Metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much
October 28th, 2017
Przedstawiono metodę ilościowego określania głównych cech czasowych obserwowanych w rytmach okołomotorycznych much. Kwantyfikacja jest osiągana poprzez dopasowanie aktywności muchy do wieloparametrycznego kształtu fali modelowej. Parametry modelu opisują kształt i wielkość porannych i wieczornych szczytów dziennej aktywności.
U większości zwierząt zegary okołodobowe koordynują procesy behawioralne i molekularne oraz synchronizują je z codziennym cyklem światła i ciemności. U muszek owocowych zegar jest zwykle badany za pomocą nagrań lokomotorycznych. Oto przykład przeciętnej lokomocji typu dzikiego mierzonej w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym cyklu ciemności, cyklu światło-ciemność pokazanego z żółto-czarnym paskiem na górze.
Typowe nagranie muchy pokazuje złożony, biomodalny wzór z dwoma szczytami aktywności, porannym szczytem, który ma miejsce około świtu i wieczornym szczytem, który ma miejsce o zmierzchu. Te dwa piki razem tworzą kształt fali, który bardzo różni się od sinusoidalnych oscylacji obserwowanych w genach zegara, co sugeruje, że mechanizmy, oprócz zegara, mają głęboki wpływ na tworzenie obserwowanego wzorca w danych behawioralnych. Tutaj przedstawiamy pierwszą metodę, która matematycznie opisuje wzorce czasowe w aktywności much.
Dopasowujemy dane dotyczące aktywności do modelowego kształtu fali, który naśladuje lokomocję muchy. Nasz model składa się z czterech wyrazów wykładniczych, dwóch składników ze szczytu porannego i dwóch składników ze szczytu wieczornego. Wraz z okresem okołodobowym nasz model ma dziewięć niezależnych parametrów.
Parametry B definiują tempo porannego wzrostu, porannego zaniku, wieczornego wschodu i wieczornego zaniku. TM i TE definiują szerokości szczytów porannych i wieczornych, a HM i HE definiują wysokości szczytów. Razem parametry te w pełni opisują wielkość i kształt porannych i wieczornych szczytów we wzorcu aktywności.
Nasza metoda może być zastosowana do wyjaśnienia mechanizmów i substratu, które leżą u podstaw powszechnie obserwowanego wzorca aktywności bimodalnej w odczytach lokomotorycznych much. Do eksperymentu z lokomocją, przygotuj pojedyncze rurki z jedzeniem na jednym końcu i bawełną na drugim. W tym celu najpierw umieść od pięciu do sześciu gramów pokarmu dla much w 50-mililitrowej zlewce.
Pokrój jedzenie na małe kawałki, aby łatwiej było je stopić w kuchence mikrofalowej. Pojedynczy monitor aktywności mieści 32 pojedyncze rurki. Dlatego weź 32 rurki i połącz je ze sobą za pomocą gumki.
Rozpuść jedzenie w zlewce w kuchence mikrofalowej. Podgrzewaj jedzenie przez około 10 do 15 sekund. Wyłączaj kuchenkę mikrofalową co pięć sekund i lekko potrząśnij zlewką z jedzeniem, aby zapewnić równomierne stopienie żywności.
Upewnij się, że cała żywność jest stopiona i że w zlewce nie pozostały żadne stałe kawałki jedzenia. Gdy pokarm jest jeszcze płynny, włóż probówki do zlewki z jedzeniem. Przesuń rurki trochę w górę i w dół, aby były równomiernie wypełnione.
Pozwól potrawie ostygnąć i zestalać się przez około godzinę. Gdy żywność stwardnieje, wyjmij rurki z zlewki, wykonując ruch obrotowy, aby żywność nie przykleiła się do dna zlewki. Następnie zdejmij gumkę.
Uszczelnij koniec jedzeniem za pomocą wosku. W tym celu najpierw ostrożnie wytrzyj tubę ręcznikiem papierowym. Następnie dociśnij rurkę do wosku.
