Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego
October 27th, 2017
Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.
Ogólnym celem tej analizy RNASeq w próbkach larw danio pręgowanego jest identyfikacja profili ekspresji genów dla zarodków i larw danio pręgowanego oraz ilościowe zestawienie porównawcze zmian ekspresji genów między próbkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w każdej dziedzinie, w której zarodki lub larwy danio pręgowanego są źródłem informacji, takie jak to, w jaki sposób supresja jednego docelowego genu powoduje zmiany ekspresji genów lub zakłócenie pewnych szlaków w stosunku do innych schorzeń. Główną zaletą tej techniki jest to, że danio pręgowany jest podatny na produkcję dużej liczby zwierząt, a dane transkryptomu całych zwierząt można łatwo uzyskać.
Ponadto izolację określonych typów komórek można łatwo osiągnąć za pomocą sortowania zwierząt transgenicznych. Procedury zademonstrują Lain Hostelley, doktorantka, i Jessica Nesmith, post-doc z mojego laboratorium. Na początek hoduj zarodki do trzeciego miesiąca życia, co jest dojrzałością reprodukcyjną.
Oddziel dwa dorosłe samce i trzy samice ryb z pożądanego szczepu do podzielonych zbiorników godowych ze świeżą wodą systemową wieczorem przed pobraniem zarodka. Następnego ranka, po zapaleniu się świateł, usuń przegrodę i pozwól rybom naturalnie łączyć się w pary, dopóki zarodki nie zostaną zaobserwowane na dnie zbiornika. Zbierać zarodki w odstępach 30-minutowych na oddzielnych szalkach Petriego w pożywce dla zarodków, aż do uzyskania pożądanej liczby.
Aby ustalić stopień zarodka, hoduj je w grupach od 50 do 75 na 10-centymetrową szalkę Petriego, aby zapewnić spójny czas rozwoju wszystkich zarodków. Następnie utrzymuj talerze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Zmierz wiek zarodka za pomocą liczby somitycznej po segmentacji do około 24 godzin po zapłodnieniu lub HPF i oddziel zarodki na podstawie wieku rozwojowego.
Po eutanazji zarodków na pożądanym etapie zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś pulę 20 zarodków do oznakowanej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie usuń nadmiar pożywki zarodkowej z probówki do mikrowirówki. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika do lizy do probówki.
I użyj tłuczka do mechanicznej homogenizacji zarodków. Następnie dodaj dodatkowe 800 mikrolitrów odczynnika do lizy, aby zwiększyć całkowitą objętość do jednego mililitra. Aby wyekstrahować RNA, dodaj odczynnik do lizy do pobranej próbki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
Dodaj 0,2 mililitra chloroformu na każdy 1 mililitr użytego odczynnika do lizy i odwróć probówki ręcznie przez 15 sekund. Po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut, odwirować próbki w temperaturze 12 000 G i 4 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przenieś oddzieloną fazę wodną do świeżej probówki i dodaj 0,5 mililitra izopropanolu na każdy 1 mililitr użytego odczynnika do lizy.
Po inkubacji probówek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odwirować próbki przez 10 minut. Następnie dodaj 75% etanolu do RNA i odwiruj probówki w temperaturze 7 500 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez 5 minut. Całkowicie usunąć supernatant i pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Następnie ponownie zawiesić RNA w 15 do 30 mikrolitrach uzdatnionej wody DEPC. Aby oczyścić wysokiej jakości RNA po ekstrakcji osadu i umyciu próbki zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć spektrofotometru absorpcyjnego do oznaczenia wyekstrahowanego RNA pod kątem stężenia i czystości. Upewnij się, że wartość 260 na 230 wynosi około 2,0 przed wysłaniem próbek RNA do dostawcy lub korpusu w celu analizy RNASeq i zmiany ekspresji genów w oparciu o kwantyfikację odczytów sekwencjonowania.
Aby porównać pojedynczy warunek eksperymentalny z kontrolnym, otwórz dane genów o zróżnicowanej ekspresji w oprogramowaniu do zarządzania arkuszami kalkulacyjnymi. Wybierz strzałkę listy rozwijanej obok przycisku sortowania, a następnie wybierz opcję sortowania niestandardowego w arkuszu kalkulacyjnym. W oknie, które się pojawi, zaznacz pole pod kolumną i wybierz sortowanie według kolumny LFC.
Upewnij się, że w kolumnie sortowania według wybrano wartości. W kolumnie kolejności wybierz sortowanie od największego do najmniejszego, a następnie kliknij przycisk OK. Aby określić geny o zróżnicowanej ekspresji znalezione w dwóch warunkach eksperymentalnych, w eksperymentalnym arkuszu kalkulacyjnym i kontrolnym w porównaniu z arkuszem kontrolnym, wybierz pierwszą komórkę w pustej kolumnie.
Następnie wpisz następujące równanie w komórce. Naciśnij Enter lub Return, aby uruchomić równanie. Zaznacz komórkę zawierającą równanie i kliknij pole w prawym dolnym rogu komórki.
