Name: Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj jednoetapową metodę oceny klonogennej śmierci komórek wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu barwienia DAPI i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia jednoczesną identyfikację apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Akiko Shibata za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii na programy dla wiodących szkół podyplomowych, kultywujących światowych liderów w terapii ciężkimi jonami i inżynierii.

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe w autoklawie.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w szklanej zlewce.</li>
		<li>Przykryj szklaną zlewkę folią.</li>
		<li>Autoklaw w temperaturze 121 °C przy ciśnieniu 15 psi przez 20 min.</li>
		<li>Suszyć w temperaturze 50 °C. Przechowywać w temperaturze pokojowej w okapie hodowlanym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór utrwalający: 3% paraformaldehydu + 2% sacharozy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
	<ol>
		<li>Do szklanej butelki o pojemności 1 000 ml dodaj 700 ml PBS i 30 g paraformaldehydu. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest, należy nosić odpowiednie rękawice.</li>
		<li>Całkowicie rozpuść paraformaldehyd, ogrzewając go do temperatury 80 °C za pomocą kuchenki mikrofalowej. 
		UWAGA: Opary paraformaldehydu są toksyczne, nosić maskę.</li>
		<li>Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 20 g sacharozy.</li>
		<li>Dodaj PBS, aby całkowita objętość wynosiła 1 l.</li>
		<li>Podwielokrotność w probówkach o pojemności 50 ml. Roztwór utrwalający może być przechowywany przez 3 lata w temperaturze -20 °C lub przez 3 miesiące w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli komórkowej
UWAGA: Te procedury powinny być wykonywane w kapturze hodowlanym.
<ol>
	<li>Hodowla i pasaż komórek ludzkiego kostniakomięsaka U2OS w celu utrzymania wzrostu logarytmicznego5. 
	UWAGA: Inne typy komórek mogą być używane po ustaleniu optymalnej dawki napromieniania.</li>
	<li>Przetrzyj skalpel ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Za pomocą skalpela umieścić szkiełko nakrywkowe na szalce do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm (zwanej dalej po prostu "szalką"). 
	UWAGA: Liczba szkiełek nakrywkowych w jednym naczyniu może być zwiększona zgodnie z planem eksperymentalnym (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej: DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą. 
	UWAGA: W zależności od wybranego typu ogniwa można używać innych nośników.</li>
	<li>Wytrzyj kleszcze ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Za pomocą kleszczy delikatnie przytrzymaj środek szkiełka nakrywkowego. Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną z naczynia, trzymając się szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA: Ten krok sprzyja unieruchomieniu szkiełka nakrywkowego na naczyniu.</li>
	<li>Odłącz przylegające hodowane komórki za pomocą trypsin5.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia.</li>
		<li>Dodaj 1 ml PBS i delikatnie wstrząśnij naczyniem.</li>
		<li>Odessać PBS z naczynia.</li>
		<li>Dodaj 1 ml trypsyny [0,25 w/v% Trypsyna-1mmol/L EDTA] do naczynia.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
		<li>Dodaj 9 ml pożywki hodowlanej do naczynia.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl przygotować zawiesinę jednokomórkową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki5.
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 0,9 ml zawiesiny komórek i 0,1 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
		<li>Nanieść 10 μl na hemocytometr.</li>
		<li>Zbadaj liczbę niebarwionych (tj. żywych) komórek pod mikroskopem z odwróconymi fazami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W probówce o pojemności 15 ml przygotować zawiesinę komórek o objętości 3 ml w pożywce hodowlanej o gęstości 0,5 x 105 komórek/mL. 
	UWAGA: Gęstość komórek może być modyfikowana zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Delikatnie dodaj 2 ml zawiesiny komórkowej do naczynia.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Napromieniowanie
UWAGA: Z promiennikiem rentgenowskim należy obchodzić się ostrożnie, zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Zbadaj komórki pod mikroskopem z odwróconymi fazami. Upewnij się, że komórki są przymocowane do szkiełka nakrywkowego i są żywe.</li>
	<li>Naświetlić czaszę promieniami rentgenowskimi 6 Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5%CO2, 
	UWAGA: Czas inkubacji może być modyfikowany zgodnie z planem eksperymentalnym (patrz Dyskusja).</li>
</ol>
4. Fiksacja
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl w odległości 5 mm od końca. 
