Nowe metody badania kodowania smakowego
29 czerwca 2017
Prezentujemy trzy nowe metody do nauki kodowania smakowego. Posługując się prostym zwierzęciem, Manduca sexta (Manduca), opisujemy protokół preparacji, użycie zewnątrzkomórkowych tetrod do rejestrowania aktywności wielu neuronów receptorów smakowych oraz system dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji.
Ogólnym celem tych metod jest zbadanie kodowania smakowego w prostym zwierzęcym mandi-casecsta poprzez rejestrowanie aktywności wielu neuronów receptorowych in vivo, przy jednoczesnym dostarczaniu i monitorowaniu precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące gustacji, takie jak to, w jaki sposób degustatory są kodowane przez populacje neuronów receptorów smakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zapisy in vivo wielu neuronów smakowych przed, w trakcie i po precyzyjnie dostarczonych bodźcach smakowych.
Osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą uznać ją za wyzwanie, ponieważ procedura sekcji jest skomplikowana. Z tego powodu mamy nadzieję, że wizualna demonstracja metody będzie pomocna. Techniki te zostały opracowane przez Sama Writera, kiedy był studentem w moim laboratorium, razem z Alejandrą, Kui Sun zademonstruje te procedury.
Trzy dni po eklozji wybierz dowolnej płci, która ma ogólnie zdrowy wygląd. Skrzydła powinny być w pełni rozciągnięte, a trąbka i czułki powinny być dobrze uformowane i nienaruszone. W dygestorium włóż wybraną do rurki ograniczającej, aż głowica zostanie odsłonięta.
Następnie unieruchom, wkładając bibułę do drugiego końca tubki. Teraz, za pomocą sprężonego powietrza dostarczanego ze strzykawki, usuń włosy z odsłoniętej głowy. Następnie umieść probówkę na glinianej platformie na szalce Petriego.
Ustaw głowę grzbietem do góry. Następnie chroń anteny i trąbkę. Najpierw wykonaj osłony dla każdej struktury z 200 mikrolitrowych końcówek pipet pociętych na pół centymetra.
Aby manipulować trąbką, przygotuj haczyk z kawałka drutu. Rozciągnij trąbkę do jednej z osłon, aż najbardziej proksymalna część trąbki będzie chroniona. Przymocuj rurkę do grzbietowej części torebki głowy za pomocą mocnego wosku batikowego.
Następnie ostrożnie pokryj anteny i zabezpiecz rurki woskiem batiku. Teraz ustabilizuj mózg, przecinając mięsień kompresora klamry. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj narzędzi do mikrodysekcji, aby otworzyć torebkę głowy, wykonując małe nacięcie tuż pod trąbką.
Aby potwierdzić, że mięsień został przecięty, podaj roztwór sacharozy do dystalnych dwóch trzecich trąbki i przez pięć minut upewnij się, że trąbka się nie rozciąga. Następnie zamknij kapsułkę na głowę za pomocą warstwy stopionego wosku batikowego. Aby przepłukać mózg solą fizjologiczną, zbuduj miseczkę woskową wokół brzusznej strony głowy.
Za pomocą elektrycznego woskarza zacznij budować woskowiny wzdłuż przedniej części głowy, przesuwając się w kierunku tyłu. Trzymaj rurki trąbki i anteny wewnątrz kubka. Kontynuuj budowanie kubka na zewnątrz i w górę, aż osiągnie poziom oczu.
Za pomocą kleszczy weź palpy wargowe i przymocuj je do miseczki woskowej za pomocą stopionego wosku. Następnie uszczelnij wszelkie otwory w kubku na wosk i rurkach za pomocą warstwy rzeczy na dwuskładnikowej żywicy epoksydowej. Wymieszaj żywicę epoksydową za pomocą wykałaczki.
Najpierw zakryj zewnętrzną i wewnętrzną powierzchnię kubka. Po drugie, wypełnij część rurki krępującej otaczającej szyję, aby głowa była mocniej trzymana. Po 20 minutach sprawdź, czy kubek nie przecieka.
Aby rozpocząć operację mózgu, najpierw odetnij palpy wargowe. Aby otworzyć brzuszną stronę torebki głowy, przeciąć naskórek wzdłuż tyłu i przodu głowy oraz wokół oczu. Następnie przetnij wzdłuż tyłu głowy i wykonaj więcej nacięć z przodu głowy w pobliżu trąbki.
Następnie delikatnie unieś płatek naskórka za pomocą kleszczy, aby odsłonić mózg. Teraz wykonaj najbardziej krytyczny krok, odsłaniając SSE i nerwy szczękowe. Powoli i ostrożnie usuwaj tkankę tłuszczową i tchawicę.
Często płucz mózg świeżą solą fizjologiczną. Bądź bardzo ostrożny, ponieważ bardzo łatwo jest zmiażdżyć nerwy szczękowe. Gdy SSE i nerwy szczękowe będą wreszcie widoczne, zostaną pokryte cienką osłonką.
Aby usunąć tę osłonkę, odcedź nadmiar soli fizjologicznej, a następnie osłabij osłonkę, nakładając 10% roztwór dypazy kolagenazy. Po namoczeniu przez pięć minut spłucz roztwór kilkakrotnie solą fizjologiczną. Następnie, po kilku płukaniach solą fizjologiczną, delikatnie usuń osłonkę za pomocą bardzo drobnych kleszczy preparacyjnych.
Na koniec przymocuj linię kroplową z solą fizjologiczną do kubka perfuzyjnego. W tej sekcji opisano, jak zbudować i używać systemu dostarczania degustatorów. System składa się z probówki z kilkoma otworami.
Otwory zapewniają wejście dla trąbki zwierzęcia, kolektora degustacyjnego, czujnika koloru i umożliwiają przenikanie wody. Aby zbudować ten system, najpierw przygotuj probówkę do trąbki. Wykonaj otwór wielkości trąbki za pomocą lutownicy.
Następnie zbuduj przesiewaną sekcję w rurce, aby utrzymać trąbkę na miejscu. Wytnij pięć milimetrów nad otworem, umieść tam siatkę z woskiem i ponownie połącz rurki za pomocą wosku i żywicy epoksydowej. Użyj ciśnieniowego systemu perfuzyjnego, aby dostarczyć degustacje.
Podłącz tyle probówek, ile potrzeba do kolektora. Aby podłączyć rurkę wyjściową tastant, wykonaj otwór około jednego centymetra nad siatką, a następnie przymocuj do niej rurkę wyjściową za pomocą żywicy epoksydowej. Do każdej próbki dołącz sztuczny barwnik, który ma być wykrywany przez czujnik koloru.
Przymocuj czujnik koloru do aparatu w otworze o szerokości pół centymetra wokół siatki i zabezpiecz go tam za pomocą żywicy epoksydowej. Użyj pompy perystaltycznej, aby dostarczyć wodę destylowaną do systemu za pomocą silikonowych rurek. Ścieki zbierać w dużym pojemniku.
Użyj pompy pneumatycznej, aby dostarczyć degustatory wraz z podmuchami powietrza. Teraz zacznij pompować czystą wodę przez rurkę i dostarczaj impulsy smaku, aby przetestować czujnik koloru. Teraz załaduj destylację dwóch trzecich trąbki do probówki.
Za pomocą kleszczy rozciągnij trąbkę i delikatnie wepchnij ją do otworu. Następnie uszczelnij trąbkę miękkim woskiem dentystycznym i warstwą żywicy epoksydowej. Teraz podłącz linię perfuzji soli fizjologicznej i ustaw przepływ perfuzji.
Następnie zanurz elektrodę masową tetrody ze skręconego drutu w kąpieli solankowej. Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść tetrodę obok nerwu szczękowego i powoli wsuń ją do nerwu. Po wykryciu sygnałów impulsowych należy odczekać, aż preparat ustabilizuje się przez co najmniej 10 minut przed wykonaniem nagrań.
Zapisy wykonano z neuronów receptorów smakowych przed, w trakcie i po podaniu degustacyjnym przy użyciu opisanego protokołu. Początek i przesunięcie jednosekundowego impulsu każdego degustatora było monitorowane przez czujnik koloru. Degustacje wywołały skoki, które zostały wykryte przez każdy z czterech kanałów.
W obrębie pociągów kolców można było zaobserwować indywidualne potencjały czynnościowe. Oprogramowanie do sortowania spajków zostało użyte do przypisania tych kolców do unikalnych neuronów. Odpowiedź trzech różnych neuronów receptorów smakowych na sześć degustantów podawanych w sekwencji ujawnia różne poziomy podstawowej aktywności i selektywności w stosunku do degustatorów.
Ponadto odpowiedzi miały różny czas. Niektóre są ograniczone do czasu trwania bodźca, podczas gdy inne trwają dłużej niż bodziec. Zapisy wewnątrzkomórkowe można również wykonać z aksonów receptorów smakowych za pomocą konwencjonalnych elektrod z ostrego szkła.
Nagrania wewnątrzkomórkowe były bardzo podobne do reakcji obserwowanych przy użyciu opisanej techniki tetrody, ale nagrania tetrody były łatwiejsze do wykonania, trwalsze i bardziej solidne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie odsłonić nerwy szczękowe i strefę podprzełykową w mandi-casecsta i być w stanie zbudować system dostarczania degustacji z precyzyjną kontrolą czasową. Podczas wykonywania tego protokołu należy nosić laboratoryjne rękawice ochronne i maskę na twarz, ponieważ drobny sproszkowany łusek zrzucany przez mandi-casecsta może być alergizujący.
Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu trzech i pół godziny. Po tej procedurze można również wykonać jednoczesne zapisy z wielu obszarów mózgu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, w jaki sposób reakcje neuronów receptorów smakowych na degustacje są przekształcane, gdy są one przekazywane do postsynaptycznych neuronów docelowych.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia trzy nowe metody badania kodowania gustatorycznego u ćmy Manduca sexta. Techniki obejmują protokół sekcji, pozakomórkowe rejestracje tetradami neuronów receptorów gustatorycznych oraz system dostarczania i monitorowania bodźców gustatorycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia zachowań
- Elektrofizjologia
Tło
- Zrozumienie kodowania gustatorycznego jest kluczowe dla wglądu w przetwarzanie sensoryczne.
- Ćma Manduca sexta służy jako prosty organizm modelowy dla tych badań.
- Rejestracje z wielu neuronów receptorów gustatorycznych mogą wyjaśnić, jak informacje o smaku są kodowane.
- Precyzyjne dostarczanie bodźców gustatorycznych jest niezbędne dla dokładnych wyników eksperymentu.
Cel badania
- Opracowanie metod do rejestracji in vivo neuronów gustatorycznych.
- Zbadanie, jak bodźce gustatoryczne są kodowane przez populacje neuronów receptorów gustatorycznych.
- Dostarczenie wizualnej demonstracji technik sekcji i rejestracji.
Stosowane metody
- Protokół sekcji do przygotowania ćmy do rejestracji neuronowych.
- Wykorzystanie pozakomórkowych tetrodes do rejestracji aktywności neuronalnej.
- System dostarczania i monitorowania czasowych impulsów bodźców gustatorycznych.
- Pomoce wizualne wspomagające nowych badaczy w złożonym procesie sekcji.
Główne wyniki
- Udane rejestracje in vivo z wielu neuronów receptorów gustatorycznych.
- Zdemonstrowano skuteczność systemu dostarczania bodźców gustatorycznych.
- Dostarczono wglądu w kodowanie informacji gustatorycznych.
- Zastosowane wyzwania i rozwiązania w procesie sekcji.
Wnioski
- Opracowane metody są cenne dla badania kodowania gustatorycznego.
- Rejestracje in vivo mogą poprawić zrozumienie przetwarzania smaku.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych technikach, aby dalece zgłębić gust.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding gustatory coding mechanisms provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery, particularly for compounds modulating feeding behavior or metabolic pathways. The ability to record population-level neuronal responses in vivo supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outputs. These methods enable predictive confidence in early discovery by quantifying how tastants are encoded across gustatory receptor neuron populations before downstream signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking tastant identity and concentration to specific patterns of electrical activity across gustatory receptor neuron populations.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct in vivo measurement of neuronal responses before, during, and after stimulus delivery, clarifying target engagement in sensory pathways.
- Scientific Value: Facilitates pathway characterization by revealing how individual neurons contribute to population-level coding, aiding in target selection for modulating feeding-related behaviors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by enabling consistent extracellular recording of multiple gustatory receptor neurons using tetrode arrays.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility through precise temporal control of tastant delivery and real-time monitoring via color sensor feedback, reducing variability in stimulus presentation.
- Scientific Value: Enables screening readiness by generating quantifiable spike train outputs that can be sorted to identify individual neuron responses, supporting reliable compound evaluation in taste-modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking in vivo gustatory receptor neuron activity to downstream brain processing, allowing assessment of how sensory signals are transformed at postsynaptic targets.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing baseline neuronal response profiles that can be used to detect compound-induced alterations in coding fidelity.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by distinguishing between stimulus-locked and sustained neuronal responses, helping to differentiate direct sensory effects from secondary network adaptations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for targets involved in chemosensory signaling and feeding behavior regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling researchers to determine how specific tastants are encoded by defined populations of gustatory receptor neurons, clarifying molecular receptive ranges.
- Screening: Describes assay readiness through stable tetrode recordings that yield consistent spike detection across channels, allowing comparison of neuronal responses under different conditions.
- Analytics: Highlights spike sorting as a key analytical output that assigns action potentials to unique neurons, enabling resolution of individual contributions to population coding.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how gustatory receptor neuron responses propagate to follower neurons in the brain, informing postsynaptic target validation.
- Enterprise Reuse: Positions the tetrode-based recording system as a reusable platform for longitudinal studies, as recordings are longer lasting and more robust than intracellular sharp electrode methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how tastant identity and concentration are represented in neural activity patterns.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through a perfusable preparation that supports repeated recordings and simultaneous multi-area monitoring.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing objective, quantifiable neural readouts that correlate tastant delivery with electrophysiological outcomes, reducing reliance on behavioral proxies alone.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that alter gustatory coding fidelity, enabling early detection of off-target sensory effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, microsurgery, and electrophysiology to successfully expose maxillary nerves and subesophageal zone without damaging delicate structures.
- Dependent on specialized instrumentation including micromanipulators, tetrodes, perfusion systems, and color sensors for tastant delivery and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and wax-sealing protocols to ensure consistent preparation quality across users and laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the approach to other model systems, as the maxillary nerve accessibility and sheath removal techniques are species-specific.
- Includes practical limitations such as the intricate dissection process and allergenic scaling from the moth, which require safety precautions and may limit throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Preparing M. sexta for Brain Surgery
10:03
Conclusion
8:45
Results: Tetrode Recordings of Stimulated Gustatory Receptor Neurons
4:22
Revealing the Subesophageal Zone (SEZ) and Maxillary Nerves
6:00
Tastant Delivery System and Extracellular Tetrode Recording
