoprzestrzenny kod populacji do generowania reprezentacji poszczególnych degustacji, a nie podstawowych kategorii smakowych 10.
Tutaj oferujemy 3 nowe narzędzia do pomocy w nauce kodowania smakowego. Po pierwsze, sugerujemy użycie Manduca sexta jako stosunkowo prostego organizmu modelowego podatnego na elektrofizjologiczne badanie smaku i opisujemy procedurę sekcji. Po drugie, sugerujemy użycie zewnątrzkomórkowych "tetrod" do rejestrowania aktywności poszczególnych GRN. I po trzecie, proponujemy nowe urządzenie do dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów smaku do zwierzęcia. Narzędzia te zostały zaadaptowane z technik stosowanych przez nasze laboratorium i inne do badania układu węchowego.
Owady, takie jak muszka owocowa Drosophila melanogaster, szarańcza Schistocerca americana, a także Manduca sexta, przez dziesięciolecia dostarczały potężnych zasobów do zrozumienia podstawowych zasad dotyczących układu nerwowego, w tym kodowania sensorycznego (np. węch 13). U ssaków receptory smaku to wyspecjalizowane komórki, które komunikują się z neuronami poprzez złożone szlaki drugiego przekaźnika 1,14. U owadów jest prościej: ich receptorami smaku są neurony. Co więcej, szlaki smakowe ssaków w pobliżu peryferii są stosunkowo złożone, obejmują wiele, równoległych tras neuronowych, a dostęp do ważnych komponentów jest trudny, ponieważ znajdują się one w małych strukturach kostnych 15. Ścieżki smakowe owadów wydają się być prostsze. U owadów GRN są zawarte w wyspecjalizowanych strukturach znanych jako sensilla, znajdujących się w antenie, aparatach gębowych, skrzydłach i nogach 16,17. GRN bezpośrednio rzutują na strefę podprzełykową (SSE), strukturę, której rola została uznana za głównie smakową 17, i która zawiera neurony smakowe drugiego rzędu 10. Stamtąd informacja wędruje do ciała, aby kierować odruchami, i do wyższych obszarów mózgu, gdzie jest integrowana, przechowywana i ostatecznie kieruje wyborami behawioralnymi 16.
Konieczne jest scharakteryzowanie peryferyjnych reakcji smakowych, aby zrozumieć, w jaki sposób informacje o smaku są rozpowszechniane i przekształcane z punktu do punktu w całym układzie nerwowym. Najczęściej stosowaną metodą bezpośredniego monitorowania aktywności neuronalnej GRN u owadów jest technika zapisu końcówek 12,18,19,20,21,22,23. Polega to na umieszczeniu elektrody bezpośrednio na czujniku, z których wiele jest stosunkowo łatwo dostępnych. Degustator jest zawarty w elektrodzie, co pozwala na aktywację i zewnątrzkomórkowy pomiar odpowiedzi neuronalnych GRN w czułce. Ponieważ jednak degustant jest zawarty w elektrodzie, nie jest możliwe zmierzenie aktywności GRN przed dostarczeniem degustatora lub po jego usunięciu, ani wymiana degustantów bez wymiany elektrody 20. Inna metoda, technika nagrywania "ściany bocznej", została również wykorzystana do rejestrowania aktywności GRN. W tym przypadku elektroda rejestrująca jest umieszczana w podstawie czujnika smaku 24, a degustacje są dostarczane przez oddzielną szklaną kapilarnę na końcu sensillum. Obie techniki ograniczają zapis z GRN do określonego sensillum. W tym miejscu proponujemy nową technikę: nagrywanie z losowo wybranych aksonów GRN z różnych sensyli, przy jednoczesnym oddzielnym dostarczaniu sekwencji degustacji do trąbki. Zapisy aksonów uzyskuje się poprzez umieszczenie ostrych elektrod szklanych lub wiązek elektrod zewnątrzkomórkowych (tetrod) w nerwie, który przenosi aksony z GRN w trąbce do SSE 10. U Manduca aksony te przechodzą przez nerw szczękowy, o którym wiadomo, że jest czysto aferentny, co pozwala na jednoznaczne rejestrowanie reakcji sensorycznych 25. Ta metoda zapisu z aksonów pozwala przez ponad dwie godziny na stabilny pomiar odpowiedzi GRN przed, w trakcie i po serii prezentacji degustacyjnych.
Tutaj opisujemy procedurę preparacji w celu odsłonięcia nerwów szczękowych razem z SSE, która pozwala na jednoczesne rejestrowanie odpowiedzi wielu GRN i neuronów w SSE 10. Opisujemy również wykorzystanie zewnątrzkomórkowych nagrań GRN przy użyciu specjalnie wykonanej 4-kanałowej tetrody ze skrętu drutowego, która w połączeniu z metodą sortowania kolców pozwala na analizę wielu (w naszych rękach do sześciu) GRN jednocześnie. Następnie porównujemy nagrania wykonane tetrodami z nagraniami wykonanymi za pomocą ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych. Na koniec opisujemy nowy aparat do dostarczania bodźców smakowych. Nasz nowy aparat, zaadaptowany ze sprzętu od dawna używanego przez wielu badaczy do dostarczania substancji zapachowych w badaniach węchowych, oferuje korzyści w badaniu smaku: ulepsza poprzedni wielokanałowy system dostarczania, taki jak te opracowane przez Stürckowa i współpracowników (patrz referencje 26,27), nasz aparat osiąga precyzyjną kontrolę nad czasem dostarczania degustacji, zapewniając jednocześnie odczyt napięcia tego czasu; Pozwala też na szybkie, sekwencyjne dostarczanie wielu smacznych bodźców 10. Aparat kąpie trąbkę w stałym strumieniu czystej wody, do której mogą być dostarczane kontrolowane impulsy smaku. Każdy impuls smakowy przechodzi przez trąbkę, a następnie jest wypłukiwany. Degustatory zawierają niewielką ilość bezsmakowego barwnika spożywczego, dzięki czemu czujnik koloru może monitorować, z precyzyjnym wyczuciem czasu, przejście smaku przez trąbkę.

