Name: Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę analizy obliczeniowej obrazów konfokalnych do oceny przestrzennego rozkładu modyfikacji DNA w jądrach komórkowych. Technika ta umożliwia badanie intensywności sygnału i kolokalizacji pochodnych 5-metylocytozyny w badaniach epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Radę Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi [BB/N005759/1 do A.R.]. NRFH został sfinansowany przez The Rosetrees Trust i The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Mikroskop Zeiss Elyra PS.1, komputery przetwarzające i oprogramowanie zostały sfinansowane przez BBSRC BB/L013827/1 (Multidisciplinary Super Resolution Microscopy Facility at Nottingham University grant)

1. Generowanie obrazów konfokalnych
<ol>
	<li>W ramach przygotowań do analizy zmodyfikowanych form cytozyny należy przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne zgodnie z opisem Abakir i wsp.34.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie szkiełek za pomocą mikroskopu i zapisz pliki w formacie LSM. 
	UWAGA: Podczas porównywania profili intensywności między próbkami wartości stosowane dla mocy i wzmocnienia lasera dla każdego kanału muszą być zachowane przez cały czas trwania procedury wykonywania obrazu, aby umożliwić bezpośrednie porównanie na etapie analizy obrazu.</li>
</ol>
2. Generowanie wykresów intensywności 2.5D
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie (np. Zen Black) i wybierz "Przetwarzanie obrazu".</li>
	<li>Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz. Wybierz obraz, który wymaga przetworzenia.</li>
	<li>Kliknij "Pokaż wszystko" pod obrazem, aby wyświetlić wszystkie elementy graficzne. W dolnej połowie ekranu znajdują się trzy zakładki; 'Wymiary', 'Wyświetlacz' i 'Grafika', wybierz zakładkę 'Grafika'.
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie "prostokąt", aby wybrać jądra/obszar zainteresowania.</li>
		<li>Wybierz "Wytnij region", aby przyciąć obraz. Spowoduje to wygenerowanie nowego obrazu dla przyciętego regionu w osobnej karcie.</li>
		<li>Przejdź do menu Plik i wybierz Zapisz jako. Nadaj plikowi nazwę i zapisz go jako plik LSM lub CZI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie (np. Zen Blue) i wybierz "Zen Desk".</li>
	<li>Wyślij przycięty obraz z Zen Black do Zen Blue, wybierając plik i klikając menu Plik, a następnie wybierz Wyślij do Zen 2012-blue edition. Przycięty obraz otworzy się w odpowiednim programie. 
	UWAGA: Plik obrazu jest przesyłany, ponieważ funkcja wykresu intensywności 2.5D w Zen Black 2012 nie wyświetla obrazów z wielu kanałów jednocześnie.</li>
	<li>Po lewej stronie obrazu wybierz zakładkę oznaczoną '2.5D', która umożliwia wizualizację obrazu w 2.5D. Kliknij "Pokaż wszystko", aby wyświetlić wszystkie elementy graficzne.</li>
	<li>Zmień ustawienia wizualizacji za pomocą czterech szarych pasków umieszczonych po lewej stronie i pod obrazem. 
	UWAGA: Lewy pasek, górna część ekranu = powiększenie. Lewy pasek, dolna część ekranu = obróć obraz wokół osi. Dół ekranu, lewy pasek = obrót obrazu. Dół ekranu, prawy pasek = paski skali rozwijania i zmniejszania.</li>
	<li>Upewnij się, że wybranym trybem renderowania jest powierzchnia, ponieważ zapewnia to najlepszą wizualizację poszczególnych szczytów.</li>
	<li>Zmień odległość siatki, zmieniając wartość procentową, im niższa wartość procentowa, tym bardziej zdefiniowany jest każdy pojedynczy szczyt.</li>
	<li>Aby zapisać obraz 2.5D, najpierw ukryj listę plików po prawej stronie i narzędzia graficzne pod obrazem, klikając szarą strzałkę poniżej wykresu 2.5D (obok "pokaż wszystko"), co spowoduje ukrycie zakładek graficznych pozwalających na rozszerzenie obrazu w celu wypełnienia ekranu. Aby zapisać wykres 2.5D, naciśnij "PrtSc" na klawiaturze. Spowoduje to zrobienie zrzutu ekranu wyświetlacza. Wklej zrzut ekranu w programie Microsoft Paint i przytnij obraz przed zapisaniem.</li>
</ol>
3. Profilowanie intensywności
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie (np. Zen Black) i wybierz Przetwarzanie obrazu.</li>
	<li>Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz. Wybierz obraz, który wymaga przetworzenia.</li>
	<li>Gdy obraz pojawi się na ekranie, po lewej stronie obrazu wybierz zakładkę oznaczoną "Profil".</li>
	<li>W dolnej połowie ekranu wybierz (zaznacz) zakładkę "Pokaż wszystko". Umożliwi to dostęp do wszystkich opcji formatowania.</li>
	<li>W dolnej połowie ekranu znajdują się trzy zakładki: "Wymiary", "Wyświetlacz" i "Profil"; wybierz "Profil" i zaznacz (zaznacz) pole "Tabela". Wybierz przycisk "Strzałka".</li>
	<li>Na obrazie użyj myszy, aby wybrać punkt początkowy i przeciągnij myszą po ciągłej liczbie komórek. Zwolnij przycisk myszy, aby utworzyć wykres intensywności dla komórek wzdłuż linii; Dodatkowo tabela zostanie wypełniona danymi pomiaru intensywności dla pikseli wzdłuż linii dla każdej długości fali. 
	UWAGA: Tabela poda odległość (μm), przy której odczytywana jest intensywność pikseli dla fluorescencji czerwonej, zielonej i niebieskiej.</li>
	<li>Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy na tabelę, wybierz opcję "Zapisz tabelę..." i zapisz w odpowiedniej lokalizacji jako plik .txt.</li>
	<li>Aby zapisać wybrane zdjęcie profilu intensywności, wybierz menu Plik i wybierz opcję "Eksportuj...". W wyskakującym okienku wybierz "Oznaczony plik obrazu (format)" i "Zawartość okna obrazu - pojedyncze okienko (dane)", a następnie kliknij "Wybierz nazwę pliku i zapisz...", wybierz odpowiednią lokalizację i kliknij "Zapisz".</li>
	<li>Powtórz ten proces dla każdego indywidualnego profilu intensywności w zależności od pól widzenia i liczby profili do analizy.</li>
	<li>Zaimportuj zapisane dane o profilach intensywności (patrz 3.7) i przeanalizuj je w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie wykonaj analizę statystyczną.</li>
</ol>
4. Analiza kolokacji
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz "Przetwarzanie obrazu".</li>
	<li>Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz. Wybierz obraz, który wymaga przetworzenia.</li>
	<li>Gdy obraz pojawi się na ekranie, po lewej stronie obrazu wybierz zakładkę oznaczoną "Coloc".</li>
	<li>W dolnej połowie ekranu wybierz (zaznacz) zakładkę "Pokaż wszystko". Umożliwi to dostęp do wszystkich opcji formatowania.</li>
	<li>W dolnej połowie ekranu znajdują się cztery zakładki: "Wymiary", "Wyświetlacz", "Grafika" i "Kolokalizacja"; wybierz "Kolokalizacja" i zaznacz pola "Tabela" i "Obraz".
	<ol>
		<li>Wybierz trzecią ikonę u góry tej zakładki (Zamknij tekst Beziera pojawi się, gdy najedziesz myszą na narzędzie), a następnie użyj tego narzędzia, aby otoczyć pojedyncze jądra, wartości dla tych jąder pojawią się w tabeli. 
		UWAGA: Dla każdego otoczonego jądra tworzony jest wykres punktowy dla fluorescencji czerwonej i zielonej, który jest wizualizowany w lewym panelu ekranu. Oś jest następnie przesuwana w celu wyprowadzenia komórek w zależności od progu. Ponieważ jądra będące przedmiotem zainteresowania są wybierane ręcznie na obrazach, dostosowywanie progów bramkowania powyżej zera nie jest wymagane. Wszystkie wartości intensywności pikseli obserwowane w obrębie obwodów jądrowych są uważane za sygnał dodatni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz ten proces, wybierając trzecią ikonę w zakładce i okrążając kolejne jądra, aż zbiór danych zostanie uzupełniony.</li>
	<li>Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy na tabelę, wybierz zapisz tabelę i zapisz w odpowiedniej lokalizacji.</li>
	<li>Aby zapisać obraz kolokalizacyjny, wybierz menu Plik i wybierz "Eksportuj...", a następnie wybierz; Oznaczone Plik obrazu (Format) i 'Zawartość okna obrazu - pojedyncza płaszczyzna (Dane)', a następnie kliknij 'Wybierz nazwę pliku i zapisz...', wybierz odpowiednią lokalizację i kliknij 'Zapisz'.</li>
	<li>Wykreśl dane kolokalizacji w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie przeprowadź analizę statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li>
<li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li>
<li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Monograph+Series%22%5BJournal%5D)">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li>
<li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li>
<li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li>
<li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+%28cytosine-5%29+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li>
<li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+de+novo+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li>
<li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6%2C+20+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li>
<li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+loading%2C+but+not+de+novo+methylation%2C+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li>
<li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li>
<li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+differentiation%2C+cytidine+analogs+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNA+methylation%3A+DNA+Methylation+in+Early+mammalian+Development%22">DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development</a>. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).</li>
<li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li>
<li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li>
<li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology+%28Elsevier%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li>
<li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+DNA+demethylation%3A+many+roads+lead+to+Rome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141(2016).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron+%28II%29%2F%CE%B1-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li>
<li>He, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR%3A+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li>
<li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li>
<li>Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027282">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PloS one. 5 (12), e15367(2010).</li>
<li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2754-8_8">Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue</a>. , Springer. 125-137 (2016).</li>
<li>Alioui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Carboxylcytosine+is+localized+to+euchromatic+regions+in+the+nuclei+of+follicular+cells+in+axolotl+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary.</a> Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).</li>
<li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46(2014).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li>
<li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy%3A+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li>
</ol>

Nie ujawniono żadnych potencjalnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje krokowy proces generowania wizualnych reprezentacji modyfikacji DNA w jądrach. Chociaż techniki te są wrażliwe i skuteczne, mają szereg ograniczeń.