	UWAGA: Wycięta końcówka pomaga płynnie nałożyć roztwór utrwalający.</li>
	<li>Za pomocą odciętej końcówki dodaj 1 ml roztworu utrwalającego (przygotowanego w kroku 1.2) do naczynia z bocznej ścianki naczynia. 
	UWAGA: Ten krok jest zależny od czasu i dlatego powinien być wykonywany bez wymiany końcówek mikropipet w przypadku pracy z wieloma próbkami. Nałożenie roztworu utrwalającego bezpośrednio na dno naczynia może uszkodzić komórki.</li>
	<li>Umieść naczynie w kwadratowym naczyniu do hodowli. Delikatnie potrząśnij kwadratowym naczyniem hodowlanym, aby równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór utrwalający z naczynia.</li>
	<li>Dodaj 2 ml PBS do naczynia z bocznej ścianki naczynia. 
	UWAGA: Nałożenie PBS bezpośrednio na dno naczynia może uszkodzić komórki.</li>
	<li>Odessać PBS z naczynia.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7 i 4.8 dwa razy. 
	UWAGA: Naczynie można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C z szkiełkami nakrywkowymi zanurzonymi w 2 ml PBS.</li>
</ol>
5. Barwienie DAPI
<ol>
	<li>Na szkiełko szkiełkowe nanieść 5 μl 1 μg/ml odczynnika barwiącego DAPI. 
	UWAGA: Odczynnik do barwienia DAPI jest stabilny przez 6 miesięcy, jeśli jest przechowywany w sposób chroniony przed światłem w temperaturze -20 °C lub niższej.</li>
	<li>Za pomocą skalpela usuń szkiełko nakrywkowe z naczynia.</li>
	<li>Odrysuj nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli odczynnika barwiącego DAPI na szkle szkiełkowym, tak aby komórki były wystawione na działanie odczynnika barwiącego DAPI. 
	UWAGA: Ten krok jest zależny od czasu. Wysuszenie odczynnika barwiącego DAPI może prowadzić do nieoptymalnego barwienia.</li>
	<li>Próbki można przechowywać przez 1 rok w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Zbadaj próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jądra są wizualizowane za pomocą filtra DAPI. 
	UWAGA: Można użyć obiektywu olejowego 20X lub 60X, w zależności od zainteresowania badacza. W przypadku korzystania z soczewki olejowej 60X dodaj jedną kroplę oleju na szkiełko nakrywkowe. Uważaj, aby próbki nie dotykały obiektywu; W przeciwnym razie soczewka może zostać uszkodzona.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów jąder za pomocą kamery CCD i oprogramowania do akwizycji obrazów cyfrowych z następującymi ustawieniami i parametrami: filtr DAPI, obrazy jednowarstwowe, wzmocnienie 1X i automatyczna ekspozycja.</li>
	<li>Zakończ akwizycję obrazu: Wytrzyj obiektyw 20X ręcznikami papierowymi zwilżonymi środkiem do czyszczenia obiektywów. Wytrzyj soczewkę olejową 60X ręcznikami papierowymi zwilżonymi chloroformem.</li>
</ol>
7. Ocena trybu klonogennej śmierci komórki
<ol>
	<li>Na losowo wybranych obrazach policz liczbę jąder, które spełniają kryteria apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek, aż całkowita liczba zliczonych jąder osiągnie 300. Wykonaj ten krok w trzech egzemplarzach dla każdego ustawienia eksperymentalnego.
	<ol>
		<li>Kryteria apoptozy: obecność ciał apoptotycznych (tj. skondensowanych i rozdrobnionych jąder)6,7.</li>
		<li>Kryteria katastrofy mitotycznej: obecność jąder wykazujących dwa lub więcej odrębnych płatów lub mikrojąder8,9,10.</li>
		<li>Kryteria starzenia się komórek: obecność ognisk heterochromatycznych związanych ze starzeniem się (SAHF) (tj. jądrowego DNA zawierającego 30-50 jasnych, gęstych ognisk)2,11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588(2017).</li>
<li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121(2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li>
<li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li>
<li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C646%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+histone+acetyltransferase+p300%2C+radiosensitizes+lung+cancer+cells+by+enhancing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe.</a> Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+lethality-based+strategy+to+treat+cancers+harboring+a+genetic+deficiency+in+the+chromatin+remodeling+factor+BRG1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1.</a> Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).</li>
<li>Russo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+E7016%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li>
<li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+through+a+tragedy%3A+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li>
<li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+%CE%B3H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950(2016).</li>
<li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity%3A+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Per.+Med%22%5BJournal%5D)">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Krytyczne kroki w ramach protokołu są następujące. Po pierwsze, komórki powinny być hodowane na szalce hodowlanej jako monowarstwa, ponieważ przeprowadzenie oceny morfologicznej jąder barwionych DAPI jest trudne dla komórek wielowarstwowych. W tym celu w kroku 2.9 zaleca się ostrożne przeniesienie szalki hodowlanej do inkubatora; Potrząsanie szalką hodowlaną generuje wir zawieszonych komórek, który prowadzi do koncentracji komórek w środku szalki hodowlanej. Ponadto należy unikać nadmiernej konfluencji prowadzącej do powstawania komórek wielowarstwowych. W tym celu, w kroku 2.7, liczba komórek wysianych na szalce hodowlanej może być modyfikowana w oparciu o czas podwojenia populacji i odstęp czasu między napromienianiem a utrwalaniem. Zalecana jest zbieżność około 80 w momencie utrwalenia. Po drugie, szybkość jest ważna w utrwalaniu i barwieniu DAPI (tj. kroki 4 i 5). Niespójność między próbkami w odniesieniu do czasu potrzebnego na te etapy może prowadzić do niejednorodności intensywności sygnału DAPI w jądrach, co zaciemniłoby ocenę morfologiczną.
W kroku 2.2 można zwiększyć liczbę szkiełek nakrywkowych w pojedynczym naczyniu hodowlanym; W naczyniu o średnicy 35 mm można umieścić maksymalnie cztery szkiełka nakrywkowe, a ich liczbę można dodatkowo zwiększyć za pomocą większych naczyń. Umieszczenie wielu szkiełek nakrywkowych w każdej naczyniu hodowlanej umożliwia efektywną ocenę przebiegu w czasie dla danego zabiegu (tj. szkiełka nakrywkowe mogą być pobierane z szalki hodowlanej jeden po drugim w wielu interesujących punktach czasowych).
W kroku 3.2 dawka napromieniowania może być modyfikowana w zależności od zainteresowania badaczy. Zastosowanie stałej dawki do wielu linii komórkowych umożliwia porównanie wrażliwości na każdy tryb klonogennej śmierci komórki wśród linii komórkowych. Z drugiej strony, zastosowanie izoklonogennych dawek przeżycia dla każdej linii komórkowej umożliwia porównanie klonogennych profili śmierci komórkowej między liniami komórkowymi. Izoklonogenną dawkę przeżycia można określić za pomocą testu przeżycia klonogennego12. Wartość D10 , dawka zapewniająca 10% przeżycia klonogennego, jest częstym punktem końcowym dla dawki przeżycia izoklonogennej.
W kroku 3.3 czas od napromieniania do utrwalenia może być modyfikowany w zależności od zainteresowania badaczy; Jest to ważne, ponieważ szczytowy czas apoptozy wywołanej przez podczerwień, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek różni się w zależności od linii komórkowej i leczenia. W tym artykule użyliśmy 72 godzin po napromieniowaniu jako punktu czasowego, który byłby najbardziej przydatny do wstępnego badania przesiewowego profili śmierci komórki klonogennej, w oparciu o wiele badań przeprowadzonych przez naszą grupę i innych opisanych w następujący sposób: 1,2,3,4,8,9: (i) Apoptoza wywołana promieniowaniem rentgenowskim w komórkach powstałych z guzów litych występuje najczęściej kilka dni po napromieniowaniu. (ii) Katastrofa mitotyczna wywołana promieniowaniem rentgenowskim w komórkach nowotworowych występuje najbardziej widocznie podczas drugiej lub trzeciej mitozy po uwolnieniu z tymczasowego zatrzymania cyklu komórkowego wywołanego napromieniowaniem. Uwolnienie następuje zwykle około 24 godziny po napromieniowaniu, po czym następują powtarzające się mitozy w odstępach około 24 godzin. (iii) Starzenie się komórek wywołane promieniowaniem rentgenowskim staje się widoczne po przerwie zależnej od danej linii komórkowej: 2 dni po napromieniowaniu dla niektórych wczesnych przypadków i 7 dni po napromieniowaniu dla większości linii komórkowych. Po uzyskaniu ogólnego obrazu profili śmierci komórki klonogennej na podstawie wstępnego badania przesiewowego, eksperymenty w czasie dostarczą bardziej szczegółowego wyjaśnienia czasu szczytu dla każdego trybu klonogennej śmierci komórki w określonej linii komórkowej i/lub stanie będącym przedmiotem zainteresowania4.
Należy zauważyć, że test barwienia DAPI i test przeżycia klonogennego, złota metoda oceny wrażliwości na promieniowanie, nie są wymienne. Apoptoza i katastrofa mitotyczna trwają tylko przez wiele godzin. W ten sposób test barwienia DAPI dla danego punktu czasowego wykrywa apoptozę i katastrofę mitotyczną, która występuje w momencie oceny. Z drugiej strony, wyniki testu przeżycia klonogennego w danym punkcie czasowym obejmują całkowitą ilość apoptozy i katastrofy mitotycznej, które wystąpiły w okresie inkubacji przez zwykle 10 - 14 dni po napromieniowaniu. W odróżnieniu od apoptozy i katastrofy mitotycznej, komórki starcze pozostają na szalce hodowlanej; Gromadzą się one stopniowo w czasie po napromieniowaniu. W związku z tym wyniki zarówno testu barwienia DAPI, jak i testu przeżycia klonogennego odzwierciedlają całkowitą ilość starzenia się, które wystąpiło w okresie inkubacji. Co ważne, proporcje apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się wywołanego napromieniowaniem różnią się znacznie w zależności od linii komórkowej i dawki napromieniowania. Teoretycznie wyniki jednego testu nie mogą być bezpośrednio przełożone na wyniki drugiego testu.