<table><tbody><tr><td> Sekcja i przygotowanie próbki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa, 15 ml Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Igła, krótki skos, 19 G x 1 - 1/2"&nbsp;</td><td>&nbsp; MONOJET</td><td>888200144</td><td>Do nakładania powietrza w celu usunięcia włosów z.</td></tr><tr><td>Modelina Clay-van Aken Plastalina&nbsp;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego -100 x 15 mm&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet (1 - 200 &mikro; L)</td> <td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy przewód połączeniowy 22 AWG</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>Do wkładania trąbki do końcówki pipety.</td></tr><tr><td>Wosk batikowy</td><td>Żakard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Wosk elektryczny</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Myscroscope stereo</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 kleszcze (grube)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>Do usuwania tkanki tłuszczowej i nienerwowej.</td></tr><tr><td>Kleszcze tytanowe Dumont #5 (cienkie)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>Do usuwania tkanki tłuszczowej i nienerwowej.</td></tr><tr><td>Kleszczyki do #5SF Dumont (bardzo cienkie)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>Do usuwania tkanki nerwowej.</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas (cienkie)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>Do usuwania naskórka.</td></tr><tr><td>Kolagenaza/Dyspaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Epoksyd</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Saline Perfusion System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw przedłużający z regulatorem przepływu</td><td>&nbsp; B Braun Medical Inc.</td>Zestaw do podawania <td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV z miejscem wstrzyknięcia Y</td><td>&nbsp; B Braun Medical Inc.</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Tastant System dostarczania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Białe przezroczyste rurki nylonowe OD 1/4", ID 1/8"Small</td> <td>Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>Sztywna rura, która łączy cztery główne elementy systemu.</td></tr><tr><td>Lutownica</td><td>Specjaliści od obwodów</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie obrotowe-Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Siatka polipropylenowa, rozmiar otworu (rozmiar otworu 0,1 x 0,13 cm)&nbsp;</td><td>Siatka przemysłowa</td><td>XN5170</td><td>Do zapewnienia, że trąby różnych zwierząt są umieszczone w tym samym miejscu.</td></tr><tr><td>Ciśnieniowy 16-kanałowy system perfuzyjny&nbsp;</td><td>Narzędzia biologiczne</td><td>PS-16H</td><td>Do degustacji. System ten obejmuje zawory zaciskowe, przewody, kolektor, cylindry roztworu, sterownik zaworu i akcesoria montażowe.</td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe, ID 0,034", ID 0,050"</td><td>Becton, Dickinson & Co</td><td>427421</td><td>Rurka wyjściowa z systemu perfuzyjnego.</td></tr><tr><td>Pneumatyczne PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Do sterowania kanałem wyjściowym systemu perfuzyjnego.&nbsp;</td></tr><tr><td>System oprogramowania do akwizycji danych, karta DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>Do sterowania pompą pico w celu dostarczania degustacji i rejestrowania sygnałów z czujnika koloru.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Pompa perystaltyczna Manostat</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>Do pompowania wody.</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, ID 1/16" OD 1/8"</td> <td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>Do podłączenia źródła wody do rurki pompy perystaltycznej, a rurki wylotowej pompy do sztywnej rurki systemu dostarczania.</td></tr><tr><td>Czujnik koloru - cyfrowy czujnik światłowodowy</td><td>Keyence</td><td>&nbsp; FS-V31M</td><td>Do monitorowania dostawy degustacyjnej.&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednostka światłowodowa z czujnikiem koloru odblaskowym</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>Do podłączenia czujnika koloru.</td></tr><tr><td>Peryferia dentystyczne Wosk</td><td>Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td>Aby zabezpieczyć trąbkę w sztywnej rurce.</td></tr><tr>Dwa pojemniki <td></td><td></td><td>o pojemności 3,7 l</td><td>Do dostarczania wody do systemu i zbierania odpadów wodnych.</td></tr><tr><td>Szybki zielony FCF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe 25,5 cm</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>Do wprowadzania trąbki na mole do otworu trąbki w sztywnej rurce.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt do elektrofizjologii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.C. wzmacniacz</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>Lampa</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec Źródło światła DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator ręczny</td><td>Mikromanipulator</td><td>Leica</td><td>Do precyzyjnego wprowadzania tetrod do mózgu zwierzęcia. Manipulator musi umożliwiać drobne i zgrubne ruchy w osiach x, y i z.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Stół z izolacją drgań (stół laboratoryjny MICRO-g)</td><td>Oscyloskop TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix&nbsp;</td><td></td><td></td>TDS2014</tr><tr><td>16-kanałowy przedwzmacniacz i wzmacniacz</td><td>16-kanałowy MA-800 Amplifier System&nbsp;</td><td>Komputer B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td>Dell</td><td></td><td>optiplex 780</td><td>Poniżej przedstawiono minimalne zalecane wymagania. Pamięć RAM: 3,32 GHz, 3 GB. Procesor: Intel Core&nbsp; 2 Duet. Karta graficzna: zintegrowana Intel GMA X4500.</td></tr><tr><td>System oprogramowania do akwizycji danych, karta DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>Do sterowania pompą pico w celu dostarczania degustacyjnego oraz do rejestrowania sygnałów z czujnika koloru i elektrody.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Tastants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