Sprawdź wzrokowo jakość uszczelki i, jeśli to konieczne, powtórz uszczelnienie ponownie. Korzystając z tej techniki, uszczelnij wszystkie probówki do eksperymentu. Drugi koniec rurek zamyka się bawełną.
Bawełna przepuści powietrze, jednocześnie utrzymując muchy zamknięte w rurkach. Jest również łatwy do wyjęcia i ponownego włożenia, co przyda się, gdy będziemy ładować rurki muchami do eksperymentu. Teraz, gdy probówki są gotowe, załaduj je muchami do eksperymentu.
W tym celu rozładuj muchy na podkładce za pomocą CO2. Następnie za pomocą pędzla ostrożnie umieść pojedynczą muchę w każdej pojedynczej tubce. Umieść rurkę z muchą w monitorze.
W tej samej kolejności, co na monitorze, lokomocja much będzie rejestrowana w pliku wyjściowym przez system monitora. Podłącz monitor do komputera i umieść go w inkubatorze, który utrzymuje stałą temperaturę i wilgotność. Na podstawie eksperymentu ustaw odpowiednie warunki światła/ciemności.
W przypadku eksperymentu światło/ciemność trzymaj muchy w cyklu światło-ciemność przez cały eksperyment. W analizie nie należy wykorzystywać pierwszego dnia pomiarów. W przypadku eksperymentu z ciągłą ciemnością, najpierw trzymaj muchy przez dwa dni w warunkach jasnych/ciemnych w celu porwania i synchronizacji zegarów, a następnie przełącz się na ciągłą ciemność.
W analizie nie należy używać pomiarów z pierwszego dnia ciągłej ciemności. Przed przejściem do następnej sekcji zalecamy zapoznanie się z protokołem. System monitorujący wyśle pojedynczy plik, który zawiera aktywność wszystkich much w monitorze.
Ostatnie 32 kolumny pliku wyjściowego zawierają aktywność poszczególnych much. Nasz program działa z ćwiczeniami w locie pojedynczym. W związku z tym podziel plik wyjściowy na wiele pojedynczych plików aktywności lotu.
Każdy plik powinien być jednokolumnowym plikiem TXT. Teraz, po przygotowaniu plików aktywności, możemy przeprowadzić naszą analizę. Uruchom funkcję ModelFitPS3 w oknie poleceń programu MATLAB z następującymi parametrami wejściowymi.
Częstotliwość próbkowania, umieść interwał próbkowania danych w sekundach. Na przykład nasze dane zostały pobrane z 20-sekundową częstotliwością próbkowania. Dlatego umieściliśmy tutaj 20
.Jako interwał kosza umieść przedział czasu w minutach, do którego dane zostaną podzielone na kosze w celu lepszej wizualizacji. Zalecamy binowanie do 20 lub 30 minut, ale na razie wstawię tutaj 10, aby później pokazać, jak można to łatwo zmienić. W polu trend umieść jeden, jeśli dane pokazywały trend bazowy, a w przeciwnym razie zero.
Nasze dane nie mają żadnego trendu bazowego. Dlatego umieściłem tutaj zero. Naciśnij Enter, aby uruchomić funkcję.
W wyskakującym okienku wybierz plik aktywności pojedynczego lotu i naciśnij Otwórz. Program obliczy i wykreśli widmo mocy danych. W tym oknie określ okres podstawowy w danych.
W tym celu kliknij lewym przyciskiem myszy na szczycie w okresie okołodobowym lub prawym przyciskiem myszy na szczycie w drugiej harmonicznej, replikowanej w przybliżeniu w okresie okołodobowym podzielonej przez dwa. W naszym przypadku szczyt na drugiej harmonicznej jest znacznie większy i ostrzejszy niż szczyt w okresie okołodobowym. Dlatego korzystamy z drugiej opcji.
Następnie program wykreśli dane podzielone na wybrane interwały przedziału. Jak widać, przy 10-minutowym interwale poranny i wieczorny szczyt nie są zbyt dobrze zwizualizowane. Dlatego chcemy zmienić tę wartość.
Aby to zrobić, po prostu kliknij prawym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu wykresu. W nowym oknie dialogowym wpisz nową wartość interwału przedziału. Zalecamy kategoryzację do 20-minutowego interwału czasowego.
