Name: Metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj metodę obliczeniową do ilościowego określania aktywności okołodobowej much. Naucz się analizować wzorce aktywności porannej i wieczornej przy użyciu modelu matematycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Stanislavowi Lazopulo za pomoc przy tworzeniu treści wideo.

1. Pomiar lokomocji much za pomocą monitora aktywności Drosophila (DAM)
UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zobacz reference5.
<ol>
	<li>Przygotuj pojedyncze rurki na muchy z jedzeniem na jednym końcu i bawełną z drugiej. Koniec z jedzeniem powinien być szczelnie zamknięty, aby zapobiec wysychaniu żywności.
	<ol>
		<li>Umieść 5-6 g pokarmu na muchy w zlewce o pojemności 50 ml. Pokrój jedzenie na małe kawałki, aby łatwiej było je stopić.</li>
		<li>Połącz 32 pojedyncze szklane rurki za pomocą gumowej opaski.</li>
		<li>Rozpuść żywność w zlewce, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej przez 10-15 s. Zatrzymaj kuchenkę mikrofalową co 5 sekund i ostrożnie potrząśnij zlewką, aby zapewnić równomierne stopienie żywności.</li>
		<li>Gdy pokarm jest jeszcze płynny, włóż przygotowane pojedyncze probówki do zlewki z jedzeniem. Przesuwaj rurki w górę i w dół, aby były równomiernie wypełnione.</li>
		<li>Pozostaw żywność do ostygnięcia i zestalenia się przez około 1 godzinę.</li>
		<li>Gdy pokarm stwardnieje, wyjmij rurki z żywnością ze zlewki.</li>
		<li>Uszczelnij koniec zawierający żywność za pomocą wosku. Najpierw ostrożnie wyczyść tubkę ręcznikiem papierowym, a następnie dociśnij rurkę do wosku. Sprawdź wzrokowo jakość uszczelki i, jeśli to konieczne, powtórz uszczelnienie ponownie.</li>
		<li>Zamknij drugi koniec rurki bawełną; bawełna pozwoli na przepływ powietrza, jednocześnie utrzymując muchę zablokowaną w tubie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść pojedynczą muchę w każdej pojedynczej rurce i umieść rurki w DAM.</li>
	<li>Umieść monitory w inkubatorze, który utrzymuje stałą temperaturę i wilgotność. Na podstawie eksperymentu ustaw odpowiednie warunki światła/ciemności w następujący sposób.
	<ol>
		<li>W przypadku eksperymentów światło/ciemność utrzymuj muchy w cyklu światło/ciemność przez cały eksperyment. W analizie nie należy wykorzystywać pierwszego dnia pomiarów.</li>
		<li>W przypadku eksperymentów z ciągłą ciemnością, najpierw trzymaj muchy przez dwa dni w jasnych/ciemnych warunkach w celu porwania i synchronizacji zegarów, a następnie przełącz się na ciągłą ciemność. W analizie nie należy wykorzystywać pomiarów z pierwszego dnia ciągłej ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz dane z co najmniej czterech dni, które można wykorzystać w analizie. 
	UWAGA: System DAM wyśle pojedynczy plik z nagraniem lokomocji wszystkich much w monitorze.</li>
</ol>
2. Analiza danych
<ol>
	<li>Podziel plik wyjściowy monitora na wiele pojedynczych plików aktywności muchy; każdy plik powinien być jednokolumnowym plikiem ".txt" z indywidualnym pomiarem lokomocji much.</li>
	<li>Uruchom funkcję "ModelFitPS3.m" w oknie poleceń Matlab z następującymi parametrami wejściowymi:
	<ol>
		<li>W przypadku częstotliwości próbkowania ustaw interwał próbkowania danych w sekundach. Na przykład, jeśli aktywność była mierzona co minutę, wprowadź 60 jako częstotliwość próbkowania.</li>
		<li>W przypadku bin_interval ustaw przedział czasu w minutach, do którego dane będą grupowane, aby uzyskać lepszą wizualizację; zalecany interwał przedziału to 20-30 minut.</li>
		<li>W polu trend wprowadź wartość "1", jeśli dane pokazują trend bazowy, a w przeciwnym razie "0"; dane z trendem zostaną najpierw zdetrendyzowane przez dopasowanie wielomianu drugiego rzędu, a następnie odjęcie go od danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W wyskakującym okienku wybierz plik pojedynczej aktywności lotu. 
	Uwaga: Pierwszy wykres to widmo mocy danych, a nie znany wykres aktywności. Z wykreślonego widma mocy wyznacz okres pierwotny T0: Kliknij lewym przyciskiem myszy na szczycie okołodobowym lub prawym przyciskiem myszy na drugim piku harmonicznej (około T0/2).</li>
	<li>Na otwartym wykresie danych sprawdź, czy poranne i wieczorne szczyty są dobrze zwizualizowane. Jeśli nie, zmień wartość bin_interval, klikając prawym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu wykresu i wprowadzając nową wartość bin_interval w oknie dialogowym. Program przerysuje dane z nową wartością interwału. Aby zaakceptować wartość bin_interval, kliknij lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu wykresu.</li>
	<li>Program ponownie narysuje dane i pokaże pierwsze pięć dni aktywności. Na tym wykresie kliknij pierwszy pik M, który zostanie wykorzystany w analizie (czasami konieczne jest pominięcie jednego lub dwóch dni). 
	UWAGA: Program przerysuje wykres, zaczynając od wybranego porannego szczytu. Niebieskie i czerwone linie pokażą przybliżoną pozycję odpowiednio piku E i piku M następnego dnia, w oparciu o okres określony w kroku 2.4.</li>
	<li>Na tym samym wykresie wybierz dane do wstępnego dopasowania danych do modelu: Kliknij następujące punkty (w tej kolejności; zwróć uwagę, że miejsce kliknięcia będzie oznaczone czerwoną gwiazdką na dole): (i) Szczyt szczytu M; (ii) koniec piku M; (iii) początek szczytu E; (iv) wierzchołek szczytu E; (v) koniec piku E; (vi) Wierzchołek szczytu M z dnia następnego.</li>
	<li>Zauważ, że program prezentuje teraz widmo mocy. 
	UWAGA: Oś x jest teraz podana w częstotliwości.
	<ol>
		<li>W otwartym oknie z widmem mocy wskaż punkty, które zostaną użyte do dopasowania wyrażenia analitycznego dla widma mocy modelu. Okres wykryty w kroku 2.4 jest oznaczony czerwoną linią. Aby wybrać punkty dopasowania, najpierw z grubsza określ okres podstawowy, podobnie jak w kroku 2.4. Następnie za pomocą suwaka dostosuj wartość okresu podstawowego tak, aby punkty dopasowania (oznaczone czerwonymi kółkami, pojawią się po przesunięciu suwaka) były zamknięte do wartości szczytowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wizualnym wybraniu piku kliknij "Akceptuj", a program dopasuje wybrane punkty do wyrażenia analitycznego w celu obliczenia parametrów modelu.</li>
	<li>Należy pamiętać, że parametry i błąd dopasowania spektralnego są zapisywane do pliku "model_fit_parameters.txt"; program dodatkowo zapisze 2 figury z pasowaniami danych lokomotywy i jej widma mocy.</li>
</ol>