nowe metody badania kodowania smaku

New Methods to Study Gustatory Coding 

Zmysł smaku pozwala zwierzętom wykrywać substancje chemiczne w środowisku, co prowadzi do zachowań krytycznych dla przetrwania. Kiedy neurony receptorów smakowych (GRN) wykrywają cząsteczki smakowe, kodują informacje o tożsamości i stężeniu smaku jako wzorce aktywności elektrycznej, które następnie rozchodzą się do neuronów podążających w mózgu. Wzorce te stanowią wewnętrzne reprezentacje degustatora, które następnie pozwalają zwierzęciu wybierać działania i tworzyć wspomnienia. Wykorzystanie stosunkowo prostych modeli zwierzęcych było potężnym narzędziem do badania podstawowych zasad kodowania sensorycznego. W tym miejscu proponujemy trzy nowe metody badania kodowania smakowego za pomocą Manduca sexta. W pierwszej kolejności przedstawiamy procedurę preparacyjną w celu odsłonięcia nerwów szczękowych i strefy podprzełykowej (SEZ), pozwalającą na rejestrację aktywności GRN z ich aksonów. Po drugie, opisujemy zastosowanie elektrod zewnątrzkomórkowych do rejestrowania aktywności wielu GRN poprzez umieszczenie drutów tetrodowych bezpośrednio w nerwie szczękowym. Po trzecie, prezentujemy nowy system do dostarczania i monitorowania, z dużą precyzją czasową, impulsów o różnych smakach. Metody te pozwalają na scharakteryzowanie odpowiedzi neuronalnych in vivo bezpośrednio z GRN przed, w trakcie i po dostarczeniu degustantów. Podajemy przykłady śladów napięcia zarejestrowanych z wielu GRN i przedstawiamy przykład, w jaki sposób technika sortowania szczytów może być zastosowana do danych w celu identyfikacji odpowiedzi poszczególnych neuronów. Wreszcie, aby zweryfikować nasze podejście do nagrywania, porównujemy nagrania zewnątrzkomórkowe uzyskane z GRN z tetrodami z nagraniami wewnątrzkomórkowymi uzyskanymi za pomocą ostrych elektrod szklanych.