Dlatego umieściliśmy tutaj 20. Naciśnij przycisk OK. Program natychmiast przerysowuje dane z nową wartością przedziału przedziału. Aby zaakceptować tę wartość, po prostu kliknij lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu wykresu.
Program przerysuje teraz dane i pokaże tylko pięć dni pomiaru. W tym oknie wybierz pierwszy poranny szczyt, który zostanie użyty w analizie. Czasami konieczne jest pominięcie pierwszego lub dwóch dni, co zajmuje muchom przystosowanie się do cyklu światła i ciemności.
Aby wybrać szczyt poranny, po prostu kliknij na preferowany szczyt. Program przerysuje dane i teraz pokaże tylko trzy dni pomiarów, zaczynając od wybranego porannego szczytu. Niebieskie i czerwone pionowe linie pokazują pierwszy szczyt wieczorny i drugi szczyt poranny w oparciu o okres wybrany w pierwszym oknie.
W tym oknie należy wybrać punkt, w którym rura jest używana do wstępnego dopasowania danych do funkcji modelu. W tym celu kliknij następujące punkty w tej konkretnej kolejności. Najpierw kliknij na górę pierwszego porannego szczytu.
Kliknięcie jest oznaczone czerwoną gwiazdką na dole, pokazującą lokalizację kliknięcia. Następnie kliknij na koniec szczytu porannego, następnie na początek szczytu wieczornego, następnie na szczyt szczytu wieczornego, następnie na koniec szczytu wieczornego, a na końcu szczytu porannego następnego dnia. Program ponownie wykreśli widmo mocy, ponieważ ostateczne parametry są uzyskiwane na podstawie dopasowania spektralnego.
Widmo jest teraz wykreślane jako częstotliwość na osi x, a szczyt okołodobowy znajduje się po lewej stronie wykresu. Okres wyznaczony w pierwszym kroku jest pokazany czerwoną pionową linią. Aby wybrać punkty dopasowania, najpierw z grubsza określ okres podstawowy.
W tym celu kliknij lewym przyciskiem myszy na szczyt w okresie okołodobowym lub kliknij prawym przyciskiem myszy na szczyt na drugiej harmonicznej. Ponownie skorzystamy z drugiej opcji. Następnie na dole pojawi się suwak, aby wybrać punkty do dopasowania spektralnego.
Punkty będą oznaczone czerwonymi kółkami i pojawią się po przesunięciu suwaka. Przesuń suwak w lewo i w prawo, a następnie umieść punkty jak najbliżej wierzchołków szczytów widmowych. Po uzyskaniu najlepszego obrazu naciśnij przycisk Akceptuj, a program dopasuje wybrane punkty do wyrażenia analitycznego dla widma mocy modelu.
Po dopasowaniu program wyświetli dwa dodatkowe wykresy. Pierwszym z nich jest widmo mocy modelu zbudowanego z wyodrębnionych parametrów. Drugi to dane dopasowane do modelu.
Dane są oznaczone czarną linią, a model jest pokazany czerwoną linią. Można zauważyć, że funkcja jest bardzo zbliżona do danych, zwłaszcza z ostatnich trzech dni aktywności. Wyodrębnione parametry są zapisywane w pliku TXT parametrów dopasowania modelu.
Po nazwie pliku parametry są zapisywane w następującej kolejności, najpierw b porannego zaniku, następnie b porannego wschodu, b wieczornego wschodu, b wieczornego zaniku, okresu okołodobowego, następnie szerokość porannego szczytu podzielona przez okres okołodobowy, szerokość szczytu wieczornego podzielona przez okres okołodobowy, wysokość porannego szczytu, wysokość szczytu wieczornego oraz błąd dopasowania widmowego. Oprócz pliku parametrów pasowania modelu program wygeneruje również dwa dodatkowe pliki. Pierwszym z nich jest dopasowanie danych do funkcji modelu, a drugim jest dopasowanie spektralne.
