Nowe metody badania kodowania smaku

Ogólnym celem tych metod jest badanie kodowania smaku u prostego modelu zwierzęcego poprzez rejestrację aktywności wielu neuronów receptorowych in vivo, przy jednoczesnym podawaniu i monitorowaniu precyzyjnie czasowych impulsów substancji smakowych. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zmysłu smaku, takie jak sposób kodowania smaków przez populacje gustatorycznych neuronów receptorowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość prowadzenia rejestracji in vivo z wielu neuronów gustatorycznych przed, w trakcie i po precyzyjnie podanych bodźcach smakowych.

Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą uznać ją za wymagającą ze względu na złożony przebieg procedury sekcji. Z tego powodu mamy nadzieję, że wizualna demonstracja tej metody okaże się pomocna. Techniki te zostały opracowane przez Sama Writera podczas jego studiów doktoranckich w moim laboratorium, we współpracy z Alejandrą; procedury te zostaną zaprezentowane przez Kui Sun.

Trzy dni po wygryzieniu z poczwarki należy wybrać ćmę dowolnej płci o ogólnie zdrowym wyglądzie. Skrzydła powinny być całkowicie rozprostowane, a ssawka i czułki dobrze wykształcone i nieuszkodzone. W dygestorium należy umieścić wybraną ćmę w rurce stabilizującej tak, aby wystawała jedynie głowa.

Następnie unieruchom ćmę, wkładając papier odkuchenny do drugiego końca probówki. Teraz, używając sprężonego powietrza podawanego za pomocą strzykawki, usuń włosy z odsłoniętej głowy. Następnie umieść probówkę na glinianej platformie w szalce Petriego.

Ustaw głowę stroną grzbietową do góry. Następnie zabezpiecz czułki i trąbkę. W pierwszej kolejności przygotuj osłonki dla każdej z tych struktur, wykorzystując końcówki do pipety 200 µL pocięte na odcinki o długości pół centymetra.

Aby manipulować ssawką, przygotuj haczyk z kawałka drutu. Wysuń ssawkę do jednej z osłonek, aż jej najbardziej proksymalna część zostanie zabezpieczona. Przymocuj rurkę do grzbietowej części torebki głowy, używając twardego wosku batikowego.

Następnie ostrożnie odsuń czułki i zabezpiecz probówki woskiem batikowym. Teraz ustabilizuj mózg poprzez przecięcie mięśnia kompresora klamry. Pod mikroskopem sekcyjnym, używając narzędzi do mikrosekcji, otwórz torebkę głowy, wykonując małe nacięcie tuż poniżej trąbki.

Aby potwierdzić przecięcie mięśnia, podaj roztwór sacharozy do dystalnych dwóch trzecich proboscis i przez pięć minut upewnij się, że proboscis nie wysuwa się. Następnie zamknij torebkę głowy, nakładając warstwę roztopionego wosku batikowego. Aby przeprowadzić perfuzję mózgu solą fizjologiczną, zbuduj woskowy kubek wokół brzusznej strony głowy.

Używając elektrycznego woskownika, zacznij tworzyć woskowąy kubek wzdłuż przedniej części głowy, przesuwając się w stronę tyłu. Rurki obejmujące aparat gębowy (proboscis) i czułki powinny pozostać wewnątrz kubka. Kontynuuj budowanie kubka na zewnątrz i w górę, aż osiągnie on poziom oczu.

Za pomocą pęsety należy ująć palpy chułkowe i przymocować je do woskowego naczynia, używając roztopionego wosku. Następnie należy uszczelnić wszelkie otwory w naczyniu woskowym i probówkach, nakładając cienką warstwę żywicy epoksydowej. Żywicę należy wymieszać za pomocą wykałaczki.

Najpierw pokryj zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie kubka. Po drugie, wypełnij część rurki stabilizującej otaczającej szyję, aby głowa była utrzymywana bardziej stabilnie. Po 20 minutach sprawdź, czy kubek nie przecieka.

Aby rozpocząć operację mózgu, najpierw odetnij palpy wargowe. W celu otwarcia strony brzusznej torebki głowowej, przetnij kutykulę wzdłuż tylnej i przedniej części głowy oraz wokół oczu. Następnie przetnij tył głowy i wykonaj dodatkowe nacięcia w przedniej części głowy w pobliżu trąbki.

Następnie, ostrożnie unieś pęsetą płat kutykuli, aby odsłonić mózg. Teraz wykonaj najważniejszy krok: odsłonięcie SEZ i nerwów szczękowych. Powoli i starannie usuń tkankę tłuszczową oraz tchawicę.

Często płucz mózg świeżym roztworem soli fizjologicznej. Zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ nerwy szczękowe są bardzo podatne na zmiażdżenie. Gdy SEZ i nerwy szczękowe staną się widoczne, będą one pokryte cienką osłoną.

Aby usunąć tę osłonkę, należy odlać nadmiar soli fizjologicznej, a następnie osłabić osłonkę, aplikując 10% roztwór kolagenazy dispase. Po pięciominutowym moczeniu należy kilkukrotnie wypłukać roztwór solą fizjologiczną. Następnie, po kilku płukaniach solą fizjologiczną, należy delikatnie usunąć osłonkę za pomocą superprecyzyjnej pęsety do mikrosekcji.