Aktywność GRN można rejestrować za pomocą pozakomórkowej elektrody tetrodowej przed, w trakcie i po podaniu substancji smakowej (Rysunek 6A i 6C). Rysunek 6A (panele środkowy i dolny) przedstawia przefiltrowane (300-6 0 Hz) zapisy napięcia zarejestrowane przez każdy z czterech przewodów umieszczonych w nerwie szczękowym, gdzie można zaobserwować sygnały o różnych amplitudach odzwierciedlające potencjały czynnościowe (strzałki). Impuls substancji smakowej (1 M sacharozy) o czasie trwania 1 s podano 2 s po rozpoczęciu eksperymentu; początek i koniec stymulacji monitorowano za pomocą czujnika koloru (Rysunek 6A, panel górny). Substancja smakowa wywoła kolce, które można zaobserwować w każdym z czterech kanałów (Rysunek 6A, panel środkowy). GRN można zidentyfikować i odróżnić od mechanosensorów (tutaj nieprzedstawionych), gdy reagują one na niektóre substancje smakowe, a na inne nie 10.
Aby zidentyfikować i wyizolować odpowiedzi pojedynczych neuronów z rejestracji tetrodowych, przeprowadziliśmy poza liniową segregację impulsów (spike sorting), korzystając z zestawu funkcji opracowanych na podstawie metod Pouzata 31 oraz Kleinfelda 32,3 (metody te opisano w cytowaniach: 10,29). Rysunek 6B przedstawia przykład segregacji impulsów zastosowanej do danych pokazanych na Rysunku 6A, w której zidentyfikowano trzy dobrze odseparowane jednostki.
Wykresy rastrowe z Rysunku 6C przedstawiają odpowiedzi trzech wyizolowanych jednostek z Rysunku 6B na sześć różnych substancji smakowych (1 M sacharozy, maltozy i NaCl; 100 mM kofeiny oraz 10 mM berberyny i lobeliny) podawanych sekwencyjnie (pokazano 4 próby/substancja). Jak pokazano na Rysunku 6C, zarejestrowane GRN wykazują różny poziom aktywności bazowej, od stanu ciszy (GRN 1) po aktywność niską lub umiarkowaną (GRN 2 i 3). Po podaniu substancji smakowej GRN wykazują zróżnicowane wzorce aktywności i różną selektywność względem bodźców. Na przykład GRN 1 reagowała tylko na sacharozę, podczas gdy GRN 2 reagowała na maltozę i NaCl seriami impulsów (bursts), a na lobelinę impulsami jedynie na początku stymulacji. Ponadto niektóre odpowiedzi są zsynchronizowane z czasem trwania bodźca (np. odpowiedź GRN 1 na sacharozę), podczas gdy inne trwają dłużej niż czas podawania bodźca (np. odpowiedź GRN 3 na berberynę) lub zawierają zarówno komponenty pobudzające, jak i hamujące (np. Rysunek 7, odpowiedzi GRN 2 na NaCl i sacharozę). Więcej informacji na temat zróżnicowanej wrażliwości i wzorców aktywności GRN znajduje się w literaturze 10.
Aby zwalidować zastosowanie tetrody i technik sortowania impulsów (spike-sorting) do rejestracji GRN z nerwu szczękowego, przeprowadzono rejestracje wewnątrzkomórkowe z aksonów GRN u innych zwierząt, wykorzystując konwencjonalne ostre elektrody szklane (oporność 80-120 MΩ). Stwierdzono, że wzorce aktywności uzyskane za pomocą rejestracji wewnątrzkomórkowych były podobne do odpowiedzi zaobserwowanych przy użyciu techniki tetrody (Rysunek 7). Ślady napięcia w zielonej ramce w Panelu A zostały zarejestrowane wewnątrzkomórkowo z GRN 1 podczas 5 następujących po sobie prób prezentacji sacharozy, a te same odpowiedzi przedstawiono jako wykresy rastrowe w panelu B. (Należy zauważyć, że ten typ odpowiedzi odpowiada odpowiedzi uzyskanej za pomocą tetrod i przedstawionej na Rysunku 6C). GRN 2, rejestrowany ostrymi elektrodami wewnątrzkomórkowymi, wykazuje szerszy wzorzec odpowiedzi.
