Name: In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę śledzenia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura przy użyciu fluorescencyjnego barwnika DiD.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obecne badanie było wspierane przez Shanghai Innovation Funding (1402H294300) sponsorowane przez Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (CN) dla dr Wen Wanga. Chcielibyśmy podziękować dr Guangdong Zhou (Narodowe Centrum Inżynierii Tkankowej w Chinach) za jego pomoc techniczną i doradztwo naukowe dotyczące tego manuskryptu. Chcielibyśmy również podziękować Panu Huitang Xia (Dziewiąty Szpital Ludowy w Szanghaju) za jego pomoc w zakresie dobrostanu zwierząt.

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki, z naciskiem na zminimalizowanie cierpienia zwierząt. Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Dziewiątym Szpitalu Ludowym w Szanghaju, stowarzyszonym z Shanghai JiaoTong University School of Medicine, o numerze protokołu [2017]063.
1. Opracowanie chirurgicznie indukowanego modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura
<ol>
	<li>Do tego zabiegu chirurgicznego należy użyć 8-12 tygodniowych samców szczurów Sprague Dawley (SD) o masie ciała od 250 do 300 g.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta 40 mg/kg tiletaminy i 40 mg/kg zolazepamu we wstrzyknięciu domięśniowym.</li>
	<li>Umieść zwierzę w lewej pozycji bocznej na podgrzewanym scenie. Dokładnie ogol prawe kolano maszynką do golenia. Zdezynfekuj obszar operacyjny 10% roztworem jodu prowidonu, a następnie 70% etanolem, powtórz jeszcze dwa razy, a następnie pomaluj 10% roztworem jodu prowidonu i przykryj obszar niechirurgiczny podkładką chirurgiczną.</li>
	<li>Za pomocą skalpela chirurgicznego wykonaj 2 cm nacięcie boczne wzdłuż ścięgna rzepki, aby odsłonić torebki stawowe.</li>
	<li>Użyj skalpela chirurgicznego, aby przeciąć więzadło poboczne przyśrodkowe. Odbijaj łąkotkę w kierunku kości udowej.</li>
	<li>Podczas operacji wlej sterylny 0,9% roztwór chlorku sodu na powierzchnię chrząstki stawowej, aby zapobiec wysuszeniu chrząstki.</li>
	<li>Chwyć łąkotkę przyśrodkową kleszczami i przetnij łąkotkę w jej najwęższym miejscu od przyczepu piszczelowego skalpelem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Unikaj uszkodzenia chrząstki.</li>
	<li>Zamknij torebkę stawową szwem wchłanialnym 4 - 0.</li>
	<li>Monitoruj szczury operowane, aż odzyskają przytomność.</li>
	<li>Należy wstrzyknąć 20 mg/kg gentamycyny w celu zapobieżenia zakażeniu i 0,05 mg/kg buprenorfiny drogą domięśniową w celu złagodzenia bólu po zabiegu.</li>
	<li>Utrzymuj szczury w obiekcie dla zwierząt o kontrolowanej temperaturze w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności przez 3 - 8 tygodni, aż do wystąpienia KOA. Zwierzęta nadal otrzymują leki przeciwbólowe, w tym między innymi buprenorfinę (0,05 mg/kg domięśniowo) i gentamycynę (20 mg/kg domięśniowo), jeśli objawy bólowe utrzymują się.</li>
</ol>
2. Ocena histologiczna modelu szczura KOA
<ol>
	<li>Ofiarować szczury z nadmiernym wdychaniem CO2 (dodać szybkość napełniania około 30% objętości komory na minutę dwutlenkiem węgla do istniejącego powietrza w komorze, aby zwierzę straciło przytomność w ciągu 2-3 minut. Utrzymuj przepływ CO2 przez co najmniej 1 minutę po ustaniu oddychania) we wskazanych punktach czasowych (reprezentatywne wyniki są pokazane po 8 tygodniach indukcji KOA w zakresie od 3 do 8 tygodni) po operacji. </li>
	<li>Wypreparuj skórę i mięśnie wokół stawów kolanowych i odetnij stawy kolanowe skalpelem.</li>
	<li>Utrwal stawy kolanowe w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 3 dni w temperaturze pokojowej. Następnie odwapnić próbki w 20% kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez około 4 tygodnie w temperaturze 4 °C i zmieniać EDTA co 3 dni. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), takie jak rękawice i okulary.</li>
	<li>Odwodnić próbki za pomocą automatycznego procesora tkankowego. Ustaw menu, aby rozpocząć cykl spłukiwania w następujący sposób: 70% etanolu przez 1 godzinę; następnie odpowiednio 80% etanolu i 95% etanolu przez 1 godzinę; następnie 2 cykle 100% etanolu przez 1 godzinę; następnie ksylen dwa razy przez 1 godzinę za każdym razem i parafinę 3 razy w temperaturze 58 °C przez 1 godzinę za każdym razem. 
	Uwaga: Ksylen jest toksyczny, dlatego należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i okulary. 
	UWAGA: Opcjonalnie użyj słoików Coplin do ręcznego odwadniania z taką samą konfiguracją, jak automatyczny procesor tkanek.</li>
	<li>Umieść przyśrodkową część nienaruszonego stawu twarzą do dołu i osadź go w bloku parafinowym z tkanką osadzoną w środku. 
