Name: Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj analizę transkryptomiczną RNASeq u Danio rerio do identyfikacji profili ekspresji genów w zarodkach i larwach. Ta metoda umożliwia badaczom ilościowe porównania zmian ekspresji oraz analizę szlaków sygnałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) i T32DK098107 (T.L.H. i J.E.N.).

<ol><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Disease+Models+and+Chemical+Screens%22">The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens</a>. , 4th ed, Academic Press. (2017).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics%2C+and+Transcriptomics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics</a>. , 4th ed, Academic Press. (2016).</li>
<li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , 3rd ed, Academic Press. (2011).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cpdb.molgen.mpg.de/">http://cpdb.molgen.mpg.de/</a> (2017).</li>
<li>Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneontology.org/">http://www.geneontology.org/</a> (2017).</li>
<li>IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li>
<li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li>
<li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podejście opisane w tym protokole oferuje stosunkowo szybką i opłacalną strategię analizy na poziomie transkryptomu całych zwierząt lub określonych posortowanych populacji komórek. Danio pręgowany stanowi korzystny model dla tego typu badań ze względu na łatwość i szybkość generowania dużych ilości materiału wyjściowego, łatwość wdrożenia genetycznych lub środowiskowych warunków eksperymentalnych oraz dostępność szerokiego spektrum transgenicznych linii reporterowych pozwalających na izolację populacji specyficznych dla ...

Analiza porównawcza globalnej ekspresji genów jest cennym narzędziem do identyfikacji nowych genów przyczyniających się do obserwowanych fenotypów. Takie analizy zazwyczaj opierają się na ilościowej ocenie obfitości transkryptów w porównaniu między próbkami eksperymentalnymi i kontrolnymi. Podejścia celowane, takie jak qRT-PCR, są stosunkowo szybkie i dokładne w badaniu zmian ekspresji pojedynczych genów. Sekwencjonowanie RNA (RNASeq) oferuje szerokie, wolne od hipotez podejście do identyfikacji istotnych zmian w ekspresji genów między próbkami, co czyni je obecnie standardem dla takich badań w systemach eksperymentalnych.
Danio pręgowany stał się ważnym modelem w wielu obszarach chorobowych. Pierwotnie opracowane ze względu na ich użyteczność w badaniach biologii rozwoju, ze względu na ich wysoką płodność i stosunkowo niskie koszty utrzymania, eksperymentalne zastosowanie danio pręgowanego ewoluowało, obejmując szeroki zakres fenotypów od stadium embrionalnego do dorosłego, a także szeroki wachlarz testów molekularnych1,2,3. Rzeczywiście, te zalety sprawiają, że badania mechanistyczne molekularne są szybkie i opłacalne ze względu na łatwość pozyskiwania dużych ilości materiału w połączeniu z łatwością manipulacji zarówno genetycznej, jak i środowiskowej na wszystkich etapach życia. Co więcej, przezroczysta natura zarodków i larw danio pręgowanego sprawia, że idealnie nadaje się do generowania specyficznych dla komórek i tkanek transgenicznych linii reporterowych, umożliwiając wizualizację in vivo dyskretnych populacji komórek4. Wykorzystanie takich linii pozwala na globalną analizę ekspresji genów w określonych izolowanych typach komórek w oparciu o ekspresję genu reporterowego.
Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół globalnej analizy ekspresji genów za pomocą RNASeq po hodowli zarodków danio pręgowanego. Eksperymentalne manipulacje genetyczne, w tym przejściowe knockdown genu oparte na morfolinie (MO) lub edycja genomu za pośrednictwem CRISPR, zostały przedstawione w innym miejscu5,6,7. Dlatego skupiamy się na szczegółowym protokole izolacji RNA z całych zarodków lub posortowanych transgenicznych komórek wykazujących ekspresję reportera, a następnie na prostej analizie obliczeniowej wyników RNASeq przy użyciu narzędzi szlaku i terminów ontologii genów (GO). Na koniec dołączyliśmy strategię walidacji zmian ekspresji genów za pomocą ilościowej PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR). Protokoły te mają zastosowanie do zarodków danio pręgowanego poddanych szerokiemu zakresowi warunków eksperymentalnych, w tym porównaniu mutantów genetycznych lub warunków środowiskowych.