Test barwienia DAPI ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, pozostaje kwestią sporną, czy katastrofa mitotyczna jest odrębnym sposobem śmierci komórki. W dziedzinie biologii radiacyjnej katastrofa mitotyczna jest uważana za główny sposób śmierci komórki wywołanej podczerwienią, który różni się od innych mechanizmów klonogennej śmierci komórki1. Z drugiej strony inni twierdzą, że katastrofa mitotyczna nie jest odrębnym sposobem śmierci komórki, ale raczej procesem, który poprzedza śmierć komórki, w tym apoptozą i nekrozą13,14. Tak więc apoptoza i katastrofa mitotyczna mogą się w pewnym stopniu pokrywać. Po drugie, wcześniejsze badania sugerują, że starzenie się komórek może wystąpić przy braku SAHF w niektórych liniach komórkowych i warunkach leczenia2. Obecnie należy stosować inne testy zaprojektowane specjalnie dla każdego trybu klonogennej śmierci komórki, aby zwiększyć solidność wniosków z danego eksperymentu. Po trzecie, test barwienia DAPI nie może ocenić sposobów klonogennej śmierci komórki innych niż apoptoza, katastrofa mitotyczna i starzenie się komórek (np. martwica i autofagia). Po czwarte, użyteczność testu barwienia DAPI jako predyktora odpowiedzi guza na radioterapię nie została wyjaśniona w klinice. Z tego punktu widzenia test przeżycia klonogennego, który ocenia całkowitą ilość śmierci komórki klonogennej, jest lepszy niż test barwienia DAPI, ponieważ ustalono korelację między SF2, przeżywającą frakcją komórek napromieniowanych promieniami rentgenowskimi 2 Gy, a odpowiedzią guza na radioterapię15. Niemniej jednak warto zauważyć, że test przeżycia klonogennego nie jest szeroko stosowany w klinice, głównie ze względu na wymóg wysokiego stopnia wiedzy specjalistycznej i długiego okresu czasu (tj. 14 dni) na pozyskanie danych. Dla porównania, procedura barwienia DAPI jest prostsza i zajmuje znacznie mniej czasu, około 3-4 dni, aby uzyskać wyniki. Przydatność testu barwienia DAPI jako predyktora odpowiedzi guza na radioterapię zostanie przetestowana w klinice w najbliższej przyszłości.
Podsumowując, test barwienia DAPI jest opłacalnym jednoetapowym testem do jednoczesnej oceny trzech głównych trybów klonogennej śmierci komórki wywołanej przez podczerwień. Takie podejście pozwala na łatwe badanie przesiewowe trybów klonogennej śmierci komórki dla różnych linii komórkowych, ustawień leczenia i punktów czasowych, w celu wyjaśnienia mechanizmów śmierci komórki w komórkach docelowych i warunków będących przedmiotem zainteresowania.

Promieniowanie jonizujące (IR) indukuje wiele rodzajów klonogennej śmierci komórki. Badania nad klonogenną śmiercią komórek wywołaną przez IR są ważne dla zrozumienia toksyczności IR dla normalnych tkanek, a także dla opracowania metod zwiększających skuteczność leczenia radioterapii nowotworów. Apoptoza, katastrofa mitotyczna i starzenie się komórek są głównymi sposobami klonogennej śmierci komórki indukowanej przez IR1. Apoptoza to regulowany tryb śmierci komórki, który jest inicjowany przez uszkodzenie DNA1. Katastrofa mitotyczna to śmierć komórki, która następuje z powodu nieprawidłowej mitozy wynikającej z nienaprawionych pęknięć dwuniciowych DNA1. Starzenie się komórek definiuje się jako stan nieodwracalnego zatrzymania wzrostu komórek2; Należy zauważyć, że starzenie się komórek nie jest śmiercią komórki per se, ale jest sposobem klonogennej śmierci komórki, ponieważ znosi klonogenne przeżycie komórki starczej.
Różne testy komórkowe zostały opracowane do indywidualnej oceny apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek. Apoptozę można ocenić za pomocą końcowego barwienia deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), barwienia aneksyny V, testów fragmentacji DNA i oznaczania fazy cyklu komórkowego sub-G1 za pomocą cytometrii przepływowej1. Katastrofę mitotyczną można ocenić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla markerów mitotycznych, w tym MPM2, barwienia TUNEL i mikroskopii elektronowej1. Starzenie się komórek można ocenić za pomocą barwienia związanego ze starzeniem β-galaktozydazy (SA-β-Gal), testów zatrzymania wzrostu i mikroskopii elektronowej1. Co ważne, dominujący tryb klonogennej śmierci komórki różni się w zależności od linii komórkowych i ustawień leczenia3,4. Dlatego, aby wyjaśnić ogólny profil klonogennej śmierci komórek dla danego środowiska eksperymentalnego, należy przeprowadzić wiele testów obejmujących wszystkie te tryby śmierci razem, co jest pracochłonne i kosztowne.