	UWAGA: Opcjonalnie użyj kleszczy, aby ręcznie osadzić próbki w bloku parafinowym.</li>
	<li>Rozpocznij wycinanie odcinków strzałkowych o grubości 5 μm od przyśrodkowego brzegu złącza w odstępach 30 μm z 2 sekcjami szeregowymi za pomocą mikrotomu obrotowego.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach i odparafinowaj szkiełka w ksylenie. Pomiędzy 2 sekcjami szeregowymi zabarwić jedno szkiełko barwieniem Hematoxyliną i Eozyną (H&E): 0,1% Hematoksyliną przez 15 minut, 1% roztworem kwasu octowego przez 10 s i 0,5% eozyną przez 10 minut. I zabarwić drugi szkiełko barwieniem Safranin O/Fast Green: 0,1% Hematoxylin przez 15 min, 0,02% Fast Green przez 3 min, 1% roztworem kwasu octowego przez 10 s i 0,1% Safraniną O przez 3 min. 
	Uwaga: Ksylen jest toksyczny, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice, okulary.</li>
	<li>Oceń wybarwione szkiełka za pomocą systemu oceny histopatologii Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową Stawów (OARSI) u szczurów6.</li>
</ol>
3. Znakowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikiem fluorescencyjnym DiD
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do znakowania komórek DiD w 100% etanolu o stężeniu 1 mM. Chroń roztwór do znakowania komórek przed światłem i przechowuj go w temperaturze pokojowej przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Hoduj haMSC za pomocą standardowych procedur hodowli komórkowych w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 1% penicyliny i streptomycyny oraz 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) na 10-centymetrowej szalce Petriego.</li>
	<li>Odłącz haMSC za pomocą 2 ml 0,25% trypsyny z 1 mM EDTA przed około 80% konfluencją.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę za pomocą 4 ml pożywki hodowlanej i wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić komórki o gęstości 1 x 106 komórek/ml w 5 ml pożywki hodowlanej bez surowicy.</li>
	<li>Oznaczyć komórki, dodając 50 μl roztworu do znakowania komórek DiD w 5 ml pożywki hodowlanej bez surowicy w temperaturze 37 °C przez 50 minut.</li>
	<li>Wiruj oznaczone komórki w temperaturze 800 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Przemyć komórki jeszcze dwa razy 5 ml roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o stężeniu 800 x g przez 3 minuty każde.</li>
	<li>Sprawdź oznakowane haMSC za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z zestawem filtrów Cy5.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i uzyskaj 2,5 x 106 żywych komórek w 100 μl PBS do wstrzykiwań.</li>
</ol>
4. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo do śledzenia haMSC
<ol>
	<li>Osiem tygodni po operacji (Krok 1) znieczulić szczury KOA przez domięśniowe wstrzyknięcie 25 mg/kg tiletaminy i 25 mg/kg zolazepamu.</li>
	<li>Dokładnie ogol prawe kolano maszynką do golenia, aby odsłonić obszar stawu. Zdezynfekuj obszar stawów 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą igły strzykawkowej 26 G wstrzyknąć 2,5 x 106 znakowanych komórek zawieszonych w 100 μl PBS w środku obszaru trójkąta utworzonego przez przyśrodkową stronę więzadła rzepki, kłykieć przyśrodkowy kości udowej i kłykieć piszczelowy przyśrodkowy (<klasa silna = "xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania i zainicjuj system obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.</li>
	<li>Ustawić szczury w pozycji leżącej w centralnym stopniu systemu obrazowania i zamknąć drzwi komory.</li>
	<li>Zaznacz pole wyboru "fluorescencyjny" i wybierz zestawy filtrów fluorescencyjnych 640 nm dla wzbudzenia i 680 nm dla emisji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wybierz pole widzenia na D. Ustaw grupowanie pikseli na średnie (8), F/Stop na 2 i czas ekspozycji na automatyczny. Utrzymuj stały optymalny czas ekspozycji, aby uzyskać porównywalne wyniki w całym badaniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Usuń zwierzę ze sceny i monitoruj powrót do zdrowia po znieczuleniu. 
	UWAGA: Ułóż zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej 2-3 warstwami ręcznika.</li>
	<li>Wybierz jednostki wydajności promieniowania do pomiaru fluorescencji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2B). Wybierz obszary zainteresowania (ROI) do analizy i określ ilościowo sygnały fluorescencyjne z każdego obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Powtórz procedurę obrazowania in vivo dla każdego szczura sekwencyjnie, aby zbadać podłużną retencję haMSC w stawie. 
	UWAGA: Sugerujemy obrazowanie sygnałów fluorescencyjnych zwierząt za pomocą systemu obrazowania in vivo raz na dwa dni przez pierwszy tydzień po wstrzyknięciu i raz na tydzień, aż sygnał nie będzie mógł zostać wykryty.</li>
</ol>

