Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego knockdownu ekspresji genów i pomiar efektów knockdown na śmierć komórki wywołaną przez E4orf4

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zaobserwowanie wpływu nokautu ACF jeden lub SNF dwa H na śmierć komórki indukowaną przez E cztery lub cztery. Osiąga się to poprzez generowanie linii komórkowych, w których ekspresja ACF jeden lub SNF dwa H srna jest warunkowo aktywowana przez dodanie doksycykliny, co powoduje obniżenie poziomu białka ACF jeden lub SNF dwa H jako drugi krok. Komórki uzyskanych linii komórkowych są traktowane doksycykliną w celu zmniejszenia ekspresji ACF jeden lub SNF two H lub pozostawia się je bez leczenia.

Następnie E cztery lub cztery ulega ekspresji w komórkach z lub bez ACF jeden lub SNF dwa H.In celu zbadania wpływu ACF jeden lub SNF dwa H na E cztery lub cztery indukowane zgony komórkowe uzyskuje się wyniki, które pokazują wpływ ACF jeden lub SNF dwa poziomy H na E, toksyczność cztery lub cztery, na podstawie zliczania jądra o morfologii apoptotycznej przy użyciu testu JY. Główną przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak transfekcja przejściowa RNA, jest to, że wszystkie komórki wyrażają S-H-R-N-A, a odsetek komórek ulegających koekspresji razem z tradycyjnym plazmidem jest wyższy. Metoda ta zapewnia wgląd w mechanizmy leżące u podstaw indukowanej śmierci komórki przez 4 0 4, ale może być również zastosowana do badania innych białek protonowych.

Oprócz Any Lafe, badacz z mojego laboratorium będzie demonstrował części tej procedury Aby rozpocząć procedurę generowania indukowalnych linii komórkowych, płytki T-Rex 2 9 3 komórek o gęstości około pięć razy 10 do sześciu komórek na 10 centymetrową płytkę w ośmiu mililitrach DMEM zawierającej surowicę bez tetracykliny i z pięcioma mikrogramami mililitra blastera na bok w inkubacji płytek przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%dwutlenku węgla następnego dnia. Zastąp pożywkę ośmioma mililitrami świeżej pożywki przed transfekcją. Plazmid do transfekcji to plazmid P superior neo plus GFP w kodowaniu ACF jeden lub SNF dwóch H-S-H-R-N-A, napędzany przez indukowany tetracykliną promotor H one, a także gen oporności na neomycynę połączony z GFP i napędzany przez konstytutywny promotor PGK.

Dodaj 10 mikrogramów plazmidowego DNA do 500 mikrolitrów 150-milimolowego chlorku sodu i wiruj. Następnie dodaj odczynnik PY w strumieniu o stężeniu dwóch mikrolitrów na mikrogram DNA do innej probówki z 500 mikrolitrami 150 milimolowego chlorku sodu i wiruj. Dodaj roztwór ciasta strumieniowego do DNA i dobrze wymieszaj, wirując.

Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach delikatnie odpipetuj kompleksy DNA na 10-centymetrowe płytki zawierające od 70 do 80% konfluencji. T-Rex 2 9 3 komórki mieszanki następnego dnia.

Zastąp pożywkę selektywną pożywką w tym przykładzie DMEM, jak poprzednio, zawierającą 500 mikrogramów na mililitr G four 18. Przez następne dwa tygodnie monitoruj komórki. Zastępuj selektywną pożywkę podobną świeżą pożywką co trzy do czterech dni, aż pojawią się kolonie.

Zidentyfikuj kolonie wzrokiem i zaznacz ich położenie na dole płytki za pomocą kolorowego markera. Sprawdź pod mikroskopem, czy kolonie są dobrze oddzielone. Kolonie można wyizolować, gdy są wystarczająco duże, aby można je było uwidocznić bez mikroskopu.

Aby ta procedura zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby podczas izolacji kolonii wybrać dobrze oddzielone kolonie. W sterylnym kapturze odessać pożywkę z płytki. Delikatnie spłucz PBS i dobrze odessaj cały pozostały płyn.

Dodaj trzy mikrolitry 0,25% tripów w EDTA do jednej kolonii na płytce, głaszcząc je wielokrotnie, aż komórki oderwą się od płytki. Przenieść komórki do selektywnego podłoża w studzience na płytce 24-dołkowej. Powtórz to dla kilku innych kolonii na talerzu.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż wypełnią studnię. Następnie podziel komórki z każdej pierwotnej kolonii na trzy dołki, każda na osobnej 12-dołkowej płytce i inkubuj przez noc następnego dnia. Zastąpić pożywkę w jednej płytce pożywką zawierającą jeden mikrogram na mililitr doksycykliny z roztworu podstawowego przygotowanego w wodzie podwójnie destylowanej.

Wymienić pożywkę w płytce kontrolnej na pożywkę bez doksycykliny. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Komórki z jednej studni poddanej działaniu substancji i jednej niepoddanej działaniu substancji są następnie pobierane do analizy Western Blot w celu określenia skuteczności ACF jeden lub SNF two H strąconych, reprezentatywny wynik pokazano tutaj.

Ta plama była barwiona przeciwciałami przeciwko SNF dwa H i alfa tubulinie. Ten ostatni służy jako kontrola załadunku dwóch klonów. Numer cztery i numer pięć wykazały silne zmniejszenie SNF dwa H po indukcji doksycykliny i dlatego są wybrane do użycia w eksperymencie knockdown, który zostanie wykazany w następnym segmencie.

Nieleczone komórki na trzeciej płytce zostaną wykorzystane do rozszerzenia wybranej linii komórkowej, a podwielokrotności tych komórek zostaną następnie zamrożone. W celu dalszego użycia w celu wywołania knockdown ACF jednej lub SNF dwóch komórek H płytki w selektywnym podłożu na 10-centymetrowych płytkach, dodaj doksycyklinę w ilości jednego mikrograma na mililitr do połowy płytek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 48 do 72 godzin. Każda grupa płytek musi zawierać komórki dla 12 sześciocentymetrowych płytek, w tym dwa duplikaty do testu DPI dla każdego punktu, a także jedną płytkę do analizy western blot każdej próbki.

48 do 72 godzin po indukcji trypsyna przetrzyj komórki z każdej grupy komórek i po ich policzeniu połóż 1,5 razy 10 do sześciu komórek na sześciocentymetrowej płytce w tym samym podłożu z doksycykliną lub bez. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez noc następnego dnia, transfekuj komórki. Jak wskazano.

Zarówno komórki nieleczone, jak i leczone doksycykliną są transfekowane w trzech egzemplarzach na cztery sposoby. Jeden z pustym plazmidem i plazmidem eksprymującym GFP, dwa z pustym plazmidem, a także wektor wyrażający ACF odporny na SHRA, jeden GFP lub SNF, dwa HGFP, trzy z plazmidem kodującym E, cztery lub cztery i plazmid wyrażający GFP, a z plazmidem kodującym E cztery, wszystkie cztery. A wektor wyrażający odporny na SHRA ACF jeden GFP lub SNF dwa HGFP po transfekcji inkubuje wszystkie płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc.

Następnego dnia po transfekcji komórek ekstrahuje się białka z jednej płytki na próbkę do analizy Western blot w celu ustalenia, czy ACF jeden lub SNF dwa H zostały skutecznie strącone i że E cztery lub cztery uległy jednakowej ekspresji w różnych próbkach. Pozostałe 16 płytek zostanie wykorzystanych do testu DPI. Odessać pożywkę z płytek przeznaczonych do testu DPI i delikatnie umyć komórki PBS w kapturze chemicznym.

Dodać jeden mililitr 4% paraformaldehydu przygotowanego w PBS, aby przykryć komórki, inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Odessać paraformaldehyd i przemyć PBS, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania po trzecim praniu PBS w 80% etanolu utrzymywanym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.

Odessać etanol i przemyć komórki dwukrotnie PBS, wytrząsając w temperaturze pokojowej przez pięć minut, za każdym razem, po czym przemyć raz przez pięć minut w temperaturze pokojowej PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,05% między 20 lub P-B-S-B-T. Również z potrząsaniem, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych. Zablokuj komórki w jednym mililitrze buforu P-B-S-B-T zawierającego 10% koziej surowicy przez 20 minut, wstrząsając w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj komórki dwukrotnie w P-B-S-B-T po pięć minut każde mycie. Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem specyficznym dla E cztery lub cztery, w tym przypadku w jednym mililitrze P-B-S-B-T przez jedną godzinę, wstrząsając temperaturą pokojową. Następnie umyj dwukrotnie w P-B-S-B-T i raz w PBS zawierającym 0,1% BSA, po pięć minut każde pranie.

Następnie dodaj do komórek jeden mililitr PBS 0,1% BSA zawierający odpowiednie wtórne przeciwciało znakowane fluorescencyjnie i 0,5 mikrograma na mililitr. Końcowe stężenie DPI inkubować przez 40 minut, wstrząsając w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec myj PBS przez pięć minut.

Wysuszyć studzienkę przez aspirację i trzymać płytki do góry nogami przez dodatkową godzinę do nocy, aby osiągnąć całkowite wyschnięcie i przykryć folią aluminiową szkiełka pokrywy do montażu na komórkach za pomocą roztworu flora Mount G. Trzymaj talerze w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do liczenia. Komórki jąder apoptotycznych, które zostały poddane różnym zabiegom opisanym w protokole, zostały utrwalone i wybarwione czterema lub czterema specyficznymi przeciwciałami E i DPI w celu uwidocznienia jąder transfekowanych komórek.

Ten rysunek pokazuje przykład komórek wykazujących ekspresję E cztery lub cztery, a panel A GFP pokazuje samą kontrolną ekspresję białka GFP, a panel B pokazuje E cztery lub cztery jądra barwnika DAPI są pokazane w panelu C, a połączone obrazy są pokazane w panelu D. Białe strzałki oznaczają GFP i E. Cztery lub cztery transfekowane komórki zawierające jądra o morfologii apoptotycznej. Czerwone strzałki oznaczają jądra o nieregularnych kształtach, które nie są liczone jako jądra apoptotyczne, gwiazdka oznacza jądra mitotyczne lub jądra, które właśnie podzieliły liczbę skondensowanych lub rozdrobnionych jąder wizualizowanych przez DAPI. Barwienie policzono w celu obliczenia procentu jąder o morfologii apoptotycznej w populacji transfekowanych komórek, aby zachować optymalną obiektywność testu.

Liczenie jądra apoptotycznego w różnych próbkach przeprowadzono w sposób ślepy, w którym osoba licząca nie była świadoma tożsamości próbki Reprezentatywny wynik pokazano na tym wykresie. Wyższy odsetek nieprawidłowości jądrowych zaobserwowano w E czterech lub czterech komórkach wykazujących ekspresję, co potwierdza, że T cztery lub cztery indukują śmierć komórki. Najwyższy odsetek nieprawidłowości jądrowych zaobserwowano w komórkach eksprymujących E cztery lub cztery, w których poziomy ACF jeden były zmniejszone przez SHR i nokaut za pośrednictwem wskazujący, że knockdown ACF jeden zwiększa E cztery lub cztery, śmierć komórek Inge zwiększa toksyczność E cztery lub cztery.

Wyrażanie niskich poziomów ACF nie wynikało ze wzrostu czterech lub czterech poziomów E, jak obserwowano w Western blot. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ułatwieniu zalecanego liczenia stentu jądra apoptotycznego z DPI oraz o zastosowaniu ścisłych kryteriów identyfikacji tego jądra. Oprócz tej procedury można wykonać inne metody, takie jak testy genów klonów, w celu walidacji wyników DA PSE Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak testy koimmunoprecypitacji, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, czy istnieje fizyczna interakcja między badanymi białkami.