<ol><li>Pittendrigh, C. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4615-6552-9_5">Circadian systems: general perspective.</a> Biological Rhythms. II, 57-80 (1981).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (11), 764-776 (2010).</li>
<li>Tataroglu, O., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+ticks+of+the+Drosophila+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">The molecular ticks of the Drosophila circadian clock.</a> Curr Opin Insect Sci. 7, 51-57 (2015).</li>
<li>Plautz, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+period+gene+transcription+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila period gene transcription in living animals.</a> J Biol Rhythms. 12 (3), 204-217 (1997).</li>
<li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor+activity+to+study+circadian+rhythms+and+sleep+parameters+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila.</a> J Vis Exp. (43), e2157(2010).</li>
<li>Helfrich-Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+morning+and+evening+components+in+the+activity+rhythm+of+Drosophila+melanogaster--sex-specific+differences+suggest+a+different+quality+of+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster--sex-specific differences suggest a different quality of activity.</a> J Biol Rhythms. 15 (2), 135-154 (2000).</li>
<li>Dautzenberg, F. M., Neysari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible+binding+kinetics+of+neuropeptide+Y+ligands+to+Y2+but+not+to+Y1+and+Y5+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Irreversible binding kinetics of neuropeptide Y ligands to Y2 but not to Y1 and Y5 receptors.</a> Pharmacology. 75 (1), 21-29 (2005).</li>
<li>Lazopulo, A., Syed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+provides+mechanistic+links+to+temporal+patterns+in+Drosophila+daily+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A mathematical model provides mechanistic links to temporal patterns in Drosophila daily activity.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 14(2016).</li>
<li>Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+positional+tracking+for+long-term+analysis+of+Drosophila+sleep+and+locomotion+using+the+%26%2334%3Btracker%26%2334%3B+program%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the &#34;tracker&#34; program.</a> PloS ONE. 7 (5), e37250(2012).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neural+Network+Underlying+Circadian+Entrainment+and+Photoperiodic+Adjustment+of+Sleep+and+Activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Neural Network Underlying Circadian Entrainment and Photoperiodic Adjustment of Sleep and Activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
<li>Guo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+neuron+feedback+controls+the+Drosophila+sleep-activity+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian neuron feedback controls the Drosophila sleep-activity profile.</a> Nature. 536 (7616), 292-297 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiono instrukcje dotyczące korzystania z narzędzia obliczeniowego, które dostarcza ilościowego opisu wzorca lokomocji much. Narzędzie dopasowuje dane dotyczące lokomocji do modelu matematycznego składającego się z czterech wyrazów wykładniczych, które razem opisują kształt i rozmiar pików M i E. Ostateczne wartości parametrów modelu uzyskuje się poprzez dopasowanie widm mocy danych, gdzie użycie surowych danych może uniknąć artefaktów, które grupowanie lub filtrowanie danych może nałożyć na war...