<table><tbody><tr><td>Commercial Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>odczynnik</td></tr><tr>do lizy<td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>bufor dysocjacyjny 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>bufor dysocjacyjny 2</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona przez DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Konwersja cDNA FirstNici</td> Zestaw do <td>konwersji cDNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>bufor FACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>octan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td> Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Odmiany danio pręgowanego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 mikronowy sitko</td><td>komórkowe Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>rurka FACS</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometr</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td> Mikroskop odwrócony <td>Zeiss Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki kryjące 1,0 l Zestaw zbiorników krzyżowych</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>probówka FACS 5 ml rurka polipropylenowa</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td></td> Analiza wzbogacania http://cpdb.molgen.mpg.de/ <td></td><td></td></tr><tr><td>GO</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na rnaseq od danio pręgowanego

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Analiza globalnych zmian ekspresji genów jest cennym narzędziem do identyfikacji nowych szlaków leżących u podstaw obserwowanych fenotypów. Danio pręgowany jest doskonałym modelem do szybkiej oceny całego transkryptomu z całych zwierząt lub pojedynczych populacji komórek ze względu na łatwość izolacji RNA od dużej liczby zwierząt. W artykule przedstawiono protokół globalnej analizy ekspresji genów w zarodkach danio pręgowanego z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA (RNASeq). Opisujemy otrzymywanie RNA z całych zarodków lub z populacji komórek uzyskanych za pomocą sortowania komórek u zwierząt transgenicznych. Opisujemy również podejście do analizy danych RNASeq w celu identyfikacji wzbogaconych szlaków i terminów ontologii genów (GO) w globalnych zestawach danych dotyczących ekspresji genów. Na koniec udostępniamy protokół walidacji zmian ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR). Protokoły te mogą być wykorzystywane do analizy porównawczej zestawów kontrolnych i eksperymentalnych danio pręgowanego w celu identyfikacji nowych zmian ekspresji genów i zapewnienia molekularnego wglądu w fenotypy będące przedmiotem zainteresowania.

Sortowanie genów o różnej ekspresji:
Aby zidentyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji w stadium larwalnym modeli zespołu Alströma i zespołu Bardeta-Biedla (BBS) u danio pręgowanego, zastosowano celowanie w transkrypty alms1 lub bbs1 poprzez wstrzyknięcie uprzednio zwalidowanych MO blokujących splicing do embrionów danio pręgowanego typu dzikiego16,17. W ...

