Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Ogólnym celem tej techniki jest dostarczenie narzędzia obliczeniowego do oceny rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału modyfikacji DNA, wizualizowanych za pomocą barwienia immunologicznego w jądrach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, umożliwiając badanie lokalizacji jądrowej i względnych poziomów modyfikacji DNA w różnych układach modelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że modyfikacje DNA są mierzone za pomocą wielkości sygnału bota, a następnie rozkładu.

Jedną z implikacji tej techniki jest to, że ułatwia nam ona zrozumienie potencjalnych funkcjonalnych rzędów modyfikacji DNA w różnych systemach biologicznych. Technika ta ma również dodatkowe zastosowanie w analizie obliczeniowej innych epitopów wykrywalnych za pomocą immunohistochemii. Aby rozpocząć, otwórz pliki w formacie LSM obrazu mikroskopii konfokalnej.

Wybierz opcję Przetwarzanie obrazu, a następnie wybierz żądany obraz do analizy. Należy pamiętać, że porównując profile intensywności między próbkami, moc i wzmocnienie lasera muszą być spójne, aby można było dokonać bezpośrednich porównań. Następnie kliknij pokaż wszystko, aby wyświetlić wszystkie kontrolki graficzne, a następnie wybierz kartę grafika i wybierz narzędzie prostokąta, aby wybrać obszar zawierający interesujące jądra.

Następnie użyj polecenia wytnij region, aby wyizolować obszar zainteresowania. Teraz zapisz obraz pod nową nazwą i w formacie LSM lub CZI i ponownie otwórz plik w oprogramowaniu Zen Blue. Otwórz biurko ZEN w Zen Blue, a następnie użyj polecenia wyślij do ZEN w Zen Black, aby otworzyć plik w Zen Blue.

Następnie aktywuj zakładkę oznaczoną 2.5d, aby umożliwić wizualizację obrazu w 2.5d. Kliknij opcję pokaż wszystko, aby wyświetlić wszystkie kontrolki graficzne i zmienić ustawienia za pomocą czterech szarych pasków. Paski sterują powiększaniem, obracaniem, pochylaniem osi oraz rozszerzaniem i kurczeniem się pasków skali.

Wybierz tryb renderowania, aby jak najlepiej zobrazować poszczególne szczyty, a następnie zmień dużą odległość, zmieniając wartość procentową. Im niższa wartość procentowa, tym bardziej zdefiniowany jest każdy pojedynczy szczyt. Teraz przed zapisaniem obrazu 2.5d ukryj listę plików i narzędzia graficzne, klikając szarą strzałkę poniżej wykresu 2.5d.

Następnie zapisz wykres jako zrzut ekranu za pomocą print screen na klawiaturze. Otwórz opcję przetwarzania obrazu w oprogramowaniu i otwórz interesujący Cię plik. Następnie wybierz kartę profilu i wybierz kartę pokaż wszystko, aby uzyskać dostęp do wszystkich opcji formatowania.

Na karcie profilu wybierz opcję tabeli i przycisk strzałki. Teraz użyj myszki, aby wybrać punkt początkowy i narysuj linię nad ciągłą liczbą komórek, a następnie generowany jest wykres intensywności dla komórek wzdłuż tej linii wraz z tabelą pomiarów intensywności. Zwróć uwagę, że tabela zawiera również odległość, w której intensywność pikseli jest czerwona dla czerwonej i niebieskiej fluorescencji.

Jednostka to mikrony. Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, wybierz zapisz tabelę i zapisz ją jako plik tekstowy. Aby zapisać profil intensywności, wybierz opcję eksportu, w wyskakującym oknie przełącz dwie opcje, oznaczony plik obrazu, format i zawartość okna obrazu, pojedyncze okienko, dane.

Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zapisać plik. Teraz powtórz ten proces dla każdego potrzebnego profilu intensywności. W oprogramowaniu wybierz przetwarzanie obrazu i wybierz interesujący Cię plik obrazu.