Zegar okołodobowy jest endogennym oscylatorem biochemicznym o okresie około 24 godzin i jest prawie wszechobecny u zwierząt i roślin1,2. Zegar pomaga zsynchronizować wewnętrzne procesy i zachowanie organizmu z zewnętrznym cyklem ciemności światła. Struktura genetyczna zegara okołodobowego jest szeroko badana od lat sześćdziesiątych XX wieku przy użyciu muszki owocowej D. melanogaster. U tego owada rdzeń zegara okołodobowego składa się z czterech białek: PERIOD, TIMELESS, CLOCK i CYCLE. Te podstawowe składniki wraz z innymi cząsteczkami tworzą pętlę sprzężenia zwrotnego, która wytwarza prawie sinusoidalne oscylacje genów zegara3,4. Zegar okołodobowy u much jest szeroko badany za pomocą wielodniowych zapisów lokomotyw, w których aktywność much jest wykrywana za pomocą pojedynczej wiązki podczerwonej przecinającej środek pojedynczej rury5. Typowy zapis muchy ma złożony wzorzec bimodalny z dwoma dobrze rozróżnialnymi szczytami: poranny szczyt (M), który zaczyna się pod koniec nocy i osiąga maksimum, gdy włączają się światła; oraz Szczyt wieczorny (E), który rozpoczyna się pod koniec dnia i osiąga maksimum, gdy wyłączają się światła6. Co ciekawe, kształt takiego zapisu behawioralnego bardzo różni się od prostych oscylacji sinusoidalnych obserwowanych na poziomie molekularnym, co sugeruje działanie dodatkowych mechanizmów składających się na obserwowane wzorce czasowe. Aby lepiej zrozumieć te ukryte mechanizmy, opracowaliśmy narzędzie obliczeniowe, które zapewnia ilościowy opis wzorców czasowych.
W naszej pracy rytmy lokomotoryczne są definiowane w kategoriach kształtu fali, który naśladuje wzorzec aktywności muchy. Ponieważ proste fale sinusoidalne nie mogą być używane do modelowania obserwowanych rytmicznych zmian aktywności, przetestowaliśmy różne kształty sygnału, aby wybrać najprostszy, który uchwyci wszystkie istotne cechy widoczne na nagraniach. Zachowanie okołodobowe muszki owocowej jest kontrolowane przez aktywność neuronów zegarowych, które często mają wykładnicze wzorce aktywacji i dezaktywacji7. Dynamika wykładnicza i wizualna analiza danych zmotywowały nas do zbudowania modelu z wyrazami wykładniczymi składającego się z czterech wykładników z dziewięcioma niezależnymi parametrami i bardzo przypominającego wzorzec aktywności muchy8. Oprócz danych dotyczących lokomotywy analizujemy również jej spektrum mocy. Typowe spektrum aktywności muchy wykazuje wiele pików przy harmonicznych T0/2, T0/3 itd., oprócz oczekiwanego podstawowego piku w okresie okołodobowym T0. Zgodnie z twierdzeniem Fouriera, tylko czysta fala sinusoidalna wytwarza pojedynczy pik w widmach mocy, podczas gdy bardziej złożone przebiegi wykazują wiele pików widmowych w harmonicznych okresu pierwotnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W związku z tym, biorąc pod uwagę niesinusoidalny wzorzec czasowy w aktywności much8, wieloszczytowe widmo mocy danych jest matematycznie oczekiwane i niekoniecznie oznacza obecność wielu okresów oscylacji. Co ważne, widmo mocy proponowanego modelowego kształtu fali pokazuje również piki na wszystkich harmonicznych okresu pierwotnego, podobnie jak w przypadku nagrań lokomotyw muchowych, podkreślając w ten sposób wysoką wierność, z jaką nasz model opisuje dane o muchach zarówno w czasie, jak i częstotliwości.
Przy rozdzielczościach czasowych wynoszących kilka minut lub mniej, dane o aktywności lotu wydają się zaszumione, co utrudnia wydobycie parametrów bezpośrednio z surowych danych. Grupowanie danych w dłuższe interwały czasowe może zmniejszyć poziom szumu, ale może zmienić dane w sposób, który może mieć wpływ na szacowanie parametrów modelu. W związku z tym uzyskujemy parametry z widm mocy zapisów, używając wyrażenia analitycznego dla oczekiwanych widm mocy obliczonych z transformaty Fouriera funkcji modelu8 (patrz Plik dodatkowy 1 w odnośniku8). Takie podejście polegające na uzyskiwaniu parametrów z widm mocy daje dokładne wartości parametrów bez żadnych dodatkowych manipulacji, takich jak kategoryzowanie lub filtrowanie surowych danych dotyczących aktywności. Szczegóły matematyczne modelu i zastosowania do danych typu dzikiego i zmutowanego są opisane w reference8. Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na instrukcjach krok po kroku dotyczących korzystania z narzędzia obliczeniowego.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Activity Monitor</td><td>TriKinetics</td><td>DAM2, DAM5</td><td>Mierzy locootion much za pomocą pojedynczej wiązki podczerwieni</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Środowisko obliczeniowe i język programowania, MatLab powinien zawierać zestawy narzędzi do optymalizacji i matematyki symbolicznej</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster&nbsp;</td><td></td><td>per[S], per[L], iso31(typ dziki)</td><td>Naszą analizę można przeprowadzić na mutantach much w dowolnym okresie okołodobowym</td></tr></tbody></table>

metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

U większości zwierząt i roślin, zegary okołodobowe koordynują procesy behawioralne i molekularne oraz synchronizują je z codziennym cyklem światło-ciemność. Podstawowe mechanizmy, które leżą u podstaw tej czasowej kontroli, są szeroko badane na przykładzie muszki owocowej Drosophila melanogaster jako organizmu modelowego. U much zegar jest zwykle badany poprzez analizę wielodniowego zapisu lokomotorycznego. Takie nagranie pokazuje złożony wzorzec bimodalny z dwoma szczytami aktywności: porannym szczytem, który ma miejsce około świtu, i wieczornym szczytem, który ma miejsce o zmierzchu. Te dwa piki razem tworzą kształt fali, który bardzo różni się od sinusoidalnych oscylacji obserwowanych w genach zegara, co sugeruje, że mechanizmy oprócz zegara mają głęboki wpływ na tworzenie obserwowanych wzorców w danych behawioralnych. W tym miejscu podajemy instrukcje dotyczące korzystania z niedawno opracowanej metody obliczeniowej, która matematycznie opisuje wzorce czasowe w aktywności much. Metoda dopasowuje dane dotyczące aktywności do modelowego kształtu fali, który składa się z czterech wyrazów wykładniczych i dziewięciu niezależnych parametrów, które w pełni opisują kształt i wielkość porannych i wieczornych szczytów aktywności. Wyodrębnione parametry mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów kinetycznych substratów, które leżą u podstaw powszechnie obserwowanych wzorców aktywności bimodalnej w rytmach lokomotorycznych much.

Zaprezentowana tutaj metoda umożliwia kwantyfikację głównych cech wzorca lokomocji muchy. Kwantyfikacja jest realizowana poprzez dopasowanie danych o aktywności do modelu składającego się z czterech składników wykładniczych:
<img alt="Równania matematyczne dla modelowania systemów dynamicznych; H_M, H_E, wykładniczy zanik, zmienne czasowe." src="/files/ftp_upload/55977/55977eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Ró...

Przedstawiono metodę ilościowego określania głównych cech czasowych obserwowanych w rytmach okołomotorycznych much. Kwantyfikacja jest osiągana poprzez dopasowanie aktywności muchy do wieloparametrycznego kształtu fali modelowej. Parametry modelu opisują kształt i wielkość porannych i wieczornych szczytów dziennej aktywności.

Metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. ...