<img alt="Schemat analizy odpowiedzi neuronalnej; dane elektrofizjologiczne z pomiarami w mikrowoltach i czasem wystąpienia impulsów (spike timings)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki rejestracji z nerwu szczękowego przy użyciu tetrod elektrozewnątrzkomórkowych. (A) Przedstawiono przefiltrowane (300–60 Hz) przebiegi napięcia zarejestrowane przez każdy z czterech przewodów w obrębie nerwu szczękowego (panel środkowy). W okresie wskazanym czerwonym cieniowaniem w panelu środkowym podano 1-sekundowy impuls substancji smakowej. Początek i koniec stymulacji monitorowano za pomocą czujnika koloru, co wskazano za pomocą czerwonego przebiegu napięcia w panelu górnym, a w panelu środkowym obszar ten oznaczono czerwonym cieniowaniem. Poziome linie przerywane oznaczają wartości +50 (góra), 0 (środek) i -50 (dół) µVPrzedstawiono powiększenie surowych zapisów napięcia odpowiadających obszarowi wewnątrz pionowych linii przerywanych (panel dolny). Przykłady impulsów wskazano strzałkami.B) Przykład sortowania impulsów (spike sorting) zastosowanego do danych przedstawionych na panelu A. Kształty fal zarejestrowane na każdym z czterech elektrod zewnątrzkomórkowych (1-4) zostały zidentyfikowane jako pochodzące od trzech różnych GRN (jednostek 1-3) przyczyniających się do zarejestrowanych sygnałów. Dla trzech jednostek przedstawiono poszczególne zdarzenia (kolorowe cienkie linie) oraz średnią (gruba czarna linia). Aby wiarygodnie zidentyfikować niezależne jednostki przy użyciu metody sortowania impulsów, należy wziąć pod uwagę szereg kryteriów statystycznych (patrz literatura) 10,29). (C) Wykresy rastrowe przedstawiające odpowiedzi trzech wyizolowanych jednostek na sekwencję sześciu różnych substancji smakowych (pokazano 4 próby/substancja). Okres podawania substancji smakowej (1 s) jest zaznaczony obszarem zacienionym na czerwono. Stężenia substancji smakowych wynosiły odpowiednio 1 M (sacharoza, maltoza, NaCl), 10 mM (kofeina) oraz 10 mM (beryna i lobelina). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy napięcie-czas w elektrofizjologii; odpowiedzi GRN na H2O, sacharozę, NaCl; analiza aktywności neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7Rejestracje wewnątrzkomórkowe z aksonów GRN. (A, zielony panel) Zapisy napięcia zarejestrowane z GRN przy użyciu szklanych mikroelektrod wewnątrzkomórkowych (oporność 80–120 MΩ) umieszczonych w nerwie szczękowym, wywołane 5 następującymi po sobie stymulacjami 1 M sacharozą (Suc).B) Wykresy rastrowe odpowiedzi dwóch sieci neuronów zmysłu smaku (GRN), w tym odpowiedzi przedstawione na panelu A (panel w zielonej ramce), na dwa różne substancje smakowe podawane sekwencyjnie (10 mM – kolor czcionki szary; 1 M – kolor czcionki czarny), zarejestrowane za pomocą szklanych mikroelektrod wewnątrzkomórkowych umieszczonych w nerwie szczękowym (pokazano 7 prób/substancję smakową i 3 próby/wodę). Czas podawania substancji smakowej zaznaczono czerwonym cieniowaniem w obu panelach. Początek i koniec stymulacji monitorowano za pomocą czujnika koloru, co wskazują czerwone ślady napięcia u dołu każdego panelu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Prezentujemy trzy nowe metody do nauki kodowania smakowego. Posługując się prostym zwierzęciem, Manduca sexta (Manduca), opisujemy protokół preparacji, użycie zewnątrzkomórkowych tetrod do rejestrowania aktywności wielu neuronów receptorów smakowych oraz system dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji.