Należy podkreślić, że dane generowane z wykresów 2,5D, profili intensywności sygnału oraz analizy kolokalizacyjnej mają charakter półilościowy. Dzięki punktowemu oświetlaniu próbki podczas akwizycji obrazu za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, rejestrowane są bezwzględne natężenia sygnału każdego kanału. Nie są to jednak bezwzględne wielkości 5hmC i 5caC, które są wykrywane, a jedynie wskazują na obecność, brak lub skalę tych znaczników epigenetycznych.
Ze względu na powtarzalny charakter wzmocnień sygnału, ograniczenia zgodne z wielkością maszyn stosowanych w celu wzmocnienia sygnału nieuchronnie zakłócają przybliżenia rzeczywistego fizycznego zajętości genomu tych znaków34. Prawdziwa lokalizacja genomowa tych znaczników może być przesłonięta przez te masywne białka, które fizycznie zajmują obszary nierozdzielne nawet przy optymalnych granicach rozdzielczości konfokalnej 200-300 nm34. Co więcej, intensywność sygnału poszczególnych kanałów dla każdego znaku nie może być porównywana ze sobą ze względu na różnice w czułości przeciwciał i koniugacji fluoroforu34. Jednak informacje uzyskane za pomocą obrazowania rzucają światło na przestrzenną i czasową organizację znaczników genomowych.
W celu dokładnego określenia ilościowego sygnałów 5hmC i 5caC, jądra są podświetlane i otaczane względem przeciwbarwienia DAPI, wyraźnie wyznaczając obszar, który ma być analizowany. Procedura ta zwalnia z wymogu kalibracji progów bramkowania, ponieważ szum tła jest pomijany w ręcznym procesie selekcji jąder1. Automatyzację tego procesu można osiągnąć w najnowszym oprogramowaniu, które pozwala na przeprowadzenie segmentacji jądrowej. Podczas gdy dostępne są bezpłatne alternatywne pakiety oprogramowania, takie jak FIJI do analizy kolokalizacji, wady, takie jak wymóg konwersji obrazów do binarnych formatów 8-bitowych, maskowanie obrazów i wprowadzanie danych wykluczenia rozmiaru w celu wybrania obszarów zainteresowania, ograniczają dostępność tego programu dla użytkownika. Dodatkowo, biorąc pod uwagę ogólnie ograniczone poziomy 5hmC i 5caC w genomie w połączeniu z ich dominującą lokalizacją w regionach euchromatycznych i ogólnym zubożeniem genomowych sekwencji CpG, ręczne okrążanie jąder wprowadza stronniczość użytkownika. W związku z tym podświetlanie jąder automatycznie zakłada, że wszystkie zdarzenia zachodzące w obrębie wyznaczonego obszaru są pozytywne i ignoruje wszelkie piksele tła, które mogą być obecne. W związku z tym analizowanie obrazów na podstawie intensywności pikseli może być bardziej znaczące. Czynniki te są ważne przy rozważaniu zastosowania współczynnika kolokalizacji Mandera do analizy stopnia przestrzennego nakładania się dwóch sygnałów, niezależnie od ich intensywności sygnału, w przeciwieństwie do współczynnika korelacji Pearsona, który zakłada liniową zależność między sygnałami.
Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj techniki niosą ze sobą temat wizualnej reprezentacji danych biologicznych w intuicyjnym formacie. Chociaż półilościowa analiza obrazu nie może zastąpić potężnych technik, takich jak spektrometria mas pod względem czułości lub sekwencjonowanie całego genomu o pojedynczej rozdzielczości podstawowej, dostarcza ona danych uzupełniających, umożliwiając precyzyjne formułowanie wniosków i hipotez na podstawie analizy obrazów.

Metylacja DNA, dobrze udokumentowany mechanizm związany z regulacją transkrypcji pociąga za sobą modyfikację reszt cytozyny w kontekście dinukleotydu 5'-cytozyno-fosforan-guanina-3' (CpG) poprzez dodanie grupy metylowej (-CH3) do atomu węgla 5- pierścienia pirymidynowego cytozyny, tworząc 5-metylocytozynę (5mC)1. U ssaków około 70% CpG jest metylowanych, co stanowi tylko 1% ich genomów, ponieważ są one pozbawione tej sekwencji palindromicznej z powodu mutagennej skłonności 5mC do spontanicznej deaminacji do tyminy2. Obecność grup metylowych w sekwencjach promotorów genów wykazuje silną korelację z represją transkrypcyjną u kręgowców3,4,5. Dodawanie tych grup metylowych jest katalizowane przez wysoce konserwatywne enzymy metylotransferazy DNA (DNMT) DNMT3a, 3b i 3L oraz DNMT1, które modyfikują cytozyny CpG odpowiednio w kontekstach metylacji de novo i podtrzymującej6. Ekspresja DNMT3A/B jest podwyższona podczas rozwoju w embrionalnych komórkach macierzystych i epiblastach; Jednak jego zmniejszona ekspresja jest obserwowana po zaangażowaniu linii komórek pluripotencjalnych w losy somatyczne podczas różnicowania8. Dzieląc redundancję funkcjonalną, DNMT3a i 3b wykazują specyficzne tkankowo wzorce ekspresji, przy czym 3a wykrywa się jednolicie w zarodkach myszy, ale 3b jest głównie zlokalizowane w tkankach neuroektodermy i ektodermy kosmówkowej8.
Sygnatury metylacji mogą być dziedziczone podczas mitozy i mejozy10. Metylacja podtrzymująca polega na ułatwionej przez DNMT1 modyfikacji reszt cytozyny CpG istniejących w półmetylowanych palindromiach na dwuniciowym DNA11. DNMT1 wiąże DNA w widełkach replikacyjnych11, a w konsekwencji poziomy metylacji genomu osiągają szczyt podczas fazy S cyklu komórkowego12. DNMT1 metyluje niezmodyfikowane cytozyny, wyróżniając w ten sposób nowo zsyntetyzowane nici DNA, promując inaktywację chromosomu X i utrzymując profile represji transkrypcji13. Poprzez rozpoznawanie hemi-metylowanych sekwencji CpG DNA, DNMT1 utrzymuje ustalone wzorce metylacji wyznaczone przez metylację de novo, np. represję promotorów retrotranspozonów długo przeplatanego pierwiastka jądrowego 1 (LINE1) w celu zahamowania jego potencjalnie rakotwórczego rozprzestrzeniania się14. Chociaż posiada powinowactwo do wiązania preferencyjnego hemi metylowanego DNA, DNMT1 może metylować niemetylowane sekwencje wyspy CpG (CGI) w zmutowanych komórkach DNMT3a/b -/-, spełniając awaryjną rolę metylacji de novo15. Tak więc, ze względu na półkonserwatywną naturę replikacji DNA16, metylacja podtrzymująca może wiernie odtworzyć sygnatury metylacji od komórki rodzicielskiej do potomnej17.
Jednakże, aby ekspresja genów mogła być dynamicznie modulowana, represyjna modyfikacja metylacji musi zostać usunięta, co można osiągnąć za pomocą pasywnych i aktywnych mechanizmów demetylacji18. Białka translokazy Ten-Eleven (TET) należące do konserwatywnej rodziny białek dioksygenazy są zdolne do iteracyjnego utleniania grup metylowych na resztach CpG19. Te białka Tet, homologiczne do białek wiążących J-Base (JBP) odkrytych w Trypanosome bruceii, rozpoznają i wiążą zmodyfikowane zasady DNA, np. 5mC i dotleniają te reszty do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC)20. Utlenianie 5mC wspomagane białkiem Tet powoduje stopniową zmianę konformacji z konfiguracji metylowej na hydroksylową, karbonylową i karboksylową, jednak modyfikacje 5fC i 5caC można zsyntetyzować bezpośrednio z utleniania 5mC21,22,23,24.
Pouczającym wskaźnikiem aktywności białka TET w zrozumieniu ich regulacji jest badanie rozmieszczenia i obfitości znaczników oksy-metylo-cytozyny. Znacząca obecność 5mC w ubogich promotorach CpG jest wykrywalna w przeciwieństwie do niemetylowanych regionów bogatych w CpG, przy czym te ostatnie są charakterystyczne dla wysp CpG25. We wszystkich tkankach najwyższą specyficzną dla tkanek metylację obserwuje się w mózgu, jądrach i krwi, podczas gdy błona śluzowa jamy ustnej wykazuje największą hipometylację, co wskazuje na zróżnicowany wzorzec metylacji występujący w promotorach specyficznych dla tkanki26.
Poprzez wykorzystanie czułych przeciwciał anty-5mC i anty-5hmC w selektywnym immunoprecypitacji metylowego/hydroksymetylowego DNA (meDIP/hmeDIP), a następnie sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości, Ficz et al. wykazali wysokie obłożenie 5hmC w promotorach, eksonach i sekwencjach retrotranspozonów LINE-1, które korelowały z obniżonymi poziomami 5mC w tych miejscach w embrionalnych komórkach macierzystych myszy27. I odwrotnie, największe wzbogacenie o 5 mC zaobserwowano w powtarzających się sekwencjach satelitarnych, w których obecność 5hmC była ograniczona28. Badania przeprowadzone na tkance mózgowej ludzkiego płata czołowego wykazały bardzo znaczące wzbogacenie 5hmC, czterokrotnie wyższe niż w embrionalnych komórkach macierzystych myszy28. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, wysokoprzepustowe sekwencjonowanie tkanki płata czołowego wykazało większość 55-59% sygnału 5hmC zlokalizowanego w regionach promotorowych CpG o niskiej gęstości, 35-38% w ciałach genowych i około 6% zajętości w regionach międzygenowych. W przeciwieństwie do tego, 5mC było wzbogacone w regionach międzygenowych (25-26%) i wyższe w ciałach genów (52-55%), ale zmniejszone (22-24%) w sekwencjach promotorowych29. Badania te wskazują na obfitość 5hmC w embrionalnych komórkach macierzystych i tkance somatycznej, zwłaszcza w mózgu, jednak badania nad dystrybucją 5fC i 5caC są ograniczone.
Ciekawe, niedawno odkryte u eukariontów metylacja reszt adeniny na pozycji 6 azotu (N6) (6mA) wykazują genomowy profil obfitości odwrotny do profilu 5mC30. Obserwacje z tandemowej spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową ujawniają, że bezwzględne poziomy 6mA występują w nadmiarze u wczesnych zarodków ryb danio pręgowanego i świń w porównaniu z plemnikami, przy czym ich poziomy (0,003% adeniny genomowych) stale rosną po zapłodnieniu, osiągając szczyt w stadium rozwoju moruli (33 razy więcej niż plemniki) i osiągając poziomy somatyczne w stanie stacjonarnym 0,004% adenin genomowych31. Immunoprecypitacja sekwencji DNA wzbogaconych o 6mA wykazała dominujące zajęcie (około 80% wzbogacenia) tego znaku w powtarzających się regionach pierwiastków i miejscach rozpoczęcia transkrypcji32. Obserwacje te kontekstualizują i potwierdzają odkrycie embrionalnych komórek macierzystych 6mA pozbawionych demetylazy, wykazujących skumulowane wyciszanie retrotranspozonów LINE-1 za pośrednictwem 6mA w porównaniu z elementami aktywnymi transkrypcyjnie w komórkach typu dzikiego. Dane te sugerują transkrypcyjną funkcję regulacyjną dla klasy 6mA<sup="xref">33.
Podczas gdy sprzężone znaczniki biochemiczne sprzężone z kolejnymi testami DIP wskazują na obecność lub brak utlenionych pochodnych metylocytozyny (oksy-mC), nie mogą one przekazać rozkładu przestrzennego ani ilościowych informacji o tych znakach34,35. Niedawno opracowano protokół czułego wykrywania immunochemicznego 5hmC i 5caC36. Ta sprzężona z fluoroforem metoda barwienia immunologicznego opartego na przeciwciałach wtórnych w połączeniu z wykorzystaniem skaningowej laserowej mikroskopii konfokalnej ma wyjątkową zaletę polegającą na zapewnieniu wizualnej lokalizacji tych modyfikacji DNA w komórkach, podkreślając w ten sposób poszczególne dodatnio lub ujemnie zabarwione komórki odpowiadające heterogenicznej obecności tych znaków. Bezwzględne intensywności sygnału 5hmC i 5caC wzmocnione przez sprzężone przeciwciała umożliwiają zaproponowanie półilościowych interpretacji wielkości i pozycji tych znaczników w jądrze, np. regionów heterochromatycznych i euchromatycznych37,38. W tym miejscu opisano technikę analizy obliczeniowej obrazów z mikroskopii konfokalnej. Zademonstrowano generowanie wykresów rozkładu przestrzennego 2,5D do wyświetlania odrębnych pików sygnału 5hmC i 5caC na piksel oraz ich lokalizacji w jądrach. Wykresy histogramu profili intensywności sygnału 5hmC i 5caC mogą ilustrować trendy w obfitości tych znaków, ponieważ szczyty i dołki są wykreślane jako oddzielne, nienakładające się kanały. Wreszcie, realizując funkcję kolokalizacji, można określić stopień zbliżenia jednego sygnału do drugiego, a w rezultacie zidentyfikować ich odpowiednie współrzędne genomowe.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Elyra PS1. Mikroskop o wysokiej rozdzielczości wyposażony w głowicę konfokalną LSM780</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie immunologiczne w modyfikacjach dna: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Przez kilka dziesięcioleci uważano, że 5-metylocytozyna (5mC) jest jedyną modyfikacją DNA o znaczeniu funkcjonalnym u metazoanów. Odkrycie enzymatycznego utleniania 5mC do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC), a także wykrycie N6-metyladeniny (6mA) w DNA organizmów wielokomórkowych zapewniło dodatkowy stopień złożoności badań epigenetycznych. Zgodnie z rosnącą liczbą dowodów eksperymentalnych, te nowe modyfikacje DNA mogą odgrywać określone role w różnych procesach komórkowych i rozwojowych. Co ważne, ponieważ niektóre z tych znaczników (np. 5hmC, 5fC i 5caC) wykazują specyficzne dla tkanek i etapów rozwojowych występowanie u kręgowców, immunochemia stanowi ważne narzędzie pozwalające na ocenę przestrzennego rozkładu modyfikacji DNA w różnych kontekstach biologicznych. W tym miejscu opisano metody analizy obliczeniowej modyfikacji DNA uwidocznionych za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie mikroskopii konfokalnej. W szczególności pokazano generowanie wykresów intensywności sygnału w wymiarze 2,5 (2,5D), profile intensywności sygnału, kwantyfikację intensywności barwienia w wielu komórkach oraz określenie współczynników kolokalizacji sygnału. Łącznie techniki te mogą być przydatne w ocenie poziomów i lokalizacji tych modyfikacji DNA w jądrze, przyczyniając się do wyjaśnienia ich ról biologicznych w metazoanach.

Aby określić rozkład przestrzenny 5hmC i 5caC w różnicujących się progenitorach wątroby, wykonano obrazowanie preparatów barwionych immunohistochemicznie pod kątem tych modyfikacji DNA przy użyciu mikroskopu.
Wstępna analiza rozkładu przestrzennego tych oxi-mCs została przeprowadzona poprzez wygenerowanie wykresów intensywności 2,5D (Rysunek 1A, 1B). Piki czerwone i zielone wydawały się być dobrze zdefiniowane, przy ograniczonej obecności pików pomarańczowych, co wskazywało na niewielki stopień nakładania się sygnałów 5caC i 5hmC. Zgodnie z tymi wynikami, profile intensywności 5hmC i 5caC w odpowiadającej komórce nie pokrywają się ze sobą w znacznym stopniu (Rysunek 1C). Ilustruje to, że 5caC i 5hmC wykazują odmienne wzorce rozkładu jądrowego w progenitorach wątrobowych, co sugeruje, że zależne od Tet utlenianie 5mC prowadzi do powstania różnych utlenionych pochodnych tej modyfikacji DNA w konkretnych regionach chromatyny.
Aby porównać poziomy 5caC i 5hmC w komórkach medulloblastoma Daoy oraz komórkach ependymoma BXD-1425EPN, przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne tych oxi-mCs w obu próbkach w identycznych warunkach eksperymentalnych. Następnie porównano intensywność sygnałów 5caC i 5hmC w 20 profilach wygenerowanych w obrębie 3-5 komórek zarejestrowanych dla każdej z linii komórkowych (Rysunek 2A-2D). Ilościowa analiza tych wyników wykazała, że komórki BXD-1425EPN wykazują znacznie niższe poziomy barwienia immunocytochemicznego zarówno dla 5hmC, jak i 5caC w porównaniu z komórkami Daoy (Rysunek 2D).
Biorąc pod uwagę dwa kanały: czerwony (5hmC) i zielony (5caC), które można oznaczyć odpowiednio jako R i G, współczynnik korelacji Pearsona (PCC) opisuje stopień nakładania się przestrzennego i współsegregacji R i G, zakładając, że oba znaczniki pozostają w relacji liniowej, co określa statystyka R34. Podniesienie wartości PCC do kwadratu, oznaczone jako R2, umożliwia pomiar zmienności intensywności sygnału zielonego, która jest uwarunkowana intensywnością sygnału czerwonego34. Jest to zbędne w przypadku naszej analizy kolokalizacji 5caC względem 5hmC.
Aby zbadać rozkład przestrzenny 5caC i 5hmC w nieróżnicowanych (Undiff) hiPSC oraz w endodermie wątrobowym 24 godziny (HE24) po indukcji, przeprowadzono analizę kolokalizacji tych modyfikacji DNA na tych samych obrazach konfokalnych, analizując wartości R dla 20 jąder w każdej linii komórkowej (Rycyna 3A-3C).
Ilościowa analiza tych wyników wykazała, że stopień kolokalizacji jest znacząco wyższy (P &lt; 0,05) w HE24 w porównaniu do Undiff (Rycina 3c). Może to wynikać z mniejszej ilości 5caC, a tym samym z mniejszego natężenia jego sygnału w komórkach Undiff.
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna; barwienie 5hmC, 5caC, DAPI; wykres intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Barwienie immunohistochemiczne progenitorów endodermy wątrobowej 72 godziny po indukcji różnicowania. (A) Współbarwienie 5hmC (czerwony), 5caC (zielony) i przeciwbarwienie jąder DAPI (niebieski). Biała przerywana strzałka „B” oznacza kierunek profilowania próbek przez jądro, przedstawiony na 1C. Pasek skali reprezentuje 5 µm. Kanał czerwony: wzmocnienie 800, laser 1%. Kanał zielony: wzmocnienie 750, laser 2,4%. Kanał DAPI: wzmocnienie 750, laser 2,6%. (B) Wykres intensywności 2.5D sygnałów 5hmC, 5caC i DAPI. Pojedyncze piki reprezentują absolutne intensywności sygnału każdego piksela. Przedstawiono widoki scalone oraz poszczególne kanały. (C) Profile intensywności sygnałów 5hmC, 5caC i DAPI w progenitorach wątrobowych 72 godziny po indukcji różnicowania. Intensywności pików zostały zarejestrowane wzdłuż wymiarów białej przerywanej strzałki „B” i są wskazane wzdłuż osi x profilu intensywności czarną przerywaną strzałką. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna 5hmC i 5caC; wyniki analizy na wykresie słupkowym intensywności pikseli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza intensywności sygnałów 5hmC i 5caC w liniach komórkowych medulloblastoma Daoy i ependymoma BXD-1425EPN. (A) Barwienie immunofluorescencyjne 5hmC (czerwony) i 5caC (zielony) w komórkach Daoy i BXD-1425EPN. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu imersyjnego 63x, oba z tymi samymi ustawieniami. Przedstawiono widoki scalone oraz poszczególne kanały. Paski skali reprezentują 10 µm. Kanał czerwony: gain 746, laser 1%. Kanał zielony: gain 750, laser 2,4%. Pojedyncze komórki (B) Daoy oraz (C) BXD-1425EPN zostały powiększone na sąsiednich rysunkach. Paski skali dla (B) i (C) reprezentują 5 µm. (D) Średnia intensywność fluorescencji sygnałów 5hmC vs 5caC w komórkach Daoy i BXD-1425EPN (n = 20, SD). Istotność oceniano za pomocą testu F oraz dwupróbkowego testu t. Gwiazdki oznaczają statystycznie istotne wartości p jako ** dla p &lt;0,01 oraz *** dla p &lt;0,001. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna różnicowania hiPSC; barwienie 5hmC, 5caC, DAPI; analiza na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza kolokalizacji sygnałów absolutnych 5hmC i 5caC w nieróżnicowanych hiPSC (Undiff) w porównaniu do endodermy wątrobowej 24 godziny po różnicowaniu komórek progenitorowych (HE24). Obrazy z mikroskopii konfokalnej (A) nieróżnicowanych hiPSC oraz (B) komórek HE24 zabarwionych na 5hmC (czerwony), 5caC (zielony) i DAPI (niebieski). Komórki obrazowano przy użyciu obiektywu imersyjnego 63X przy identycznych ustawieniach. 20 zakreślonych jąder ilustruje komórki pobrane do analizy kolokalizacji. Paski skali reprezentują 20 µm. Kanał czerwony: wzmocnienie 800, laser 1%. Kanał zielony: wzmocnienie 750, laser 2,4%. Kanał DAPI: wzmocnienie 750, laser 2,6%. (C) Analiza kolokalizacji obecności sygnału 5caC w zasięgu bliskości 5hmC w komórkach Undiff i HE24 (n = 20, SD). Istotność oceniono za pomocą testu F i testu t dla dwóch prób. Gwiazdki oznaczają statystycznie istotne wartości p < 0,05. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Ogólnym celem tej techniki jest dostarczenie narzędzia obliczeniowego do oceny rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału modyfikacji DNA, wizualizowanych za pomocą barwienia immunologicznego w jądrach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, umożliwiając badanie lokalizacji jądrowej i względnych poziomów modyfikacji DNA w różnych układach modelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że modyfikacje DNA są mierzone za pomocą wielkości sygnału bota, a następnie rozkładu.Jedną z implikacji tej techniki jest to, że ułatwia nam ona zrozumienie potencjalnych funkcjonalnych rzędów modyfikacji DNA w różnych systemach biologicznych. Technika ta ma również dodatkowe zastosowanie w analizie obliczeniowej innych epitopów wykrywalnych za pomocą immunohistochemii. Aby rozpocząć, otwórz pliki w formacie LSM obrazu mikroskopii konfokalnej.Wybierz opcję Przetwarzanie obrazu, a następnie wybierz żądany obraz do analizy. Należy pamiętać, że porównując profile intensywności między próbkami, moc i wzmocnienie lasera muszą być spójne, aby można było dokonać bezpośrednich porównań. Następnie kliknij pokaż wszystko, aby wyświetlić wszystkie kontrolki graficzne, a następnie wybierz kartę grafika i wybierz narzędzie prostokąta, aby wybrać obszar zawierający interesujące jądra.Następnie użyj polecenia wytnij region, aby wyizolować obszar zainteresowania. Teraz zapisz obraz pod nową nazwą i w formacie LSM lub CZI i ponownie otwórz plik w oprogramowaniu Zen Blue. Otwórz biurko ZEN w Zen Blue, a następnie użyj polecenia wyślij do ZEN w Zen Black, aby otworzyć plik w Zen Blue.Następnie aktywuj zakładkę oznaczoną 2.5d, aby umożliwić wizualizację obrazu w 2.5d. Kliknij opcję pokaż wszystko, aby wyświetlić wszystkie kontrolki graficzne i zmienić ustawienia za pomocą czterech szarych pasków. Paski sterują powiększaniem, obracaniem, pochylaniem osi oraz rozszerzaniem i kurczeniem się pasków skali.Wybierz tryb renderowania, aby jak najlepiej zobrazować poszczególne szczyty, a następnie zmień dużą odległość, zmieniając wartość procentową. Im niższa wartość procentowa, tym bardziej zdefiniowany jest każdy pojedynczy szczyt. Teraz przed zapisaniem obrazu 2.5d ukryj listę plików i narzędzia graficzne, klikając szarą strzałkę poniżej wykresu 2.5d.Następnie zapisz wykres jako zrzut ekranu za pomocą print screen na klawiaturze. Otwórz opcję przetwarzania obrazu w oprogramowaniu i otwórz interesujący Cię plik. Następnie wybierz kartę profilu i wybierz kartę pokaż wszystko, aby uzyskać dostęp do wszystkich opcji formatowania.Na karcie profilu wybierz opcję tabeli i przycisk strzałki. Teraz użyj myszki, aby wybrać punkt początkowy i narysuj linię nad ciągłą liczbą komórek, a następnie generowany jest wykres intensywności dla komórek wzdłuż tej linii wraz z tabelą pomiarów intensywności. Zwróć uwagę, że tabela zawiera również odległość, w której intensywność pikseli jest czerwona dla czerwonej i niebieskiej fluorescencji.Jednostka to mikrony. Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, wybierz zapisz tabelę i zapisz ją jako plik tekstowy. Aby zapisać profil intensywności, wybierz opcję eksportu, w wyskakującym oknie przełącz dwie opcje, oznaczony plik obrazu, format i zawartość okna obrazu, pojedyncze okienko, dane.Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zapisać plik. Teraz powtórz ten proces dla każdego potrzebnego profilu intensywności. W oprogramowaniu wybierz przetwarzanie obrazu i wybierz interesujący Cię plik obrazu.Następnie wybierz kartę z etykietą coloc do analizy kolokalizacji i wybierz pozycję pokaż wszystko, aby uzyskać dostęp do wszystkich opcji formatowania. Z czterech zakładek w dolnej połowie ekranu wybierz opcję kolokalizacji, a następnie opcje tabeli i obrazu. Następnie wybierz trzecią ikonę u góry zakładki, oznaczoną wyskakującym tekstem, zamkniętym przed wyjściem.Użyj tego narzędzia, aby okrążyć pojedyncze jądro. Wartości pojawią się następnie w tabeli i zostanie utworzony wykres punktowy dla czerwonej i zielonej fluorescencji. Oś tego wykresu jest ruchoma, co steruje bramkowaniem detekcji.Wszystkie intensywności pikseli w jądrze należy uznać za sygnały dodatnie. Ponieważ poziomy modyfikacji DNA różnią się w całym jądrze, aby uwzględnić słabe sygnały, nie bramkujemy danych. Należy w tym miejscu podkreślić, że dyskusyjne jest, czy wartości tła powinny być uwzględniane w analizie.Co ważne, współczynnik nakładania się jest niezależny od różnic w natężeniu sygnału pomiędzy tymi dwoma kanałami. Natomiast współczynnik korelacji osób zakłada liniową zależność między sygnałami. Teraz powtórz ten proces okrążania jąder, aby uzupełnić zestaw danych.Następnie, aby wyeksportować dane, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę i postępuj zgodnie z opcjami, aby zapisać dane. Aby zapisać obraz kolokacyjny, użyj polecenia eksportu z dwiema opcjami: oznaczony plik obrazu, format i zawartość pojedynczego okienka okna obrazu, dane, a następnie postępuj zgodnie z opcjami, aby zapisać plik. Zbadano rozkład przestrzenny dwóch utlenionych pochodnych pięciu cytozyny metylowej w różnicowaniu przodków haphadycznych, przy użyciu opisanego protokołu.Sygnały czerwony i zielony reprezentują dwie odrębne modyfikacje DNA. Sygnały są dobrze zdefiniowane i w ograniczonym stopniu się pokrywają. Zgodnie z oczekiwaniami, profile dwóch intensywności sygnału i odpowiadającej im komórki nie pokrywają się ze sobą silnie.Wyraźny wzór sugeruje, że zależne od kranu utlenianie pięciu cytozyny metylowej może generować różne utlenione pochodne w określonych regionach chromatyny. Podobne porównanie dwóch modyfikacji DNA przeprowadzono w komórkach rdzeniaka zarodkowego Daoya i w komórkach wyściółczaka BXD. Obie linie komórkowe pochodzą z dziecięcych guzów mózgu.Kwantyfikacja wykazała, że komórki BXD wykazują znacznie niższe poziomy obu sygnałów w porównaniu z komórkami Daoy. Następnie badano kolokalizację utlenionych pochodnych 5MC w niezróżnicowanych hiPSC. W ciągu 24 godzin po indukcji różnicowania endodermy wątrobowej i hiPSC.W tej analizie kolokalizacja sygnału zmieniła się znacząco wraz z indukcją różnicowania, co można przypisać zmniejszonej wielkości pięciu CAC w niezróżnicowanych komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wykresy i profile intensywności 2,5D oraz jak tworzyć dane kolokalizacyjne. Opisane tutaj narzędzia do analizy i wizualizacji obrazu przyczyniają się do badań epigenetycznych, zapewniając stosunkowo szybki sposób porównywania sygnałów różnych modyfikacji DNA w różnych grupach eksperymentalnych.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ważne jest, aby unikać prześwietlenia i używać tych samych ustawień dla różnych grup eksperymentalnych podczas mikroskopii. Pęcherzyki powietrza w uchwycie i niewystarczające zanurzenie mogą powodować miejscową utratę fluorescencji, dlatego kontrola wzrokowa obszaru skanowania ma kluczowe znaczenie.Procedurę można dodatkowo zautomatyzować, segmentując jądra i tworząc obszary zainteresowania za pomocą Zen Blue. Regiony te mogą być importowane do Zen Black, w celu przeprowadzenia analizy kolokalizacji na wielu jądrach.

immunostaining-for-dna-modifications-computational-analysis-confocal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Obecny protokół opisuje metody oceny białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentek. Obejmuje to kompleksowe metody galwanizacji i barwienia, a także szczegółowe, obiektywne procedury kwantyfikacji.

Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.

Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek

Poznaj metodę analizy obliczeniowej obrazów konfokalnych do oceny przestrzennego rozkładu modyfikacji DNA w jądrach komórkowych. Technika ta umożliwia badanie intensywności sygnału i kolokalizacji pochodnych 5-metylocytozyny w badaniach epigenetycznych.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Przeglądaj więcej filmów