U większości zwierząt zegary okołodobowe koordynują procesy behawioralne i molekularne oraz synchronizują je z codziennym cyklem światła i ciemności. U muszek owocówek zegar ten jest zazwyczaj badany przy użyciu rejestracji aktywności lokomocyjnej. Oto przykład średniej lokomocji typu dzikiego mierzonej w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności; cykl światło-ciemność został zaznaczony żółto-czarnym paskiem u góry.Typowy zapis aktywności muchy wykazuje złożony wzorzec bimodalny z dwoma szczytami aktywności: porannym, występującym około świtu, oraz wieczornym, występującym około zmierzchu. Te dwa szczyty razem tworzą przebieg fali, który znacznie różni się od oscylacji sinusoidalnych obserwowanych w genach zegarowych, co sugeruje, że mechanizmy poza samym zegarem mają istotny wpływ na kształtowanie obserwowanego wzorca w danych behawioralnych. Przedstawiamy tutaj pierwszą metodę, która matematycznie opisuje wzorce czasowe w aktywności much.Dane o aktywności dopasowaliśmy do modelowej formy fali, która naśladuje lokomocję muchy. Nasz model składa się z czterech członów wykładniczych: dwóch członów odpowiadających szczytowi porannemu i dwóch członów odpowiadających szczytowi wieczornemu. Wraz z okresem okołodobowym, nasz model posiada dziewięć niezależnych parametrów.Parametry B określają tempo wzrostu porannego, spadku porannego, wzrostu wieczornego oraz spadku wieczornego. TM i TE określają szerokości szczytów porannego i wieczornego, a HM i HE określają wysokości tych szczytów. Wspólnie parametry te w pełni opisują rozmiar i kształt szczytów porannego i wieczornego w schemacie aktywności.Naszą metodę można zastosować do wyjaśnienia mechanizmów i substratów leżących u podstaw powszechnie obserwowanego bimodalnego wzorca aktywności w pomiarach lokomocji muszek. Do eksperymentu z lokomocją należy przygotować pojedyncze probówki z pożywką na jednym końcu i watą na drugim. W tym celu należy najpierw wsypać od pięciu do sześciu gramów pożywki dla muszek do probówki o pojemności 50 ml.Pokrój pokarm na małe kawałki, aby łatwiej było go rozpuścić w mikrofalówce. Pojedynczy monitor aktywności pomieści 32 oddzielne probówki. Dlatego należy wziąć 32 probówki i połączyć je ze sobą za pomocą gumki recepturki.Rozpuść pokarm w zlewce w mikrofalówce. Podgrzewaj pokarm przez około 10 do 15 s. Zatrzymuj mikrofalówkę co pięć sekund i lekko wstrząśnij zlewką z pokarmem, aby zapewnić jego równomierne rozpuszczenie.Należy upewnić się, że cała pokarm została roztopiona i w zlewce nie pozostały żadne stałe fragmenty. Gdy pokarm jest jeszcze w stanie ciekłym, należy włożyć probówki do zlewki z pokarmem. Probówkami należy delikatnie poruszać w górę i w dół, aby zostały one wypełnione równomiernie.Pozostaw pożywkę do ostygnięcia i stężeń przez około jedną godzinę. Po zestaleniu pożywki wyjmij probówki z zlewki, wykonując ruch obrotowy, aby pożywka nie przywarła do dna naczynia. Następnie zdejmij gumkę recepturkę.Uszczelnij koniec probówki za pomocą wosku. W tym celu najpierw ostrożnie przetrzyj probówkę ręcznikiem papierowym, a następnie dociśnij ją do wosku.Wizualnie sprawdź szczelność zamknięcia i w razie potrzeby powtórz proces zgrzewania. Stosując tę technikę, zamknij wszystkie probówki przeznaczone do eksperymentu. Drugi koniec probówek zamknij watą.Wata pozwoli na przepływ powietrza, jednocześnie zatrzymując muchy wewnątrz probówek. Jest ona również łatwa do wyjęcia i ponownego włożenia, co okaże się przydatne podczas wprowadzania much do probówek na potrzeby eksperymentu. Po przygotowaniu probówek należy wprowadzić do