Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie różnicowania komórek zrębu w linię adipogenną przy użyciu markera białkowego specyficznego dla linii, białka wiążącego kwasy tłuszczowe cztery. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie i rozszerzenie interesujących komórek zrębu. Komórki zrębu są następnie pobierane i siane na standardowych płytkach do hodowli in vitro.

Po kilkudniowej inkubacji komórki traktuje się pożywką różnicującą adipogenną. Komórki inkubuje się przez 14 dni, z regularną wymianą pożywki. Po różnicowaniu komórki są utrwalane i barwione przeciwciałami przeciwko czterem białku wiążącemu kwasy tłuszczowe.

Zautomatyzowany przesiewowy mikroskop immunofluorescencyjny o wysokiej zawartości służy do rejestrowania obrazów znakowanych komórek w płytkach mikrodołkowych. Zróżnicowanie jest następnie określane ilościowo za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod pomiaru różnicowania adipogennego przy użyciu barwników, takich jak Oil Red O, test opisany w tym filmie wykorzystuje przeciwciało przeciwko białku specyficznemu dla linii, czterem białku wiążącemu kwasy tłuszczowe, w celu potwierdzenia różnicowania adipogennego.

W ten sposób metoda ta określa ilościowo zmiany w ekspresji genów, które odpowiadają różnicowaniu adipogennemu. Ten test jest w stanie dostarczyć wielu informacji, w tym procentu zróżnicowanych komórek, intensywności sygnału fluorescencyjnego na komórkę i zmian w morfologii komórki. Zdolność do analizowania wielu cech umożliwia identyfikację potencjalnych subtelnych zmian w różnicowaniu w odpowiedzi na różne zabiegi.

Test ten ma również wysoką zdolność do ciągnięcia przepływowego, dzięki czemu idealnie nadaje się do zastosowań związanych z badaniami przesiewowymi leków o dużym przepływie. Ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce ASC, która jest pożywką podstawową DMEM/F-12, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, GlutaMAX i antybiotykami. Pipetować do 96-dołkowej płytki hodowlanej, po 5000 komórek na dołek.

Na każdego dawcę potrzeba ośmiu studni. Cztery studzienki otrzymują pożywkę kontrolną, podczas gdy pozostałe otrzymują pożywkę różnicującą. Co czwarta studzienka każdego zabiegu będzie służyć węzłowi kontroli pierwotnej.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni, nawilżaj je w warunkach atmosferycznych 5% dwutlenku węgla przez cztery dni. Ma to na celu umożliwienie komórkom wzrostu do zbiegu w każdej studzience. Czwartego dnia wyjmij płytki z inkubatora.

Usuń połowę pożywki z każdej studzienki. Dodać równą objętość kompletnej pożywki ASC lub pożywki do różnicowania adipogennego, którą uzupełnia się insuliną, izobutylometyloksantyną, deksametazonem i indometazonem. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni, nawilżoną warunkami atmosferycznymi 5% dwutlenku węgla.

Okres wymagany do wystarczającego rozróżnienia wynosi 14 dni. W tym czasie należy uzupełniać pożywkę, wymieniając ją co dwa do trzech dni. Po różnicowaniu wyjąć płytki z inkubatora.

Ostrożnie odpipetować wszystkie media z każdej studzienki. Napraw komórki, dodając lodowaty metanol. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Usuń metanol, a następnie przemyj solą fizjologiczną buforowaną Tris. Zablokuj, dodając 0,25% blokera kazeiny. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń kazeinę, a następnie przemyj solą fizjologiczną buforowaną Tris. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał, rozcieńczając przeciwciało anty-FABP4 200-krotnie w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Dodaj mieszaninę do wszystkich studzienek, z wyjątkiem tych zarezerwowanych jako podstawowa kontrola węzła.

Zamiast tego dodaj bufor rozcieńczający przeciwciała do tych studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną Tris.

