Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych
September 7th, 2017
Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.
Ogólnym celem tej techniki jest dostarczenie narzędzia obliczeniowego do oceny rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału modyfikacji DNA, wizualizowanych za pomocą barwienia immunologicznego w jądrach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, umożliwiając badanie lokalizacji jądrowej i względnych poziomów modyfikacji DNA w różnych układach modelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że modyfikacje DNA są mierzone za pomocą wielkości sygnału bota, a następnie rozkładu.
Jedną z implikacji tej techniki jest to, że ułatwia nam ona zrozumienie potencjalnych funkcjonalnych rzędów modyfikacji DNA w różnych systemach biologicznych. Technika ta ma również dodatkowe zastosowanie w analizie obliczeniowej innych epitopów wykrywalnych za pomocą immunohistochemii. Aby rozpocząć, otwórz pliki w formacie LSM obrazu mikroskopii konfokalnej.
Wybierz opcję Przetwarzanie obrazu, a następnie wybierz żądany obraz do analizy. Należy pamiętać, że porównując profile intensywności między próbkami, moc i wzmocnienie lasera muszą być spójne, aby można było dokonać bezpośrednich porównań. Następnie kliknij pokaż wszystko, aby wyświetlić wszystkie kontrolki graficzne, a następnie wybierz kartę grafika i wybierz narzędzie prostokąta, aby wybrać obszar zawierający interesujące jądra.
Następnie użyj polecenia wytnij region, aby wyizolować obszar zainteresowania. Teraz zapisz obraz pod nową nazwą i w formacie LSM lub CZI i ponownie otwórz plik w oprogramowaniu Zen Blue. Otwórz biurko ZEN w Zen Blue, a następnie użyj polecenia wyślij do ZEN w Zen Black, aby otworzyć plik w Zen Blue.
Następnie aktywuj zakładkę oznaczoną 2.5d, aby umożliwić wizualizację obrazu w 2.5d. Kliknij opcję pokaż wszystko, aby wyświetlić wszystkie kontrolki graficzne i zmienić ustawienia za pomocą czterech szarych pasków. Paski sterują powiększaniem, obracaniem, pochylaniem osi oraz rozszerzaniem i kurczeniem się pasków skali.
Wybierz tryb renderowania, aby jak najlepiej zobrazować poszczególne szczyty, a następnie zmień dużą odległość, zmieniając wartość procentową. Im niższa wartość procentowa, tym bardziej zdefiniowany jest każdy pojedynczy szczyt. Teraz przed zapisaniem obrazu 2.5d ukryj listę plików i narzędzia graficzne, klikając szarą strzałkę poniżej wykresu 2.5d.
Następnie zapisz wykres jako zrzut ekranu za pomocą print screen na klawiaturze. Otwórz opcję przetwarzania obrazu w oprogramowaniu i otwórz interesujący Cię plik. Następnie wybierz kartę profilu i wybierz kartę pokaż wszystko, aby uzyskać dostęp do wszystkich opcji formatowania.
Na karcie profilu wybierz opcję tabeli i przycisk strzałki. Teraz użyj myszki, aby wybrać punkt początkowy i narysuj linię nad ciągłą liczbą komórek, a następnie generowany jest wykres intensywności dla komórek wzdłuż tej linii wraz z tabelą pomiarów intensywności. Zwróć uwagę, że tabela zawiera również odległość, w której intensywność pikseli jest czerwona dla czerwonej i niebieskiej fluorescencji.
Jednostka to mikrony. Aby wyeksportować te dane, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, wybierz zapisz tabelę i zapisz ją jako plik tekstowy. Aby zapisać profil intensywności, wybierz opcję eksportu, w wyskakującym oknie przełącz dwie opcje, oznaczony plik obrazu, format i zawartość okna obrazu, pojedyncze okienko, dane.
Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zapisać plik. Teraz powtórz ten proces dla każdego potrzebnego profilu intensywności. W oprogramowaniu wybierz przetwarzanie obrazu i wybierz interesujący Cię plik obrazu.
Następnie wybierz kartę z etykietą coloc do analizy kolokalizacji i wybierz pozycję pokaż wszystko, aby uzyskać dostęp do wszystkich opcji formatowania. Z czterech zakładek w dolnej połowie ekranu wybierz opcję kolokalizacji, a następnie opcje tabeli i obrazu. Następnie wybierz trzecią ikonę u góry zakładki, oznaczoną wyskakującym tekstem, zamkniętym przed wyjściem.
Użyj tego narzędzia, aby okrążyć pojedyncze jądro. Wartości pojawią się następnie w tabeli i zostanie utworzony wykres punktowy dla czerwonej i zielonej fluorescencji. Oś tego wykresu jest ruchoma, co steruje bramkowaniem detekcji.
Wszystkie intensywności pikseli w jądrze należy uznać za sygnały dodatnie. Ponieważ poziomy modyfikacji DNA różnią się w całym jądrze, aby uwzględnić słabe sygnały, nie bramkujemy danych. Należy w tym miejscu podkreślić, że dyskusyjne jest, czy wartości tła powinny być uwzględniane w analizie.
