Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów w niskich stężeniach za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM)

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zademonstrowanie wykrywania mikroorganizmów na bardzo niskich poziomach za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej. Technika ta jest bardziej czuła niż tradycyjna mikroskopia świetlna i dostarcza informacji o zachowaniu bakterii w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologicznej i kosmologicznej, takie jak poszukiwanie organizmów chorobotwórczych w wodzie lub życia w naszym Układzie Słonecznym na lodowych księżycach.

Główną zaletą tej techniki jest to, że DHM jest techniką wolumetryczną, co oznacza, że możemy natychmiast uchwycić trójwymiarowe informacje na naszej próbce, bez konieczności fizycznego ponownego ustawiania ostrości. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania zakażeń krwią lub płynem mózgowo-rdzeniowym ze względu na zdolność do wykrywania niskich stężeń bakterii. Aby rozpocząć tę procedurę, w dniu eksperymentu należy wykonać spektrofotometryczny odczyt głównej kultury bakteryjnej, który powinien mieścić się w zakresie od 0,6 do 0,7.

Następnie pobiera się próbkę kultury wzorcowej i liczy komórki bezpośrednio za pomocą komory liczącej Petroffa-Haussera w celu zliczenia zarówno żywych, jak i martwych komórek. Przenieść 10 mikrolitrową próbkę nierozcieńczonej kultury za pomocą mikropipety do komory. Zobrazuj go pod mikroskopem obiektywowym o wysokiej wilgotności suchej, używając kontrastu fazowego.

Następnie policz bakterie w co najmniej 20 kwadratach i uśrednij je. Obliczyć stężenie jako średnią z 20 kwadratów pomnożoną przez współczynnik rozcieńczenia. Aby policzyć tylko żywe komórki, należy wykonać seryjne rozcieńczenie każdej z wybranych próbek bakteryjnych sterylnym 0,9% roztworem soli fizjologicznej, przenosząc 20 mikrolitrów roztworu bakteryjnego do innego dołka i rozcieńczając go 180 mikrolitrami soli fizjologicznej.

Powtarzaj procedurę, aż najniższe stężenie wyniesie około 10 do trzech komórek na mililitr. Następnie należy pobrać 100 mikrolitrów próbek z co najmniej dwóch rozcieńczeń i ułożyć je na odpowiednich płytkach z pożywkami stałymi. Rozprowadzić je za pomocą sterylnego rozsiewacza i wykonać co najmniej trzy powtórzenia każdego rozcieńczenia.

Następnie inkubuj je w odpowiedniej temperaturze przez noc lub do momentu, gdy kolonie wyrosną. Następnie policz kolonie. Obliczyć jednostki tworzące kolonie i uśrednić je przez kontrpróby.

W tej procedurze należy wykonać seryjne rozcieńczenia kultury głównej dla DHM i liczenie CFU po DHM na płytkach pożywki bulionowej lizogenii. Rozcieńczyć bakterie w 25 mililitrach minimalnej pożywki, która pobudzi ruchliwość, ale zahamuje podział komórek, tak aby stężenie komórek nie zmieniło się znacząco podczas eksperymentu. Aby nagrać filmy DHM, za pomocą sterylnej strzykawki należy pobrać około 10 mililitrów interesującego Cię rozcieńczenia.

Następnie podłączyć strzykawkę do komory na próbki DHM za pomocą sterylnych złączek i przewodów. Próbka ze strzykawki przepływa przez komorę na próbkę w sposób ciągły za pomocą pompy strzykawkowej. Gdy próbka przepływa przez komorę na próbkę, hologramy są kolejno rejestrowane z odpowiednią szybkością klatek.

Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby całe 10 mililitrów próbki przepłynęło przez DHM. Aby upewnić się, że bakterie nie rosną ani nie umierają podczas eksperymentów, należy zaszczepić wzbogacone płytki pożywki 100 mikrolitrami zużytej pożywki po przechwyceniu obrazu DHM, rozprowadzając go za pomocą sterylnego rozsiewacza. Następnie inkubuj je w odpowiedniej temperaturze przez 24 godziny przed policzeniem kolonii.

Dokładna liczba komórek jest niezbędna do ilościowego określenia granic wykrywalności. Ważne jest, aby wszystkie rozcieńczenia wykonywać z dużą starannością przy użyciu skalibrowanych mikropipet i potwierdzać wszystkie zliczenia za pomocą gęstości optycznej, galwanizacji i bezpośredniego liczenia w komorze Petroffa-Haussera. Aby przeanalizować dane pod kątem obecności bakterii w pozyskanych filmach z hologramami, przeprowadź filtrowanie odejmowane przez medium, najpierw konwertując obrazy do formatu 32-bitowego.

Następnie oblicz medianę wartości pikseli. Na koniec odejmij tę medianę od każdego odpowiedniego piksela, aby wyeliminować nieruchome artefakty w hologramie. Następnie ręcznie policz liczbę widocznych pierścieni obszaru i komórek z fokusem.

Do każdej serii hologramów będzie dołączony plik ze znacznikiem czasu. Użyj pliku znacznika czasu, aby obliczyć całkowitą ilość próbki pompowanej w momencie przechwycenia obrazu. Następnie oblicz gęstość komórek, dzieląc całkowitą liczbę wykrytych komórek przez całkowitą objętość zobrazowanej próbki.

Średnia od pięciu do 10 klatek, aby uzyskać dokładne statystyki. Ten wykres przedstawia przewidywane komórki na pole widzenia na podstawie objętości próbki 365 mikrometrów na 365 mikrometrów na jeden milimetr. W przypadku stężeń, w których liczba komórek w polu widzenia spada poniżej jednego, w celu uzyskania wykrycia wymaganych jest wiele obrazów.

Jest to sekwencja hologramu DHM kultury Serratia marcescens przy 2 100 komórkach na mililitr mierzona liczbą płytek. Sekwencja pokazuje jedną komórkę mniej więcej co jedną do dwóch sekund, co doskonale pasuje do przewidywania. A to jest kolejna sekwencja hologramu DHM kultury Serratia marcescens przy 620 komórkach na mililitr mierzona liczbą płytek.

Ta sekwencja pokazuje jedną komórkę mniej więcej co sześć do siedmiu sekund. Używając cyfrowej mikroskopii holograficznej do obrazowania komórek, należy pamiętać o stosowaniu technik sterylizacji filtracyjnej podczas przygotowywania wszystkich roztworów. Pozwoli to uniknąć wprowadzania cząstek stałych do urządzenia.

Próbując tej procedury, należy pamiętać o przygotowaniu zdrowych kultur komórkowych i mieć pod ręką dodatkowe podłoże wzrostowe, płytki i pożywkę o ruchliwości. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie fluorescencyjne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak procent komórek żywych i martwych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią do badania trójwymiarowej ruchliwości w hodowanych komórkach i próbkach środowiskowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak liczyć bakterie za pomocą mikroskopii holograficznej i walidować wyniki przy użyciu innych technik liczenia. Nie zapominaj, że praca z kulturami bakteryjnymi może być bardzo niebezpieczna. Podczas uprawy i obchodzenia się z żywymi organizmami należy zawsze podejmować odpowiednie środki ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.