Name: Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj zaawansowaną cytometrię przepływową do jednoczesnego obrazowania i wykrywania wielu markerów starzenia w komórkach DLBCL. Ta metoda łączy szybkość analizy z wysoką rozdzielczością obrazów komórek pojedynczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem dla Yong Yu z Uniwersytetu Johannesa Keplera w Linzu (BERM16108001).

1. Linie komórkowe DLBCL z leczeniem mafosfamidem lub daunorubicyną w celu wywołania starzenia się komórek
UWAGA: Protokół działa również w przypadku przylegających komórek rakowych. W zależności od wielkości komórki, wysiewa się 1-2 × 105 komórek do jednego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubuje płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez noc przed zabiegiem. Kroki protokołu są takie same jak w przypadku ogniw zawiesinowych, ale z dwoma wyjątkami. Najpierw komórki muszą zostać wytrypsynizowane z płytki po kroku 3.4. Po drugie, etapy mycia są wykonywane bez wirowania przed trypsynizacją.
<ol>
	<li>Policz komórki DLBCL i nasiona 1 × 106 komórek/ml w 4 ml pożywki na dołek do 6-dołkowej płytki hodowlanej. Hoduj komórki DLBCL w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Dodaj MAF (5 μg/ml) lub DN (20 ng/ml) do hodowli komórkowej i delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać. 
	UWAGA: MAF i DN nie są stabilne. Po rozpuszczeniu w DMSO, roztwór podstawowy należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy unikać cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 3 dni.</li>
	<li>Po 3-dniowej inkubacji zebrać komórki DLBCL w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 100 × g, 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulki komórek z 4 ml świeżej pożywki i dodać zawiesiny z powrotem do płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Hodować płytkę komórkową w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez kolejne 2 dni przed zbiorem w celu analizy.</li>
</ol>
2. Przygotuj roztwory do barwienia (Tabela 1)
3. Barwienie komórek DLBCL różnymi markerami starzenia
UWAGA: Próbki komórek barwione indywidualnymi markerami (np. pacific blue-EdU, C12FDG, lub Alexa Fluor 647-γH2AX) są przygotowane do wygenerowania matrycy kompensacyjnej w celu skorygowania rozlewu fluorescencji podczas pomiaru. Chociaż jest to wysoce zalecane, krok ten może zostać zawieszony, gdy występuje pomijalne nakładanie się (wartość współczynnika kompensacji ≤ 0,1) widm emisyjnych między różnymi fluoroforami. Jednak użytkownicy muszą określić ustandaryzowane kroki kompensacji w przypadku korzystania z różnych przyrządów i paneli fluorescencyjnych.
<ol>
	<li>Dodać 10 mM roztworu EdU w stosunku 1:1,000 do hodowli komórkowej DLBCL wygenerowanej z kroku 1.6 (końcowe stężenie EdU wynosi 10 μM). Delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 100 mM roztworu chlorochiny do końcowego stężenia 75 μM (patrz dyskusja). Delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 20 mM roztworu C12FDG w stosunku 1:1,000 do końcowego stężenia C12FDG wynoszącego 20 μM. Delikatnie kołysać płytką, aby wymieszać i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 100 mM roztworu 2-fenyloetylo-β-D-tiogalaktozydu (PETG) w stosunku 1:50, aby zatrzymać barwienie fSA-β-gal (końcowe stężenie PETG 2 mM). Delikatnie obróć płytkę, aby wymieszać.</li>
	<li>Przenieść komórki do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 100 × g, 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Powtórz krok prania PBS. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 500 μl 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd.</li>
	<li>Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze pokojowej 250 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 4 ml PBS.</li>
	<li>Powtórz krok prania PBS. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do przepuszczalności saponin i przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze 250 × g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady komórkowe w 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało 1:500 γH2AX w roztworze do inkubacji przeciwciał). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w ciemności.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 250 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć 100 μl roztworu saponinowego.</li>
	<li>Powtórz krok prania dodatkowo dwa razy. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 500 μl koktajlu detekcyjnego EdU.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Wirować przy 250 × g, w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić sklarowany osad i przemyć 1 ml roztworu saponinowego.</li>
	<li>Powtórz krok prania dwa razy. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 20-50 μl PBS. Przejdź do sekcji 4, aby uzyskać sample pomiar.</li>
</ol>
4. Obrazowanie markerów starzenia za pomocą systemu obrazowania cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Opróżnij butelkę na zużyty płyn. Sprawdź poziomy koralików prędkości, sterylizatora, środka czyszczącego, odbąbelkowca, osłony i odczynników do płukania (woda dejonizowana), aby zapewnić wystarczającą ilość płynów przed włączeniem przyrządu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Włącz instrument i oprogramowanie do obrazowania (patrz interfejs oprogramowania w Rysunek 1A).</li>
	<li>Kliknij przycisk Start, aby zainicjować fluidykę i kalibrację systemu. 