nich muchy do przeprowadzenia doświadczenia.W tym celu przenieś muchy na podkładkę, używając CO2. Następnie, za pomocą pędzelka, ostrożnie umieść pojedynczą muchę w każdej z osobnych probówek. Włóż probówkę z muchą do monitora.System monitora zarejestruje lokomocję much w pliku wyjściowym w takiej samej kolejności, w jakiej znajdują się one w urządzeniu. Podłącz monitor do komputera i umieść go w inkubatorze zapewniającym stałą temperaturę i wilgotność. W zależności od przebiegu eksperymentu ustaw odpowiednie warunki oświetlenia/ciemności.W przypadku eksperymentu w cyklu światło/ciemność, należy utrzymywać muchy w tym cyklu przez cały czas trwania badania. Pierwszego dnia pomiarów nie należy uwzględniać w analizie. W przypadku eksperymentu w stałej ciemności, najpierw należy utrzymywać muchy przez dwa dni w warunkach cyklu światło/ciemność w celu synchronizacji zegarów biologicznych, a następnie przenieść je do stałej ciemności.W analizie nie należy uwzględniać pomiarów z pierwszego dnia stałej ciemności. Przed przejściem do następnej sekcji zalecamy zapoznanie się z protokołem. System monitorujący wygeneruje pojedynczy plik zawierający dane o aktywności wszystkich much znajdujących się w monitorze.Ostatnie 32 kolumny pliku wyjściowego zawierają aktywność poszczególnych much. Nasz program przetwarza dane dotyczące aktywności pojedynczych much. Należy zatem podzielić plik wyjściowy na wiele plików zawierających aktywność pojedynczej muchy.Każdy plik powinien być jednokolumnowym plikiem TXT. Teraz, po przygotowaniu plików aktywności, możemy przeprowadzić analizę. Uruchom funkcję ModelFitPS3 w oknie poleceń MATLAB z następującymi parametrami wejściowymi.Częstotliwość próbkowania; należy wprowadzić odstęp czasu pomiędzy próbkami danych w sekundach. Na przykład, nasze dane zostały pobrane z częstotliwością próbkowania wynoszącą 20 sekund. W takim przypadku wpisujemy tutaj 20.W polu bin interval wpisz przedział czasowy w minutach, według którego dane zostaną pogrupowane w celu lepszej wizualizacji. Zalecamy grupowanie w przedziałach 20 lub 30 minut, jednak w tym przypadku wpiszę 10, aby później pokazać, jak łatwo można to zmienić. W polu trend wpisz jeden, jeśli dane wykazują trend linii bazowej, a zero w przeciwnym razie.Nasze dane nie wykazują żadnej tendencji linii bazowej. W związku z tym wprowadziłem tutaj zero. Naciśnij Enter, aby uruchomić funkcję.W wyskakującym oknie wybierz pojedynczy plik z aktywnością muchy i kliknij Otwórz. Program obliczy i wykreśli widmo mocy danych. W tym oknie określ główny okres w danych.W tym celu należy kliknąć lewym przyciskiem myszy na szczyt odpowiadający okresowi okołodobowemu lub prawym przyciskiem myszy na szczyt drugiej harmonicznej, który powtarza się w przybliżeniu w połowie okresu okołodobowego. W naszym przypadku szczyt drugiej harmonicznej jest znacznie większy i wyraźniejszy niż szczyt okresu okołodobowego. Dlatego korzystamy z drugiej opcji.Następnie program wykreśli dane pogrupowane według wybranego interwału koszyka. Jak widać, przy 10-minutowym interwale koszyka, poranne i wieczorne szczyty nie są bardzo dobrze zwizualizowane. Dlatego chcemy zmienić tę wartość.Aby to zrobić, wystarczy kliknąć prawym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu na wykresie. W nowym oknie dialogowym wpisz nową wartość dla odstępu koszyka. Zalecamy ustawienie interwału czasowego na 20 minut.W związku z tym wprowadzamy tutaj wartość 20. Należy zatwierdzić wybór przyciskiem OK. Program natychmiast przerysuje dane z nową wartością przedziału koszyka (bin interval). Aby zaakceptować tę