Badania przesiewowe śmierci komórki za pomocą barwienia DAPI: metoda szybkiego badania przesiewowego klonogennej śmierci komórek wywołanej podczerwienią w liniach komórek nowotworowych

Narażenie na promieniowanie jonizujące, takie jak promieniowanie rentgenowskie, może spowodować uszkodzenie DNA, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki. Aby przebadać wpływ promieniowania jonizującego na profile śmierci komórki, zacznij od pobrania szalki hodowlanej zawierającej przylegające komórki rakowe umieszczonej na powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Napromieniować szalkę hodowlaną promieniami rentgenowskimi przez żądany czas. Zabieg ten powoduje uszkodzenie DNA wewnątrz komórek. Następnie odessać zużytą pożywkę z naczynia hodowlanego i dodać odpowiedni utrwalacz. Roztwór ten przenika do komórek i blokuje składniki komórkowe na miejscu podczas kolejnych etapów barwienia.

Wyrzucić roztwór utrwalający. Usunąć szkiełko nakrywkowe zawierające komórki poddane działaniu promieniowania rentgenowskiego z naczynia hodowlanego. Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na powierzchni szkiełka podstawowego, nakładając na nie kroplę barwnika DAPI tak, aby komórki miały bezpośredni kontakt z DAPI.

Cząsteczki DAPI dostają się do jąder i wiążą się z miejscami DNA bogatymi w A-T. Teraz zwizualizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jądra są niebieskie i wykazują wyraźną morfologię.

Komórki wykazujące skondensowane i rozdrobnione jądra wskazują na apoptozę, zaprogramowaną śmierć komórki. Inne z jądrami wielopłatkowymi reprezentują, że komórki doświadczają katastrofy mitotycznej. Te ze spłaszczonymi jądrami wykazującymi wiele jasnych punktów sugerują komórki ulegające starzeniu.

Pobrać komórki z inkubatora i odessać pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego. Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 1,000 mikrolitrów około 5 milimetrów od końca za pomocą nożyczek i użyj jej, aby dodać 1 mililitr roztworu utrwalającego do naczynia hodowlanego.

Nałóż roztwór utrwalający wzdłuż ścianek naczynia hodowlanego, aby zminimalizować uszkodzenie komórek. Następnie przenieś tę szalkę hodowlaną do kwadratowego naczynia hodowlanego i delikatnie nią potrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na szkiełku nakrywkowym. Następnie inkubuj naczynie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Odessać roztwór utrwalający z naczynia. Teraz dodaj 2 mililitry PBS wzdłuż ścianek naczynia, a następnie odessaj PBS. Aby przygotować się do barwienia DAPI, dodaj 5 mikrolitrów odczynnika barwiącego DAPI na szklane szkiełko. Następnie usuń szkiełko nakrywkowe z naczynia za pomocą skalpela i odsącz nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego ręcznikiem papierowym.

Teraz zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli odczynnika barwiącego DAPI na szkiełku podstawowym, tak aby komórki były wystawione na działanie odczynnika barwiącego DAPI. Na koniec zbadaj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr DAPI.