Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie uszkodzenia DNA w subjądrowym regionie komórki za pomocą konfokalnego lasera fluorescencyjnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące naprawy DNA, takie jak to, w jaki sposób białka są rekrutowane i zatrzymywane w miejscach uszkodzenia DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wizualizację interesującego białka w czasie rzeczywistym, dzięki czemu można zbudować profil rekrutacji i retencji.

Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia szkiełka z komorą zawierającego interesujące komórki w inkubatorze ze stopniem utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Rejestruj pola obrazu za pomocą zakodowanego, zautomatyzowanego stolika mikroskopowego. Wybierz rozpoznawalną cechę naczynia hodowlanego, taką jak bariera między studzienkami.

Zbierz obraz i zapisz lokalizację X-Y. Pozwoli to na wyrównanie i rejestrację lokalizacji X-Y wybranych pól po przygotowaniu próbki. Po zakończeniu rejestracji obrazu wybierz pole do mikronapromieniowania i skoncentruj próbkę.

W przypadku komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie należy wybrać płaszczyznę ogniskową z maksymalnym przekrojem jądrowym w interesującym nas kanale fluorescencyjnym. Skupienie się na maksymalnym przekroju poprzecznym jądra ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewnia, że punkt ogniskowy jest wyśrodkowany na jądrze w celu monitorowania rekrutacji białka będącego przedmiotem zainteresowania do miejsca indukowanego uszkodzenia. Wybierz wyraźną cechę w jądrze, taką jak jąderko, i przesuwaj płaszczyznę ogniskowej w górę iw dół, obserwując tę zmianę wyglądu.

Prawdziwa płaszczyzna ogniskowa będzie leżeć w przejściu od światła do ciemności. Aby ustawić ostrość próbki, wybierz płaszczyznę ogniskowej, w której wybrany element ma najostrzejszy kontrast. Kolejnym krokiem jest zarejestrowanie pozycji pola zainteresowania.

Utwórz kwadratowy obszar zainteresowania o wymiarach trzy na trzy piksele (ROI) w oprogramowaniu mikroskopu. Umieść ten ROI nad jądrem komórki, która ma zostać uszkodzona, i ustaw ten ROI jako uszkodzony ROI. Zbierz obraz przed uszkodzeniem, w tym położenie zwrotu z inwestycji w obrażenia.

Uzyskaj obraz zawierający jasne pole w kanale kwiatowym dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ogniwa są teraz gotowe do mikronapromieniowania laserowego. W tej demonstracji zostanie użyty laser 405-nanometrowy o 100% mocy.

Dawka lasera 405-nanometrowego jest kontrolowana poprzez modulację szybkości skanowania i wykonanie jednego skanu wybranego zwrotu z inwestycji w uszkodzenia. W tym eksperymencie użyj ośmiu i 0,5 klatki na sekundę do mikronaświetlania o długości 405 nanometrów. Wybór odpowiedniej mocy lasera do uszkadzania komórek ma kluczowe znaczenie dla rozdzielenia różnych szlaków naprawy DNA.

Wykonaj akwizycję obrazu poklatkowego jasnego pola i kanałów fluorescencyjnych po uszkodzeniu. Dostosuj czas trwania i częstotliwość filmu poklatkowego, aby zoptymalizować gromadzenie danych, idealnie uchwycając akumulację białka fluorescencyjnego w miejscu uszkodzenia ROI i jego dysocjację w czasie trwania eksperymentu. Po zakończeniu przebiegu czasowego wybierz nowe pole komórek do uszkodzenia i kontynuuj mikronapromienianie i obrazowanie poklatkowe, aż do osiągnięcia pożądanej liczby uszkodzonych komórek.

Zalecane jest od 10 do 25 komórek na wybrany warunek. Aby zwiększyć ogólną liczbę komórek do analizy immunofluorescencyjnej, należy uszkodzić dodatkowe pola w naczyniu hodowlanym, aby wygenerować wielopolowy przebieg czasowy odpowiedzi po uszkodzeniu. Zapisz lokalizację X-Y każdego pola i czas wystąpienia uszkodzenia.