W tym artykule opisujemy szybki i opłacalny, jednoetapowy test do jednoczesnej oceny apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek wywołanego przez IR3,4. W tej metodzie komórki hodowane na szkiełku nakrywkowym są naświetlane promieniami rentgenowskimi i barwione dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej apoptoza, katastrofa mitotyczna i starzenie się komórek są identyfikowane na podstawie odpowiednich charakterystycznych morfologii jąder barwionych DAPI. Podejście to będzie przydatne w zastosowaniach, w tym w badaniach przesiewowych pod kątem klonogennych profili śmierci komórek w różnych liniach komórkowych, ustawieniach leczenia i punktach czasowych, w celu zbadania mechanizmów śmierci komórki w komórkach docelowych i warunkach będących przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>szkiełko nakrywkowe</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>skalpel</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>trypsyna</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr> mikroskop z <tr><td>odwróconymi fazami</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>promiennik rentgenowski</td><td>Faxitron Bioptics</td> Kwadratowe naczynie hodowlane <td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>Szkło szkiełkowe</td><td></td><td></td> Odczynnik do barwienia DAPI Matsunami Pro-11 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cell Signaling</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>8961S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>fluorescencyjny Filtr DAPI</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>soczewka mikroskopu fluorescencyjnego (20 razy;)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw mikroskopu fluorescencyjnego (60& razy;, olej)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 60X/1.40 olej</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr> Aparat CCD Oprogramowanie do <tr><td>cyfrowej akwizycji obrazu</td><td></td> Nikon <td>DS-Qi2</td> Nikon NIS-Elements Środek do czyszczenia obiektywów dokumentów <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

Badania nad śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem jonizującym (IR) są ważne dla zrozumienia wpływu IR na nowotwory złośliwe i normalne tkanki. W tym miejscu opisujemy szybki i opłacalny jednoetapowy test do jednoczesnej oceny głównych trybów klonogennej śmierci komórki indukowanej przez IR, tj. apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek. W tej metodzie komórki hodowane na szkiełku nakrywkowym są naświetlane promieniami rentgenowskimi i barwione dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej identyfikuje się apoptozę, katastrofę mitotyczną i starzenie się komórek na podstawie charakterystycznych morfologii jąder barwionych DAPI. Apoptoza jest determinowana przez obecność ciał apoptotycznych (tj. skondensowanych i rozdrobnionych jąder). Katastrofa mitotyczna jest określana przez obecność jąder, które wykazują dwa lub więcej odrębnych płatów i mikrojąder. Starzenie się komórek zależy od obecności ognisk heterochromatycznych związanych ze starzeniem się (tj. jądrowego DNA zawierającego 30-50 jasnych, gęstych ognisk). Takie podejście pozwala eksperymentatorowi na łatwe badanie przesiewowe pod kątem klonogennych trybów śmierci komórki przy użyciu różnych linii komórkowych, ustawień leczenia i / lub punktów czasowych, w celu wyjaśnienia mechanizmów śmierci komórki w komórkach docelowych i warunków będących przedmiotem zainteresowania.

Jako przykład, ludzkie komórki osteosarkoma U2OS poddano działaniu promieniowania rentgenowskiego o dawce 6 Gy, inkubowano przez 72 h, a następnie przeprowadzono analizę barwienia DAPI zgodnie z protokołem. Rysunek 1 przedstawia powiększone obrazy typowych morfologii jąder związanych z apoptozą, katastrofą mitotyczną i starzeniem się komórek, uzyskane przy użyciu obiektywu olejowego 60×. Charakterystyczne morfologie dla każdego trybu klonogennej śmierci komórek opisano w krokach 7.1.1-7.1.3. Rysunek 2 przedstawia obrazy ogólne jąder uzyskane przy użyciu obiektywu 20X. Naświetlanie promieniami rentgenowskimi w dawce 6 Gy często indukowało katastrofę mitotyczną, rzadziej apoptozę, a najrzadziej starzenie się komórek. W ten sposób badanie w polu o małym powiększeniu pozwala na szybką ocenę ogólnego profilu klonogennej śmierci komórek w danym układzie eksperymentalnym. Rysunek 3 przedstawia graficzną reprezentację ilościowych danych.