wartość, wystarczy kliknąć lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu na wykresie.Program ponownie narysuje dane i wyświetli pomiary z tylko pięciu dni. W tym oknie należy wybrać pierwszy poranny szczyt, który zostanie wykorzystany w analizie. Czasami konieczne jest pominięcie pierwszych jednego lub dwóch dni, których muchy potrzebują na adaptację do cyklu światło-ciemność.Aby wybrać poranny szczyt, należy po prostu kliknąć wybrany szczyt. Program ponownie narysuje dane i wyświetli teraz pomiary z trzech dni, zaczynając od wybranego porannego szczytu. Niebieskie i czerwone linie pionowe wskazują pierwszy wieczorny szczyt oraz drugi poranny szczyt na podstawie okresu wybranego w pierwszym oknie.W tym oknie wybierz punkty dla próbki użytej do wstępnego dopasowania danych do funkcji modelu. W tym celu kliknij następujące punkty w podanej kolejności. Najpierw kliknij wierzchołek pierwszego porannego piku.Kliknięcie jest oznaczone czerwoną gwiazdką na dole, która wskazuje miejsce kliknięcia. Następnie należy kliknąć na koniec szczytu porannego, potem na początek szczytu wieczornego, następnie na wierzchołek szczytu wieczornego, potem na koniec szczytu wieczornego, a na koniec na wierzchołek szczytu porannego następnego dnia. Program ponownie wykreśli widmo mocy, ponieważ ostateczne parametry są uzyskiwane z dopasowania widmowego.Widmo jest obecnie przedstawione z częstotliwością na osi x, a szczyt okołodobowy znajduje się po lewej stronie wykresu. Okres wyznaczony w pierwszym kroku jest zaznaczony czerwoną linią pionową. Aby wybrać punkty dopasowania, należy najpierw wstępnie określić okres podstawowy.W tym celu należy kliknąć lewym przyciskiem myszy na szczyt odpowiadający okresowi okołodobowemu lub kliknąć prawym przyciskiem myszy na szczyt drugiej harmonicznej. Ponownie zastosujemy drugą opcję. Następnie na dole pojawi się suwak służący do wyboru punktów dla dopasowania widmowego.Punkty zostaną wyświetlone jako czerwone kółka i pojawią się po przesunięciu suwaka. Przesuwaj suwak w lewo i w prawo, umieszczając punkty jak najbliżej szczytów pików widma. Po uzyskaniu najlepszego obrazu naciśnij przycisk Accept, a program dopasuje zaznaczone punkty do wyrażenia analitycznego dla modelowego widma mocy.Po dopasowaniu program wygeneruje dwa kolejne wykresy. Pierwszym z nich jest widmo mocy modelu zbudowanego z wyekstrahowanych parametrów. Drugim są dane dopasowane do modelu.Dane przedstawiono czarną linią, a model czerwoną linią. Widać, że funkcja ściśle odpowiada danym, szczególnie w ciągu ostatnich trzech dni aktywności. Wyekstrahowane parametry zostały zapisane w pliku TXT z parametrami dopasowania modelu.Po nazwie pliku parametry są zapisywane w następującej kolejności: najpierw b porannego spadku, następnie b porannego wzrostu, b wieczornego wzrostu, b wieczornego spadku, okres okołodobowy, następnie szerokość porannego piku podzielona przez okres okołodobowy, szerokość wieczornego piku podzielona przez okres okołodobowy, wysokość porannego piku, wysokość wieczornego piku oraz błąd dopasowania dopasowania widmowego. Oprócz pliku z parametrami dopasowania modelu, program wygeneruje również dwa kolejne pliki. Pierwszym są dane dopasowane do funkcji modelu, a drugim jest dopasowanie widmowe.Przeprowadź tę analizę z pozostałymi plikami aktywności. Wszystkie wyodrębnione parametry są zapisywane w pliku TXT z parametrami dopasowania modelu i mogą być dalej wykorzystane do powiązania wyników behawioralnych z mechanizmami leżącymi u podstaw codziennego zachowania much, kontrolowanego przez model wzorca aktywności.