<ol><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+year+in+review+2016%3A+clinical%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis year in review 2016: clinical.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).</li>
<li>Wang, W., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+osteoarthritis+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells.</a> Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).</li>
<li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clin Transl Med. 5 (1), 27(2016).</li>
<li>Bendele, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15758487">Animal models of osteoarthritis.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).</li>
<li>Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).</li>
<li>Janusz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+osteoarthritis+in+the+rat+by+surgical+tear+of+the+meniscus%3A+Inhibition+of+joint+damage+by+a+matrix+metalloproteinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor.</a> Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+tracking+after+intra-articular+delivery+in+a+rat+osteoarthritis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160(2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administering+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+to+prevent+and+treat+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis.</a> Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).</li>
<li>Desando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+delivery+of+adipose+derived+stromal+cells+attenuates+osteoarthritis+progression+in+an+experimental+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model.</a> Arthritis Res Ther. 15 (1), 22(2013).</li>
<li>Riester, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Studies+for+Use+of+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stromal%2FStem+Cells+in+a+Rabbit+Model+for+Osteoarthritis+to+Support+a+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+long-term+survival+of+intramyocardially+delivered+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging.</a> Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).</li>
<li>Wolbank, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+of+human+adipose-derived+stem+cells+for+non-invasive+in+vivo+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking.</a> Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).</li>
<li>Heymer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+oxide+labelling+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+collagen+hydrogels+for+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair.</a> Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).</li>
<li>Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+of+the+dyes+CFSE%2C+CM-DiI+and+PKH26+for+tracking+of+human+preadipocytes+to+evaluate+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering.</a> Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).</li>
<li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+in+vivo+fate+of+intra-articularly+transplanted+human+bone+marrow-derived+clonal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).</li>
<li>Chen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safety+study+on+intrathecal+delivery+of+autologous+mesenchymal+stromal+cells+in+rabbits+directly+supporting+Phase+I+human+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials.</a> Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).</li>
<li>Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+in+vivo+imaging+of+arthritis+in+a+collagen-induced+murine+model+with+phosphatidylserine-binding+near-infrared+%28NIR%29+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye.</a> Arthritis Res Ther. 17, 50(2015).</li>
<li>Texier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanine-loaded+lipid+nanoparticles+for+improved+in+vivo+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging.</a> J Biomed Opt. 14 (5), 054005(2009).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+in+osteoarthritis%3A+A+critical+review+of+the+state-of-the-art%2C+current+prospects%2C+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges.</a> Bone. 85, 81-90 (2016).</li>
<li>Detante, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+99mTc-HMPAO-labeled+human+mesenchymal+stem+cells+after+stroke%3A+in+vivo+imaging+and+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution.</a> Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).</li>
<li>Hu, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+resonance+imaging+tracking+of+SPIO-labeled+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Xia, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+transplantation+of+atsttrin-transduced+mesenchymal+stem+cells+ameliorate+osteoarthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).</li>
<li>Jasmin,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+labeling+of+bone+marrow+mesenchymal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+and+in+vivo+visualization+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging.</a> J Nanobiotechnology. 9, 4(2011).</li>
<li>Lehmann, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+of+human+nucleus+pulposus+cells+with+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+from+human+bone+marrow+reveals+formation+of+tunnelling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes.</a> Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose-derived+mesenchymal+progenitor+cells+engraft+into+rabbit+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage.</a> Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).</li>
</ol>

Meng Li, Ming Hao i Wen Wang są obecnymi pracownikami i posiadaczami opcji na akcje Cellular Biomedicine Group (Nasdaq: CBMG). Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Standardy bezpieczeństwa i badania nad biodystrybucją terapii komórkami macierzystymi są pilnie potrzebne, zanim będziemy mogli przenieść regeneracyjne leczenie komórkami macierzystymi KOA z ławki do łóżka pacjenta. Jednak patologiczne środowisko choroby odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu się i biodystrybucji przeszczepionychhaMSCs 10. Ostatnio nasza grupa wykazała, że dostawowe wstrzyknięcie haMSC utrzymywało się dłużej w patologicznym środowisku KOA niż iniekcje w normalnych warunkach<sup class="...

Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego (KOA) jest chorobą zwyrodnieniową wynikającą z utraty chrząstki stawowej i postępującego stanu zapalnego, która stała się główną przewlekłą chorobą u osób starszych na całym świecie1. Jednak obecne terapie wykorzystujące leki przeciwzapalne, suplementy fizykalne i zabiegi chirurgiczne mogą przynieść tylko tymczasową ulgę w objawowym bólu2.
Mezenchymalne komórki macierzyste (haMSC) pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej stały się obiecującym środkiem regeneracyjnym na chorobę zwyrodnieniową stawu kolanowego, ze względu na ich potencjał multipotencjalnego różnicowania dla regeneracji chrząstki i właściwości immunomodulacyjnych3,4. W porównaniu z metodami farmakologicznymi mającymi na celu zbadanie mechanizmów działania in vivo, śledzenie żywych hemoMSC w małych modelach zwierzęcych KOA jest obecnie pouczające dla ustalenia przesłanek i wykonalności terapii haMSC przed zastosowaniem klinicznym. W przypadku badań przedklinicznych meniscektomia przyśrodkowa (MM) destabilizuje obciążenie mechaniczne stawu w celu wywołania KOA u szczurów, co zapewnia stosunkowo wykonalny model o stałej odtwarzalności5. Początek KOA wywołanego przez MM następuje wcześniej niż samo przecięcie więzadła krzyżowego przedniego lub w połączeniu z częściową łąkotką przyśrodkową6. W związku z tym długoterminowe interakcje między wstrzykniętymi haMSC a patologicznym mikrośrodowiskiem KOA są często oceniane u szczurów indukowanych przez MM7,8.
Chociaż skuteczność terapeutyczna haMSC została obszernie opisana, odpowiednia wiedza na temat utrzymywania się in vivo wszczepionych haMSC poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA) jest rzadkością9,10. W związku z tym opracowano różne metody znakowania komórkowego, w tym immunohistologię11, luciferase12, zielone białko fluorescencyjne13 transfekcja, znakowanie tlenkiem żelaza do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI)14 oraz liczne barwniki fluorescencyjne do komórek8,15,16. W porównaniu z pracochłonnymi analizami histologicznymi, nieinwazyjne obrazowanie in vivo wykorzystuje urządzenia optyczne do wykrywania rozkładu i dynamiki w czasie rzeczywistym komórek znakowanych sygnałami fluorescencyjnymi10,17. W przypadku funkcjonalnego obrazowania żywych komórek, cytokompatybilne znakowanie fluorescencyjne jest wyrafinowaną, wolną od radioaktywności techniką śledzenia w celu ujawnienia aktywności komórkowej po przeszczepie komórek macierzystych18. Co więcej, wielokolorowe fluorescencyjne barwniki lipofilowe mają przewagę nad amino-reaktywnymi barwnikami hydrofilowymi lub białkami fluorescencyjnymi, w tym lepszą przepuszczalność komórek i zwiększoną wydajność kwantową fluorescencji19.
Tak więc, zawarte tutaj protokoły wykorzystują czerwony laser do pobudzania komórek oznaczonych lipofilowymi karbocyjaninami DiD (DilC18(5)), które są dalekim czerwonym fluorescencyjnym analogiem Dil (dialkilokarbocyjaniny)20. Przesunięte ku czerwieni widma wzbudzenia i emisji DiD pozwalają uniknąć interferencji autofluorescencyjnej i umożliwiają obrazowanie tkanek głębokich przez długi czas u żywych zwierząt8. Ta metoda śledzenia komórek in vivo znakowanych DiD jest ważna do monitorowania przeszczepionych komórek macierzystych, takich jak haMSC, w modelach zwierzęcych, co jest niezbędne do zrozumienia i ulepszenia obecnej terapii regeneracyjnej komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td>System znieczulenia zwierząt Matrx VMR</td><td>Midmark</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>4-0 szew</td><td>Szanghaj Jinhuan</td><td>KC439</td><td></td></tr><tr><td>Brzytwa</td><td>Pritech</td><td>LD-9987</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>0,9% roztwór chlorku sodu</td><td>Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H43020455</tr><tr><td>Penicylina</td><td>Szanghaj Kangfu chemiczna farmaceutyczna Co., Ltd.</td><td>Brak</td> Buprenorfina <td></td></tr><tr><td></td><td>Tianjin Instytut Badań Farmaceutycznych Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>Brak</td> Paraformaldehyd <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Rozcieńczyć do końcowego stężenia 10% w PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Rozcieńczyć do końcowego stężenia 20% w PBS</td></tr><tr><td>0,1% roztworze hematoksyliny, Mayer' s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>0,5% roztwór Eozyny Y, alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Excelsior ESTM Procesor tkanek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A78400006</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Histocentre&trade; 3 Osadzanie tkanek Center</td><td>Thermo Fisher</td><td>B64100010</td><td></td></tr><tr><td>W pełni zautomatyzowany mikrotom obrotowy</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Wirówka do V118877</td><td></td><td></td>Corning</tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-TL</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>0,4% roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Titetamme</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Zolazepam</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka hiposermiczna do jednorazowego użytku 26G</td><td>Shanghai Misawa Przemysł medyczny</td><td>Brak IVIS</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum In Vivo System obrazowania Oprogramowanie</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 4.0</td><td>PerkinElmer</td><td>Brak</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Aby wesprzeć kliniczne zastosowanie terapii ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (haMSC) w chorobie zwyrodnieniowej stawu kolanowego (KOA), zbadaliśmy skuteczność trwałości komórek i biodystrybucji haMSC w modelach zwierzęcych. Pokazaliśmy metodę znakowania błony komórkowej haMSC lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym. Następnie dostawowe wstrzyknięcie znakowanych komórek u szczurów z chirurgicznie wywołanym KOA monitorowano dynamicznie za pomocą systemu obrazowania in vivo. Zastosowaliśmy lipofilowe karbocyjaniny DiD (DilC18 (5)), dalekoczerwony fluorescencyjny analog Dil (dialkilokarbocyjaniny), który wykorzystywał czerwony laser, aby uniknąć wzbudzenia naturalnej zielonej autofluorescencji z otaczających tkanek. Co więcej, przesunięte ku czerwieni widma emisyjne DiD umożliwiły obrazowanie tkanek głębokich u żywych zwierząt, a procedura znakowania nie spowodowała żadnych efektów cytotoksycznych ani funkcjonalnych uszkodzeń haMSC. Wykazano, że podejście to jest skuteczną metodą śledzenia haMSC w modelu KOA szczura. Zastosowanie tej metody może być również wykorzystane do określenia optymalnej drogi podawania i dawkowania MSCs z innych źródeł w badaniach przedklinicznych.

W celu indukowania modelu KOA w prawym stawie kolanowym szczurów SD wykonano zabieg MM (Rysunek 3). Osiem tygodni po operacji szczury uśmiercono, a seryjne przekroje stawów kolanowych oceniono przy użyciu barwienia H&amp;E oraz Safranin O/Fast Green (Rysunek 4). W barwieniu H&amp;E powierzchnia chrząstki stawowej w kolanach operowanych wykazywała bardziej nieregularne brzegi niż w normalnym stawie niepoddanym operacji. W barwieni...

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena skuteczności utrzymania się komórek oraz ich biodystrybucji w przypadku zastosowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u szczura (model KOA), przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Śledzenie komórek macierzystych in vivo może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej dotyczące integracji i dystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w zwierzęcych modelach KOA. Główną zaletą zastosowania DiD jest fakt, że jego przesunięte w stronę czerwieni widmo emisji pozwala na obrazowanie głębokich tkanek u żywych zwierząt, bez efektów cytotoksycznych lub uszkodzeń funkcjonalnych komórek znakowanych barwnikiem.Zacznij od umieszczenia znieczulonego samca szczura Sprague Dawley w wieku od 8 do 12 tygodni, o masie od 250 do 300 g, w pozycji bocznej lewej na podgrzewanej podkładce. Za pomocą brzytwy dokładnie ogól prawe kolano, a następnie zdezynfekuj obszar operacyjny 10% roztworem powidonu jodowego i 70% etanolem. Obszar poza polem operacyjnym przykryj

in-vivo-tracking-human-adipose-derived-mesenchymal-stem-cells-rat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Opisujemy system wielokątowego rotacyjnego obrazowania optycznego (MAROI) do ilościowego oznaczania in vivo markera fluorescencyjnego dostarczanego przez nanopęcherzyki saposyny C (SapC)-dioleoilofosfatydyloseryny (DOPS). Wykorzystując mysie modele raka i zapalenia stawów, pokazujemy, w jaki sposób analiza krzywej sygnału MAROI może być wykorzystana do precyzyjnego mapowania i biologicznej charakterystyki procesów chorobowych.

In vivo (in vivo) Obrazowanie optyczne guzów mózgu i zapalenia stawów za pomocą fluorescencyjnych nanopęcherzyków SapC-DOPS

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Ten protokół opisuje znakowanie radioaktywne mezenchymalnych komórek macierzystych koni i ich implantację do urazów ścięgien u konia w celu określenia przeżycia komórek i dystrybucji tkanek za pomocą scyntygrafii gamma.

In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Mysie badania na modelach zapalenia jelita grubego wykazały, że niewielki procent (1 - 5%) mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wstrzykniętych dożylnie lub dootrzewnowo do miejsca zapalnego jelita grubego1,2. Badanie to pokazuje, że dosercowe wstrzyknięcia MSC pod kontrolą USG powodują zwiększoną lokalizację w jelicie.

Wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą ultradźwięków ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia naprowadzania do jelita do stosowania w mysich modelach eksperymentalnych chorób zapalnych jelit

Tradycyjne metody oceny różnicowania adipogennego są tanie i łatwe w użyciu, ale nie są specyficzne dla zmian w ekspresji genów. Opracowaliśmy test do ilościowego określania różnicowania komórek mezenchymalnych w dojrzałe adipocyty przy użyciu markera specyficznego dla linii. Test ten ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i medycynie klinicznej.

Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Poznaj metodę śledzenia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura przy użyciu fluorescencyjnego barwnika DiD.

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

Przeglądaj więcej filmów