<img alt="Skutki komórkowe: apoptoza, katastrofa mitotyczna, starzenie się; obrazy mikroskopowe; zmiany w jądrach komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Powiększone obrazy jąder barwionych DAPI przedstawiające typową morfologię apoptozy, katastrofy mitotycznej oraz starzenia komórkowego. Komórki U2OS naświetcono promieniami rentgenowskimi z dawką 6 Gy. Po 72 h komórki utrwalono i wybarwiono DAPI. Obrazy jąder komórkowych uzyskano przy użyciu obiektywu olejowego 60X. Pasek skali = 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Odpowiedź komórkowa na promieniowanie; obraz mikroskopowy, komórki przy 0 Gy vs 6 Gy, wskaźniki uszkodzeń DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Obrazy przekrojowe jąder komórkowych barwionych DAPI w komórkach poddanych napromieniowaniu promieniami rentgenowskimi. Komórki U2OS poddano naświetlaniu promieniami rentgenowskimi w dawce 6 Gy lub naświetlaniu pozornemu. Po 72 h komórki utrwalono i zabarwiono DAPI. Obrazy jąder komórkowych zarejestrowano przy użyciu obiektywu 20X. Okręgi – apoptoza; strzałki – katastrofa mitotyczna. Pasek skali = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy zależności odpowiedzi od dawki promieniowania; procent przeżywalności komórek przy dawkach 0 Gy i 6 Gy; analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilościowe dane dotyczące apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia komórkowego indukowanych w komórkach poddanych napromieniowaniu promieniami rentgenowskimi. Komórki U2OS poddano napromieniowaniu promieniami rentgenowskimi w dawce 6 Gy lub poddano procedurze pozornej. Po 72 h komórki utrwalono i zabarwiono DAPI. Obrazy jąder komórkowych wykonano przy użyciu obiektywu 20X. W losowo wybranych polach oceniono łącznie 30 jąder pod kątem apoptozy (Ap), katastrofy mitotycznej (MC) i starzenia komórkowego (Sns). Pomiary przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Przedstawiono wartości średnie, a słupki błędu wskazują odchylenia standardowe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Badania nad śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem jonizującym (IR) są ważne dla zrozumienia wpływu IR na nowotwory złośliwe i normalne tkanki. Tutaj opisujemy jednoetapowy test do oceny głównych trybów indukowanej przez IR klonogennej śmierci komórek w oparciu o morfologię jąder barwionych dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) uwidocznionych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

Ogólnym celem tego testu jest ocena głównych trybów klonogennej śmierci komórek indukowanej promieniowaniem jonizującym w oparciu o charakterystyczne morfologie jąder barwionych DAPI. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii radiacyjnej. Główną zaletą tej szybkiej i ekonomicznej techniki jest to, że główne sposoby klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem jonizującym mogą być oceniane jednocześnie.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w biologii radiacyjnej będą miały trudności z oceną klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem, ponieważ do oceny każdego trybu śmierci komórki wymagane są różne testy. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeprowadziliśmy zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe klonogennej śmierci komórek wywołanej promieniowaniem przy użyciu wielu linii komórkowych i dawek promieniowania. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię promieniowania, może być również stosowana w innych systemach, takich jak chemioterapia raka.Procedurę zademonstruje nasz współpracownik, Atsushi Shibata. Zacznij od wysterylizowania skalpela ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Następnie za pomocą skalpela umieść szkiełko nakrywkowe w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek.Do naczynia hodowlanego ze szkiełkiem nakrywkowym dodać jeden mililitr pożywki hodowlanej. Teraz delikatnie przytrzymaj środek szkiełka nakrywkowego sterylnymi kleszkami i całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną z naczynia. Następnie przygotuj trzymililitrową zawiesinę komórek w pożywce hodowlanej w 15-mililitrowej probówce.Dodaj zawiesinę komórkową do szalki hodowlanej. I inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Upewnij się, że komórki są przymocowane do szkiełka nakrywkowego i są żywe, badając je pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym.Teraz naświetlić naczynie sześcioma szarymi promieniami rentgenowskimi. Po napromieniowaniu inkubować komórki w inkubatorze przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Teraz wyjmij komórki z inkubatora i odessaj pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego.Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów około pięciu milimetrów od końca za pomocą nożyczek. I użyj go, aby dodać jeden mililitr roztworu utrwalającego do naczynia hodowlanego. Nałóż roztwór utrwalający wzdłuż ścianek naczynia hodowlanego, aby zminimalizować uszkodzenie komórek.Następnie przenieś tę szalkę hodowlaną do kwadratowego naczynia hodowlanego i delikatnie nią potrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na szkiełku nakrywkowym. Następnie inkubuj naczynie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór utrwalający z naczynia.Teraz dodaj dwa mililitry PBS wzdłuż ścianek naczynia. A następnie zassać PBS. Aby przygotować się do barwienia DAPI, dodaj pięć mikrolitrów odczynnika barwiącego DAPI na szklane szkiełko.Następnie zdejmij szkiełko nakrywkowe z naczynia za pomocą skalpela. I odsączyć nadmiar PBS na szkiełku nakrywkowym, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego ręcznikiem papierowym. Teraz zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli odczynnika barwiącego DAPI na szkiełku podstawowym, tak aby komórki były wystawione na działanie odczynnika barwiącego DAPI.Na koniec zbadaj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr DAPI. Pokazano morfologie jądrowe w każdym z trzech trybów śmierci komórki. Komórki apoptotyczne mają skondensowane jądra.Liczne płaty obserwuje się w jądrach komórek ulegających katastrofie mitotycznej. Obserwuje się, że komórki poddawane starzeniu wykazują charakterystyczne ogniska heterochromatyny związane ze starzeniem się. Przedstawiono obserwację porównawczą jąder naświetlanych imitacją i jąder napromieniowanych sześcioma promieniami rentgenowskimi Graya.Okręgi oznaczają jądra ulegające apoptozie, a strzałki oznaczają jądra ulegające katastrofie mitotycznej. Przedstawiono ocenę około 300 jąder poddanych napromienianiu w porównaniu z makietą. Obserwuje się, że promieniowanie rentgenowskie w sześciu odcieniach grayów powoduje katastrofę mitotyczną częściej w wieku około 25%, a następnie apoptozę w wieku około 5% i bardzo rzadkie zdarzenia starzenia.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie uszkodzić komórek poprzez nałożenie roztworów bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak analiza cytometrii przepływowej lub białka markera śmierci komórki, a także barwienie beta-galaktozydazą związane ze starzeniem się w celu oceny starzenia, aby lepiej zrozumieć każdy tryb klonogennej śmierci komórki.

one-step-protocol-for-evaluation-mode-radiation-induced-clonogenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Test klonogenny: komórki adherentne

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Ten film demonstruje metodologię badania głównych profili śmierci komórek w liniach komórek nowotworowych wywołanych promieniowaniem jonizującym (IR) za pomocą testu barwienia DAPI. Jądra barwione DAPI komórek docelowych przechodzących śmierć komórkową wykazują odrębną morfologię i można je łatwo zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Badania przesiewowe śmierci komórki za pomocą barwienia DAPI: metoda szybkiego badania przesiewowego klonogennej śmierci komórek wywołanej podczerwienią w liniach komórek nowotworowych

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół zastosowania rodaminy 123 do identyfikacji potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i badania indukowanej przez CLIC4 apoptozy komórek HN4 in vitro. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym laserowym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym zarejestrowano zmianę MMP w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Poznaj jednoetapową metodę oceny klonogennej śmierci komórek wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu barwienia DAPI i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia jednoczesną identyfikację apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek.

Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów