Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Metoda ta może szybko generować obrazy o wysokiej rozdzielczości, które umożliwiają analizę rozkładu przestrzennego i kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych w komórkach, umożliwiając jednocześnie szybką analizę wielu próbek. Komórki są mierzone za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania cytometrii przepływowej, łączącego szybkość, czułość i szczegółowe obrazy pojedynczych komórek z informacjami przestrzennymi, dostarczając unikalnych danych, których nie można uzyskać za pomocą optometrii przepływowej lub mikroskopii. Jedną z ważnych rad jest zapewnienie wystarczającej liczby komórek do ustalenia ustawień przyrządu i zawieszamy komórki o dużej gęstości na czas pomiarów.

Poza tym pozyskiwanie danych jest proste i podobne do konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Najpierw wygeneruj linie komórkowe DLBCL zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie dodać 10 milimolowy roztwór EdU w stosunku jeden do 1000 do hodowli komórkowej DLBCL i inkubować płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny po wymieszaniu płytki przez delikatne kołysanie.

Po inkubacji wyjąć płytkę i dodać 100 milimolowy roztwór chlorochiny do końcowego stężenia 75 mikromolowych. Wymieszaj, delikatnie kołysząc i inkubuj przez 30 minut. Następnie dodać 20 milimolowych roztworów C12 FDG do końcowego stężenia 20 mikromolów.

Po delikatnym wymieszaniu inkubować płytkę przez godzinę, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj 100 milimolowy roztwór 2-fenyloetylo-beta-d-d-tiogalaktozydu w stężeniu od jednego do 50, aby zatrzymać barwienie beta-galu FSA. I delikatnie obróć płytkę, aby wymieszać.

Przenieś komórki do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów i wiruj z prędkością 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu przemyć komórki czterema mililitrami PBS i odwirować w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 mikrolitrach w 4% roztworze utrwalającym paraformaldehyd.

Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i przemyć komórki dwukrotnie czterema mililitrami PBS i odwirować w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu do przepuszczalności saponin.

Teraz przenieś zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Osadzać komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwotnego i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, w ciemności.

Odwirować probówki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i przemyć 100 mikrolitrami roztworu saponinowego. Po dwukrotnym umyciu komórek wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w 500 mikrolitrach koktajlu detekcyjnego EdU.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności i wirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i przemyć jednym mililitrem roztworu saponinowego. Powtórzyć mycie dwa razy, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 20 do 50 mikrolitrach PBS.

Przed włączeniem przyrządu opróżnij butelkę ze zużytym płynem i sprawdź poziom SpeedBeads, sterylizatora, środka czyszczącego, odbąbelkowca i wystarczającej ilości płynów. Po włączeniu przyrządu i oprogramowania do obrazowania kliknij przycisk uruchamiania, aby zainicjować fluidykę i kalibrację systemu. Ustaw powiększenie na 40 razy i ustaw prędkość płynu na niską.

Po włączeniu laserów włącz laser o długości 405 nanometrów do pomiaru EdU Pacific Blue, 488 nanometrów do pomiaru C12-FDG oraz 642 nanometry do pomiaru Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Ustaw kanał szósty dla kanału rozproszonego, kanał pierwszy i kanał dziewiąty dla jasnego pola. Następnie zacznij od próbki, która ma mieć najwyższą fluorescencję, aby ustawić intensywność laserów i delikatnie odwróć probówkę z próbką, aby wymieszać.

Po otwarciu pokrywy probówki włóż probówkę z próbką do stacji dokującej. Kliknij Załaduj, aby rozpocząć i otworzyć wykres punktowy. Następnie wybierz obszar Cechy, podkreślenie MO1 i podkreślenie współczynnika proporcji MO1 odpowiednio dla osi X i Y.

Ustaw współczynnik proporcji bramki powyżej 0,5, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek poniżej i po prawej stronie oraz populację SpeedBead po lewej stronie. Teraz otwórz wykres histogramu i wybierz średni kwadrat gradientu cech maski pierwszej i kanał pierwszy dla osi X. Wybierz populację singletów i ustaw bramkę, aby wybrać dla skoncentrowanych komórek.

Otwórz wykres histogramu i wybierz nieprzetworzone maksymalne intensywności pikseli dla kanałów osi X 2, 7 i 11. Następnie dostosuj moce laserów 488 nanometrów, 405 nanometrów i 642 nanometrów odpowiednio dla kanału drugiego, siódmego i 11, tak aby każdy fluorochrom miał surową maksymalną wartość piksela między 100 a 4 000, aby uniknąć przesycenia. Wybierz skoncentrowaną populację do zarejestrowania i kliknij przycisk Pobierz, aby zmierzyć próbki DLBCL ze spójnymi ustawieniami.

Zmieniając próbki do pomiaru, kliknij przycisk powrotu, aby odzyskać probówkę z próbką. Naciśnij przycisk Załaduj, aby wyrzucić próbkę. Po zmierzeniu wszystkich próbek wyłącz jasne pole i laser rozproszony

Zmierz pojedyncze próbki kontrolne koloru, aby wygenerować macierz kompensacji. Kliknij przycisk Shutdown (Zamknij), aby zamknąć system obrazowania. Przeanalizuj dane w oprogramowaniu do analizy obrazu.

Użyj narzędzia Spot Wizard w oprogramowaniu do analizy obrazów, aby automatycznie zliczyć i określić ilościowo ogniska jądrowej gammy H2AX i obrazy żywych komórek. Wybierz dwie populacje komórek, jedną z wysoką i jedną z niską liczbą plamek, aby przeszkolić Kreatora lokalizacji w celu dalszej automatycznej analizy zliczania plamek. Metoda cytometrii przepływowej w obrazach pojedynczych komórek wykazała zwiększoną populację C12-FDG dodatnią, ujemną EdU, gamma H2AX-dodatnią, starzejącą się populację i KARPAS422.

Komórki WSU-DLCL2 i OCI-LY1, ale nie w komórkach SU-DHL6. Analiza oparta na obrazowaniu wykazała znacznie wyższą liczbę ognisk i KARPAS422 gamma H2AX, WSU-DLCL2 i OCI-LY1, ale nie w komórkach SU-DHL6. Podobne wyniki uzyskano w odniesieniu do częstości występowania i danych ilościowych.

Dodanie saponiny do zawiesiny komórkowej ma kluczowe znaczenie, w przeciwnym razie przeciwciała nie mogą dotrzeć do wewnętrznych antygenów komórki, a ostre detergenty prowadzą do utraty sygnału C12-FTG Cytometria obrazowa jest optymalna do analizy zmian w lokalizacji markerów, takich jak translokacja czynnika transkrypcyjnego do jądra w odpowiedzi na określone bodźce. Taką analizę można również przeprowadzić za pomocą naszego protokołu. Metoda ta pozwala na wizualizację wielu markerów fluorescencyjnych na poziomie pojedynczej komórki, co pomaga w wykryciu obecności, intensywności i lokalizacji poszczególnych sygnałów.