Nowe metody badania kodowania smaku

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Ogólnym celem tych metod jest badanie kodowania smaku u prostego modelu zwierzęcego poprzez rejestrację aktywności wielu neuronów receptorowych in vivo, przy jednoczesnym podawaniu i monitorowaniu precyzyjnie czasowych impulsów substancji smakowych. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zmysłu smaku, takie jak sposób kodowania smaków przez populacje gustatorycznych neuronów receptorowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość prowadzenia rejestracji in vivo z wielu neuronów gustatorycznych przed, w trakcie i po precyzyjnie podanych bodźcach smakowych.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą uznać ją za wymagającą ze względu na złożony przebieg procedury sekcji. Z tego powodu mamy nadzieję, że wizualna demonstracja tej metody okaże się pomocna. Techniki te zostały opracowane przez Sama Writera podczas jego studiów doktoranckich w moim laboratorium, we współpracy z Alejandrą; procedury te zostaną zaprezentowane przez Kui Sun.Trzy dni po wygryzieniu z poczwarki należy wybrać ćmę dowolnej płci o ogólnie zdrowym wyglądzie. Skrzydła powinny być całkowicie rozprostowane, a ssawka i czułki dobrze wykształcone i nieuszkodzone. W dygestorium należy umieścić wybraną ćmę w rurce stabilizującej tak, aby wystawała jedynie głowa.Następnie unieruchom ćmę, wkładając papier odkuchenny do drugiego końca probówki. Teraz, używając sprężonego powietrza podawanego za pomocą strzykawki, usuń włosy z odsłoniętej głowy. Następnie umieść probówkę na glinianej platformie w szalce Petriego.Ustaw głowę stroną grzbietową do góry. Następnie zabezpiecz czułki i trąbkę. W pierwszej kolejności przygotuj osłonki dla każdej z tych struktur, wykorzystując końcówki do pipety 200 µL pocięte na odcinki o długości pół centymetra.Aby manipulować ssawką, przygotuj haczyk z kawałka drutu. Wysuń ssawkę do jednej z osłonek, aż jej najbardziej proksymalna część zostanie zabezpieczona. Przymocuj rurkę do grzbietowej części torebki głowy, używając twardego wosku batikowego.Następnie ostrożnie odsuń czułki i zabezpiecz probówki woskiem batikowym. Teraz ustabilizuj mózg poprzez przecięcie mięśnia kompresora klamry. Pod mikroskopem sekcyjnym, używając narzędzi do mikrosekcji, otwórz torebkę głowy, wykonując małe nacięcie tuż poniżej trąbki.Aby potwierdzić przecięcie mięśnia, podaj roztwór sacharozy do dystalnych dwóch trzecich proboscis i przez pięć minut upewnij się, że proboscis nie wysuwa się. Następnie zamknij torebkę głowy, nakładając warstwę roztopionego wosku batikowego. Aby przeprowadzić perfuzję mózgu solą fizjologiczną, zbuduj woskowy kubek wokół brzusznej strony głowy.Używając elektrycznego woskownika, zacznij tworzyć woskowąy kubek wzdłuż przedniej części głowy, przesuwając się w stronę tyłu. Rurki obejmujące aparat gębowy (proboscis) i czułki powinny pozostać wewnątrz kubka. Kontynuuj budowanie kubka na zewnątrz i w górę, aż osiągnie on poziom oczu.Za pomocą pęsety należy ująć palpy chułkowe i przymocować je do woskowego naczynia, używając roztopionego wosku. Następnie należy uszczelnić wszelkie otwory w naczyniu woskowym i probówkach, nakładając cienką warstwę żywicy epoksydowej. Żywicę należy wymieszać za pomocą wykałaczki.Najpierw pokryj zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie kubka. Po drugie, wypełnij część rurki stabilizującej otaczającej szyję, aby głowa była utrzymywana bardziej stabilnie. Po 20 minutach sprawdź, czy kubek nie przecieka.Aby rozpocząć operację mózgu, najpierw odetnij palpy wargowe. W celu otwarcia strony brzusznej torebki głowowej, przetnij kutykulę wzdłuż tylnej i przedniej części głowy oraz wokół oczu. Następnie przetnij tył głowy i wykonaj dodatkowe nacięcia w przedniej części głowy w pobliżu trąbki.Następnie, ostrożnie unieś pęsetą płat kutykuli, aby odsłonić mózg. Teraz wykonaj najważniejszy krok: odsłonięcie SEZ i nerwów szczękowych. Powoli i starannie usuń tkankę tłuszczową oraz tchawicę.Często płucz mózg świeżym roztworem soli fizjologicznej. Zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ nerwy szczękowe są bardzo podatne na zmiażdżenie. Gdy SEZ i nerwy szczękowe staną się widoczne, będą one pokryte cienką osłoną.Aby usunąć tę osłonkę, należy odlać nadmiar soli fizjologicznej, a następnie osłabić osłonkę, aplikując 10% roztwór kolagenazy dispase. Po pięciominutowym moczeniu należy kilkukrotnie wypłukać roztwór solą fizjologiczną. Następnie, po kilku płukaniach solą fizjologiczną, należy delikatnie usunąć osłonkę za pomocą superprecyzyjnej pęsety do mikrosekcji.Na koniec zamocuj linię kroplową z solą fizjologiczną w naczyniu perfuzyjnym. W tej sekcji opisano sposób konstrukcji i wykorzystania systemu