Wyjmij, dodaj świeżą sól fizjologiczną buforowaną Tris i inkubuj przez pięć minut na bujaku. Powtórz ten proces dwukrotnie. Przygotować drugą mieszaninę przeciwciał, rozcieńczając 200-krotnie przeciwciało Anti-Rabbit Alexa 488 second w buforze do rozcieńczania przeciwciał.

Dodać DAPI, który znakuje jądra komórkowe, w końcowym rozcieńczeniu od jednego do 2000. Dodaj mieszaninę do wszystkich dołków i owiń płytkę folią, aby zapobiec fotowybielaniu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po inkubacji umyj komórki TBS, a następnie dwa 15-minutowe płukania na kołysce. Usuń cały bufor ze studzienek i dodaj bufor magazynujący, uzupełniony 0,4 miligrama na mililitr tiomersalu, aby zapobiec rozwojowi bakterii. Do obrazowania tego testu biologicznego używana jest maszyna przesiewowa o wysokiej zawartości, wyposażona w zautomatyzowany stolik, obiektywy skupiające i filtry.

Sprawdź, czy zainstalowane są odpowiednie filtry. Wyczyść spód talerza, aby uzyskać najlepszą jakość. Załaduj tabliczkę do stolika z punktem A1 umieszczonym w lewym górnym rogu.

Korzystając z kreatora akwizycji płyty, zapisz podstawowe informacje o eksperymencie, takie jak numer tablicy, powiększenie, data, warunki eksperymentu i szczegóły etykietowania. Wybierz rodzaj użytej płytki mikrodołkowej. Użytkownicy mogą wybrać studnie i liczbę witryn, które mają zostać przejęte.

Wybierz wszystkie studnie, które mają zostać zobrazowane, podświetlając siatkę. Przesuń scenę do najjaśniejszej studni. Wybranie najjaśniejszej studni zapewni, że wszystkie obrazy zostaną uzyskane z wartościami szarości pikseli, które mieszczą się w zakresie liniowym, a zatem są wprost proporcjonalne do intensywności barwienia.

Jeśli ten krok nie zostanie wykonany, obrazy wykonane w jaśniejszych studniach mogą być przesycone. Wybierz odpowiednie kombinacje kanałów, czas ekspozycji i parametry przesunięcia Z dla eksperymentu. Filtry używane do obrazowania FABP4 i DAPI odpowiadają specyficznym etykietom używanym do wizualizacji barwienia.

Do wizualizacji FABP4 wykorzystano Alexę 488, która wzbudza się na 480 nanometrach i emituje na 560 nanometrach. Barwnik DAPI, który wzbudza się na długości 360 nanometrów i emituje na częstotliwości 460 nanometrów, został użyty do wizualizacji jąder komórkowych. W przypadku płytek oznaczonych kolorem Oil Red O, kropelki tłuszczu zostały uwidocznione za pomocą jasnego światła przepuszczanego przez paliwo.

Etykieta Oil Red O została również zwizualizowana z fluorescencją, ponieważ wzbudza się przy 575 nanometrach i emituje przy 630 nanometrach. Po zakończeniu całej konfiguracji test biologiczny jest gotowy do pobrania. Obraz jest automatycznie zapisywany na serwerze online, aby umożliwić łatwy zdalny dostęp do obrazów.

Pełny zestaw obrazów przechowywanych na serwerze online jest dostępny za pomocą programu do zdalnego pulpitu. Obrazy mogą być następnie analizowane za pomocą oprogramowania MetaXpress. Aplikacja do oceniania komórek pozwala użytkownikom wybrać długość fali do wykrywania wszystkich jąder w polu, takim jak w tym przypadku DAPI.

Kolejne długości fal można wykorzystać do wykrycia dodatniego markera w jądrze, cytoplazmie lub obu lokalizacjach komórki. Białko wiążące kwasy tłuszczowe cztery, czyli FABP4, jest markerem linii adipogennej. Ekspresja FABP4 jest zlokalizowana w jądrze i cytoplazmie zróżnicowanych adipocytów.

W tym teście biologicznym analizujemy ekspresję FABP4 za pomocą modułu punktacji komórek. Po pierwsze, wykryj jądra komórkowe za pomocą kanału DAPI, ze zdefiniowanymi przez użytkownika parametrami wielkości i intensywności sygnału powyżej tła. Wykrywanie sygnału FABP4 za pomocą kanału C stopy i zdefiniowanych przez użytkownika parametrów rozmiaru i intensywności sygnału nad tłem.

W tym teście biologicznym kropelki tłuszczu znakowane olejem czerwonym O, które fluorescenują w zakresie 560 nanometrów, analizowano za pomocą modułu MetaXpress Can, Transflour. Ten algorytm analizy wykrywa wszystkie komórki za pomocą jąder znakowanych DAPI, które spełniają kryteria wielkości komórki i intensywności barwienia określone przez użytkownika. Użytkownik określa również wielkość i intensywność wgłębień, które w tym przypadku wykrywają kropelki tłuszczu w bliskim sąsiedztwie jąder komórkowych.

Informacje dotyczące wielkości kropelek tłuszczu, intensywności barwienia, liczby na komórkę są rejestrowane przez test Transflour. Ważne jest, aby pamiętać, że etykieta Oil Red O wyciekła lub rozpuściła się w niektórych komórkach, potencjalnie ograniczając i myląc prawdziwą ilość zachodzącego różnicowania. Reprezentatywne obrazy wczesnych i późnych pasaży, komórek kontrolnych i zróżnicowanych, oznaczonych DAPI, barwieniem jądrowym i FABP4 są pokazane wraz z obrazami łączenia i segmentacji.

Obrazy segmentacji wyświetlają zróżnicowane komórki z zieloną nakładką i niezróżnicowane komórki z czerwoną nakładką. Odsetek komórek wykazujących ekspresję FABP4 wykorzystano jako miarę potencjału różnicowania adipogennego. Zaobserwowano znaczny wzrost komórek wykazujących ekspresję FABP4 przy różnicowaniu adipogennym w komórkach wczesnego i późnego pasażu.

Komórki wczesnego pasażu wykazywały znacznie większy wzrost różnicowania niż komórki późnego pasażu. Reprezentatywne obrazy DAPI i Oil Red O są pokazane wraz z obrazami scalania i segmentacji. Obrazy segmentacji przedstawiają wszystkie jądra z zieloną nakładką i kropelki lipidów zabarwione czerwienią olejową z czerwoną nakładką na czerwono.

Obszar barwienia czerwienią olejową O na komórkę wykorzystano jako miarę potencjału różnicowania adipogennego. Zaobserwowano istotny wzrost obszaru barwienia czerwieni olejowej O przy różnicowaniu adipogennym. Komórki z wczesnym pasażem wykazywały większą powierzchnię barwienia czerwienią olejową O na komórkę w porównaniu z komórkami z późnym pasażem.

Western blot przeprowadzono w celu analizy poziomu ekspresji białka FABP4 w zróżnicowanych wczesnych i późnych pasażach ASC. Półilościowa analiza gęstości optycznej prążków FABP4 jako stosunku do całkowitej kontroli obciążenia białkami wykazała, że znakowanie immunologiczne FABP4 było znacznie zwiększone we wczesnych pasażach i w mniejszym stopniu w późnych pasażach zróżnicowanych komórkach. Oglądając ten film, powinieneś zrozumieć, jak różnicować komórki macierzyste w linię adipogenną, jak przeprowadzać barwienie immunofluorescencyjne za pomocą markera specyficznego dla genu adipogennego, czwartego białka wiążącego kwasy tłuszczowe i wreszcie, jak obrazować i analizować wszystkie istotne cechy morfologiczne komórek, które są immunododatnie dla białka wiążącego kwasy tłuszczowe cztery.

Mam nadzieję, że ten film okaże się przydatny w Twoich badaniach.