Przytrzymaj przycisk myszy i przeciągnij zaznaczony obszar maksymalnie w dół kolumny, aż wybierzesz ostatni identyfikator elementu, aby skopiować równanie do każdej komórki w kolumnie. Wybierz ponownie sortowanie niestandardowe i dodaj drugi poziom sortowania, klikając ikonę plusa w lewym dolnym rogu. Na pierwszym poziomie sortuj według, w obszarze kolumna wybierz pozycję duplikat.
W obszarze Sortuj według wybierz wartości, a następnie w obszarze Kolejność wybierz pozycję Z, aby A.In drugi poziom, a następnie według w obszarze kolumna wybierz pozycję LFC. W obszarze Sortuj według wybierz wartości, a następnie w obszarze Kolejność wybierz pozycję od największego do najmniejszego, a następnie wybierz pozycję OK. Aby usunąć wszystkie nawiasy z kolumny symboli genów przed kontynuowaniem, zaznacz całą kolumnę zawierającą symbole genów.
Wybierz opcję edycji, a następnie zastąp w rozwijanym menu plików. Wpisz nawias otwarty, gwiazdkę, nawias zamknięty w pasku wyszukiwania w oknie zamiany i dzierżawij zamianę na pusty pasek. Wybierz opcję Zamień wszystko, aby usunąć wszystkie wystąpienia nawiasów.
Aby określić wzbogacone szlaki, skopiuj żądane symbole genów do schowka. Przejdź do ConsensusPathDB, a następnie wybierz analizę zestawu genów na lewym pasku bocznym strony internetowej, a następnie analizę nadreprezentacji. W polu Wklej listę identyfikatorów genów i białek wklej listę genów.
Wybierz symbol genu w polu typu identyfikatora genu/białka i kliknij przycisk Kontynuuj. W sekcji zestawów opartych na ścieżkach zaznacz pole wyboru obok ścieżek zdefiniowanych przez bazy danych ścieżek. Wybierz opcję znajdź wzbogacone zbiory, aby uzyskać listę ścieżek zawierających geny na liście wejściowej.
Zaznacz wszystkie wzbogacone ścieżki do wizualizacji w sieci ścieżek, zaznaczając każde pole obok nazw ścieżek lub w obszarze Wybierz w nagłówku kolumny powyżej pól wyboru kliknij wszystkie. Następnie wybierz opcję wizualizacji wybranych zestawów. Dostosuj filtry względnego nakładania się i udostępnionych kandydatów, zaznaczając dowolne pole w górnej środkowej części strony i wprowadzając żądany procent, względne nakładanie się lub liczbę udostępnionych kandydatów, a następnie wybierz pozycję zastosuj.
Aby określić wzbogacone ontologie genów, skopiuj symbole genów odpowiedniej grupy do schowka. Przejdź do narzędzia do analizy GO Enrichment w Gene Ontology Consortium. Po lewej stronie strony, pod identyfikatorami genów tutaj, wklej listę symboli genów w polu.
Pod polem identyfikatorów genów wybierz termin go, proces biologiczny. Następnie wybierz danio rerio pod polem Go Terms i kliknij Prześlij. Przeprowadź QRT PCR i porównaj z RNASeq, zgodnie z protokołem tekstowym.
Sekwencjonowanie wyekstrahowanego RNA z larw, którym wstrzyknięto Morpholinos przeciwko jałmużnie1 lub bbs1, ujawniło geny, które były wyjątkowo regulowane w górę i w dół w modelach Alstrom i BBS, a także geny, które uległy znaczącym zmianom w obu modelach. Aby dokładniej wyjaśnić profil molekularny modelu Alstrom, zidentyfikowano szlaki i ontologie genów wzbogacone w geny o zróżnicowanej ekspresji. Jak pokazano tutaj, 31 wszystkich ścieżek zostało regulowanych w górę.
Oprócz szerokiej grupy metabolizmu, najbardziej dotkniętymi szlakami były wrodzony i nabyty układ odpornościowy, z odpowiednio 32 i 20 genami. Wzbogacone zostały również zdarzenia sygnalizacyjne receptora limfocytów B. Kilka szlaków sygnałowych zostało również wzbogaconych wśród genów o podwyższonej regulacji, co jest zgodne z powiązaniem zespołu Alstroma z pierwotną dysfunkcją rzęsek.
Ponadto trzy szlaki związane z wydzielaniem insuliny były regulowane w górę: kwasy tłuszczowe związane z GPR40, wolne kwasy tłuszczowe i acetylocholina. Wreszcie, sześć terminów GO zostało wzbogaconych wśród genów o podwyższonej regulacji w modelu Alstrom, w tym różnicowanie erytrocytów, homeostaza erytrocytów, homeostaza komórek szpikowych i procesy homeostatyczne. Po opanowaniu, analizę ścieżki i terminu GO można wykonać w mniej niż godzinę.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wybór parametrów szlaku i wartości odcięcia są najważniejszymi czynnikami przy interpretacji wyników porównań ekspresji RNASeq. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak aplikacja z liniami zmutowanymi i analiza transkryptomu pojedynczych typów komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak profilowanie transkryptomu typów komórek i zmiany ekspresji genów pod kontrolą określonych genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać danych transkryptomicznych danio pręgowanego generowanych przez RNASeq do identyfikacji znaczących zmian ekspresji genów między próbkami eksperymentalnymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia podejście do analizy całej transkryptomu z zarodków, larw lub posortowanych komórek rybki zebrafish. Metoda pozwala na identyfikację profili ekspresji genów i ilościowe porównania między próbkami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwoju
- Genomika
Tło
- Ryby zebrafish są przydatnymi modelami do badania zmian w ekspresji genów.