Wykonaj tę analizę z innymi plikami działań. Wszystkie wyodrębnione parametry są zapisywane w pliku TXT parametrów dopasowania modelu i mogą być dalej wykorzystywane do łączenia danych wyjściowych zachowania behawioralnego z podstawowymi mechanizmami, które regulują codzienne zachowanie muchy kontrolowane przez wzorzec aktywności modelu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje nową metodę kwantyfikacji cech czasowych rytmów aktywności okołodobowej u much owocowych. Poprzez dopasowanie danych o aktywności much do wieloparametrycznego modelu falowego, praca charakteryzuje szczyty poranne i wieczorne codziennej aktywności.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Chronobiologia
- Analiza Behawioralna
Wprowadzenie
- Zegary okołodobowe regulują procesy behawioralne i molekularne u zwierząt.
- Muchy owocowe służą jako organizm modelowy do badania rytmów okołodobowych.
- Rejestracje aktywności wykazują skomplikowane wzorce aktywności w odpowiedzi na cykle światło-ciemność.
- Zrozumienie tych rytmów może dostarczyć wskazówek dotyczących szerszych mechanizmów biologicznych.
Cel Badania
- Opracowanie modelu matematycznego do opisu wzorców aktywności much.
- Kwantyfikacja odrębnych szczytów aktywności obserwowanych u much owocowych.
- Wzmocnienie zrozumienia mechanizmów rytmu okołodobowego wykraczającego poza tradycyjne modele.
Wykorzystane Metody
- Rejestracje aktywności much dzikich typów.
- Analiza wzorców aktywności w cyklu 12-godzinnym światło/ciemność.
- Dopasowanie danych o aktywności do wieloparametrycznego modelu falowego.
- Charakteryzacja szczytów aktywności porannej i wieczornej.
Główne Wyniki
- Identyfikacja dwóch odrębnych szczytów aktywności w dobowym rytmie.
- Demonstracja złożonego, bimodalnego wzorca w aktywności much.
- Parametry modelu skutecznie opisują kształt i wielkość szczytów aktywności.
- Wgląd w dodatkowe mechanizmy wpływające na wzorce behawioralne.
Wnioski
- Proponowana metoda zapewnia solidną platformę do analizy rytmów okołodobowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia danych behawioralnych w odniesieniu do zegarów okołodobowych.
- Przyszłe badania mogą bazować na tym modelu, aby zbadać inne aspekty biologii zegarów okołodobowych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying circadian locomotor patterns in Drosophila enables mechanistic de-risking of target validation by linking behavioral outputs to underlying kinetic parameters. This computational approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible metrics for pathway interrogation. The method supports early discovery workflows by standardizing complex bimodal activity data into interpretable parameters for cross-functional collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying morning and evening peak kinetics in fly locomotor rhythms.
- Operational Value: Provides nine independent parameters that fully describe peak shape and size for consistent biological de-risking.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in target selection by elucidating substrate mechanisms beyond core clock oscillations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs from complex bimodal patterns for reliable compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through model-based fitting of activity data to a four-exponential waveform.
- Strategic Value: Facilitates platform reuse by extracting comparable parameters across genetic or pharmacological conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects behavioral phenotypes to mechanistic substrates underlying circadian-regulated processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating extracted parameters with molecular or pathway readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in locomotor-based preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by converting raw locomotor data into quantifiable parameters for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by modeling activity peaks as outputs of kinetic substrate interactions.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via model-fitted parameters that capture morning and evening peak dynamics.
- Analytics: Provides statistical outputs including peak height, width, and decay rates for comparative condition analysis.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by linking behavioral metrics to mechanistic de-risking in circadian-related pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable computational framework for standardizing circadian behavioral analysis across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic insight into bimodal activity regulation beyond transcriptional clocks.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via nine-parameter model fitting of locomotor waveforms.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative dissection of morning and evening peak contributions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in circadian biology and MATLAB-based spectral and model fitting.
- Depends on activity monitoring infrastructure and controlled light/dark incubation systems.
- Necessitates cross-team standardization of binning, trend correction, and peak selection protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the model to non-standardized fly strains or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as sensitivity to baseline trends and initial transient adaptation periods in locomotor data.