	UWAGA: Ta procedura trwa około 45 minut.</li>
	<li>Ustaw powiększenie na 40x, ustaw prędkość fluidyki na niską i włącz lasery potrzebne w eksperymencie. Włącz lasery 405 nm, 488 nm i 642 nm, aby zmierzyć odpowiednio błękit EdU-pacific, C12FDG i Alexa Fluor 647-γH2AX (lub Alexa Fluor 647-Ki67). Ustaw Ch6 dla kanału rozproszonego oraz Ch1 i Ch9 dla jasnego pola. </li>
	<li>Zacznij od próbki, która ma mieć najwyższą fluorescencję, aby ustawić intensywność laserów. Delikatnie odwróć probówkę z próbką, aby wymieszać. Otwórz pokrywę probówki i włóż probówkę z próbką do stacji dokującej. Kliknij Załaduj, aby rozpocząć.</li>
	<li>Otwórz diagram punktowy i wybierz elementy Area_M01 i Aspekt Ratio_M01 odpowiednio dla osi X i Y. Ustaw bramkę powyżej współczynnika proporcji 0,5, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek poniżej i po prawej stronie, a populację koralików prędkości po lewej stronie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Otwórz wykres histogramu i wybierz element Gradient RMS_M01_Ch01 dla osi X. Wybierz populację singletów i ustaw bramkę, aby wybrać dla skoncentrowanych komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: System obrazowania automatycznie użyje koralików prędkości do dostosowania ostrości do obrazowania. Zaleca się jednak wybranie prawej połowy piku histogramu dla najlepiej ukierunkowanej populacji.</li>
	<li>Otwórz wykres histogramu i wybierz opcję Raw Max Pixel Intensities (Maksymalne intensywności pikseli RAW dla osi X) dla każdego kanału koloru (Ch2, 7 i 11). Dostosuj moce lasera (tj. 488 nm, 405 nm i 642 nm odpowiednio dla Ch2, 7 i 11), tak aby każdy fluorochrom miał wartość Raw Max Pixel między 100 a 4,000, aby uniknąć przesycenia. 
	UWAGA: W tym eksperymencie ustawienie mocy lasera wynosi 50 mW, 200 mW i 50 mW dla laserów odpowiednio 488 nm, 405 nm i 642 nm.</li>
	<li>Wybierz skoncentrowaną populację do zarejestrowania i kliknij przycisk Pobierz, aby zmierzyć próbki DLBCL ze spójnymi ustawieniami. Podczas zmiany próbek do pomiaru kliknij przycisk Return, aby odzyskać probówkę z próbką. Naciśnij przycisk Załaduj, aby wyrzucić próbkę.</li>
	<li>Po zmierzeniu wszystkich próbek wyłącz jasne pole i laser rozpraszający. Zmierz jednokolorowe próbki kontrolne, aby wygenerować macierz kompensacji.</li>
	<li>Kliknij przycisk Shutdown (Zamknij), aby zamknąć system obrazowania.</li>
	<li>Przeanalizuj dane w oprogramowaniu do analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia Spot Wizard w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby automatycznie zliczyć i określić ilościowo ogniska jądrowe γH2AX w obrazach żywych komórek. Wybierz dwie populacje komórek (jedną z wysoką i jedną z niską liczbą komórek), aby przeszkolić kreatora lokalizacji w celu dalszej automatycznej analizy zliczania plamek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li>
<li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li>
<li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347(2010).</li>
<li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li>
<li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype%3A+one+in+vivo+reality%2C+two+possible+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li>
<li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li>
<li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li>
<li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+senescence%3A+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651(2020).</li>
<li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+ageing%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li>
<li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li>
<li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li>
<li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li>
<li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+stress-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li>
<li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740(2021).</li>
<li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W ramach tej metody zbadano zdolność czterech różnych linii komórkowych DLBCL do wchodzenia w starzenie się po leczeniu chemioterapią, z obrazowaniem w jasnym polu i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej. Na poziomie pojedynczych komórek z powodzeniem wykryliśmy główne populacje starcze C12FDG+EdU-Ki67+ w leczonych komórkach KARPAS422 i WSU-DLCL2 oraz w mniejszym stopniu w komórkach OCI-LY1, podczas gdy linia komórkowa SU-DHL6 była oporna na leczenie. Różnica w zdolno...

Różnorodność bodźców może wywołać starzenie się komórek, powodując wejście komórek w stan stabilnego zatrzymania cyklu komórkowego. Bodźce te obejmują wewnętrzne zmiany sygnalizacyjne lub stresy zewnętrzne. Sygnały wewnętrzne obejmują postępujące skracanie telomerów, zmiany w strukturze telomerów, modyfikację epigenetyczną, zaburzenia proteostazy, dysfunkcję mitochondriów i aktywację onkogenów. Stresy zewnętrzne obejmują sygnały stanu zapalnego i/lub uszkodzenia tkanek, promieniowanie lub leczenie chemiczne oraz deprywację żywieniową1,2,3,4. Wśród różnych typów starzenia najczęściej obserwowane i dobrze zbadane to starzenie replikacyjne, starzenie się wywołane onkogenem (OIS), starzenie się wywołane promieniowaniem i starzenie się wywołane terapią (TIS). OIS jest ostrą odpowiedzią komórkową na uszkodzenia genotoksyczne spowodowane stresem replikacyjnym generowanym przez nieprawidłową aktywację onkogenu i może do pewnego stopnia zapobiec patologicznemu postępowi od zmiany przednowotworowej do pełnoobjawowego guza. TIS występuje, gdy komórki nowotworowe są zestresowane przez chemioterapeutyki lub promieniowanie jonizujące5,6.
Starzenie się jest uważane za miecz obosieczny w patologii ze względu na jego wysoce dynamiczną naturę. Początkowo został opisany jako korzystny mechanizm hamujący nowotwór, który usuwa uszkodzone komórki z krążącej puli dzielących się komórek, chroniąc normalne funkcjonowanie narządów i hamując wzrost guza7,8,9. Jednak pojawiające się dowody sugerują ciemną stronę starzenia się. Starzejące się komórki wydzielają cytokiny prozapalne, znane jako fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP), co prowadzi do zwłóknienia i nieprawidłowego funkcjonowania narządów oraz sprzyja inicjacji i progresji nowotworu10. Co więcej, starzejące się komórki nowotworowe przechodzą przeprogramowanie epigenetyczne i ekspresję genów równolegle z przebudową chromatyny i aktywacją trwałej odpowiedzi uszkodzenia DNA (DDR)11,12, nowo uzyskując nowe właściwości komórek macierzystych raka3. Chociaż nowotwory zdolne do starzenia się lepiej reagują na interwencję terapeutyczną w porównaniu z nowotworami niezdolnymi do starzenia się13, utrzymywanie się komórek starczych może prowadzić do złego rokowania długoterminowego, jeśli nie zostaną one skutecznie zidentyfikowane i wyeliminowane przez leki senolityczne5. Tak czy inaczej, wiarygodna metoda oceny starzenia ma duże znaczenie kliniczne, nie tylko ze względu na rokowanie w leczeniu, ale także ze względu na rozwój nowych strategii ukierunkowanych na komórki starcze.
Niezależnie od różnych wyzwalaczy, komórki starcze wykazują pewne cechy wspólne, w tym powiększoną, spłaszczoną, wielojądrową morfologię z dużymi wakuolami, znacznie rozszerzone jądra, tworzenie bogatej w H3K9me3 heterochromatyny związanej ze starzeniem (SAHF) w jądrze, uporczywe gromadzenie markera uszkodzenia DNA γH2AX ogniska, aktywowane p53-p21CIP1 i Rb-p16INK4a mechanizmy regulacyjne cyklu komórkowego, stabilne zatrzymanie cyklu komórkowego G1, masowa indukcja SASP i podwyższona aktywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związana ze starzeniem14. Ponieważ żaden pojedynczy marker nie jest wystarczający do zdefiniowania starzenia, barwienie enzymatyczne aktywności SA-β-gal, które jest uważane za złoty standard wykrywania starzenia, jest zwykle łączone z barwieniem immunohistochemicznym dla H3K9me3 i Ki67 w celu wykrycia TIS15. Jednak chemiczny SA-β-gal na bazie chromogenów jest trudny do określenia ilościowego. W tym przypadku połączyliśmy wykrywanie 5-dodekanoilaminofluoresceiny-di-β-D-galaktopyranozydu (C12FDG) opartego na fluorescencji SA-β-gal (fSA-β-gal) z barwieniem immunofluorescencyjnym dla γH2AX i DNA włączonego do EdU w celu identyfikacji komórek starczych C12FDG+EdU-γH2AX+ za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania cytometru przepływowego, który łączy szybkość, czułość i szczegółowe obrazy pojedynczych komórek z informacjami przestrzennymi, których nie może dostarczyć cytometria przepływowa i mikroskopia. Metoda ta umożliwia szybkie generowanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na pozycjonowanie i kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych w komórkach, przy jednoczesnym licencjonowaniu szybkiej analizy wielu próbek poprzez budowę standardowych rurociągów.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-H2A.X Phospho (Ser139) Przeciwciało anty-H2A.X</td><td>Biolegend</td><td>613407</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Ki-67 (Alexa Fluor 647)</td><td>Biolegend</td><td>350509</td><td></td></tr><tr><td>C12FDG (5-dodekanylaminofluoresceina di-&beta;-D-galaktopiranozyd)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590276</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquin-difosforan</td><td>Sigma aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser (Coulter Clenz)</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy obrazu Click-iT EdU Pacific Blue Flow</td> Thermo <td>Scientific</td><td>C10418</td><td></td></tr><tr><td>Daunorubicin</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-13062A</td><td></td></tr><tr><td>Debubbler (70% Isopropanol)</td><td>Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu (Amnis&nbsp; POMYSŁY&nbsp; 6.3)</td> <td>Luminex</td><td>CN-SW69-12</td><td></td></tr><tr><td>Instrument i oprogramowanie do obrazowania (Amnis&nbsp; ImageStreamX&nbsp; System obrazowania cytometru przepływowego Mk II i oprogramowanie INSPIRE)</td><td>Luminex</td><td>100220</td><td></td></tr><tr><td>KARPAS</td><td>DSMZ</td><td>ACC 31</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksyloamina mafosfamidowa</td><td>Niomech</td><td>D-17272</td><td></td></tr><tr><td>OCI-LY1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 722</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>11473704</td><td></td></tr><tr><td>PETG (2-fenyloetylo-&beta;-D-tiogalaktozyd)&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>P4902</td><td></td></tr><tr><td>saponina</td><td>Sigma aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Osłona</td><td>Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw SpeedBead do</td> sterylizatora ImageStream <td></td><td>Luminex 400041</td><td></td></tr><tr><td>(0,4-0,7% podchlorynu)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>SU-DHL6</td><td>DSMZ</td><td>ACC 572</td><td></td></tr><tr><td>WSU-DLCL2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 575</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Leki chemioterapeutyczne mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia DNA w komórkach nowotworowych, prowadząc do apoptozy lub przedwczesnego starzenia. W przeciwieństwie do apoptotycznej śmierci komórki, starzenie się jest zasadniczo inną maszynerią hamującą rozprzestrzenianie się komórek rakowych. Dziesięciolecia badań naukowych ujawniły złożone patologiczne skutki starczych komórek rakowych w guzach i mikrośrodowiskach, które modulują komórki rakowe i komórki zrębu. Nowe dowody sugerują, że starzenie się jest silnym czynnikiem prognostycznym podczas leczenia raka, dlatego niezbędne jest szybkie i dokładne wykrywanie komórek starczych w próbkach raka. W pracy przedstawiono metodę wizualizacji i wykrywania starzenia się wywołanego terapią (TIS) w komórkach nowotworowych. Linie komórkowe chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) potraktowano mafosfamidem (MAF) lub daunorubicyną (DN) i zbadano pod kątem markera starzenia, β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-gal), markera syntezy DNA 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU) i markera uszkodzenia DNA gamma-H2AX (γH2AX). Obrazowanie cytometrem przepływowym może pomóc w generowaniu obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości w krótkim czasie, aby jednocześnie wizualizować i określać ilościowo trzy markery w komórkach nowotworowych.

Macierz kompensacyjną wygenerowano przy użyciu oprogramowania do analizy obrazów poprzez wprowadzenie zarejestrowanych danych z próbek kontrolnych jednobarwnych. Jak pokazano w Rycina uzupełniająca S1, niepomijalny (wartość współczynnika ≥ 0,1) przesiew światła z EdU do C12Wykryto FDG z wartością współczynnika crosstalk wynoszącą 0,248, podczas gdy crosstalk pomiędzy pozostałymi kanałami nie był istotny. Cztery różne linie komórkowe DLBCL poddano działaniu 5 µg/mL MAF lub 20 ng/mL DN w celu in...

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Metoda ta może szybko generować obrazy o wysokiej rozdzielczości, które umożliwiają analizę rozkładu przestrzennego i kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych w komórkach, umożliwiając jednocześnie szybką analizę wielu próbek. Komórki są mierzone za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania cytometrii przepływowej, łączącego szybkość, czułość i szczegółowe obrazy pojedynczych komórek z informacjami przestrzennymi, dostarczając unikalnych danych, których nie można uzyskać za pomocą optometrii przepływowej lub mikroskopii. Jedną z ważnych rad jest zapewnienie wystarczającej liczby komórek do ustalenia ustawień przyrządu i zawieszamy komórki o dużej gęstości na czas pomiarów.Poza tym pozyskiwanie danych jest proste i podobne do konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Najpierw wygeneruj linie komórkowe DLBCL zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie dodać 10 milimolowy roztwór EdU w stosunku jeden do 1000 do hodowli komórkowej DLBCL i inkubować płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny po wymieszaniu płytki przez delikatne kołysanie.Po inkubacji wyjąć płytkę i dodać 100 milimolowy roztwór chlorochiny do końcowego stężenia 75 mikromolowych. Wymieszaj, delikatnie kołysząc i inkubuj przez 30 minut. Następnie dodać 20 milimolowych roztworów C12 FDG do końcowego stężenia 20 mikromolów.Po delikatnym wymieszaniu inkubować płytkę przez godzinę, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj 100 milimolowy roztwór 2-fenyloetylo-beta-d-d-tiogalaktozydu w stężeniu od jednego do 50, aby zatrzymać barwienie beta-galu FSA. I delikatnie obróć płytkę, aby wymieszać.Przenieś komórki do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów i wiruj z prędkością 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu przemyć komórki czterema mililitrami PBS i odwirować w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 mikrolitrach w 4% roztworze utrwalającym paraformaldehyd.Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i przemyć komórki dwukrotnie czterema mililitrami PBS i odwirować w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu do przepuszczalności saponin.Teraz przenieś zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Osadzać komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwotnego i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, w ciemności.Odwirować probówki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i przemyć 100 mikrolitrami roztworu saponinowego. Po dwukrotnym umyciu komórek wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w 500 mikrolitrach koktajlu detekcyjnego EdU.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności i wirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i przemyć jednym mililitrem roztworu saponinowego. Powtórzyć mycie dwa razy, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 20 do 50 mikrolitrach PBS.Przed włączeniem przyrządu opróżnij butelkę ze zużytym płynem i sprawdź poziom SpeedBeads, sterylizatora, środka czyszczącego, odbąbelkowca i wystarczającej ilości płynów. Po włączeniu przyrządu i oprogramowania do obrazowania kliknij przycisk uruchamiania, aby zainicjować fluidykę i kalibrację systemu. Ustaw powiększenie na 40 razy i ustaw prędkość płynu na niską.Po włączeniu laserów włącz laser o długości 405 nanometrów do pomiaru EdU Pacific Blue, 488 nanometrów do pomiaru C12-FDG oraz 642 nanometry do pomiaru Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Ustaw kanał szósty dla kanału rozproszonego, kanał pierwszy i kanał dziewiąty dla jasnego pola. Następnie zacznij od próbki, która ma mieć najwyższą fluorescencję, aby ustawić intensywność laserów i delikatnie odwróć probówkę z próbką, aby wymieszać.Po otwarciu pokrywy probówki włóż probówkę z próbką do stacji dokującej. Kliknij Załaduj, aby rozpocząć i otworzyć wykres punktowy. Następnie wybierz obszar Cechy, podkreślenie MO1 i podkreślenie współczynnika proporcji MO1 odpowiednio dla osi X i Y.Ustaw współczynnik proporcji bramki powyżej 0,5, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek poniżej i po prawej stronie oraz populację SpeedBead po lewej stronie. Teraz otwórz wykres histogramu i wybierz średni kwadrat gradientu cech maski pierwszej i kanał pierwszy dla osi X. Wybierz populację singletów i ustaw bramkę, aby wybrać dla skoncentrowanych komórek.Otwórz wykres histogramu i wybierz nieprzetworzone maksymalne intensywności pikseli dla kanałów osi X 2, 7 i 11. Następnie dostosuj moce laserów 488 nanometrów, 405 nanometrów i 642 nanometrów odpowiednio dla kanału drugiego, siódmego i 11, tak aby każdy fluorochrom miał surową maksymalną wartość piksela między 100 a 4 000, aby uniknąć przesycenia. Wybierz skoncentrowaną populację do zarejestrowania i kliknij przycisk Pobierz, aby zmierzyć próbki DLBCL ze spójnymi ustawieniami.Zmieniając próbki do pomiaru, kliknij przycisk powrotu, aby odzyskać probówkę z próbką. Naciśnij przycisk Załaduj, aby wyrzucić próbkę. Po zmierzeniu wszystkich próbek wyłącz jasne pole i laser rozproszony.Zmierz pojedyncze próbki kontrolne koloru, aby wygenerować macierz kompensacji. Kliknij przycisk Shutdown (Zamknij), aby zamknąć system obrazowania. Przeanalizuj dane w oprogramowaniu do analizy obrazu.Użyj narzędzia Spot Wizard w oprogramowaniu do analizy obrazów, aby automatycznie zliczyć i określić ilościowo ogniska jądrowej gammy H2AX i obrazy żywych komórek. Wybierz dwie populacje komórek, jedną z wysoką i jedną z niską liczbą plamek, aby przeszkolić Kreatora lokalizacji w celu dalszej automatycznej analizy zliczania plamek. Metoda cytometrii przepływowej w obrazach pojedynczych komórek wykazała zwiększoną populację C12-FDG dodatnią, ujemną EdU, gamma H2AX-dodatnią, starzejącą się populację i KARPAS422.Komórki WSU-DLCL2 i OCI-LY1, ale nie w komórkach SU-DHL6. Analiza oparta na obrazowaniu wykazała znacznie wyższą liczbę ognisk i KARPAS422 gamma H2AX, WSU-DLCL2 i OCI-LY1, ale nie w komórkach SU-DHL6. Podobne wyniki uzyskano w odniesieniu do częstości występowania i danych ilościowych.Dodanie saponiny do zawiesiny komórkowej ma kluczowe znaczenie, w przeciwnym razie przeciwciała nie mogą dotrzeć do wewnętrznych antygenów komórki, a ostre detergenty prowadzą do utraty sygnału C12-FTG Cytometria obrazowa jest optymalna do analizy zmian w lokalizacji markerów, takich jak translokacja czynnika transkrypcyjnego do jądra w odpowiedzi na określone bodźce. Taką analizę można również przeprowadzić za pomocą naszego protokołu. Metoda ta pozwala na wizualizację wielu markerów fluorescencyjnych na poziomie pojedynczej komórki, co pomaga w wykryciu obecności, intensywności i lokalizacji poszczególnych sygnałów.

simultaneous-imaging-flow-cytometry-based-detection-multiple

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Poznaj zaawansowaną cytometrię przepływową do jednoczesnego obrazowania i wykrywania wielu markerów starzenia w komórkach DLBCL. Ta metoda łączy szybkość analizy z wysoką rozdzielczością obrazów komórek pojedynczych.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Przeglądaj więcej filmów