- Izolacja określonych typów komórek może być osiągnięta za pomocą zwierząt transgenicznych.
- Technika wspiera masową produkcję rybek zebrafish do analizy.
- Dane RNASeq mogą ujawniać zaburzenia w szlakach z powodu ukierunkowanego tłumienia genów.
Cel badania
- Zidentyfikowanie profili ekspresji genów w zarodkach i larwach rybki zebrafish.
- Porównanie zmian ekspresji genów w różnych warunkach.
- Walidacja wyników poprzez qRT-PCR.
Zastosowane metody
- Izolacja RNA z próbek rybki zebrafish.
- Analiza szlaków danych RNASeq.
- Walidacja zmian ekspresji genów na podstawie qRT-PCR.
- Sortowanie zwierząt transgenicznych w celu izolowaniu określonych typów komórek.
Główne wyniki
- Identyfikacja odrębnych profili ekspresji genów.
- Ilościowe porównanie zmian ekspresji genów.
- Wgląd w wpływ tłumienia genów na szlaki.
- Walidacja wyników RNASeq poprzez qRT-PCR.
Wnioski
- Ta metoda zwiększa rozumienie ekspresji genów w rybce zebrafish.
- Zapewnia ramy do badania procesów rozwojowych.
- Podejście jest stosowalne do różnych pytań badawczych w biologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
RNASeq-based gene expression analysis in zebrafish enables rapid, scalable identification of pathway-level disruptions following genetic perturbation, supporting early target validation and mechanistic de-risking in discovery programs. The method provides quantitative, reproducible transcriptome data that informs go/no-go decisions by linking phenotypic observations to molecular signatures, reducing ambiguity in target hypothesis testing. Its compatibility with high-throughput embryo production and cell sorting facilitates integration into phenotypic screening cascades for lead identification and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking gene suppression to pathway enrichment, clarifying mechanism of action and off-target effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of gene expression profiles between control and perturbed conditions.
- Predictive Value: Identifies enriched pathways and GO terms that provide mechanistic context for phenotypic observations, improving confidence in target-disease relationships.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative gene expression readouts suitable for compound screening and dose-response profiling in zebrafish models.
- Scalability: Leverages ease of large-scale embryo production and RNA isolation to support high-throughput screening campaigns.
- Reproducibility: Includes qRT-PCR validation step to confirm RNASeq findings, ensuring data reliability across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Identifies conserved pathways (e.g., immune signaling, insulin secretion, cilia function) linked to human disease models, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables progression from whole-embryo transcriptome analysis to sorted cell populations, facilitating mechanistic follow-up in relevant tissue contexts.
- Risk-Adjusted Decisions: Pathway and GO enrichment outputs help prioritize targets based on biological coherence and phenotypic concordance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, providing molecular phenotyping that bridges genetic perturbation to pathway-level insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying gene expression changes and identifying enriched pathways following targeted gene suppression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative transcriptome profiles that enable reliable comparison of experimental conditions in multi-well formats.
- Analytics: Generates pathway enrichment and GO term outputs that allow teams to compare mechanistic impact across compounds or genetic models.
- Translational Research: Connects zebrafish phenotypes to human-relevant biological processes (e.g., immune response, metabolic signaling) through conserved pathway analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized RNASeq workflow applicable across projects, reducing redundant method development and enabling cross-study data integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through pathway-level interpretation of gene expression data.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA extraction, library preparation, and qRT-PCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantitative molecular phenotypes linked to target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on pathway enrichment strength and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, developmental staging, and RNA handling to ensure sample integrity.
- Depends on access to RNASeq library preparation and sequencing infrastructure, either in-house or via vendor.
- Necessitates bioinformatics support for differential expression analysis, pathway enrichment (e.g., ConsensusPathDB), and GO term annotation.
- Requires standardization of embryo collection timing, lysis conditions, and sequencing depth to maintain cross-experiment comparability.
- Limited by the need for careful parameter selection in enrichment analysis (e.g., cutoff values, background sets) to avoid false positives, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Generating Embryos Through Natural Mating and Staging Embryos
2:22
Whole Embryo Dissociation, RNA Extraction and Purify High-quality RNA
4:55
Sorting Differentially Expressed Genes
7:00
Determine Enriched Pathways
7:57
Generation of Pathway Networks and Determination of Enriched GO Terms
9:12
Results: RNAseq-based Zebrafish Genome Expression Data for Alstrom and Bardet Biedl Syndromes
10:47
Conclusion
