Name: Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj mikronapromienianie laserowe do badania naprawy DNA w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia wizualizację rekrutacji białek naprawczych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr Samuelowi H. Wilsonowi z National Institute of Environmental Health Sciences za linie komórkowe użyte w tej pracy.

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+near+infrared+femtosecond+lasers+as+sub-micron+radiation+microbeam+for+cell+DNA+damage+and+repair+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies.</a> Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Front Genet. 4, 135(2013).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Werner+protein+at+DNA+double-strand+breaks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells.</a> J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).</li>
<li>Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+oxidative+stress-induced+DNA+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">DNA single-strand break repair.</a> Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).</li>
<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
<li>Cooke, M. S., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooke%2C+MS+%22Immunochemical+detection+of+oxidative+DNA+damage.+Vol.+I%22">Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I</a>. , World Scientific. 275-293 (2003).</li>
<li>Rossner, P., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+oxidatively+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).</li>
<li>Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).</li>
<li>Rybak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+phosphorylation+of+histone+H2AX+on+serine+139+%28%CE%B3H2AX%29+is+not+associated+with+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks.</a> Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).</li>
<li>Haince, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+kinetics+of+recruitment+of+MRE11+and+NBS1+proteins+to+multiple+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.</a> J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+break+repair+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-strand break repair and genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).</li>
<li>Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+aspects+of+clustered+DNA+damage+induction+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation.</a> Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).</li>
<li>Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylation+base+damage+is+converted+into+repairable+double-strand+breaks+and+complex+intermediates+in+G2+cells+lacking+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease.</a> PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).</li>
<li>Siddiqi, M. A., Bothe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+double-strand+break+formation+in+DNA+irradiated+in+aqueous+solution%3A+dependence+on+dose+and+OH+radical+scavenger+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration.</a> Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).</li>
<li>Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+laser+inactivation--towards+a+spatiotemporal-functional+analysis+of+proteins%2C+and+the+ablation+of+chromatin%2C+organelle+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.</a> J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biol. 2, 368-376 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z opisanych tutaj warunków, każdy mikroskop konfokalny z laserem UV-A lub 405 nm, zintegrowany przez producenta lub dodany przez użytkownika końcowego, może wywołać uszkodzenie DNA w jądrze komórki i umożliwić rekrutację białek naprawy DNA do miejsca indukowanego uszkodzenia DNA, które ma być monitorowane. Jednak, jak zauważono w protokole i reprezentatywnych wynikach, wybór długości fali, zastosowana moc i charakterystyka uszkodzeń są ważnymi kwestiami, które muszą być najpierw rozwiązane przez użytkownika w celu zbadania określonego szlaku naprawy DNA. Ponadto istnieją inne względy dotyczące projektowania eksperymentalnego, które również muszą być brane pod uwagę przez użytkowników.
Aby monitorować zachowanie białka w żywych komórkach po mikronapromieniowaniu, należy stworzyć białko znakowane fluorescencyjnie. Dostępność szerokiej gamy białek fluorescencyjnych, które można rozdzielić spektralnie, daje narzędzia do tworzenia fuzji białek, które można wykorzystać do scharakteryzowania odpowiedzi komórkowych na indukcję uszkodzenia DNA. Przejściowa transfekcja interesujących białek fluorescencyjnych pozwala na szybkie badanie przesiewowe szkodliwych warunków, mutacji, a nawet inhibitorów, podczas gdy stabilnie transfekowane komórki zapewniają większą kontrolę nad poziomami ekspresji i pozwalają na przeprowadzenie innych charakterystyk biochemicznych, potwierdzając wyniki mikronapromieniowania. Spektralnie odrębne białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystywane w tej samej komórce do monitorowania interakcji między białkami w obrębie tego samego szlaku lub w różnych szlakach. Białka fluorescencyjne eliminują również potrzebę stosowania specyficznych przeciwciał dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania i umożliwiają monitorowanie zachowania białka przez żywe komórki przez długi czas po indukcji uszkodzenia.
Jednak stosowanie białek fluorescencyjnych ma również wady. Bez tła genetycznego z niedoborem białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania, białka endogenne będą konkurować z białkami znakowanymi fluorescencyjnie. Sprzężenie znacznika fluorescencyjnego z końcem N lub C białka może zmienić fałdowanie białka, utrudnić kluczowe interakcje białko-białko lub blokować sygnały translokacyjne; zmieniając funkcję i potencjalnie wpływając na dynamikę rekrutacji. Efekty te wykazano w wielu raportach, w których barwienie immunofluorescencyjne wykazało dramatycznie różne czasy rekrutacji i retencji dla endogennych białek w miejscu uszkodzenia28. Stosowanie transfekcji przejściowej lub stabilnych klonów może również zmienić zaobserwowaną odpowiedź, zazwyczaj poprzez zmiany w poziomach ekspresji białek. Co więcej, zastosowanie wielu białek fluorescencyjnych w jednym eksperymencie może również zmienić dynamikę rekrutacji, jeśli poziomy białek nie są dobrze zrównoważone lub jeśli rekrutacja większego białka znakowanego fluorescencyjnie blokuje rekrutację innych białek. Wreszcie, białka fluorescencyjne mogą działać jako słabe czynniki uczulające, zwiększając tworzenie reaktywnych form tlenu i potencjalnie zmieniając indukowane mieszaniny uszkodzeń DNA46,47. Pomimo tych wad, białka fluorescencyjne oferują szereg wyraźnych zalet w badaniu naprawy DNA za pomocą mikronapromieniowania, a jeśli użytkownicy włączą odpowiednie kontrole, takie jak opisana tutaj charakterystyka uszkodzeń, mogą dostarczyć nowego wglądu w reakcję na uszkodzenia i interakcje białko-białko3.
Jeśli obrazowanie żywych komórek nie jest wymagane, immunofluorescencja może być stosowana do monitorowania odpowiedzi na indukowane uszkodzenia. Poprzez utrwalanie komórek w określonych momentach po uszkodzeniu indukcji i barwienie przeciwciałami specyficznymi dla białek i zmian chorobowych, można zbudować statyczne migawki indukcji uszkodzeń oraz rekrutacji i zatrzymywania białek naprawczych. Przeciwciała mogą być stosowane do monitorowania rekrutacji wielu białek będących przedmiotem zainteresowania i/lub modyfikacji potranslacyjnych wywołanych odpowiedzią na uszkodzenie DNA. Zastosowanie immunofluorescencji eliminuje potrzebę stosowania białek fluorescencyjnych i pozwala na badanie endogennego zachowania białek. Jednak ta metoda również ma swoje wady. Konieczne są wysoce specyficzne przeciwciała, a procedury przenikania i blokowania muszą być zoptymalizowane, aby umożliwić wykrycie rekrutacji o wystarczającej intensywności sygnału. Procedury naprawcze nie są natychmiastowe, a to fizyczne ograniczenie ogranicza czasowe rozwiązanie tego podejścia. Mapowanie miejsca indukcji uszkodzeń, aby komórki mogły zostać ponownie zlokalizowane po barwieniu, może również stanowić poważne wyzwanie. Mikroskop konfokalny wykorzystany w tej pracy pozwala na rejestrację na podstawie obrazu, jak opisano powyżej, dzięki czemu uszkodzone komórki mogą być przemieszczane z dużą precyzją. Jeśli rejestracja etapu lub wytrawione szkło nakrywkowe nie jest dostępne, inwestycja czasu związana z przeniesieniem komórek bez rejestracji etapu, w połączeniu z nieodłącznym opóźnieniem między indukcją uszkodzenia a zobrazowaną rekrutacją, może sprawić, że immunofluorescencja stanie się nieatrakcyjna dla niektórych użytkowników. Jednak najdokładniejsze i najbardziej kompletne projekty eksperymentalne mikronapromieniania będą obejmowały tego typu podejścia równolegle z wykorzystaniem białek fluorescencyjnych, jak opisano w przedstawionym protokole.
W tym przypadku wykorzystuje się zarówno obrazowanie żywych komórek, jak i immunofluorescencję, aby zademonstrować użyteczność mikropromieniowania laserowego. Barwienie immunofluorescencyjne pozwala nam dokładnie zbadać mieszaninę powstałych uszkodzeń DNA i rekrutację białek indukowaną przez każdą moc lasera, co pozwala nam lepiej interpretować obserwowane zmiany w rekrutacji i retencji XRCC1-GFP. Na podstawie tych wyników należy ograniczyć stosowanie laserów o długości fali 405 nm do badania białek BER i SSBR. Co więcej, optymalny projekt eksperymentalny obejmowałby pomiary mocy po osiągnięciu celu, pełną charakterystykę mieszaniny uszkodzeń dla każdej użytej linii komórkowej oraz walidację rekrutacji i retencji obserwowanej w fluorescencyjnie znakowanych białkach za pomocą immunofluorescencji. Oczywiście względy sprzętowe, czasowe i kosztowe mogą sprawić, że te optymalne projekty eksperymentalne będą niemożliwe dla niektórych użytkowników. Jednak znaczenie każdego z tych elementów zostało tutaj pokazane, a użytkownicy powinni pamiętać o tych względach przy rozpoczynaniu eksperymentów z mikronapromieniowaniem.

Mikroskopia fluorescencyjna stała się potężną techniką do wizualizacji architektury komórkowej, badania lokalizacji białek i monitorowania interakcji białko-białko i białko-DNA. Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania reakcji na uszkodzenia DNA po zastosowaniu globalnych czynników uszkadzających DNA, takich jak światło ultrafioletowe (UV), promieniowanie jonizujące, chemiczne środki utleniające lub alkilujące i/lub chemioterapeutyki, dostarczyło nowych informacji na temat inicjacji, sygnalizacji i rekrutacji białek naprawczych DNA do miejsc uszkodzenia DNA1,2. Jednak te globalne i asynchroniczne szkodliwe zdarzenia ograniczają, jeśli poszukuje się szczegółowych informacji na temat kolejności rekrutacji, kinetyki asocjacji lub dysocjacji oraz relacji między kluczowymi białkami naprawy DNA. Na szczęście postępy w laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych, szersza dostępność fal laserowych wywołujących uszkodzenia oraz ulepszenia białek fluorescencyjnych w ciągu ostatnich 25 lat dostarczyły naukowcom ulepszonych narzędzi do badania tych aspektów naprawy DNA poprzez ukierunkowaną indukcję uszkodzeń DNA.
Naświetlanie komórek mikropromieniami laserowymi w celu badania funkcji komórkowych i subkomórkowych jest dobrze znanym narzędziem w biologii komórkowej i radiacyjnej3. Zastosowanie tej techniki do badania naprawy DNA pojawiło się, gdy Cremer i współpracownicy użyli wysoce skoncentrowanego systemu mikrowiązek laserowych UV (257 nm) do wywołania uszkodzenia DNA w plamce 0,5 μm w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO)4 i ustalili indukcję fotouszkodzeń DNA przez ten system5. Chociaż w tamtym czasie oferował on znaczne ulepszenia w stosunku do metod mikrowiązki UV, przyjęcie tego szkodliwego systemu było ograniczone ze względu na jego wyspecjalizowaną konfigurację i niezdolność do generowania podwójnych pęknięć nici (DSB)6. Późniejsze badania różnych długości fal UV-B (290 - 320 nm) i UV-A (320 - 400 nm) przez wiele grup wykazały, że fotoprodukty UV, zmiany w zasadach oksydacyjnych, pęknięcia pojedynczej nici (SSB) i DSB mogą być indukowane w zależności od długości fali i mocy zastosowanej lasera4,7,8,9,10 (recenzja w 3). Co więcej, stwierdzono również, że kombinacje tych długości fal UV-B i UV-A ze środkami uczulającymi, takimi jak psoralen, bromodeoksyurydyna (BrdU) i barwniki Hoechsta, indukują uszkodzenia DNA w zależności od długości fali, mocy i czasu trwania ekspozycji, chociaż moc potrzebna do wywołania uszkodzenia jest często obniżona w obecności tych czynników11,12,13,14,15. Postępy te rozszerzyły zastosowanie mikronapromieniowania, chociaż nadal istniały przeszkody techniczne, które należało rozwiązać, aby można było je pokonać w celu szerszego zastosowania tych metod.
Cremer i współpracownicy znacznie rozwinęli dziedzinę mikro-napromieniowania poprzez precyzyjne skupienie mikrowiązki UV w celu zastosowania znacznej szkodliwej energii na wysoce zlokalizowanym obszarze komórki. Wraz z rozwojem mikroskopów konfokalnych i systemów mikrodysekcji laserowej, ściśle skupione światło stało się szerzej dostępne; jednak sprzężenie źródeł UV z oscyloskopami i radzenie sobie z wywoływanymi przez nie aberracjami chromatycznymi nadal stanowiło poważne wyzwanie dla większości użytkowników3,6,16. Wraz ze wzrostem popularności barwników UV w latach dziewięćdziesiątych, optyka zdolna do ustawiania ostrości i rejestrowania fluorescencji wzbudzonej promieniowaniem UV stała się szerzej dostępna16, a ulepszenia w skanowaniu laserowym dały użytkownikom możliwość tworzenia wysoce skoncentrowanych punktów wzbudzenia UV w komórkach6,17. Jednak dopiero na początku 2000 roku prawdziwy wpływ tej kombinacji ściśle skoncentrowanych wiązek z laserami o większej intensywności był odczuwalny, kiedy pojawiły się liczne raporty pokazujące, że pęknięcia nici DNA mogą być indukowane z i bez uczulaczy w zakresie UV-A6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24,25,26, a nawet na dłuższych falach widzialnych, takich jak 488 nm27. Postępy te pozwoliły na szersze zastosowanie techniki mikronapromieniania w wielu systemach komercyjnych. Równolegle z tymi osiągnięciami pojawiły się również techniki dwufotonowe, które umożliwiły precyzyjną indukcję uszkodzeń DNA; Chociaż te postępy nie będą tutaj omawiane, istnieje wiele artykułów przeglądowych omawiających te metodologie9,28,29,30.
Dzięki obecnej dostępności mikroskopów konfokalnych zdolnych do dostarczania wysoce skupionego światła UV i powszechnej dostępności białek fluorescencyjnych, które umożliwiają śledzenie w czasie rzeczywistym białek naprawczych DNA, techniki mikronapromieniania przekształciły się w potężne narzędzia do badania odpowiedzi na uszkodzenia DNA i ścieżek naprawy. Jednak użytkownicy muszą mieć świadomość, że generowanie uszkodzeń DNA jest w dużym stopniu zależne od długości fali lasera i mocy przyłożonej do regionu subjądrowego. Zastosowanie długości fal UV-C (~260 nm) umożliwia bezpośrednie wzbudzenie DNA i wysoką selektywność do indukcji fotoproduktów UV7,8. Długości fal UV-B i UV-A wytwarzają mieszaniny uszkodzeń DNA (uszkodzenia zasadowe, SSB i DSB), w zależności od przyłożonej mocy i użytego tła komórkowego7. Endogenne fotouczulacze i poziomy przeciwutleniaczy w docelowych komórkach mogą wpływać na mieszaniny uszkodzeń DNA wytwarzane przez te długości fal. Dodatkowo stosowanie egzogennych fotouczulaczy (BrdU itp.) może pomóc w obniżeniu energii potrzebnej do indukcji uszkodzenia DNA. Jednak środki te mogą same w sobie indukować uszkodzenie DNA i mogą zmieniać cykl komórkowy i strukturę chromatyny, więc ich stosowanie może powodować niepożądane skutki, które muszą być brane pod uwagę przez użytkownika. Dlatego przed zastosowaniem mikronapromieniania do badania odpowiedzi i naprawy uszkodzeń DNA, konieczne jest dokładne rozważenie interesującego szlaku naprawy DNA, długości fal dostępnych do użycia oraz utworzonej mieszaniny uszkodzeń DNA.
Tutaj mikropromieniowanie laserowe jest wykonywane na dwóch powszechnie używanych długościach fal, 355 nm i 405 nm, bez uczulaczy, aby zademonstrować mieszaniny uszkodzeń DNA wywołanych przez te długości fal i wpływ, jaki te mieszaniny uszkodzeń mają na badanie naprawy SSB i DSB. Użytkownicy powinni być świadomi, że te długości fal nie tworzą pojedynczego rodzaju pęknięć nici lub uszkodzeń podstawowych. Aby rozróżnić szlaki naprawy DNA, użytkownicy muszą dokładnie kontrolować zastosowaną moc w określonym regionie jądra i scharakteryzować indukowane uszkodzenia za pomocą markerów pęknięcia wielu nici i przeciwciał przeciwko zmianom w DNA. Odpowiednio zastosowane i scharakteryzowane mikropromieniowanie laserowe może wzbogacić niektóre rodzaje uszkodzeń DNA, umożliwiając użytkownikom ocenę naprawy uszkodzeń podstawy i SSB lub DSB, z pewną specyficznością. W związku z tym udostępniliśmy metodę pozwalającą użytkownikom na powtarzalne wykonanie mikronaświetlania laserowego, scharakteryzowanie mieszanin uszkodzeń DNA wywołanych zastosowaną dawką lasera oraz przeprowadzenie analizy danych.

<table><tbody><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Nikon A1rsi</td><td>Oprogramowanie Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Laser Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>Źródło promieniowania</td></tr><tr><td>Galwanometr miniskaner fotoaktywacji</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe czujnik mocy fotodiody</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowy czujnik mocy fotodiody</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy ręczny miernik mocy optycznej i energii</td><td>THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>Od dr Samuela H. Wilsona, NIEHS</td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne media</td><td>Hyklon</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Atlanta biologiczne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus transfekcja</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4-komorowe szkło nakrywkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8-komorowe szkło nakrywkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>Antyfosfo-histon H2AX&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>Dimer pirymidyny Antycyklobutan</td>, <td>klon Cosmo Bio</td>, <td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>Anty 8-okso-2&acute;-deoksyguanozyna&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 kozia anty-mysz</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 koza anty-królik</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>Uwaga toksyczny!</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>Uwaga toksyczny!</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>Uwaga toksyczny!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Uwaga toksyczny!</td></tr><tr><td>Chlorowodorek Tris</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Istnieją wysoce skoordynowane szlaki naprawy DNA, które wykrywają, wycinają i zastępują uszkodzone zasady DNA, a także koordynują naprawę pęknięć nici DNA. Podczas gdy techniki biologii molekularnej wyjaśniły strukturę, funkcje enzymatyczne i kinetykę białek naprawczych, nadal istnieje potrzeba zrozumienia, w jaki sposób naprawa jest koordynowana w jądrze. Mikronapromienianie laserowe stanowi potężne narzędzie do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania rekrutacji białek naprawczych. Indukcja uszkodzeń DNA przez mikropromieniowanie laserowe może zachodzić przy różnych długościach fal, a użytkownicy mogą niezawodnie indukować pęknięcia pojedynczej nici, uszkodzenia zasad i pęknięcia podwójnej nici za pomocą różnych dawek. W tym przypadku mikropromieniowanie laserowe jest wykorzystywane do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych indukowanych przez dwie popularne konfokalne długości fal laserowych, 355 nm i 405 nm. Ponadto opisano właściwą charakterystykę zastosowanej dawki lasera do indukowania określonych mieszanin uszkodzeń, dzięki czemu użytkownicy mogą w sposób powtarzalny wykonywać akwizycję i analizę danych dotyczących mikronapromieniowania laserowego.

Charakteryzacja indukowanych uszkodzeń DNA 
Indukcja uszkodzeń zasad oraz pęknięć nici zależy od dawki lasera zastosowanej do wybranego obszaru jądra oraz mikrośrodowiska komórkowego użytego modelu komórkowego7. Białka fluorescencyjne połączone z białkami naprawczymi, takimi jak XRCC1, 53BP1, Ku70 lub Rad51, stanowią przydatne markery pęknięć pojedynczych i podwójnych nici, umożliwiając ustalenie minimalnej energii wymaganej do zaobserwowania akumulacji białka fluorescencyjnego w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) uszkodzenia powyżej poziomu fluorescencji tła9,19,31. Po znalezieniu warunków indukujących odpowiedź, kluczowe jest scharakteryzowanie mieszaniny uszkodzeń wywołanych przez konkretną długość fali i dawkę. Zmniejszenie dawki i czasu ekspozycji przy danej długości fali może pozwolić użytkownikowi zminimalizować powstawanie złożonych mieszanin uszkodzeń. Wykazano, że niskie dawki lasera w zakresie UV-A powodują głównie pęknięcia pojedynczych nici (SSB) i niewielką ilość uszkodzeń zasad, co jest odpowiednie do badania szlaków SSBR i BER10,28. Zwiększenie dawki prowadzi do powstania bardziej złożonych uszkodzeń zasad (oksydacyjnych i indukowanych promieniami UV) oraz indukuje znacznie większą liczbę pęknięć podwójnych nici (DSB)7,10. Choć indukcja pojedynczego rodzaju uszkodzenia DNA jest pożądana przy badaniu konkretnych szlaków naprawy DNA, bardziej prawdopodobne jest, że użytkownicy indukują mieszaninę uszkodzeń DNA, w której konkretne uszkodzenie, takie jak SSB, występuje znacznie częściej niż uszkodzenia zasad czy DSB. Jest to podobne do mieszanin uszkodzeń DNA indukowanych przez czynniki chemiczne, takie jak nadtlenek wodoru (H2O2) lub metylometanosulfonian (MMS)32. Raportując wyniki, użytkownicy muszą mieć świadomość możliwości wystąpienia mieszanin uszkodzeń; staranna charakteryzacja dawki i rodzaju uszkodzeń w miejscu indukcji jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności i porównywalności uzyskanych wyników.
W badaniach nad mikroirradiation często stosuje się XRCC1-GFP jako marker indukcji uszkodzeń zasad oraz pęknięć jednoniciowych (SSB)9,28. XRCC1 jest białkiem rusztowaniowym, które odgrywa istotną rolę w naprawie SSB (SSBR) oraz naprawie przez wycinanie zasad (BER), a także uczestniczy w innych szlakach naprawczych, takich jak naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)33,34,35. Pełni on ważną rolę koordynacyjną w naprawie DNA, oddziałując z szeregiem kluczowych białek, w tym z polimerazą poli(ADP-rybozową) 1 (PARP-1), polimerazą DNA β (Pol β) i ligazą DNA III. Wykorzystaliśmy XRCC1-GFP stabilnie ekspresowane w komórkach CHO-K1, aby określić dawki laserowe wymagane do generowania SSB i pęknięć dwuniciowych (DSB). Najpierw zidentyfikowano minimalną dawkę niezbędną do wywołania obserwowalnej rekrutacji XRCC1-GFP dla każdej długości fali (Rysunek 1). Dla długości fali 355 nm czas przebywania lasera 2 s nad zdefiniowanym obszarem zainteresowania (ROI) uszkodzenia spowodował wzrost sygnału fluorescencyjnego w tym ROI, co wskazało na indukcję uszkodzeń DNA wykrywalnych ponad tłem (Rysunek 1A). Dla 405 nm wymagana była prędkość skanowania 8 fps, aby wygenerować obserwowalną rekrutację do ROI uszkodzenia (Rysunek 1A). Następnie zwiększono dawkę (10 s dla 355 nm i 0,5 fps dla 405 nm), aby stworzyć bardziej intensywne ROI uszkodzenia (Rysunek 1A).
Rekrutację i retencję XRCC1-GFP w miejscu indukowanego uszkodzenia monitorowano następnie za pomocą obrazowania timelapse. Retencja białka w miejscu uszkodzenia DNA może wskazywać na trwającą naprawę DNA, podczas gdy dysocjacja białka z miejsca indukowanego uszkodzenia jest często uważana za marker zakończenia BER lub SSBR. Jednakże nie ma jednoznacznych dowodów wiążących dysocjację XRCC1 z miejsc uszkodzeń DNA wywołanych laserem z zakończeniem procesu naprawy. Rekrutację białka do miejsca uszkodzenia mierzy się, podając średnią intensywność sygnału fluorescencyjnego w obrębie uszkodzonego ROI w stosunku do średniego sygnału fluorescencyjnego zmierzonego dla całego jądra komórkowego (Rysunek 1B). Ten rodzaj normalizacji pomaga niwelować fluktuacje intensywności sygnału w jądrze, choć w zależności od dystrybucji komórkowej badanego białka można zastosować inne techniki normalizacji. W tym przypadku XRCC1 lokalizuje się w przedziale jądrowym, zatem normalizacja do obszaru jądra mierzy redystrybucję sygnału do ROI uszkodzenia. Średnia intensywność fluorescencji ROI jest następnie rejestrowana dla każdego obrazu w serii timelapse, w tym obrazu przed uszkodzeniem, i przedstawiana na wykresie jako funkcja czasu (Rysunek 1C).
Następnie dalej charakteryzowano uszkodzenia wywołane przez dwie wybrane dawki lasera, aby zbadać powstawanie uszkodzeń zasad DNA. Po pierwsze, za pomocą immunofluorescencji badano powstawanie CPD, czyli masywnych uszkodzeń indukowanych przez UV, jako markerów uszkodzeń typu NER (Rycyna 2A). Następnie badano indukowane oksydacyjnie uszkodzenie zasady 8-oxodG jako marker uszkodzeń typu BER (Rycyna 2B). Nie zaobserwowano istotnego wzrostu uszkodzeń CPD przy ekspozycji na niską dawkę dla obu długości fal (2 s dla 355 nm i 8 fps dla 405 nm), podczas gdy wysoka dawka przy obu długościach fal (10 s dla 355 nm i 0,5 fps dla 405 nm) wykazała istotny wzrost sygnału fluorescencyjnego w obrębie ROI uszkodzeń (Rycyna 2A). Wykres rozrzutu średniej intensywności CPD w ROI dla każdej uszkodzonej komórki wykazuje heterogeniczność w powstawaniu i wykrywaniu uszkodzeń przy obu długościach fal i dawkach, co wskazuje, że przy niższych dawkach może występować niski poziom uszkodzeń CPD, ale obciążenie może nie być istotnie wykrywane aż do zastosowania wyższej dawki. Wykres rozrzutu sugeruje również niewydajność detekcji przeciwciał, co może ograniczać dokładną kwantyfikację mieszanin uszkodzeń.
Zostało to dodatkowo podkreślone podczas wykrywania indukowanych oksydacyjnie uszkodzeń DNA za pomocą markera 8-oxodG. Nie zaobserwowano wyraźnego wzrostu sygnału fluorescencyjnego w obrębie ROI uszkodzenia dla 8-oxodG przy żadnej z zastosowanych długości fali lasera ani dawek (Rysunek 2B). Przeciwciało wykorzystane w tej pracy jest zgodne z wcześniejszymi publikacjami9,10,36; należy jednak zauważyć, że obserwacja tworzenia się 8-oxodG za pomocą przeciwciał może mieć pewne ograniczenia37,38. Potwierdzenie braku uszkodzeń indukowanych oksydacyjnie jest zalecane również przy użyciu drugiego markera, takiego jak rekrutacja 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzymu odpowiedzialnego za usuwanie 8-oxodG z DNA10. Nie zaobserwowaliśmy rekrutacji OGG1 do miejsc uszkodzeń DNA; jednak nie można całkowicie wykluczyć powstawania niskich poziomów indukowanych oksydacyjnie uszkodzeń DNA.
Na koniec, przy wybranych dawkach lasera, zbadaliśmy powstawanie DSBs za pomocą dwóch markerów, γH2AX oraz 53BP-1, wykorzystując immunofluorescencję (Rysunek 3 &amp; 4). γH2AX jest powszechnie stosowany jako marker pęknięć nici, jednak jego swoistość w odniesieniu do DSBs była kwestionowana w wielu doniesieniach39,40. Ponadto jest to zdarzenie fosforylacji, które rozprzestrzenia się z miejsca pęknięcia nici, przez co lokalizacja sygnału w miejscu pęknięcia może być ograniczona ze względu na tę propagację. Dlatego połączenie γH2AX z 53BP-1 pozwala na dokładniejszą ocenę powstawania DSB w obrębie ROI uszkodzenia.
Odpowiedź γH2AX i 53BP-1 na mikroirradiację jest zależna zarówno od długości fali, jak i od dawki. Stymulacja niską dawką (2 s) przy 355 nm nie wywołuje odpowiedzi w 5. i 20. minucie, a w 10. minucie po irradiacji obserwuje się słabą i zmienną odpowiedź (Rysunek 3A) dla obu markerów. Wysoka dawka (10 s) mikroirradiacji przy 355 nm indukuje zwiększony sygnał fluorescencyjny w obrębie ROI uszkodzenia w 5., 10. i 20. minucie po irradiacji, który ulega zmniejszeniu w 40. minucie (Rysunek 3B). Wyniki te wskazują, że wymagane jest staranne miareczkowanie dawki 355 nm w celu zminimalizowania wzajemnej stymulacji szlaków naprawczych, co potwierdzono poprzez zmniejszone wykrywanie markera pęknięć dwuniciowych γH2AX w wczesnych punktach czasowych (&lt; 20 min) przy zastosowaniu niskiej dawki.