Następnie wybierz kartę z etykietą coloc do analizy kolokalizacji i wybierz pozycję pokaż wszystko, aby uzyskać dostęp do wszystkich opcji formatowania. Z czterech zakładek w dolnej połowie ekranu wybierz opcję kolokalizacji, a następnie opcje tabeli i obrazu. Następnie wybierz trzecią ikonę u góry zakładki, oznaczoną wyskakującym tekstem, zamkniętym przed wyjściem.

Użyj tego narzędzia, aby okrążyć pojedyncze jądro. Wartości pojawią się następnie w tabeli i zostanie utworzony wykres punktowy dla czerwonej i zielonej fluorescencji. Oś tego wykresu jest ruchoma, co steruje bramkowaniem detekcji.

Wszystkie intensywności pikseli w jądrze należy uznać za sygnały dodatnie. Ponieważ poziomy modyfikacji DNA różnią się w całym jądrze, aby uwzględnić słabe sygnały, nie bramkujemy danych. Należy w tym miejscu podkreślić, że dyskusyjne jest, czy wartości tła powinny być uwzględniane w analizie.

Co ważne, współczynnik nakładania się jest niezależny od różnic w natężeniu sygnału pomiędzy tymi dwoma kanałami. Natomiast współczynnik korelacji osób zakłada liniową zależność między sygnałami. Teraz powtórz ten proces okrążania jąder, aby uzupełnić zestaw danych.

Następnie, aby wyeksportować dane, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę i postępuj zgodnie z opcjami, aby zapisać dane. Aby zapisać obraz kolokacyjny, użyj polecenia eksportu z dwiema opcjami: oznaczony plik obrazu, format i zawartość pojedynczego okienka okna obrazu, dane, a następnie postępuj zgodnie z opcjami, aby zapisać plik. Zbadano rozkład przestrzenny dwóch utlenionych pochodnych pięciu cytozyny metylowej w różnicowaniu przodków haphadycznych, przy użyciu opisanego protokołu.

Sygnały czerwony i zielony reprezentują dwie odrębne modyfikacje DNA. Sygnały są dobrze zdefiniowane i w ograniczonym stopniu się pokrywają. Zgodnie z oczekiwaniami, profile dwóch intensywności sygnału i odpowiadającej im komórki nie pokrywają się ze sobą

Wyraźny wzór sugeruje, że zależne od kranu utlenianie pięciu cytozyny metylowej może generować różne utlenione pochodne w określonych regionach chromatyny. Podobne porównanie dwóch modyfikacji DNA przeprowadzono w komórkach rdzeniaka zarodkowego Daoya i w komórkach wyściółczaka BXD. Obie linie komórkowe pochodzą z dziecięcych guzów mózgu.

Kwantyfikacja wykazała, że komórki BXD wykazują znacznie niższe poziomy obu sygnałów w porównaniu z komórkami Daoy. Następnie badano kolokalizację utlenionych pochodnych 5MC w niezróżnicowanych hiPSC. W ciągu 24 godzin po indukcji różnicowania endodermy wątrobowej i hiPSC.

W tej analizie kolokalizacja sygnału zmieniła się znacząco wraz z indukcją różnicowania, co można przypisać zmniejszonej wielkości pięciu CAC w niezróżnicowanych komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wykresy i profile intensywności 2,5D oraz jak tworzyć dane kolokalizacyjne. Opisane tutaj narzędzia do analizy i wizualizacji obrazu przyczyniają się do badań epigenetycznych, zapewniając stosunkowo szybki sposób porównywania sygnałów różnych modyfikacji DNA w różnych grupach eksperymentalnych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ważne jest, aby unikać prześwietlenia i używać tych samych ustawień dla różnych grup eksperymentalnych podczas mikroskopii. Pęcherzyki powietrza w uchwycie i niewystarczające zanurzenie mogą powodować miejscową utratę fluorescencji, dlatego kontrola wzrokowa obszaru skanowania ma kluczowe znaczenie.

Procedurę można dodatkowo zautomatyzować, segmentując jądra i tworząc obszary zainteresowania za pomocą Zen Blue. Regiony te mogą być importowane do Zen Black, w celu przeprowadzenia analizy kolokalizacji na wielu jądrach.