Na koniec zamocuj linię kroplową z solą fizjologiczną w naczyniu perfuzyjnym. W tej sekcji opisano sposób konstrukcji i wykorzystania systemu podawania tastantów. System składa się z probówki testowej z kilkoma otworami.

Otwory umożliwiają wprowadzenie trąbki zwierzęcia, różnorodnych substancji smakowych oraz czujnika koloru, a także pozwalają na przepływ wody. Aby zbudować ten system, należy najpierw przygotować probówkę dla trąbki. Za pomocą lutownicy wykonaj otwór o rozmiarze odpowiadającym szerokości trąbki.

Następnie należy zbudować wewnątrz rurki sekcję z siatką, która utrzyma proboscis w odpowiednim miejscu. Wyciąć otwór 5 mm powyżej otworu, przymocować tam siatkę za pomocą wosku, a następnie ponownie połączyć rurki, używając wosku i epoksydu. Do podawania substancji smakowych należy użyć ciśnieniowego systemu perfuzji.

Podłącz do kolektora tyle probówek z substancją smakową, ile jest wymagane. Aby podłączyć rurkę wylotową substancji, wykonaj otwór około jednego centymetra powyżej siatki, a następnie przymocuj do niego rurkę wylotową za pomocą żywicy epoksydowej. Do każdej substancji smakowej dodaj sztuczny barwnik, który zostanie wykryty przez czujnik koloru.

Przymocuj czujnik koloru do aparatury w otworze oddalonym o pół centymetra od siatki i zabezpiecz go za pomocą epoksydu. Użyj pompy perystaltycznej do podawania wody destylowanej do układu poprzez rurkę silikonową. Zbierz odpłynną wodę do dużego pojemnika.

Użyj pompy pneumatycznej do podawania substancji smakowych za pomocą podmuchów powietrza. Następnie zacznij pompować czystą wodę przez rurki i podawaj impulsy substancji smakowej, aby przetestować czujnik koloru. Teraz wprowadź dwie trzecie ssawki ćmy do rurki testowej.

Za pomocą pęsety wysuń proboscis i delikatnie wprowadź go do otworu. Następnie uszczelnij proboscis w miejscu wprowadzenia, używając miękkiego wosku dentystycznego oraz warstwy żywicy epoksydowej. Teraz podłącz linię perfuzji solą fizjologiczną i ustaw przepływ perfuzji.

Następnie zanurz elektrodę uziemiającą skręconej tetrody drutowej w kąpieli solnej. Potem, za pomocą mikromanipulatora, ustaw tetrodę obok nerwu szczękowego i powoli wprowadź ją do nerwu. Po wykryciu sygnałów impulsowych pozwól preparatowi stabilizować się przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem rejestracji.

Rejestracje z neuronów receptorowych smaku przeprowadzono przed, w trakcie i po podaniu substancji smakowych zgodnie z opisanym protokołem. Początek i koniec jednosekundowego impulsu każdej substancji smakowej monitorowano za pomocą czujnika koloru. Substancje smakowe wywoływały potencjały czynnościowe, które były wykrywane przez każdy z czterech kanałów.

W obrębie serii impulsów (spike trains) można było zaobserwować poszczególne potencjały czynnościowe. Do przypisania tych impulsów do poszczególnych neuronów wykorzystano oprogramowanie do sortowania impulsów (spike sorting). Odpowiedź trzech różnych neuronów receptorowych smaku na sześć substancji smakowych podawanych sekwencyjnie wykazuje różne poziomy aktywności podstawowej oraz różną selektywność względem bodźców smakowych.

Ponadto odpowiedzi charakteryzowały się różnym czasem trwania. Niektóre były zsynchronizowane z czasem trwania bodźca, podczas gdy inne trwały dłużej niż bodziec. Rejestracje wewnątrzkomórkowe można było również przeprowadzić z aksonów receptorów smakowych, wykorzystując konwencjonalne ostre elektrody szklane.

Rejestracje wewnątrzkomórkowe były bardzo podobne do odpowiedzi zaobserwowanych przy użyciu opisanego techniki tetrodowej, jednak rejestracje tetrodowe były łatwiejsze do wykonania, trwalsze i bardziej stabilne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie odsłonić nerwy szczękowe oraz strefę podprzełykową u mandi-casecsta, a także zbudować system podawania substancji smakowych z precyzyjną kontrolą czasową. Podczas wykonywania tego protokołu należy nosić laboratoryjne rękawice ochronne oraz maseczkę, ponieważ drobny, proszkowy naskórek zrzucany przez mandi-casecsta może być alergizujący.

Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w ciągu trzech i pół godziny. Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest również przeprowadzanie jednoczesnych pomiarów z wielu obszarów mózgu w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób przekształcania odpowiedzi neuronów receptorowych smakowych na substancje smakowe podczas ich przekazywania do postsynaptycznych neuronów docelowych.