Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
23 października 2017
Badania nad śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem jonizującym (IR) są ważne dla zrozumienia wpływu IR na nowotwory złośliwe i normalne tkanki. Tutaj opisujemy jednoetapowy test do oceny głównych trybów indukowanej przez IR klonogennej śmierci komórek w oparciu o morfologię jąder barwionych dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) uwidocznionych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Ogólnym celem tego testu jest ocena głównych trybów klonogennej śmierci komórek indukowanej promieniowaniem jonizującym w oparciu o charakterystyczne morfologie jąder barwionych DAPI. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii radiacyjnej. Główną zaletą tej szybkiej i ekonomicznej techniki jest to, że główne sposoby klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem jonizującym mogą być oceniane jednocześnie.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w biologii radiacyjnej będą miały trudności z oceną klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem, ponieważ do oceny każdego trybu śmierci komórki wymagane są różne testy. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeprowadziliśmy zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe klonogennej śmierci komórek wywołanej promieniowaniem przy użyciu wielu linii komórkowych i dawek promieniowania. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię promieniowania, może być również stosowana w innych systemach, takich jak chemioterapia raka.
Procedurę zademonstruje nasz współpracownik, Atsushi Shibata. Zacznij od wysterylizowania skalpela ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Następnie za pomocą skalpela umieść szkiełko nakrywkowe w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek.
Do naczynia hodowlanego ze szkiełkiem nakrywkowym dodać jeden mililitr pożywki hodowlanej. Teraz delikatnie przytrzymaj środek szkiełka nakrywkowego sterylnymi kleszkami i całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną z naczynia. Następnie przygotuj trzymililitrową zawiesinę komórek w pożywce hodowlanej w 15-mililitrowej probówce.
Dodaj zawiesinę komórkową do szalki hodowlanej. I inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Upewnij się, że komórki są przymocowane do szkiełka nakrywkowego i są żywe, badając je pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym.
Teraz naświetlić naczynie sześcioma szarymi promieniami rentgenowskimi. Po napromieniowaniu inkubować komórki w inkubatorze przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Teraz wyjmij komórki z inkubatora i odessaj pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego.
Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów około pięciu milimetrów od końca za pomocą nożyczek. I użyj go, aby dodać jeden mililitr roztworu utrwalającego do naczynia hodowlanego. Nałóż roztwór utrwalający wzdłuż ścianek naczynia hodowlanego, aby zminimalizować uszkodzenie komórek.
Następnie przenieś tę szalkę hodowlaną do kwadratowego naczynia hodowlanego i delikatnie nią potrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na szkiełku nakrywkowym. Następnie inkubuj naczynie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór utrwalający z naczynia.
Teraz dodaj dwa mililitry PBS wzdłuż ścianek naczynia. A następnie zassać PBS. Aby przygotować się do barwienia DAPI, dodaj pięć mikrolitrów odczynnika barwiącego DAPI na szklane szkiełko.
Następnie zdejmij szkiełko nakrywkowe z naczynia za pomocą skalpela. I odsączyć nadmiar PBS na szkiełku nakrywkowym, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego ręcznikiem papierowym. Teraz zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli odczynnika barwiącego DAPI na szkiełku podstawowym, tak aby komórki były wystawione na działanie odczynnika barwiącego DAPI.
Na koniec zbadaj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr DAPI. Pokazano morfologie jądrowe w każdym z trzech trybów śmierci komórki. Komórki apoptotyczne mają skondensowane jądra.
Liczne płaty obserwuje się w jądrach komórek ulegających katastrofie mitotycznej. Obserwuje się, że komórki poddawane starzeniu wykazują charakterystyczne ogniska heterochromatyny związane ze starzeniem się. Przedstawiono obserwację porównawczą jąder naświetlanych imitacją i jąder napromieniowanych sześcioma promieniami rentgenowskimi Graya.
Okręgi oznaczają jądra ulegające apoptozie, a strzałki oznaczają jądra ulegające katastrofie mitotycznej. Przedstawiono ocenę około 300 jąder poddanych napromienianiu w porównaniu z makietą. Obserwuje się, że promieniowanie rentgenowskie w sześciu odcieniach grayów powoduje katastrofę mitotyczną częściej w wieku około 25%, a następnie apoptozę w wieku około 5% i bardzo rzadkie zdarzenia starzenia.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie uszkodzić komórek poprzez nałożenie roztworów bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak analiza cytometrii przepływowej lub białka markera śmierci komórki, a także barwienie beta-galaktozydazą związane ze starzeniem się w celu oceny starzenia, aby lepiej zrozumieć każdy tryb klonogennej śmierci komórki.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia jednokrokowy test do oceny głównych mechanizmów klonogennej śmierci komórek indukowanej promieniowaniem jonizującym (IR). Metoda wykorzystuje barwienie DAPI do wizualizacji morfologii jąder komórkowych, dostarczając informacji z zakresu radiobiologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Radiobiologia
- Mechanizmy śmierci komórkowej
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wprowadzenie
- Zrozumienie indukowanej przez promieniowanie IR śmierci klonalnej komórek jest kluczowe dla badań nad rakiem.
- Do oceny każdego trybu śmierci komórkowej zazwyczaj wymagane są różne testy.
- Niniejsza metoda pozwala na jednoczesną ocenę wielu trybów śmierci.
- Może ona być również zastosowana w badaniach nad chemioterapią.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i kosztowo efektywnego testu do oceny śmierci komórek indukowanej przez IR.
- Ułatwienie zrozumienia wpływu promieniowania na guzy złośliwe i tkanki prawidłowe.
- Zapewnienie metody dostępnej dla osób rozpoczynających pracę w dziedzinie radiobiologii.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur komórkowych i napromieniowanie promieniami rentgenowskimi.
- Fiksacja i barwienie jąder DAPI.
- Wizualizacja zabarwionych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Ocena morfologii jąder w celu zidentyfikowania sposobów śmierci komórkowej.
Główne wyniki
- Identyfikacja komórek apoptotycznych z kondensacją jąder.
- Obserwacja katastrofy mitotycznej poprzez obecność jąder wielopłatowych.
- Charakterystyka komórek starzejących się z ogniskami heterochromatyny.
- Analiza ilościowa wykazująca wyższy wskaźnik katastrofy mitotycznej w porównaniu do apoptozy.
Wnioski
- Test ten zapewnia prosty sposób badania klonogennej śmierci komórek.
- Umożliwia on lepsze zrozumienie odpowiedzi komórkowej na promieniowanie jonizujące.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne metody terapeutyczne, takie jak chemioterapia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka, jednoczesna ocena trybów klonogennej śmierci komórek indukowanej promieniowaniem jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka we wczesnych etapach odkrywania leków onkologicznych oraz optymalizacji strategii terapeutycznych. Ten jednostopniowy protokół mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wysokoprzepustową, ilościową ocenę apoptozy, katastrofy mitotycznej oraz starzenia się komórek, co zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad celami i szlakami sygnałowymi. Podejście to usprawnia badania mechanistyczne i dostarcza danych niezbędnych do podejmowania decyzji w zakresie selekcji projektów w radiobiologii i powiązanych modalnościach terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację odrębnych mechanizmów śmierci komórek po napromieniowaniu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie apoptozy, katastrofy mitotycznej i senescencji w ramach jednego schematu pracy.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących zaangażowania celu i modulacji szlaków w modelach onkologicznych.
- Dostarcza praktycznych danych niezbędnych do priorytetyzacji celów i doprecyzowania hipotez terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zstandaryzowany, powtarzalny test do oceny fenotypów śmierci komórkowej w wielu liniach komórkowych i warunkach.
- Generuje dane ilościowe odpowiednie do przesiewania bibliotek związków lub badania odpowiedzi na dawkę promieniowania.
- Zmniejsza złożoność analizy poprzez konsolidację wielu odczytów w ramach jednego protokołu opartego na obrazowaniu.
- Umożliwia skalowalne i kosztowo efektywne przesiewanie funkcjonalnych punktów końcowych śmierci komórkowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje fenotypy śmierci komórek in vitro z biomarkerami translacyjnymi istotnymi dla odpowiedzi na radioterapię.
- Wspiera ciągłość procesu od odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając porównawczą analizę różnych metod leczenia.
- Uzasadnia decyzje dotyczące rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez ilościowe określanie mechanizmów śmierci komórkowej.
- Zapewnia platformę do integracji dodatkowych biomarkerów lub testów funkcjonalnych w zależności od potrzeb.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w obszar wczesnego etapu odkrywania leków, identyfikacji związków wiodących oraz przedklinicznych badań mechanistycznych, umożliwiając płynną integrację z procesami badawczo-rozwojowymi w onkologii.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotezy zerowej i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez bezpośredni pomiar sposobów śmierci komórek po napromieniowaniu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do porównywania warunków traktowania i optymalizacji parametrów testu.
- Analityka: Wspiera analizę statystyczną częstości śmierci komórek, umożliwiając rzetelne porównania między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne odkrycia in vitro ze strategiami przedklinicznymi w zakresie biomarkerów, w przypadku korelacji z analizami końcowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę dla różnych linii komórkowych, metod traktowania oraz badań mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w analizie szlaków śmierci komórek.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje procesy badawcze poprzez standaryzację testów, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów dzięki wyjaśnieniu mechanizmów śmierci komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów onkologicznych w oparciu o dane mechanistyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikroskopii fluorescencyjnej i interpretacji morfologii jąder komórkowych.
- Wymaga dostępu do sprzętu do napromieniowania oraz infrastruktury obrazowania kompatybilnej z DAPI.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej oceny fenotypów śmierci komórek.
- Można dostosować do różnych linii komórkowych i schematów terapeutycznych poprzez optymalizację protokołu.
- Może wymagać uzupełniających analiz w celu głębszej walidacji mechanistycznej lub biomarkerów.
