Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków
5 września 2017
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie uszkodzenia DNA w subjądrowym regionie komórki za pomocą konfokalnego lasera fluorescencyjnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące naprawy DNA, takie jak to, w jaki sposób białka są rekrutowane i zatrzymywane w miejscach uszkodzenia DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wizualizację interesującego białka w czasie rzeczywistym, dzięki czemu można zbudować profil rekrutacji i retencji.
Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia szkiełka z komorą zawierającego interesujące komórki w inkubatorze ze stopniem utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Rejestruj pola obrazu za pomocą zakodowanego, zautomatyzowanego stolika mikroskopowego. Wybierz rozpoznawalną cechę naczynia hodowlanego, taką jak bariera między studzienkami.
Zbierz obraz i zapisz lokalizację X-Y. Pozwoli to na wyrównanie i rejestrację lokalizacji X-Y wybranych pól po przygotowaniu próbki. Po zakończeniu rejestracji obrazu wybierz pole do mikronapromieniowania i skoncentruj próbkę.
W przypadku komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie należy wybrać płaszczyznę ogniskową z maksymalnym przekrojem jądrowym w interesującym nas kanale fluorescencyjnym. Skupienie się na maksymalnym przekroju poprzecznym jądra ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewnia, że punkt ogniskowy jest wyśrodkowany na jądrze w celu monitorowania rekrutacji białka będącego przedmiotem zainteresowania do miejsca indukowanego uszkodzenia. Wybierz wyraźną cechę w jądrze, taką jak jąderko, i przesuwaj płaszczyznę ogniskowej w górę iw dół, obserwując tę zmianę wyglądu.
Prawdziwa płaszczyzna ogniskowa będzie leżeć w przejściu od światła do ciemności. Aby ustawić ostrość próbki, wybierz płaszczyznę ogniskowej, w której wybrany element ma najostrzejszy kontrast. Kolejnym krokiem jest zarejestrowanie pozycji pola zainteresowania.
Utwórz kwadratowy obszar zainteresowania o wymiarach trzy na trzy piksele (ROI) w oprogramowaniu mikroskopu. Umieść ten ROI nad jądrem komórki, która ma zostać uszkodzona, i ustaw ten ROI jako uszkodzony ROI. Zbierz obraz przed uszkodzeniem, w tym położenie zwrotu z inwestycji w obrażenia.
Uzyskaj obraz zawierający jasne pole w kanale kwiatowym dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ogniwa są teraz gotowe do mikronapromieniowania laserowego. W tej demonstracji zostanie użyty laser 405-nanometrowy o 100% mocy.
Dawka lasera 405-nanometrowego jest kontrolowana poprzez modulację szybkości skanowania i wykonanie jednego skanu wybranego zwrotu z inwestycji w uszkodzenia. W tym eksperymencie użyj ośmiu i 0,5 klatki na sekundę do mikronaświetlania o długości 405 nanometrów. Wybór odpowiedniej mocy lasera do uszkadzania komórek ma kluczowe znaczenie dla rozdzielenia różnych szlaków naprawy DNA.
Wykonaj akwizycję obrazu poklatkowego jasnego pola i kanałów fluorescencyjnych po uszkodzeniu. Dostosuj czas trwania i częstotliwość filmu poklatkowego, aby zoptymalizować gromadzenie danych, idealnie uchwycając akumulację białka fluorescencyjnego w miejscu uszkodzenia ROI i jego dysocjację w czasie trwania eksperymentu. Po zakończeniu przebiegu czasowego wybierz nowe pole komórek do uszkodzenia i kontynuuj mikronapromienianie i obrazowanie poklatkowe, aż do osiągnięcia pożądanej liczby uszkodzonych komórek.
Zalecane jest od 10 do 25 komórek na wybrany warunek. Aby zwiększyć ogólną liczbę komórek do analizy immunofluorescencyjnej, należy uszkodzić dodatkowe pola w naczyniu hodowlanym, aby wygenerować wielopolowy przebieg czasowy odpowiedzi po uszkodzeniu. Zapisz lokalizację X-Y każdego pola i czas wystąpienia uszkodzenia.
Ogniwa mogą być naprawiane natychmiast po uszkodzeniu lub pozostawione do naprawy przez wybrane przyrosty czasu przed utrwaleniem. Aby rozpocząć tę analizę, otwórz uzyskane obrazy w aplikacji do analizy obrazów, takiej jak NIS-Elements. Dla każdej komórki, która ma być mierzona, najpierw wygeneruj referencyjny zwrot z inwestycji, który reprezentuje jądro.
Użyj algorytmu progowego na sygnale fluorescencji, który zawiera piksele tworzące jądro, a następnie przekształć ten obszar w ROI. Następnie utwórz ROI o wymiarach sześć na sześć pikseli i umieść go na ROI obrażeń. Ten większy zwrot z inwestycji jest teraz zwrotem z inwestycji w szkody do analizy.
Dla każdej komórki, która ma być mierzona, zapisz średnią intensywność kwitnienia dla odniesienia i zwrotu z inwestycji w uszkodzenia. Dla każdej klatki przebiegu czasu dostosuj referencyjny zwrot z inwestycji, aby upewnić się, że obszar jądrowy jest dokładnie pokryty zwrotem z inwestycji i dostosuj zwrot z inwestycji w uszkodzenie, aby upewnić się, że uszkodzone miejsce jest pokryte. Zapisz średnią intensywność fluorescencji sygnału fluorescencyjnego w każdym ROI dla każdej klatki przebiegu czasu.
Dla każdej komórki znormalizuj średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia do odpowiadającej jej referencyjnej ROI w każdej klatce poklatkowej. W tym przypadku średnia intensywność fluorescencji jądrowej jest używana jako referencyjny ROI, a normalizacja odbywa się poprzez odjęcie średniej referencyjnej intensywności fluorescencji ROI od średniej intensywności fluorescencji ROI uszkodzenia. Powtórz normalizację dla wszystkich uszkodzonych komórek, a także dla co najmniej dwóch nieuszkodzonych komórek kontrolnych.
Na koniec znormalizuj wartości intensywności w czasie, aby pokazać zmiany w dynamice rekrutacji w funkcji leczenia eksperymentalnego. Komórki stabilnie wykazujące ekspresję XRCC1-GFP zostały napromieniowane i zobrazowane przed i po indukcji uszkodzenia. Zaobserwowano rekrutację XRCC1-GFP do szkodliwego zwrotu z inwestycji i zmierzono dynamikę rekrutacji.
Powstawanie pęknięć dwuniciowych badano za pomocą dwóch markerów. Dla obu markerów, dwusekundowa stymulacja niską dawką przy 355 nanometrach nie wywołuje żadnej odpowiedzi po pięciu minutach i 20 minutach oraz słabą i zmienną odpowiedź po 10 minutach od napromieniowania. 10-sekundowe mikropromieniowanie o wysokiej dawce przy 355 nanometrach indukuje zwiększony sygnał fluorescencyjny w obrębie zwrotu z inwestycji w uszkodzenie po pięciu, 10 i 20 minutach po napromieniowaniu, który jest zmniejszany po 40 minutach.
Wyniki te wskazują, że markery zerwania dwuniciowego DNA reagują na mikropromieniowanie o długości 355 nanometrów w sposób zależny od dawki. Natomiast stymulacja laserowa w 405 nanometrach spowodowała znaczną akumulację obu markerów w obrębie zwrotu z inwestycji w uszkodzenia, niezależnie od zastosowanej dawki. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około czterech godzin na 10 komórek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby dostosować długość fali lasera i przyłożoną moc do monitorowanego procesu naprawy. Po tej procedurze można przeprowadzić immunofluorescencję, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rekrutacji dodatkowych białek lub zmian stanu fosforylacji lub innych modyfikacji potranslacyjnych. Technika ta pozwala naukowcom badać dynamiczną rekrutację białek naprawczych DNA i lepiej określać, w jaki sposób domeny białkowe i mutacje wpływają na rozpoznawanie i reakcję na uszkodzenia DNA.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego do wywoływania uszkodzeń DNA i monitorowania rekrutacji białek naprawczych DNA. Nie zapominaj, że praca z laserami i chemikaliami, takimi jak formaldehyd, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.
Przegląd
To badanie wykorzystuje konfokalną mikroskopię fluorescencyjną i laserową mikro-iradiację do wywołania uszkodzenia DNA i obserwacji rekrutacji białek naprawczych DNA w czasie rzeczywistym. Techniki te poprawiają nasze zrozumienie mechanizmów wykrywania i naprawy uszkodzeń DNA.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mechanizmy naprawy DNA
Tło
- Uszkodzenie DNA jest krytycznym czynnikiem funkcjonowania i integralności komórkowej.
- Rozumienie dynamiki białek naprawczych DNA jest niezbędne dla wnikliwego zrozumienia stabilności genomowej.
- Mikroskopia konfokalna pozwala na precyzyjne obrazowanie procesów komórkowych.
- Laserowa mikro-iradiacja zapewnia metodę wywoływania zlokalizowanych uszkodzeń DNA.
Cel badania
- Zbadać rekrutację i utrzymanie białek naprawczych DNA w miejscach wywołanego uszkodzenia DNA.
- Analizować dynamikę reakcji białek w czasie po uszkodzeniu DNA.
- Porównywać efekty różnych długości fal lasera na ścieżki naprawy DNA.
Stosowane metody
- Komórki są hodowane na komorowych szkiełkach i utrzymywane w kontrolowanym środowisku.
- Mikroskopia konfokalna jest używana do rejestracji pól obrazów i fokusu na jądrach.
- Laserowa mikro-iradiacja jest wykonywana za pomocą lasera 405-nanometrycznego, aby wywołać uszkodzenie DNA.
- Zdjęcia time-lapse rejestrują rekrutację białek z oznakami fluorescencyjnymi po uszkodzeniu.
Główne wyniki
- Zaobserwowano i zmierzono rekrutację XRCC1-GFP do miejsc uszkodzeń.
- Różne dawki lasera wywoływały zróżnicowane odpowiedzi markerów naprawy DNA.
- Zdjęcia time-lapse ujawniły dynamikę akumulacji i dysocjacji białek.
- Wyniki wskazały na zależną od dawki odpowiedź markerów naprawy DNA na mikro-iradiację.
Wnioski
- Badanie z powodzeniem pokazuje zastosowanie mikroskopii konfokalnej i laserowej mikro-iradiacja w badaniach nad naprawą DNA.
- Wizualizację w czasie rzeczywistym zapewnia cenne wglądy w dynamikę rekrutacji białek naprawczych.
- Te techniki mogą być stosowane do dalszego badania mechanizmów naprawy DNA w różnych kontekstach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser micro-irradiation combined with confocal microscopy enables precise induction and quantification of DNA strand breaks in mammalian cells, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides real-time, quantitative insights into DNA repair protein recruitment and retention, informing target validation and pathway interrogation. The method enhances predictive confidence for DNA repair targets and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment dynamics.
- Supports functional validation of DNA repair targets by quantifying recruitment and retention at damage sites.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing single- and double-strand break responses.
- Provides quantitative data for triaging DNA repair targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, dose-controlled DNA damage induction for assay standardization.
- Generates quantitative, time-resolved readouts of protein recruitment for screening readiness.
- Supports development of scalable assays for compound evaluation targeting DNA repair pathways.
- Enables platform reuse across different repair proteins and cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair dynamics with disease-relevant cellular contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in mammalian systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying repair kinetics and pathway engagement.
- Facilitates evaluation of protein domain mutations and post-translational modifications in repair processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for DNA repair targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of DNA repair mechanisms and protein function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers time-resolved, normalized fluorescence measurements for comparative analysis of repair dynamics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling mechanistic evaluation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse DNA repair research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DNA repair target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of DNA damage and repair assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of DNA repair targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to laser-equipped confocal microscopes and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of laser dose, ROI selection, and normalization protocols.
- Adaptable to various cell models and repair proteins with appropriate optimization.
- Safety precautions are essential due to laser use and chemical fixation steps.