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Ogólnym celem niniejszej analizy RNASeq w próbkach larw rybek zebrafish jest zidentyfikowanie profili ekspresji genów dla embrionów i larw zebrafish oraz sformułowanie ilościowych wniosków porównawczych dotyczących zmian w ekspresji genów pomiędzy próbkami. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w każdej dziedzinie, w której embriony lub larwy zebrafish są informatywne, na przykład w kwestii tego, w jaki sposób supresja jednego docelowego genu wpływa na zmiany w ekspresji genów lub zaburzenie określonych szlaków w stosunku do innych warunków. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że rybki zebrafish pozwalają na hodowlę dużej liczby osobników, co umożliwia łatwe uzyskanie danych z transkryptomu całego organizmu.Dodatkowo, izolację specyficznych typów komórek można z łatwością przeprowadzić poprzez sortowanie zwierząt transgenicznych. Procedury zaprezentują Lain Hostelley, studentka studiów doktoranckich, oraz Jessica Nesmith, post-doc z mojego laboratorium. Na początek hoduj zarodki do trzech miesięcy życia, co odpowiada dojrzałości rozrodczej.Wieczorem przed pobraniem embrionów oddziel dwie dorosłe ryby samca i trzy samice wybranej linii do podzielonych zbiorników kopulacyjnych wypełnionych świeżą wodą systemową. Następnego ranka, po zapaleniu świateł, usuń przegrodę i pozwól rybom na naturalne kopulowanie, aż w dnie zbiornika pojawią się embriony. Pobieraj embriony w 30-minutowych odstępach czasu do osobnych naczyń Petri z podłożem dla embrionów, aż do uzyskania pożądanej liczby.Aby określić stadium rozwoju embrionów, należy hodować je w grupach od 50 do 75 sztuk na 10 centymetrową szalkę Petriego, aby zapewnić spójne tempo rozwoju wszystkich zarodków. Następnie płytki należy przechowywać w temperaturze 28,5 °C. Wiek embrionów należy określać na podstawie liczby somitów po rozpoczęciu segmentacji aż do około 24 godzin po zapłodnieniu (HPF), a następnie rozdzielić embriony w zależności od stadium rozwoju.Po uśmierceniu embrionów na odpowiednim etapie zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś grupę 20 embrionów do oznakowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Następnie usuń nadmiar podłoża dla embrionów z probówki. Do probówki dodaj 200 microliters odczynnika lizującego.Następnie należy użyć tłuczka do mechanicznej homogenizacji embrionów. Po tym dodaj kolejne 800 µL odczynnika lizującego, aby uzyskać całkowitą objętość 1 mL. Aby wyekstrahować RNA, dodaj odczynnik lizujący do zebranej próbki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 5 minut.Dodaj 0,2 ml chloroformu na każdy 1 ml użytego odczynnika do lizy, a następnie odwracaj probówki ręcznie przez 15 sekund. Po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut, odwiruj próbki przy 12 000 ×g i 4 °C przez 15 minut. Przenieś oddzieloną fazę wodną do nowej probówki i dodaj 0,5 ml izopropanolu na każdy 1 ml użytego odczynnika do lizy.Po inkubacji probówek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odwiruj próbki przez 10 minut. Następnie dodaj 75% ethanol do RNA i wiruj probówki przy 7 500 ×g i 4 °C przez 5 minut. Całkowicie usuń nadsącz i pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.Następnie resuspender RNA w 15 do 30 µL wody traktowanej DEPC. Aby oczyścić wysokiej jakości RNA po wyekstrahowaniu osadu i przemyciu próbki zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć spektrofotometru absorpcyjnego w celu oznaczenia stężenia i czystości wyekstrahowanego RNA. Przed wysłaniem próbek RNA do dostawcy lub jednostki badawczej w celu przeprowadzenia sekwencjonowania RNASeq oraz analizy zmian w ekspresji genów na podstawie kwantyfikacji odczytów sekwencjonowania, należy upewnić się, że stosunek 260 do 230 wynosi około 2,0.Aby porównać pojedynczy warunek eksperymentalny z kontrolą, otwórz dane dotyczące genów o różnym poziomie ekspresji w programie do zarządzania arkuszami kalkulacyjnymi. Wybierz strzałkę rozwijaną obok przycisku sortowania i wybierz niestandardowe sortowanie w arkuszu. W wyświetlonym oknie zaznacz pole pod kolumną i wybierz sortowanie według kolumny LFC.W kolumnie sortowania upewnij się, że wybrane są wartości. W kolumnie kolejności wybierz sortowanie od największej do najmniejszej i kliknij OK. Aby wyznaczyć geny o różnej ekspresji występujące w dwóch warunkach eksperymentalnych, w arkuszu porównującym grupę eksperymentalną z kontrolną zaznacz pierwszą komórkę w pustej kolumnie.Następnie wpisz poniższe równanie do komórki. Naciśnij enter lub return, aby wykonać obliczenia. Zaznacz komórkę zawierającą równanie i kliknij pole w prawym dolnym rogu komórki.Przytrzymaj lewy przycisk myszy i przeciągnij zaznaczony obszar w dół kolumny aż do ostatniego identyfikatora cechy, aby skopiować równanie do każdej komórki w kolumnie. Ponownie wybierz niestandardowe sortowanie i dodaj drugi poziom sortowania, klikając ikonę plusa w dolnym lewym rogu. Na pierwszym poziomie, w sekcji sortuj według, w polu kolumna, wybierz duplicate.W sekcji sortuj według (sort on) wybierz wartości (values), a w sekcji kolejność (order) wybierz od Z do A. Na drugim poziomie, w sekcji następnie według (then by), w polu kolumna (column) wybierz LFC. W sekcji sortuj według (sort on) wybierz wartości (values), a w sekcji kolejność (order) wybierz od największej do najmniejszej, a następnie zatwierdź