Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie uszkodzeń DNA w podjądrowym regionie komórki przy użyciu lasera z konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące naprawy DNA, takie jak sposób rekrutacji i utrzymywania białek w miejscach uszkodzeń DNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji badanego białka w czasie rzeczywistym, co pozwala na opracowanie profilu jego rekrutacji i retencji.

Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia szkiełka z komorą zawierającego badane komórki w inkubatorze nakładkowym utrzymującym temperaturę 37 °C oraz stężenie 5% carbon dioxide. Pola obrazowania należy zarejestrować za pomocą kodowanego automatycznego stolika mikroskopowego. Należy wybrać rozpoznawalny element naczynia hodowlanego, taki jak bariera między studzienkami.

Należy wykonać obraz i zapisać współrzędne X-Y. Pozwoli to na wyrównanie i rejestrację lokalizacji X-Y wybranych pól po przygotowaniu próbki. Po zakończeniu rejestracji obrazu należy wybrać pole do mikroirradiacji i ustawić ostrość próbki.

W przypadku komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie, należy wybrać płaszczyznę ogniskowania z maksymalnym przekrojem jądra w interesującym nas kanale fluorescencji. Ustawienie ostrości na maksymalnym przekroju jądra jest kluczowe, ponieważ zapewnia ono wycentrowanie punktu ogniskowania na jądrze, co umożliwia monitorowanie rekrutacji badanego białka do miejsca wywołanego uszkodzenia. Należy wybrać wyraźną strukturę w obrębie jądra, np. jąderko, i przesuwać płaszczyznę ogniskowania w górę i w dół, obserwując zmiany w jej wyglądzie.

Rzeczywista płaszczyzna ogniskowania będzie znajdować się w obszarze przejścia z jasnego w ciemny. Aby ustawić ostrość próbki, należy wybrać płaszczyznę ogniskowania, w której wybrany element posiada najwyższy kontrast. Kolejnym krokiem jest zarejestrowanie pozycji interesującego nas pola widzenia.

Utwórz w oprogramowaniu mikroskopu kwadratowy obszar zainteresowania (ROI) o rozmiarach trzech na trzy piksele. Umieść ten ROI nad jądrem komórki przeznaczonej do uszkodzenia i zdefiniuj go jako ROI uszkodzenia. Wykonaj obraz przed uszkodzeniem, obejmujący położenie ROI uszkodzenia.

Należy uzyskać obraz w jasnym polu w kanale fluorescencyjnym dla analizowanego białka. Komórki są teraz gotowe do mikro-naświetlania laserowego. W tym pokazie zostanie użyty laser o długości fali 405 nm przy mocy 100%.

Dawka lasera o długości fali 405 nm jest kontrolowana poprzez modulację prędkości skanowania i wykonanie jednego skanu wybranego obszaru zainteresowania (ROI) podlegającego uszkodzeniu. W tym doświadczeniu do mikroirradiacji przy 405 nm należy zastosować osiem klatek na sekundę oraz 0,5 klatki na sekundę. Wybór odpowiedniej mocy lasera do uszkadzania komórek jest kluczowy dla rozróżnienia różnych szlaków naprawy DNA.

Przeprowadź akwizycję obrazów time-lapse dla kanałów w polu jasnym i fluorescencji po uszkodzeniu. Dostosuj czas trwania i częstotliwość serii time-lapse, aby zoptymalizować gromadzenie danych, idealnie rejestrując akumulację białka fluorescencyjnego w obszarze ROI uszkodzenia oraz jego dysocjację w czasie trwania eksperymentu. Po zakończeniu serii czasowej wybierz nowe pole komórek do uszkodzenia i kontynuuj mikroirradiację oraz obrazowanie time-lapse, aż do osiągnięcia pożądanej liczby uszkodzonych komórek.

Zaleca się analizę od 10 do 25 komórek na wybrany warunek. Aby zwiększyć całkowitą liczbę komórek do analizy immunofluorescencyjnej, należy uszkodzić dodatkowe pola w naczyniu hodowlanym, aby stworzyć wielopolowy przebieg czasowy odpowiedzi po uszkodzeniu. Należy zapisać współrzędne X-Y każdego pola oraz czas wystąpienia uszkodzenia.