Podobne eksperymenty przeprowadzono przy użyciu stymulacji laserowej 405 nm zarówno z niską (8 fps), jak i wysoką dawką (0,5 fps) (Rysunek 4). Przy tej długości fali zaobserwowano znaczną akumulację intensywności fluorescencji w obrębie ROI uszkodzenia zarówno dla 53BP-1, jak i γH2AX, niezależnie od zastosowanej dawki, co wskazuje, że dawki te generują złożoną mieszaninę pęknięć jednoniciowych i dwuniciowych niemal natychmiast po indukcji uszkodzeń DNA (Rysunek 4). Ponadto wysokie dawki 405 nm wywołują wzrost pan-jądrowego barwienia γH2AX w ciągu 10 min od indukcji uszkodzeń (Rysunek 4B, dół), co utrudnia raportowanie detekcji ROI uszkodzenia, podczas gdy akumulacja 53BP-1 jest bardziej ograniczona do obszaru ROI uszkodzenia.
Wyniki te wyraźnie pokazują, że mikroirradiacja o długości fali 405 nm nie jest odpowiednia do monitorowania SSBR lub BER i że w celu pełnej charakterystyki indukowanych uszkodzeń oraz odpowiedzi naprawczych DNA należy zastosować wiele markerów adduktów DNA i pęknięć nici.
Zależna od dawki zmiana w rekrutacji i retencji XRCC1-GFP 
Po scharakteryzowaniu indukowanych uszkodzeń DNA, mikroirradiacja laserowa może stanowić idealną platformę do badania dynamiki białek naprawczych DNA. Kinetyka retencji i dysocjacji XRCC1-GFP wykazuje zależność od dawki (Rysunek 1), co nie jest zaskakujące, biorąc pod uwagę indukcję różnych mieszanek uszkodzeń przez każdą z długości fal. Najwyższe dawki naświetlania (10 s i 0,5 fps) wykazują silniejszą rekrutację XRCC1-GFP w porównaniu z niższymi dawkami oraz dłuższą retencję XRCC1-GFP w miejscu uszkodzenia w ciągu 20 min (Rysunek 1C). Wskazuje to, że uszkodzenia DNA powstałe przy wyższych dawkach zarówno dla 355 nm, jak i 405 nm, prawdopodobnie nie zostają naprawione w trakcie eksperymentu, co jest spójne z pojawieniem się i retencją markerów DSB, γH2AX oraz 53BP-1 (Rysunki 3 i 4).
Interesujące jest to, że niższe dawki uszkadzające (2 s i 8 fps) wykazują szybką rekrutację XRCC1-GFP do miejsc uszkodzeń oraz dysocjację XRCC1-GFP w czasie trwania eksperymentu do poziomów sprzed napromieniowania (Rysunek 1C). Bez pełnej charakterystyki mieszaniny uszkodzeń może to prowadzić do wniosku, że SSBs i uszkodzenia zasad są całkowicie naprawiane w tych warunkach uszkadzania. Jednak obecność γH2AX i 53BP-1 w 40 min dla 355 nm oraz w 5 min dla 405 nm może prowadzić do innych interpretacji. W przypadku dawki 355 nm 2 s mieszanina uszkodzeń może składać się głównie z SSBs, zatem pojawienie się markerów DSB w 40 min może wskazywać, że niektóre nienaprawione uszkodzenia mogą prowadzić do powstania DSBs lub że DSBs generowane przez tę energię są naprawiane w dłuższej skali czasowej. Różnice w skali czasowej między naprawą SSBR a DSB były wcześniej raportowane28,41,42. Podobnie, dysocjacja przy niskiej dawce 405 nm (8 fps) może wskazywać na niski poziom SSBs lub grupowanie się SSBs, które są szybko przekształcane w DSBs, co było wcześniej odnotowane dla mikro-napromieniowania o wysokim stopniu uszkadzania oraz innych czynników uszkadzających DNA43,44,45.
Wszystkie te wyniki podkreślają znaczenie charakteryzowania mieszanin indukowanych uszkodzeń oraz wykorzystania wielu białek naprawczych DNA i markerów w celu interpretacji rekrutacji i retencji białek naprawczych DNA w miejscach indukowanych uszkodzeń.
<img alt="Analiza powrotu fluorescencji, XRCC1-GFP, schemat natężenia ROI po uszkodzeniu UV przy 355 nm, 405 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Mikro-naświetlanie laserowe indukuje rekrutację XRCC1-GFP. 
(A) Komórki CHO-K1 stabilnie eksponujące XRCC1-GFP zostały poddane naświetlaniu i obrazowaniu przed oraz bezpośrednio po indukcji uszkodzeń. Strzałki wskazują miejsce dawki mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm. (B) Rekrutację mierzy się poprzez wyznaczenie średniego natężenia fluorescencji w obrębie ROI uszkodzenia i normalizację do średniego natężenia fluorescencji całego jądra. (C) Dynamikę rekrutacji można mierzyć dla każdego obrazu z serii timelapse. Wykresy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów, a słupki błędów przedstawiają SEM (n=24). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza uszkodzeń chromoforów; wykres fluorescencji, mikroskopia; naprawa DNA; eksperyment z użyciem światła UV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Mikro-naświetlanie laserowe indukuje uszkodzenia nukleotydów. 
Komórki CHO-K1 poddano mikro-naświetlaniu laserowemu i utrwalono bezpośrednio po indukcji uszkodzeń. Przeprowadzono immunofluorescencję w celu wykrycia adduktów CPD oraz 8-oxodG. (A) Góra: wykres punktowy średnich intensywności fluorescencji w ROI zaobserwowanych w uszkodzonych komórkach po barwieniu na CPD. Dół: reprezentatywne obrazy barwienia na CPD. Strzałki wskazują miejsce mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm (n=12). (B) Reprezentatywne obrazy barwienia na 8-oxodG. Strzałki wskazują miejsce mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; średnia fluorescencja 53BP1/γH2AX; badanie naświetlania; wykresy ROI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Markery pęknięć dwuniciowych DNA reagują na mikro-naświetlanie 355 nm w sposób zależny od dawki.  
Komórki CHO-K1 poddano mikro-naświetlaniu i utrwalono w określonych punktach czasowych po stymulacji. Wykonano immunofluorescencję dla markerów DSB γH2AX i 53BP-1. (A) Wykres rozproszenia znormalizowanych średnich intensywności fluorescencji w ROI uszkodzeń, zmierzonych dla komórek nieuszkodzonych i uszkodzonych. Słupki błędów reprezentują SEM (n=12). (B) Reprezentatywne obrazy dla barwienia γH2AX i 53BP-1. Strzałki wskazują miejsce mikro-naświetlania, a pasek skali wynosi 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Odpowiedź na uszkodzenia DNA, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykres, analiza białek 53BP1 i γH2AX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Markery pęknięć dwuniciowych DNA wykazują silną odpowiedź na mikroirradiację 405 nm. 
Komórki CHO-K1 poddano mikroirradiacji i utrwalono w określonych punktach czasowych po stymulacji. Immunofluorescencja dla markerów DSB γH2AX i 53BP-1. (A) Wykres rozrzutu znormalizowanych średnich intensywności fluorescencji ROI uszkodzeń zmierzonych dla komórek nieuszkodzonych i uszkodzonych. Słupki błędów reprezentują SEM (n=12). (B) Reprezentatywne obrazy dla barwienia γH2AX i 53BP-1. Strzałki wskazują miejsce mikroirradiacji, a pasek skali wynosi 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie uszkodzeń DNA w podjądrowym regionie komórki przy użyciu lasera z konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące naprawy DNA, takie jak sposób rekrutacji i utrzymywania białek w miejscach uszkodzeń DNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji badanego białka w czasie rzeczywistym, co pozwala na opracowanie profilu jego rekrutacji i retencji.Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia szkiełka z komorą zawierającego badane komórki w inkubatorze nakładkowym utrzymującym temperaturę 37 °C oraz stężenie 5% carbon dioxide. Pola obrazowania należy zarejestrować za pomocą kodowanego automatycznego stolika mikroskopowego. Należy wybrać rozpoznawalny element naczynia hodowlanego, taki jak bariera między studzienkami.Należy wykonać obraz i zapisać współrzędne X-Y. Pozwoli to na wyrównanie i rejestrację lokalizacji X-Y wybranych pól po przygotowaniu próbki. Po zakończeniu rejestracji obrazu należy wybrać pole do mikroirradiacji i ustawić ostrość próbki.W przypadku komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie, należy wybrać płaszczyznę ogniskowania z maksymalnym przekrojem jądra w interesującym nas kanale fluorescencji. Ustawienie ostrości na maksymalnym przekroju jądra jest kluczowe, ponieważ zapewnia ono wycentrowanie punktu ogniskowania na jądrze, co umożliwia monitorowanie rekrutacji badanego białka do miejsca wywołanego uszkodzenia. Należy wybrać wyraźną strukturę w obrębie jądra, np. jąderko, i przesuwać płaszczyznę ogniskowania w górę i w dół, obserwując zmiany w jej wyglądzie.Rzeczywista płaszczyzna ogniskowania będzie znajdować się w obszarze przejścia z jasnego w ciemny. Aby ustawić ostrość próbki, należy wybrać płaszczyznę ogniskowania, w której wybrany element posiada najwyższy kontrast. Kolejnym krokiem jest zarejestrowanie pozycji interesującego nas pola widzenia.Utwórz w oprogramowaniu mikroskopu kwadratowy obszar zainteresowania (ROI) o rozmiarach trzech na trzy piksele. Umieść ten ROI nad jądrem komórki przeznaczonej do uszkodzenia i zdefiniuj go jako ROI uszkodzenia. Wykonaj obraz przed uszkodzeniem, obejmujący położenie ROI uszkodzenia.Należy uzyskać obraz w jasnym polu w kanale fluorescencyjnym dla analizowanego białka. Komórki są teraz gotowe do mikro-naświetlania laserowego. W tym pokazie zostanie użyty laser o długości fali 405 nm przy mocy 100%.Dawka lasera o długości fali 405 nm jest kontrolowana poprzez modulację prędkości skanowania i wykonanie jednego skanu wybranego obszaru zainteresowania (ROI) podlegającego uszkodzeniu. W tym doświadczeniu do mikroirradiacji przy 405 nm należy zastosować osiem klatek na sekundę oraz 0,5 klatki na sekundę. Wybór odpowiedniej mocy lasera do uszkadzania komórek jest kluczowy dla rozróżnienia różnych szlaków naprawy DNA.Przeprowadź akwizycję obrazów time-lapse dla kanałów w polu jasnym i fluorescencji po uszkodzeniu. Dostosuj czas trwania i częstotliwość serii time-lapse, aby zoptymalizować gromadzenie danych, idealnie rejestrując akumulację białka fluorescencyjnego w obszarze ROI uszkodzenia oraz jego dysocjację w czasie trwania eksperymentu. Po zakończeniu serii czasowej wybierz nowe pole komórek do uszkodzenia i kontynuuj mikroirradiację oraz obrazowanie time-lapse, aż do osiągnięcia pożądanej liczby uszkodzonych komórek.Zaleca się analizę od 10 do 25 komórek na wybrany warunek. Aby zwiększyć całkowitą liczbę komórek do analizy immunofluorescencyjnej, należy uszkodzić dodatkowe pola w naczyniu hodowlanym, aby stworzyć wielopolowy przebieg czasowy odpowiedzi po uszkodzeniu. Należy zapisać współrzędne X-Y każdego pola oraz czas wystąpienia uszkodzenia.Komórki można utrwalić bezpośrednio po uszkodzeniu lub pozwolić im na naprawę w wybranych odstępach czasu przed utrwaleniem. Aby rozpocząć tę analizę, otwórz pozyskane obrazy w aplikacji do analizy obrazu, takiej jak NIS-Elements. Dla każdej komórki poddawanej pomiarom wygeneruj najpierw referencyjny obszar zainteresowania (ROI), który reprezentuje jądro komórkowe.Zastosuj algorytm progowania sygnału fluorescencji obejmujący piksele tworzące jądro komórkowe, a następnie przekształć ten obszar w ROI. Następnie utwórz ROI o rozmiarach sześć na sześć pikseli i umieść je nad ROI uszkodzenia. To większe ROI stanowi teraz ROI uszkodzenia do analizy.Dla każdej mierzonej komórki należy zapisać średnią intensywność fluorescencji dla obszarów ROI referencyjnego i uszkodzonego. Dla każdej klatki przebiegu czasowego należy dostosować ROI referencyjne, aby upewnić się, że obszar jądra jest dokładnie pokryty przez ROI, oraz dostosować ROI uszkodzone, aby upewnić się, że obejmuje ono miejsce uszkodzenia. Dla każdej klatki przebiegu czasowego należy zapisać średnią intensywność sygnału fluorescencyjnego w obrębie każdego ROI.Dla każdej komórki znormalizuj średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia względem odpowiadającego jej ROI referencyjnego w każdej klatce filmu time-lapse. W tym przypadku jako ROI referencyjne wykorzystuje się średnią intensywność fluorescencji jądra, a normalizację przeprowadza się poprzez odjęcie średniej intensywności fluorescencji ROI referencyjnego od średniej intensywności fluorescencji ROI uszkodzenia. Powtórz normalizację dla wszystkich uszkodzonych komórek oraz dla co najmniej dwóch nieuszkodzonych komórek kontrolnych.Na koniec należy przedstawić na wykresie znormalizowane wartości intensywności w czasie, aby wykazać zmiany w dynamice rekrutacji w zależności od zastosowanej procedury eksperymentalnej. Komórki stabilnie ekspresujące XRCC1-GFP poddano napromieniowaniu i obrazowaniu przed oraz po indukcji uszkodzeń. Obserwowano rekrutację XRCC1-GFP do ROI miejsca uszkodzenia i mierzono dynamikę tej rekrutacji.Powstawanie pęknięć obu nici badano przy użyciu dwóch markerów. W przypadku obu markerów, dwie drugie stymulacje niską dawką przy 355 nanometrach nie wywołują odpowiedzi w piątej i dwudziestej minucie oraz wywołują słabą i zmienną odpowiedź w dziesiątej minucie po napromieniowaniu. 10-sekundowa mikro-irradiacja wysoką dawką przy 355 nanometrach indukuje zwiększony sygnał fluorescencyjny w obszarze ROI uszkodzenia w piątej, dziesiątej i dwudziestej minucie po napromieniowaniu, który ulega zmniejszeniu w czterdziestej minucie.Wyniki te wskazują, że markery pęknięć dwuniciowych DNA reagują na mikro-napromieniowanie falą o długości 355 nm w sposób zależny od dawki. Z kolei stymulacja laserem o długości 405 nm doprowadziła do znaczącej akumulacji obu markerów w obrębie ROI uszkodzenia, niezależnie od zastosowanej dawki. Po opanowaniu techniki, jej prawidłowe przeprowadzenie dla 10 komórek zajmuje około czterech godzin.Podczas stosowania tej techniki ważne jest dostosowanie długości fali lasera oraz mocy do monitorowanego procesu naprawy. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać immunofluorescencję, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rekrutacji dodatkowych białek lub zmian w statusie fosforylacji bądź innych modyfikacji potranslacyjnych. Technika ta pozwala badaczom badać dynamiczną rekrutację białek naprawy DNA i lepiej określić, w jaki sposób domeny białkowe oraz mutacje wpływają na rozpoznawanie uszkodzeń DNA i odpowiedź na nie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat wykorzystania konfokalnego mikroskopu skaningowego do indukowania uszkodzeń DNA oraz monitorowania rekrutacji białek naprawczych DNA. Należy pamiętać, że praca z laserami i odczynnikami chemicznymi, takimi jak formaldehyd, może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, w tym stosować osobiste środki ochrony indywidualnej.

application-laser-micro-irradiation-for-examination-single-double

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę efektywnej identyfikacji komórek fazy S do dalszych badań mikroskopowych, takich jak pomiar rekrutacji białka naprawczego DNA za pomocą mikronapromieniowania laserowego.

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

W Indonezji biopsja węzła wartowniczego (SNB) nie jest rutynowo wykonywana w chirurgii raka piersi ze względu na ograniczenie w dostarczaniu znacznika radioizotopowego i izosulfanu lub opatentowanego niebieskiego barwnika (PBD). Aby pokonać tę przeszkodę, zastosowaliśmy 1% barwnik błękitu metylenowego (MBD) jako pojedynczy środek do mapowania węzłów wartowniczych (SN).

Zastosowanie 1% barwnika błękitu metylenowego jako pojedynczej techniki w biopsji węzła wartowniczego raka piersi

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Poznaj mikronapromienianie laserowe do badania naprawy DNA w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia wizualizację rekrutacji białek naprawczych w czasie rzeczywistym.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów