In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

Ogólnym celem tej procedury jest ocena skuteczności trwałości komórek i biodystrybucji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej w zapaleniu kostnego kolana szczura lub modelu KOA, przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Śledzenie komórek macierzystych in vivo może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie matematyki regeneracyjnej, dotyczące podrażnienia i dystrybucji ludzkiego tłuszczu pochodzącego z mezenchymalnych komórek macierzystych w modelach zwierzęcych KOA. Główną zaletą stosowania DiD jest to, że jego widmo emisyjne przesunięte przez szczury umożliwia głębokie obrazowanie tkanek u żywych zwierząt bez efektów cytotycznych lub funkcjonalnych uszkodzeń komórek znakowanych barwnikiem.

Zacznij od umieszczenia znieczulonego samca szczura Sprague Dawley o wadze od 250 do 300 gramów, liczącego od ośmiu do 12 tygodni, w lewej pozycji bocznej na podgrzewanej podkładce. Użyj maszynki do golenia, aby dokładnie ogolić prawe kolano i zdezynfekuj obszar operacyjny 10% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem. Przykryj obszar niechirurgiczny podkładką chirurgiczną.

I użyj skalpela, aby wykonać dwucentymetrowe nacięcie boczne wzdłuż ścięgna rzepki, aby odsłonić torebki stawowe. Następnie użyj skalpela chirurgicznego, aby przeciąć więzadło poboczne przyśrodkowe, odbijając łąkotkę w kierunku kości udowej i chwyć łąkotkę przyśrodkową kleszczami. Użyj skalpela, aby przeciąć łąkotkę w jej najwęższym miejscu od przyczepu piszczelowego.

Aby uzyskać wiarygodny i wykonalny początek KOA, strona udowa łąkotki powinna być całkowicie przecięta u każdego zwierzęcia doświadczalnego. Następnie zamknij torebkę stawową za pomocą obserwowalnego szwu 4-O i monitoruj szczura, aż w pełni wyzdrowieje. Osiem tygodni po zabiegu odłącz ludzkie komórki mezenchymalne pochodzące z tkanki tłuszczowej od 80% zlewającej się kultury z dwoma mililitrami trypsyny i EDTA na trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po kilku minutach zneutralizować trypsynę czterema mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej i zebrać komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w stężeniu od jednego do 10 do szóstego komórek na mililitr w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej bez surowicy. I oznacz komórki 50 mikrolitrami roztworu do znakowania komórek DiD przez 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i umyć je dwa razy w pięciu mililitrach PBS na przemycie. Po ostatnim odwirowaniu rozcieńczyć komórki do 2,5 razy od 10 do szóstych żywych komórek na 100 mikrolitrów stężenia PBS i załadować komórki do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26. Następnie ponownie ogol artretyczne kolano pierwszego zwierzęcia doświadczalnego, które odsłoniło obszar stawu, i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.

Wstrzyknij znakowane komórki do środka trójkąta utworzonego przez przyśrodkową stronę więzadła rzepki, kłykieć przyśrodkowy kości udowej i kłykieć piszczelowy przyśrodkowy i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Zainicjuj system obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i ustaw zwierzęta w pozycji leżącej w centralnym stopniu systemu obrazowania. Przy zamkniętych drzwiach komory należy sprawdzić skrzynkę fluorescencyjną i dobrać odpowiednie zestawy filtrów fluorescencyjnych wzbudzenia i emisji.

Ustaw pole widzenia na D, wygięcie pikseli na osiem, przystanek F na dwa, a czas ekspozycji na automatyczny. Po uzyskaniu obrazów pozwól zwierzętom dojść do siebie na poduszce termicznej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Następnie, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, wybierz jednostki wydajności promieniowania do pomiaru fluorescencji oraz obszary zainteresowania do analizy i określ ilościowo sygnały fluorescencyjne z każdego obrazu.

W tym reprezentatywnym eksperymencie seryjne odcinki stawu kolanowego szczura z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego oceniano za pomocą barwienia H&E i safraniny O/Fast Green osiem tygodni po operacji. Grubość chrząstki stawowej jest cieńsza w stawach kolanowych z artretyzmem niż w stawach przeciwległych bez operacji, co zaobserwowano w skrawkach barwionych H&E. Ponadto proteoglikan jest zmniejszony, a fibrylowany kolagen jest zwiększony w stawie z zapaleniem stawów, co jest uwidocznione przez barwienie safraniną O / Fast Green, co wskazuje na postęp fenotypu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego wywołanego operacją.

Godzinę po barwieniu, znakowane DiD ludzkie komórki mezenchymalne pochodzące z tkanki tłuszczowej wykazują okrągły kształt in vitro. Po 24 godzinach hodowane komórki mezenchymalne znakowane DiD wykazują długi kształt wrzeciona, co potwierdza, że DiD nie zmienia zdolności przylegania komórek. Obrazowanie kolan zwierząt z chorobą zwyrodnieniową stawów osiem tygodni po operacji ujawnia obecność komórek znakowanych DiD od dnia zero do dnia 70 po wstrzyknięciu.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkami macierzystymi w celu określenia optymalnej rutyny i dawki dla bezpiecznego i wykonalnego wstrzykiwania mezenchymalnych komórek macierzystych w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste DiD do wstrzyknięcia i śledzenia in vivo w chirurgicznie indukowanym modelu KOA szczura.