Komórki można utrwalić bezpośrednio po uszkodzeniu lub pozwolić im na naprawę w wybranych odstępach czasu przed utrwaleniem. Aby rozpocząć tę analizę, otwórz pozyskane obrazy w aplikacji do analizy obrazu, takiej jak NIS-Elements. Dla każdej komórki poddawanej pomiarom wygeneruj najpierw referencyjny obszar zainteresowania (ROI), który reprezentuje jądro komórkowe.

Zastosuj algorytm progowania sygnału fluorescencji obejmujący piksele tworzące jądro komórkowe, a następnie przekształć ten obszar w ROI. Następnie utwórz ROI o rozmiarach sześć na sześć pikseli i umieść je nad ROI uszkodzenia. To większe ROI stanowi teraz ROI uszkodzenia do analizy.

Dla każdej mierzonej komórki należy zapisać średnią intensywność fluorescencji dla obszarów ROI referencyjnego i uszkodzonego. Dla każdej klatki przebiegu czasowego należy dostosować ROI referencyjne, aby upewnić się, że obszar jądra jest dokładnie pokryty przez ROI, oraz dostosować ROI uszkodzone, aby upewnić się, że obejmuje ono miejsce uszkodzenia. Dla każdej klatki przebiegu czasowego należy zapisać średnią intensywność sygnału fluorescencyjnego w obrębie każdego ROI.

Dla każdej komórki znormalizuj średnią intensywność fluorescencji ROI uszkodzenia względem odpowiadającego jej ROI referencyjnego w każdej klatce filmu time-lapse. W tym przypadku jako ROI referencyjne wykorzystuje się średnią intensywność fluorescencji jądra, a normalizację przeprowadza się poprzez odjęcie średniej intensywności fluorescencji ROI referencyjnego od średniej intensywności fluorescencji ROI uszkodzenia. Powtórz normalizację dla wszystkich uszkodzonych komórek oraz dla co najmniej dwóch nieuszkodzonych komórek kontrolnych.

Na koniec należy przedstawić na wykresie znormalizowane wartości intensywności w czasie, aby wykazać zmiany w dynamice rekrutacji w zależności od zastosowanej procedury eksperymentalnej. Komórki stabilnie ekspresujące XRCC1-GFP poddano napromieniowaniu i obrazowaniu przed oraz po indukcji uszkodzeń. Obserwowano rekrutację XRCC1-GFP do ROI miejsca uszkodzenia i mierzono dynamikę tej rekrutacji.

Powstawanie pęknięć obu nici badano przy użyciu dwóch markerów. W przypadku obu markerów, dwie drugie stymulacje niską dawką przy 355 nanometrach nie wywołują odpowiedzi w piątej i dwudziestej minucie oraz wywołują słabą i zmienną odpowiedź w dziesiątej minucie po napromieniowaniu. 10-sekundowa mikro-irradiacja wysoką dawką przy 355 nanometrach indukuje zwiększony sygnał fluorescencyjny w obszarze ROI uszkodzenia w piątej, dziesiątej i dwudziestej minucie po napromieniowaniu, który ulega zmniejszeniu w czterdziestej minucie.

Wyniki te wskazują, że markery pęknięć dwuniciowych DNA reagują na mikro-napromieniowanie falą o długości 355 nm w sposób zależny od dawki. Z kolei stymulacja laserem o długości 405 nm doprowadziła do znaczącej akumulacji obu markerów w obrębie ROI uszkodzenia, niezależnie od zastosowanej dawki. Po opanowaniu techniki, jej prawidłowe przeprowadzenie dla 10 komórek zajmuje około czterech godzin.

Podczas stosowania tej techniki ważne jest dostosowanie długości fali lasera oraz mocy do monitorowanego procesu naprawy. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać immunofluorescencję, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące rekrutacji dodatkowych białek lub zmian w statusie fosforylacji bądź innych modyfikacji potranslacyjnych. Technika ta pozwala badaczom badać dynamiczną rekrutację białek naprawy DNA i lepiej określić, w jaki sposób domeny białkowe oraz mutacje wpływają na rozpoznawanie uszkodzeń DNA i odpowiedź na nie.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat wykorzystania konfokalnego mikroskopu skaningowego do indukowania uszkodzeń DNA oraz monitorowania rekrutacji białek naprawczych DNA. Należy pamiętać, że praca z laserami i odczynnikami chemicznymi, takimi jak formaldehyd, może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, w tym stosować osobiste środki ochrony indywidualnej.