Krycie i ocena stopnia zaawansowania jaj: metoda generowania zarodków i sortowania ich według etapu rozwoju

- Zacznij od zbiornika godowego, zbiornika z wyjmowaną wkładką, która umożliwia wpadanie jaj. Dodaj dwa samce i trzy samice dorosłej ryby do podzielonego zbiornika godowego wieczorem przed pobraniem zarodków, aby zaaklimatyzować się ze sobą przez noc.

Następnego ranka przenieś rybę do nowego zbiornika godowego zawierającego wodę systemową i wyjmij rozdzielacz. Odczekaj od 15 do 30 minut, aby dać rybie czas na połączenie w pary i tarło.

Teraz zbierz zarodki i przechowuj je na szalce Petriego zawierającej pożywkę zarodkową Hanka. Uprawiaj je w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza przez cały czas trwania protokołu. Zbadaj morfologię zarodków pod mikroskopem preparacyjnym.

Zaobserwujesz kilka cech rozwojowych. Rozszczepienie blastodysku powoduje powstanie wielu komórek. Blastoderma przybiera kształt odwróconego miseczki nad komórką żółtka. Segmenty mezodermy przyosiowej rozwijają się w grzbietowej części zarodka i tak dalej.

Po upływie 24 godzin od zapłodnienia wystarczy posortować zarodki według całkowitej długości ciała. W przykładowym protokole założymy krycie transgenicznych ryb reporterskich mCherry i posortujemy powstałe zarodki.

- Na początek hoduj zarodki do trzeciego miesiąca życia, co jest dojrzałością reprodukcyjną. Oddziel dwa dorosłe samce i trzy samice ryb z pożądanego szczepu do podzielonych zbiorników godowych ze świeżą wodą systemową wieczorem przed pobraniem zarodka. Następnego ranka po zapaleniu się świateł usuń przegrodę i pozwól rybom naturalnie łączyć się w pary, aż zarodki zostaną zaobserwowane na dnie zbiornika.

Zbieraj zarodki w odstępach 30-minutowych i oddzielaj szalki Petriego od podłoża zarodkowego, aż do uzyskania pożądanej liczby. Aby ustalić stopień zarodka, hoduj je w grupach od 50 do 75 sztuk na 10-centymetrową szalkę Petriego, aby zapewnić spójny czas rozwoju wszystkich zarodków. Następnie utrzymuj talerze w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza.

Zmierz wiek zarodka za pomocą liczby somitycznej po segmentacji do około 24 godzin po zapłodnieniu lub HPF i oddziel zarodki na podstawie wieku rozwojowego.