Co ważne, współczynnik nakładania się jest niezależny od różnic w natężeniu sygnału pomiędzy tymi dwoma kanałami. Natomiast współczynnik korelacji osób zakłada liniową zależność między sygnałami. Teraz powtórz ten proces okrążania jąder, aby uzupełnić zestaw danych.
Następnie, aby wyeksportować dane, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę i postępuj zgodnie z opcjami, aby zapisać dane. Aby zapisać obraz kolokacyjny, użyj polecenia eksportu z dwiema opcjami: oznaczony plik obrazu, format i zawartość pojedynczego okienka okna obrazu, dane, a następnie postępuj zgodnie z opcjami, aby zapisać plik. Zbadano rozkład przestrzenny dwóch utlenionych pochodnych pięciu cytozyny metylowej w różnicowaniu przodków haphadycznych, przy użyciu opisanego protokołu.
Sygnały czerwony i zielony reprezentują dwie odrębne modyfikacje DNA. Sygnały są dobrze zdefiniowane i w ograniczonym stopniu się pokrywają. Zgodnie z oczekiwaniami, profile dwóch intensywności sygnału i odpowiadającej im komórki nie pokrywają się ze sobą
silnie.Wyraźny wzór sugeruje, że zależne od kranu utlenianie pięciu cytozyny metylowej może generować różne utlenione pochodne w określonych regionach chromatyny. Podobne porównanie dwóch modyfikacji DNA przeprowadzono w komórkach rdzeniaka zarodkowego Daoya i w komórkach wyściółczaka BXD. Obie linie komórkowe pochodzą z dziecięcych guzów mózgu.
Kwantyfikacja wykazała, że komórki BXD wykazują znacznie niższe poziomy obu sygnałów w porównaniu z komórkami Daoy. Następnie badano kolokalizację utlenionych pochodnych 5MC w niezróżnicowanych hiPSC. W ciągu 24 godzin po indukcji różnicowania endodermy wątrobowej i hiPSC.
W tej analizie kolokalizacja sygnału zmieniła się znacząco wraz z indukcją różnicowania, co można przypisać zmniejszonej wielkości pięciu CAC w niezróżnicowanych komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wykresy i profile intensywności 2,5D oraz jak tworzyć dane kolokalizacyjne. Opisane tutaj narzędzia do analizy i wizualizacji obrazu przyczyniają się do badań epigenetycznych, zapewniając stosunkowo szybki sposób porównywania sygnałów różnych modyfikacji DNA w różnych grupach eksperymentalnych.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ważne jest, aby unikać prześwietlenia i używać tych samych ustawień dla różnych grup eksperymentalnych podczas mikroskopii. Pęcherzyki powietrza w uchwycie i niewystarczające zanurzenie mogą powodować miejscową utratę fluorescencji, dlatego kontrola wzrokowa obszaru skanowania ma kluczowe znaczenie.
Procedurę można dodatkowo zautomatyzować, segmentując jądra i tworząc obszary zainteresowania za pomocą Zen Blue. Regiony te mogą być importowane do Zen Black, w celu przeprowadzenia analizy kolokalizacji na wielu jądrach.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia pół-ilościową metodę wizualizowania nowo odkrytych utlenionych form 5-metylocytozyny (oxi-mC) oraz ich rozmieszczenia przestrzennego w jądrach. Metoda ta pozwala na ocenę intensywności sygnału modyfikacji DNA oraz ich kolokalizacji, co przyczynia się do lepszego zrozumienia ich funkcji w dziedzinie epigenetyki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Epigenetyka
- Modyfikacje DNA
- Techniki immunobarwienia
Tło
- 5-metylocytozyna i jej utlenione pochodne odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- Zrozumienie ich rozmieszczenia przestrzennego może dać wgląd w ich funkcje.
- Istniejące metody mogą nie zapewniać adekwatnej wizualizacji tych modyfikacji.
- To badanie wprowadza narzędzie komputerowe, które poprawia wizualizację i analizę.
Cel badania
- Opracowanie metody oceny rozmieszczenia przestrzennego modyfikacji DNA.
- Analiza intensywności sygnału i kolokalizacji różnych utlenionych pochodnych.
- Ułatwienie zrozumienia funkcji tych modyfikacji w systemach biologicznych.
Zastosowane metody
- Immunobarwienie modyfikacji DNA w jądrach.
- Mikroskopia konfokalna do pozyskiwania obrazów.
- Przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania Zen Blue w celu wizualizowania.
- Analiza kolokalizacji intensywności sygnału.
Główne wyniki
- Obserwowano charakterystyczne wzorce przestrzenne utlenionych pochodnych w różnych typach komórek.
- Analiza kolokalizacji ujawnila istotne zmiany podczas różnicowania.
- Kwantyfikacja wykazała różnice w poziomach sygnału między liniami komórkowymi.
- Metoda wykazała potencjał do szerszych zastosowań w badaniach epigenetycznych.
Wnioski
- Opracowany proces poprawia wizualizację modyfikacji DNA.
- Wyniki sugerują odrębne funkcje różnych utlenionych pochodnych.
- Ta technika może być zastosowana do różnych kontekstów biologicznych dla głębszego wglądu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