Ogniwa mogą być naprawiane natychmiast po uszkodzeniu lub pozostawione do naprawy przez wybrane przyrosty czasu przed utrwaleniem. Aby rozpocząć tę analizę, otwórz uzyskane obrazy w aplikacji do analizy obrazów, takiej jak NIS-Elements. Dla każdej komórki, która ma być mierzona, najpierw wygeneruj referencyjny zwrot z inwestycji, który reprezentuje jądro.

Użyj algorytmu progowego na sygnale fluorescencji, który zawiera piksele tworzące jądro, a następnie przekształć ten obszar w ROI. Następnie utwórz ROI o wymiarach sześć na sześć pikseli i umieść go na ROI obrażeń. Ten większy zwrot z inwestycji jest teraz zwrotem z inwestycji w szkody do analizy.

Dla każdej komórki, która ma być mierzona, zapisz średnią intensywność kwitnienia dla odniesienia i zwrotu z inwestycji w uszkodzenia. Dla każdej klatki przebiegu czasu dostosuj referencyjny zwrot z inwestycji, aby upewnić się, że obszar jądrowy jest dokładnie pokryty zwrotem z inwestycji i dostosuj zwrot z inwestycji w uszkodzenie, aby upewnić się, że uszkodzone miejsce jest pokryte. Zapisz średnią intensywność fluorescencji sygnału fluorescencyjnego w każdym ROI dla każdej klatki przebiegu czasu.

Dla każdej komórki znormalizuj średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia do odpowiadającej jej referencyjnej ROI w każdej klatce poklatkowej. W tym przypadku średnia intensywność fluorescencji jądrowej jest używana jako referencyjny ROI, a normalizacja odbywa się poprzez odjęcie średniej referencyjnej intensywności fluorescencji ROI od średniej intensywności fluorescencji ROI uszkodzenia. Powtórz normalizację dla wszystkich uszkodzonych komórek, a także dla co najmniej dwóch nieuszkodzonych komórek kontrolnych.

Na koniec znormalizuj wartości intensywności w czasie, aby pokazać zmiany w dynamice rekrutacji w funkcji leczenia eksperymentalnego. Komórki stabilnie wykazujące ekspresję XRCC1-GFP zostały napromieniowane i zobrazowane przed i po indukcji uszkodzenia. Zaobserwowano rekrutację XRCC1-GFP do szkodliwego zwrotu z inwestycji i zmierzono dynamikę rekrutacji.

Powstawanie pęknięć dwuniciowych badano za pomocą dwóch markerów. Dla obu markerów, dwusekundowa stymulacja niską dawką przy 355 nanometrach nie wywołuje żadnej odpowiedzi po pięciu minutach i 20 minutach oraz słabą i zmienną odpowiedź po 10 minutach od napromieniowania. 10-sekundowe mikropromieniowanie o wysokiej dawce przy 355 nanometrach indukuje zwiększony sygnał fluorescencyjny w obrębie zwrotu z inwestycji w uszkodzenie po pięciu, 10 i 20 minutach po napromieniowaniu, który jest zmniejszany po 40 minutach.

Wyniki te wskazują, że markery zerwania dwuniciowego DNA reagują na mikropromieniowanie o długości 355 nanometrów w sposób zależny od dawki. Natomiast stymulacja laserowa w 405 nanometrach spowodowała znaczną akumulację obu markerów w obrębie zwrotu z inwestycji w uszkodzenia, niezależnie od zastosowanej dawki. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około czterech godzin na 10 komórek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby dostosować długość fali lasera i przyłożoną moc do monitorowanego procesu naprawy. Po tej procedurze można przeprowadzić immunofluorescencję, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rekrutacji dodatkowych białek lub zmian stanu fosforylacji lub innych modyfikacji potranslacyjnych. Technika ta pozwala naukowcom badać dynamiczną rekrutację białek naprawczych DNA i lepiej określać, w jaki sposób domeny białkowe i mutacje wpływają na rozpoznawanie i reakcję na uszkodzenia DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego do wywoływania uszkodzeń DNA i monitorowania rekrutacji białek naprawczych DNA. Nie zapominaj, że praca z laserami i chemikaliami, takimi jak formaldehyd, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.