podawania tastantów. System składa się z probówki testowej z kilkoma otworami.Otwory umożliwiają wprowadzenie trąbki zwierzęcia, różnorodnych substancji smakowych oraz czujnika koloru, a także pozwalają na przepływ wody. Aby zbudować ten system, należy najpierw przygotować probówkę dla trąbki. Za pomocą lutownicy wykonaj otwór o rozmiarze odpowiadającym szerokości trąbki.Następnie należy zbudować wewnątrz rurki sekcję z siatką, która utrzyma proboscis w odpowiednim miejscu. Wyciąć otwór 5 mm powyżej otworu, przymocować tam siatkę za pomocą wosku, a następnie ponownie połączyć rurki, używając wosku i epoksydu. Do podawania substancji smakowych należy użyć ciśnieniowego systemu perfuzji.Podłącz do kolektora tyle probówek z substancją smakową, ile jest wymagane. Aby podłączyć rurkę wylotową substancji, wykonaj otwór około jednego centymetra powyżej siatki, a następnie przymocuj do niego rurkę wylotową za pomocą żywicy epoksydowej. Do każdej substancji smakowej dodaj sztuczny barwnik, który zostanie wykryty przez czujnik koloru.Przymocuj czujnik koloru do aparatury w otworze oddalonym o pół centymetra od siatki i zabezpiecz go za pomocą epoksydu. Użyj pompy perystaltycznej do podawania wody destylowanej do układu poprzez rurkę silikonową. Zbierz odpłynną wodę do dużego pojemnika.Użyj pompy pneumatycznej do podawania substancji smakowych za pomocą podmuchów powietrza. Następnie zacznij pompować czystą wodę przez rurki i podawaj impulsy substancji smakowej, aby przetestować czujnik koloru. Teraz wprowadź dwie trzecie ssawki ćmy do rurki testowej.Za pomocą pęsety wysuń proboscis i delikatnie wprowadź go do otworu. Następnie uszczelnij proboscis w miejscu wprowadzenia, używając miękkiego wosku dentystycznego oraz warstwy żywicy epoksydowej. Teraz podłącz linię perfuzji solą fizjologiczną i ustaw przepływ perfuzji.Następnie zanurz elektrodę uziemiającą skręconej tetrody drutowej w kąpieli solnej. Potem, za pomocą mikromanipulatora, ustaw tetrodę obok nerwu szczękowego i powoli wprowadź ją do nerwu. Po wykryciu sygnałów impulsowych pozwól preparatowi stabilizować się przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem rejestracji.Rejestracje z neuronów receptorowych smaku przeprowadzono przed, w trakcie i po podaniu substancji smakowych zgodnie z opisanym protokołem. Początek i koniec jednosekundowego impulsu każdej substancji smakowej monitorowano za pomocą czujnika koloru. Substancje smakowe wywoływały potencjały czynnościowe, które były wykrywane przez każdy z czterech kanałów.W obrębie serii impulsów (spike trains) można było zaobserwować poszczególne potencjały czynnościowe. Do przypisania tych impulsów do poszczególnych neuronów wykorzystano oprogramowanie do sortowania impulsów (spike sorting). Odpowiedź trzech różnych neuronów receptorowych smaku na sześć substancji smakowych podawanych sekwencyjnie wykazuje różne poziomy aktywności podstawowej oraz różną selektywność względem bodźców smakowych.Ponadto odpowiedzi charakteryzowały się różnym czasem trwania. Niektóre były zsynchronizowane z czasem trwania bodźca, podczas gdy inne trwały dłużej niż bodziec. Rejestracje wewnątrzkomórkowe można było również przeprowadzić z aksonów receptorów smakowych, wykorzystując konwencjonalne ostre elektrody szklane.Rejestracje wewnątrzkomórkowe były bardzo podobne do odpowiedzi zaobserwowanych przy użyciu opisanego techniki tetrodowej, jednak rejestracje tetrodowe były łatwiejsze do wykonania, trwalsze i bardziej stabilne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie odsłonić nerwy szczękowe oraz strefę podprzełykową u mandi-casecsta, a także zbudować system podawania substancji smakowych z precyzyjną kontrolą czasową. Podczas wykonywania tego protokołu należy nosić laboratoryjne rękawice ochronne oraz maseczkę, ponieważ drobny, proszkowy naskórek zrzucany przez mandi-casecsta może być alergizujący.Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w ciągu trzech i pół godziny. Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest również przeprowadzanie jednoczesnych pomiarów z wielu obszarów mózgu w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób przekształcania odpowiedzi neuronów receptorowych smakowych na substancje smakowe podczas ich przekazywania do postsynaptycznych neuronów docelowych.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wiedza na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transdukcji smaku poczyniła ostatnio znaczne postępy, głównie dzięki wykorzystaniu modeli zwierzęcych. Jednakże szeroka rozpiętość czułości i specyficzności smakowej wśród ssaków uzasadnia prowadzenie badań na tkankach ludzkich. Opisujemy technikę biopsji służącą do pobierania żywych komórek smakowych z brodawek języka człowieka.

Technika pobierania brodawek grzybiastych (smakowych) z ludzkiego języka

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Smak jest ważnym procesem sensorycznym, który ułatwia przyciąganie do dobroczynnych substancji i unikanie substancji toksycznych.  Protokół ten opisuje prosty test spożycia w celu określenia preferencji smakowej Drosophila dla danego związku chemicznego.

Test preferencji smakowych dla dorosłych Drosophila

Ten protokół mierzy ludzkie reakcje smakowe i obejmuje krótką ocenę anatomiczną, krótki test smaku oraz metodę walidacji przy użyciu zgłoszonego przez badanego genotypu odczucia i receptora smaku.

Egzamin smakowy: krótki i zatwierdzony test

Ten artykuł opisuje metody przygotowania tkanek, barwienia i analizy całych grzybów, obwodowych i podniebiennych kubków smakowych, które konsekwentnie dają całe i nienaruszone kubki smakowe (w tym włókna nerwowe, które je unerwiają) i utrzymują relacje między strukturami wewnątrz kubków smakowych a otaczającą je brodawką.

Barwienie całego wierzchu, wizualizacja i analiza grzybokształtnych, obwodowych i podniebienia kubków smakowych

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Artykuł przedstawia urządzenie μTongue (mikrofluidyka na języku) do funkcjonalnego obrazowania komórek smaku in vivo poprzez integrację mikrofluidyki z okienkiem obrazowania przyżyciowego na języku.

μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo

Rzadko stosowana metoda zapisu elektrofizjologicznego, zapis podstawowy, pozwala na analizę cech kodowania smaku, które nie mogą być zbadane konwencjonalnymi metodami zapisu. Zapis bazowy pozwala również na analizę reakcji smakowych na bodźce hydrofobowe, których nie można zbadać tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi.

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Poznaj metody badania kodowania smakowego u ćmy Manduca sexta przy użyciu in vivo rejestracji neuronów receptorowych i precyzyjnego dostarczania bodźców smakowych. Techniki te umożliwiają szczegółowe zrozumienie przetwarzania informacji smakowej.

Nowe metody badania kodowania smaku

Przeglądaj więcej filmów