przyciskiem OK. Aby usunąć nawiasy z kolumny z symbolami genów przed przejściem dalej, zaznacz całą kolumnę zawierającą symbole genów.W rozwijanym menu plików wybierz Edycję, a następnie Zamień. W polu „Znajdź” okna zamiany wpisz otwierający nawias, gwiazdkę oraz zamykający nawias, a pole „Zamień na” pozostaw puste. Wybierz opcję Zamień wszystko, aby usunąć wszystkie wystąpienia nawiasów.Aby określić wzbogacone szlaki, skopiuj wybrane symbole genów do schowka. Przejdź do strony ConsensusPathDB, następnie wybierz analizę zestawów genów (gene set analysis) w lewym pasku bocznym strony, a następnie analizę nadreprezentacji (over-representation analysis). W polu wklej listę identyfikatorów genów i białek (paste a list of gene and protein identifiers) wklej listę genów.W polu typu identyfikatora genu/białka wybierz symbol genu i kliknij przycisk proceed. W sekcji zestawów opartych na szlakach zaznacz pole obok opcji pathways as defined by pathway databases. Wybierz find enriched sets, aby uzyskać listę szlaków zawierających geny z wprowadzonej listy.Wybierz wszystkie wzbogacone szlaki do wizualizacji w sieci szlaków, zaznaczając poszczególne pola obok nazw szlaków lub klikając opcję zaznacz wszystko (all) w nagłówku kolumny nad polami wyboru. Następnie wybierz wizualizuj zaznaczone zestawy (visualize selected sets). Dostosuj filtry względnego pokrycia i wspólnych kandydatów, wybierając odpowiednie pole w górnej części strony i wprowadzając pożądany procent, względne pokrycie lub liczbę wspólnych kandydatów, a następnie wybierz zastosuj (apply).Aby określić wzbogacone ontologie genów, skopiuj symbole genów dla odpowiedniej grupy do schowka. Przejdź do narzędzia analizy wzbogacenia GO (GO Enrichment analysis) w konsorcjum Gene Ontology. Po lewej stronie strony, w polu pod napisem „your gene IDs here”, wklej listę symboli genów.Pod polem identyfikatorów genów (gene IDs) wybierz termin GO: proces biologiczny (biological process). Następnie w polu terminów GO wybierz danio rerio i kliknij przycisk submit. Przeprowadź analizę QRT PCR i porównaj wyniki z RNASeq zgodnie z protokołem tekstowym.Sekwencjonowanie wyizolowanego RNA z larw wstrzykniętych morfolinami przeciwko alms1 lub bbs1 ujawniło geny, których ekspresja była specyficznie podwyższona lub obniżona w modelach zespołu Alströma i BBS, a także geny, których poziomy uległy istotnym zmianom w obu modelach. Aby dokładniej scharakteryzować profil molekularny modelu zespołu Alströma, zidentyfikowano szlaki sygnałowe i ontologie genów wzbogacone w genach różnicowo eksponowanych. Jak pokazano tutaj, odnotowano nadekspresję łącznie 31 szlaków.Poza szeroką grupą procesów metabolicznych, najsilniej dotknięte ścieżki obejmowały wrodzony i nabyty system odpornościowy, z odpowiednio 32 i 20 genami. Wzbogacone zostały również zdarzenia sygnalizacyjne w obrębie receptorów komórek B. Wśród genów o zwiększonej ekspresji stwierdzono także wzbogacenie kilku szlaków sygnalizacyjnych, co jest zgodne z powiązaniem zespołu Alströma z dysfunkcją rzęsek pierwotnych.Dodatkowo, wykazano nadekspresję trzech szlaków związanych z wydzielaniem insuliny: wiązania kwasów tłuszczowych do GPR40, wolnych kwasów tłuszczowych oraz acetylocholiny. Wreszcie, wśród genów o zwiększonej ekspresji w modelu zespołu Alströma wzbogacono sześć terminów GO, w tym różnicowanie erytrocytów, homeostazę erytrocytów, homeostazę komórek mieloidalnych oraz procesy homeostatyczne. Po opanowaniu metody analizy szlaków i terminów GO można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż godzina.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wybór parametrów ścieżek oraz wartości progowych są najważniejszymi czynnikami przy interpretacji wyników porównań ekspresji w RNASeq. Po zastosowaniu tej procedury można wprowadzić inne metody, takie jak badania na liniach mutantów i analiza transkryptomu pojedynczych typów komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące profilowania transkryptomu typów komórek oraz zmian ekspresji genów pod kontrolą konkretnych genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać dane transkrypcyjne rybek danio-pręgowanych wygenerowane za pomocą RNASeq do identyfikacji istotnych zmian w ekspresji genów pomiędzy próbkami eksperymentalnymi.

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Izolacja wysokiej jakości, nienaruszonego RNA jest kluczowym krokiem w wielu protokołach laboratoryjnych. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ekstrakcji RNA z całych embrionów zebrafish oraz syntezę cDNA do późniejszego zastosowania w różnych procedurach eksperymentalnych, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy.

Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Artykuł opisuje protokół generowania zarodków danio pręgowanego poprzez naturalne kojarzenie i sortowanie ich etapów rozwoju. Protokół jest dalej wykorzystywany do analizy komórek β trzustki przy użyciu ryb transgenicznych.

Krycie i ocena stopnia zaawansowania jaj: metoda generowania zarodków i sortowania ich według etapu rozwoju

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj analizę transkryptomiczną RNASeq u Danio rerio do identyfikacji profili ekspresji genów w zarodkach i larwach. Ta metoda umożliwia badaczom ilościowe porównania zmian ekspresji oraz analizę szlaków sygnałowych.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów