Name: Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego knockdownu ekspresji genów i pomiar efektów knockdown na śmierć komórki wywołaną przez E4orf4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Poznaj protokół warunkowego knockdownu genów Acf1 i SNF2h przy użyciu indukowalnego shRNA w liniach komórkowych ssaków. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników remodelujących chromatynę na śmierć komórek indukowaną przez białko E4orf4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana (w części) przez THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant 399/11), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach niemiecko-izraelskiej współpracy projektowej (DIP) oraz Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences.

1. Generowanie indukowalnych linii komórkowych
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyznaczyć minimalne stężenie leku G418, które zabija wszystkie komórki wykorzystywane do przygotowania pożądanych linii komórkowych. W tym celu wysiewamy wybrane komórki na kilka płyt w dubletach przy konfluencji 70% w pożywce, która będzie stosowana podczas eksperymentu, i dodajemy rosnące stężenia G418 (0-1 000 μg/ml). Komórki należy monitorować codziennie, aby określić minimalne stężenie G418, które skutecznie zabija komórki. Śmierć komórek obserwuje się w ciągu 3-7 dni.</li>
 <li>Przed generowaniem linii komórkowych zaleca się zweryfikowanie za pomocą testów transfekcji przejściowej, czy plazmid wykazujący ekspresję shRNA może w pewnym stopniu zredukować ekspresję badanego genu. Można to przeprowadzić w dowolnej linii komórkowej, którą można skutecznie transfekować.</li>
 <li>Wysiewamy komórki T-REx-293 z gęstością około 5x106 komórek na płytę 10 cm w 8 ml pożywki DMEM (zawierającej 10% FBS zatwierdzonego dla systemu Tet, 2mM L-glutaminy, 100 j/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny oraz 5 μg/ml blasticydyny). Płyty inkubujemy przez noc w 37 °C, 5% CO2.</li>
 <li>Następnego dnia, przed transfekcją, wymieniamy pożywkę na 8 ml świeżej pożywki.</li>
 <li>Transfekujemy komórki, używając 10 μg plazmidu pSuperior.neo+GFP (Rysunek 1) kodującego shRNA dla Acf1 lub SNF2h pod kontrolą tetracyklinowo-indukowalnego promotora H1, a także genu oporności na neomycynę połączonego z GFP i pod kontrolą konstytutywnego promotora PGK. DNA dodajemy do 500 μl 150 mM NaCl. Odczynnik jetPIE dodajemy do innej aalikwoty 500 μl 150 mM NaCl w ilości 2 μl na μg DNA. Roztwór jetPIE dodajemy do DNA i dobrze mieszamy za pomocą wortexa. Inkubujemy przez 15 min w temperaturze pokojowej. Kompleksy DNA delikatnie nanosimy pipetą na płyty 10 cm zawierające komórki o konfluencji 70-80%. Płyty przenosimy z powrotem do inkubatora.</li>
 <li>Następnego dnia wymieniamy pożywkę na pożywkę selektywną (pożywka DMEM opisana powyżej, zawierająca dodatkowo 500 μg/ml G418).</li>
 <li>Przez następne dwa tygodnie monitorujemy komórki i wymieniamy pożywkę selektywną na podobną świeżą pożywkę co 3-4 dni, aż pojawią się kolonie, które można będzie zobaczyć bez użycia mikroskopu.</li>
 <li>Przed izolacją kolonii przygotowujemy płytki 24-dołkowe z pożywką selektywną.</li>
 <li>Kolonie identyfikujemy wzrokowo i zaznaczamy ich lokalizację na spodzie płyty za pomocą kolorowego markera. Pod mikroskopem weryfikujemy, czy kolonie są dobrze odseparowane.</li>
 <li>W komorze sterylnej odsysamy pożywkę z płyty, delikatnie płuczemy ciepłym PBS i dokładnie odsysamy całą pozostałą ciecz. Do jednej kolonii na płycie dodajemy 3 μl 0,25% trypsyny/EDTA. Trypsynujemy wielokrotnie pipetowaniem, aż komórki odkleją się, a następnie przenosimy je do jednego z dołków w płytce 24-dołkowej. Powtarzamy tę procedurę dla kilku innych kolonii na płycie.</li>
 <li>Hodujemy komórki w 37 °C, 5% CO2, aż wypełnią dołek. Następnie komórki pochodzące z każdej z oryginalnych kolonii dzielimy na trzy dołki, każdy w osobnej płytce 12-dołkowej, i inkubujemy przez noc.</li>
 <li>Następnego dnia wymieniamy pożywkę w jednej płytce na pożywkę zawierającą 1 μg/ml doksycykliny z roztworu stokowego przygotowanego w wodzie dwukrotnie destylowanej (1-5 mg/ml). W płytce kontrolnej wymieniamy pożywkę na pożywkę bez doksycykliny. Komórki inkubujemy przez 72 h w 37 °C, 5% CO2.</li>
 <li>Zbieramy komórki z jednego dołka traktowanego i jednego nietraktowanego z każdego klonu komórkowego w celu przygotowania ekstraktów białkowych i analizy Western blot, aby określić wydajność wyciszania Acf1 lub SNF2h. Stosujemy przeciwciała przeciwko Acf1 lub SNF2h, a także przeciwciała przeciwko alfa-tubulinie, służącej jako kontrola ładunku. Komórki w trzecim dołku, pozostawione bez traktowania, wykorzystujemy do namnażania wybranych klonów komórkowych, w których dodanie doksycykliny doprowadziło do co najmniej 50% redukcji poziomu badanego białka. Alikwoty tych komórek zamrażamy w 90% FBS i 10% DMSO do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
2. Indukcja wyciszenia genu i transfekcja
<ol>
 <li>Wysiać komórki w pożywce selektywnej na płytkach 10 cm. Do połowy płytek dodać doksycyklinę w stężeniu 1 μg/ml i inkubować w 37°C, 5% CO2 przez 48-72 h (patrz Rycina 4).</li>
 <li>Po 48-72 h poddać komórki z każdej grupy trypsynizacji, przeliczyć je i wysiać 1,5x106 komórek na płytkę 6 cm w tej samej pożywce, z doksycykliną lub bez niej. Inkubować komórki w 37°C, 5% CO2 przez noc. Zaplanować proces tak, aby każda grupa płytek z sekcji 2.1 dostarczyła komórek na dwanaście płytek 6 cm, w tym dwa duplikaty do analizy DAPI dla każdego punktu oraz jedną płytkę do analizy Western blot dla każdej próbki (patrz Rycina 4).</li>
 <li>Następnego dnia przeprowadzić transfekcję komórek na płytkach 6 cm z następującymi kombinacjami plazmidów: 1 μg pustego plazmidu lub taka sama ilość plazmidu kodującego E4orf4, wraz z 4 μg wektora wykazującego ekspresję Acf1-GFP lub SNF2h-GFP, który został uczyniony odpornym na shRNA w klonach komórkowych poprzez wprowadzenie mutacji cichych, lub 3 μg odpowiadającego pustego wektora i 1 μg plazmidu wykazującego ekspresję GFP (Rycina 4). Do przygotowania mieszaniny do transfekcji użyć odczynnika jetPIE zgodnie z powyższym opisem (10 μl na 5 μg DNA). Dla każdej próbki przygotować mieszaninę do transfekcji na trzy płytki.</li>
 <li>Po 15-minutowej inkubacji DNA z odczynnikiem jetPIE w temperaturze pokojowej, ostrożnie nanieść pipetą równe ilości kompleksów DNA z każdej mieszaniny do transfekcji na trzy płytki 6 cm i inkubować w 37°C, 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
3. Analiza DAPI w komórkach transfekowanych
<ol>
 <li>Następnego dnia wyizoluj białka z jednej płytki na próbkę do analizy Western blot, aby potwierdzić efektywny knockdown Acf1 lub SNF2h oraz równomierną ekspresję E4orf4 w różnych próbkach.</li>
 <li>Odsącz pożywkę z płytek przeznaczonych do testu DAPI, delikatnie przemyj płytki PBS i dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu przygotowanego w PBS, aby pokryć komórki. Przygotowanie roztworu paraformaldehydu oraz traktowanie komórek tym odczynnikiem należy przeprowadzać w dygestorium. Inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.</li>
 <li>Odsącz paraformaldehyd i przemyj trzy razy PBS, kołysząc płytkami w temperaturze pokojowej przez 5 min przy każdym płukaniu. Dodaj 80% etanol przechowywany w -20 °C i inkubuj w -20 °C przez co najmniej 1 hr. Płytki można przechowywać w etanolu w -20 °C przez kilka dni, pod warunkiem, że są szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu etanolu i wysychaniu.</li>
 <li>Odsącz etanol i przemyj komórki dwukrotnie PBS oraz raz PBS-BT (PBS zawierający 0,5% BSA i 0,05% tween-20), kołysząc w temperaturze pokojowej przez 5 min przy każdym płukaniu.</li>
 <li>Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał, zablokuj komórki w 1 ml buforu PBS-BT zawierającego 10% surowicy koziej przez 20 min podczas kołysania w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki dwukrotnie w PBS-BT, po 5 min na każde płukanie.</li>
 <li>Inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym (w naszym przypadku przeciwciałem specyficznym dla E4orf4) w 1 ml PBS-BT przez 1 hr podczas kołysania w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj dwukrotnie w PBS-BT i raz w PBS zawierającym 0,1% BSA, po 5 min na każde płukanie.</li>
 <li>Inkubuj komórki w 1 ml PBS-0,1% BSA zawierającego odpowiednie przeciwciało wtórne znakowane fluorescencyjnie i DAPI w końcowym stężeniu 0,5 μg per ml przez 40 min podczas kołysania w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przemyj PBS przez 5 min, dokładnie osusz przez odsysanie i pozostaw płytki odwrócone do góry dnem na dodatkową godzinę lub na noc, aby osiągnąć całkowite wysuszenie. Następnie zamocuj szkiełka nakrywkowe na komórkach, używając roztworu Fluoromount-G. Przechowuj płytki w 4 °C w ciemności do momentu zliczania jąder apoptotycznych.</li>
 <li>Poproś współpracownika o oznaczenie płytek nowymi numerami, aby zliczanie jąder apoptotycznych w różnych próbkach mogło odbyć się w sposób obiektywny (ślepa próba).</li>
 <li>Wizualizuj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 400X (w powietrzu) lub 630X (w oleju imersyjnym). Zidentyfikuj komórki transfektowane, które zostały zabarwione na poszczególne białka ekspresjonowane w każdej próbce, i policz liczbę skondensowanych lub pofragmentowanych jąder uwidocznionych w barwieniu DAPI w populacji komórek transfektowanych. Monitoruj kilka pól widzenia i policz łącznie co najmniej 200 komórek transfektowanych.</li>
 <li>Oblicz procent jąder o morfologii apoptotycznej w populacji komórek transfektowanych. Powtórz eksperyment w duplikatach 2-3 razy, aby obliczyć istotność statystyczną zmian między poszczególnymi próbkami.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajność uzyskiwania kolonii, w których warunkowy knockdown ekspresji genu przebiegł pomyślnie, jest zmienna i zależy od analizowanego genu. W naszych badaniach uzyskaliśmy 7 pomyślnych kolonii z 12 przetestowanych dla Acf1 oraz 6 z 18 dla SNF2h. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną płytkę z wybranymi klonami komórkowymi (Rysunek 2A) oraz pojedynczą kolonią (Rysunek 2B). Rysunek 3 przedstawia reprezentatywny blot przygotowany z białek wyekstrahowanych z komórek różnych klonów hodowanych w obecności lub w nieobecności doksycykliny przez 72 hr. Blot zabarwiono przeciwciałami przeciwko SNF2h oraz przeciwko alfa-tubulinie, która służyła jako kontrola załadunku. Dwa z klonów (numer 4 i 5) wykazały silną redukcję poziomu SNF2h po indukcji doksycykliną. Należy zauważyć, że choć plazmid pSuperior.neo+GFP (Rysunek 1) użyty do generowania linii komórkowych koduje białko fuzyjne neo-GFP, fluorescencja zielona w stabilnych liniach komórkowych była bardzo niska, a ekspresję innych białek fuzyjnych GFP wprowadzonych przejściowo do tych komórek można było łatwo wykryć powyżej tła fluorescencji zielonej.
Schematyczna reprezentacja eksperymentów przeprowadzonych na klonach komórkowych w celu zmierzenia wpływu wyciszenia Acf1 lub SNF2h na indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek przedstawiona jest na Rysunku 4. Czas wymagany do wyciszenia ekspresji genu poprzez traktowanie doksycykliną może się różnić w zależności od stabilności białka, którego poziomy mają zostać obniżone. W przypadku Acf1 i SNF2h, do efektywnego wyciszenia na poziomie białka wymagane było 72 h traktowania.
Rycina 5 przedstawia przykład komórek wykazujących ekspresję E4orf4 i GFP, w których zachodzi śmierć komórkowa objawiająca się pojawieniem się jąder barwionych DAPI o skondensowanej lub pofragmentowanej morfologii. Rycina 6 przedstawia wyniki reprezentatywnego eksperymentu wykazującego, że indukowane doksycykliną wyciszenie Acf1 doprowadziło do zwiększenia stymulowanej przez E4orf4 śmierci komórek (Rycina 6A). Wzrost ten nie wynikał ze zwiększenia poziomu E4orf4 (Rycina 6B). Ponadto przywrócenie Acf1 w komórkach indukowanych doksycykliną zmniejszyło wzrost toksyczności E4orf4 do poziomów obserwowanych w komórkach nieindukowanych (Rycina 6).
<img alt="Schemat wektora plazmidowego pSUPERIOR neo+GFP; miejsce klonowania genów; shRNA, promotor H1, EGFP, Neo." src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Mapa plazmidu pSuperior.neo+GFP. Mapa przedstawia indukowalny tetracykliną promotor H1 sterujący ekspresją shRNA oraz promotor PGK sterujący ekspresją białka fuzyjnego neo-GFP. Mapa została opracowana na podstawie instrukcji pSuperior firmy OligoEngine.
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych na płytce agarowej i hodowla komórkowa pod mikroskopem." src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Identyfikacja kolonii opornych na neomycynę. Przedstawiono zdjęcia płytki zawierającej kolonie (A) oraz pojedynczej kolonii (B). Kolonie uzyskano poprzez hodowlę komórek przez 14 dni w medium selektywnym zawierającym neomycynę.
<img alt="Analiza Western blot; ekspresja białka SNF2h; traktowanie doksorubicyną; metoda detekcji przeciwciałami." src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ocena wydajności wyciszenia genów w wybranych koloniach. Komórki z kilku kolonii wyselekcjonowanych w obecności neomycyny wysiano w duplikacie. Jedną studzienkę z każdej próbki indukowano doksycykliną (+), a drugą pozostawiono bez traktowania (-). Białka wyekstrahowano 72 hr po indukcji i rozdzielono metodą SDS-PAGE. Western blot barwiono sukcesywnie przeciwciałami przeciwko SNF2h oraz przeciwko alpha-Tubulinie (pełniącej rolę kontroli załadunku), co pokazuje poziomy SNF2h w komórkach indukowanych i kontrolnych.
<img alt="Schemat pracy z kulturami komórkowymi; traktowanie doksycykliną, transfekcja, test DAPI, Western blot; diagram procesu." src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Planowanie typowego eksperymentu z wykorzystaniem testu knockdown-DAPI. Przedstawiono kolejne etapy eksperymentu, w tym traktowanie doksycykliną w celu uzyskania knockdownu Acf1 lub SNF2h, transfekcję w celu przywrócenia ekspresji Acf1 lub SNF2h bądź wprowadzenia pustego wektora, a także wprowadzenie E4orf4 lub odpowiadającego mu pustego wektora do komórek oraz analizę wyników. Płytki traktowane doksycykliną zaznaczono na czerwono (Dox), a płytki kontrolne na niebiesko. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, analiza struktury komórkowej, barwienie wielokolorowe, różnicowanie komórek." src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Detekcja śmierci komórek indukowanej przez E4orf4 za pomocą testu DAPI. Komórki poddane różnym zabiegom opisanym na Rysunku 4 zostały utrwalone i zabarwione przeciwciałami specyficznymi dla E4orf4 oraz DAPI w celu wizualizacji jąder komórek transfektowanych. Przedstawione zdjęcie pochodzi z próbki zawierającej E4orf4 oraz kontrolne białko GFP. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Obrazy nałożone. Białe strzałki wskazują komórki transfektowane GFP i E4orf4 zawierające jądra o morfologii apoptotycznej. Czerwone strzałki wskazują jądra o nieregularnych kształtach, które nie zostały uznane za jądra apoptotyczne. Gwiazdkami oznaczono jądra w fazie mitozy lub jądra, które właśnie uległy podziałowi.
<img alt="Wykres słupkowy nieprawidłowości jądrowych oraz western blot ekspresji białek, oceniający efekty E4orf4 i Dox." src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Wyciszenie Acf1 nasila indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. (A) Komórki z linii pochodzącej z T-REx-293, wykazującej ekspresję Acf1-shRNA z promotora indukowanego tetracykliną, indukowano doksycykliną (+Dox) lub pozostawiono nieleczone (-Dox). Trzy dni później komórki transfekowano plazmidami wykazującymi ekspresję E4orf4 (+E4orf4) lub pustym wektorem (-E4orf4) wraz z pustym wektorem lub plazmidem wykazującym ekspresję Acf1 z tagiem GFP, który stał się odporny na shRNA dzięki wprowadzeniu mutacji cichych. Komórki utrwalono dwadzieścia cztery godziny po transfekcji i barwiono przeciwciałami przeciwko E4orf4 oraz DAPI. Indukcję śmierci komórek mierzono za pomocą opisanego powyżej testu DAPI i określono procent transfekowanych komórek z kondensacją lub fragmentacją jąder. Przedstawiono reprezentatywny eksperyment z trzema powtórzeniami, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (B) Komórki z równoległych płytek zebrano do analizy Western blot. Blot barwiono przeciwciałami przeciwko E4orf4, GFP i Acf1. Endogenne Acf1 oraz Acf1-GFP przedstawiono na dwóch oddzielnych panelach.

<ol><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li>
<li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127(2003).</li>
<li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77(2003).</li>
<li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+suppression+of+cellular+genes%3A+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li>
<li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li>
<li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li>
<li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li>
<li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B%27+subunits+of+protein+phosphatase+2A%2C+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li>
<li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li>
<li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E4orf4%2C+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li>
<li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li>
<li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wyciszanie ekspresji konkretnych genów jest istotnym podejściem do badania roli białka w szlakach regulacyjnych. Ponieważ konstytutywne wyciszenie ekspresji genów niezbędnych dla życia negatywnie wpływa na proliferację komórek, ich badanie może wymagać albo przejściowego wprowadzenia siRNAs, albo zastosowania stabilnych systemów warunkowego wyciszania. Generowanie stabilnych linii komórkowych z możliwością indukowanej lekiem ekspresji shRNAs, opisane w niniejszej pracy, daje przewagę nad transfekcjami przejściowymi, któr...

<table><tbody><tr><td>DMEM z wysoką zawartością glukozy</td><td>Gibco</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>FBS zatwierdzony do systemu Tet</td><td>Clontech</td><td>631106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>komórki T-REx-293</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>blasticydyna</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>plazmida pSuperior.neo+GFP</td><td>OligoEngine</td><td>VEC-PBS-0007/0008</td><td></td></tr><tr><td>jetPIE</td><td>Polyplus transfection</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>doksycyklina</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez e4orf4 śmierci komórek

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków ma kluczowe znaczenie dla badania wpływu analizowanego białka na różne szlaki sygnałowe1,2. Jednak w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown nie jest tolerowany przez komórki przez dłuższy czas, wymagany jest warunkowy knockdown ekspresji genów3-5. W niniejszym opracowaniu opisano protokół przygotowania linii komórkowych umożliwiających warunkowy knockdown podjednostek czynnika przebudowy chromatyny ACF. Linie te ułatwiają określenie udziału ACF w indukcji śmierci komórek przez białko E4orf4 adenowirusa6. Sekwencje kodujące krótkie napinki RNA (shRNA) dla podjednostek Acf1 i SNF2h czynnika przebudowy chromatyny ACF sklonowano obok promotora indukowalnego doksycykliną w plazmidzie zawierającym również gen oporności na neomycynę. Klony komórkowe oporne na neomycynę wyselekcjonowano w obecności G418 i wyizolowano. Uzyskane linie komórkowe indukowano traktowaniem doksycykliną, a po obniżeniu poziomu ekspresji Acf1 lub SNF2h komórki transfekowano plazmidem kodującym E4orf4 lub pustym wektorem. Aby potwierdzić specyficzny efekt konstruktów shRNA, poziomy białek Acf1 lub SNF2h przywrócono do poziomu WT poprzez kotransfekcję plazmidem ekspresyjnym Acf1 lub SNF2h, które uczyniono opornymi na shRNA poprzez wprowadzenie mutacji cichych. Zdolność E4orf4 do indukcji śmierci komórek w różnych próbkach określono za pomocą testu z DAPI, w którym mierzono częstotliwość występowania jąder o morfologii apoptotycznej w populacji transfekowanych komórek7-9.
Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do określenia funkcjonalnego udziału różnych białek w indukcji śmierci komórkowej przez ich białkowe partnery w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown może być letalny dla komórek.

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków jest kluczowa dla badania wpływu badanego białka na różne...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja wpływu wyciszenia ACF1 lub SNF2H na indukowaną przez E4 lub 4 śmierć komórek. Osiąga się to poprzez wytworzenie linii komórkowych, w których ekspresja srna ACF1 lub SNF2H jest aktywowana warunkowo poprzez dodanie doksycykliny, co w drugim kroku skutkuje obniżeniem poziomów białka ACF1 lub SNF2H. Komórki otrzymanych linii komórkowych są traktowane doksycykliną w celu zmniejszenia ekspresji ACF1 lub SNF2H lub pozostawiane bez obróbki.Następnie E4orf4 jest ekspresowany w komórkach z lub bez odpornego shRNA przeciwko ACF1 lub SNF2H. W celu zbadania wpływu ACF1 lub SNF2H na indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek, uzyskano wyniki wykazujące wpływ poziomów ACF1 lub SNF2H na toksyczność E4orf4 na podstawie zliczania jąder o morfologii apoptotycznej przy użyciu testu JY. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak przejściowa transfekcja RNA, jest to, że wszystkie komórki ekspresują shRNA, a odsetek komórek wykazujących koekspresję wraz z tradycyjnym plazmidem jest wyższy. Metoda ta pozwala na poznanie mechanizmów leżących u podstaw indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek, ale może być również stosowana do bada

preparation-cell-lines-for-conditional-knockdown-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie linii komórkowych do uwarunkowanego hamowania ekspresji genów i pomiar efektów hamowania na śmierci komórek indukowanej przez E4orf4

Niniejsza procedura opisuje szybki i prosty schemat postępowania w celu wprowadzenia siRNA do linii komórkowych trudnych do transfekcji oraz monitorowania ekspresji genów za pomocą real-time PCR. Zastosowanie automatycznego licznika komórek, wielodołkowej płyty do elektroporacji oraz automatycznej stacji elektroforezy pozwala na uzyskanie szybkich i wiarygodnych wyników bez konieczności stosowania kosztownych systemów robotycznych.

Wykorzystanie automatycznego licznika komórek w celu uproszczenia badań nad ekspresją genów: wyciszenie siRNA ekspresji genów zależnych od IL-4 w komórkach Namalwa

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Źródło: Kubala, M. H. &amp; DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (2017)W tym filmie zaprezentowano generowanie linii komórkowych nowotworowych z warunkowym wyciszeniem genów (knockdown) przy użyciu systemu lentiwirusowego shRNA indukowanego tetracykliną (Tet). Przedstawiono w nim etapy transdukcji wirusowej, selekcji antybiotykowej oraz indukowanego doksycykliną...

Generowanie komórek z warunkowym wyciszeniem genu z wykorzystaniem tetracyklinowo-responsywnego lentiwirusego systemu ekspresji shRNA

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

To jest efektywny czasowo i kosztowo protokół in vitro, badający mechanizmy nabytej oporności na ukierunkowane środki terapeutyczne, co jest wysoce niezaspokojoną potrzebą medyczną w leczeniu raka.

Poszukiwanie ścieżek napędzających nabytą oporność na terapię celowaną: wytwarzanie subklonów opornych na leki i przywracanie wrażliwości przez knock-down genów

Ustanowienie stabilnej linii komórkowej z nadekspresją interesującego genu do badania funkcji genu może być przeprowadzone przez stabilną transfekcję i selekcję pojedynczych klonów po ich transfekcji poprzez infekcję retrowirusową. Tutaj pokazujemy, że wygenerowane w ten sposób linie komórkowe HT29-DR3 wyjaśniają mechanizmy, za pomocą których receptor śmierci 3 (DR3) przyczynia się do apoptozy wywołanej antymitozą.

Ustalenie linii komórkowych z nadekspresją DR3 w celu oceny odpowiedzi apoptotycznej na terapie antymitotyczne

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Poznaj protokół warunkowego knockdownu genów Acf1 i SNF2h przy użyciu indukowalnego shRNA w liniach komórkowych ssaków. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników remodelujących chromatynę na śmierć komórek indukowaną przez białko E4orf4.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego knockdownu ekspresji genów i pomiar efektów knockdown na śmierć komórki wywołaną przez E4orf4 (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Przeglądaj więcej filmów