a-computational-method-to-quantify-fly-circadian-activity

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

W niniejszym artykule omówiono metody, które można wykorzystać do określenia funkcji okołodobowej oraz reaktywności na światło u myszy.

Pomiar reakcji okołodobowych i ostrych na światło u myszy z wykorzystaniem aktywności w kołowrotku

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Ten film opisuje system monitorowania aktywności Drosophila (DAM) używany do śledzenia aktywności lokomotorycznej. Naukowcy wykorzystują dane dotyczące aktywności zebrane z DAM do badania rytmów okołodobowych u muszek owocowych. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak ładować muchy do urządzenia i rejestrować dane dotyczące aktywności do eksperymentów okołodobowych.

Drosophila Monitor aktywności (DAM): metoda pomiaru aktywności lokomotorycznej u much

Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.

Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zsynchronizować Drosophila z dniem okołodobowym. Jest to pierwszy i najważniejszy krok niezbędny do badania rytmów biologicznych i chronobiologii.

Okołodobowe porywanie Drosophila melanogaster

Deprywacja snu to potężne narzędzie do badania funkcji i regulacji snu. Opisujemy protokół pozbawiania snu Drosophila za pomocą aparatu do neutralizacji snu oraz określania zakresu snu z odbicia wywołanego deprywacją.

Aparat do niwelowania snu: wysoce skuteczna metoda pozbawiania snu Drosophila

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obliczeniową do ilościowego określania aktywności okołodobowej much. Naucz się analizować wzorce aktywności porannej i wieczornej przy użyciu modelu matematycznego.

Metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much

Przeglądaj więcej filmów