Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie podstawowych cech fizycznych próbek komórkowych, w tym masy i objętości, za pomocą standardowego mikroskopu optycznego i przetwarzania obrazu. Osiąga się to poprzez pierwsze zamontowanie próbek komórkowych wyhodowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych na szkiełkach mikroskopowych. Następnie uzyskuje się obrazy o kontraście poprzez ostrość, jasne pole i interferencję różnicową.

Następnie każdy stos obrazów Z jest wprowadzany do oddzielnych programów do przetwarzania obrazów MATLAB, które wyodrębniają dane fizyczne. Ostatecznie podstawowe właściwości fizyczne próbek komórkowych uzyskuje się za pomocą pomiarów intensywności ogniskowania, w świetle kontrastu jasnego pola i mikroskopii kontrastu różnicowego interferencyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że próbki komórkowe nie muszą być utrwalane, przenikane ani barwione.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak sposób, w jaki gęstość subkomórkowa jest zorganizowana podczas cyklu komórkowego lub między różnymi populacjami komórek przyczyniającymi się do stanu chorobowego Korzystanie z mikroskopu z możliwościami zarówno DIC, jak i jasnego pola oraz dodatkowymi specyfikacjami zgodnie z protokołem tekstowym zacznij od otwarcia oprogramowania do tworzenia slajdów i tworzenia nowego slajdu do zbierania obrazów. Następnie otwórz okno ostrości i w sekcji zestawu filtrów wybierz DIC Na karcie zakresu pod sekcją kondensora ustaw suwak przysłony w najdalszej prawej pozycji. Zapewnia to wysokie oświetlenie apertury numerycznej i poprawia przekrój optyczny próbki.

Po przechwyceniu stosu DIC próbki otwórz okno fokusu i wybierz opcję otwórz. W sekcji zestawu filtrów ustaw suwak przysłony w najdalszej lewej pozycji, całkowicie zamknięty, aby zapewnić słabe oświetlenie NA. Po dostosowaniu intensywności sygnału otwórz okno przechwytywania obrazu.

Ustawienia przechwytywania 3D z akwizycji stosu DICZ zostaną wyświetlone w sekcji zestawu filtrów w oknie przechwytywania obrazu. Zaznacz otwarte pole i określ czas ekspozycji. W sekcji informacji o obrazie nazwij obraz i wybierz opcję Start, aby zainicjować pobieranie obrazu Zack.

Następnie wyeksportuj stosy Z zgodnie z protokołem tekstowym, aby jednorazowo przeprowadzić pomiary objętości w programie H-T-D-I-C MATLAB zatytułowanym JoVE HT DCO V one M W sekcji zero zaktualizuj zmienną katalogu zależności, kopiując i wklejając katalog zawierający hilbert. Przekształć DM i sobel edge Wykryj pliki M z eksploratora. Pomiędzy pojedynczymi cudzysłowami następujące zależności katalog równa się wykonaj sekcję zero programu joco HT DCO V one M.

W sekcji pierwszej zaktualizuj katalog obrazów, kopiując i wklejając katalog zawierający obrazy z fokusem w formie TIF kropki. Pomiędzy pojedynczymi cudzysłowami uruchom tę sekcję tylko raz, aby wyrównać i obrócić obrazy. W przypadku transformaty Hilberta uruchom drugą sekcję kodu: Pojawi się okno dialogowe zatytułowane Definiowanie parametrów HT DIC.

Następnie wprowadź numer płaszczyzny ogniskowej, w której obraz DIC próbki jest ostry, rozdzielczość poprzeczną, rozdzielczość osiową, kąt obrotu obrazu DIC potrzebny do wykonania transformaty Hilberta i na końcu rozmiar obszaru zainteresowania. Następnie kliknij przycisk OK. Obraz płaszczyzny ogniskowej DIC określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej zostanie wyświetlony z niebieskim polem.

Umieść pole nad interesującym elementem, takim jak komórka. Po umieszczeniu pola nad żądanym obszarem kliknij dwukrotnie wewnątrz B. Kontrast obrazu powinien być taki, aby ciemne cechy pojawiały się po lewej stronie, a jasne po prawej. Przeciągnij niebieskie pole na obszar zainteresowania i zmień kształt w razie potrzeby.

Następnie, w sekcji trzeciej, aby wygenerować maskę prostokątną, usuń linię komentarza 1 6 7 i linię komentarza 1 7 0 wykonaj sekcję trzecią programu, klikając obraz i przeciągając mysz, aby rozpocząć definiowanie maski prostokątnej. Następnie kliknij dwukrotnie pole, aby je zaakceptować. Aby wygenerować ręcznie rysowaną maskę, skomentuj linię 1 6 7 i usuń komentarz wiersza 1 7 0 przed wykonaniem sekcji trzeciej Klikając i rysując żądaną maskę za pomocą myszy, kliknij dwukrotnie maskę, aby zaakceptować ją po uruchomieniu sekcji czwartej, aby skonstruować stosy obrazów przekształconych przez Hilberta zgodnie z uruchomieniem protokołu tekstowego sekcja piąta.

Aby zoptymalizować segmentację obrazu obrazów przekroju poprzecznego xz obszaru zainteresowania. Pojawi się rysunek 500 wygenerowany przez program, na którym wyświetlane są trzy różne typy kontrastu. Powodzenie algorytmu w celu znalezienia granic komórki zależy od kombinacji użytej maski i wartości progu w wierszu 2, 2, 9 programu, zacznij od wartości 0,5 i dostosuj wartość progu i uruchom ponownie tę sekcję programu, aż zostanie osiągnięty właściwy konspekt w jednej z kolumn

Jeśli konspekt był najlepszy w kolumnie pierwszej, w segmentacji DIC użyj sekcji szóstej, aby określić objętość. Jeśli kolumna druga dała optymalne wyniki, uruchom sekcję siódmą, aby określić objętość komórki na podstawie Hilberta, przekształć obrazowanie DIC JEŚLI kolumna trzecia dała optymalne wyniki, użyj zobrazowania DIC z filtrem Hilberta podczas wykonywania sekcji ósmej, aby określić objętość do wykonania pomiarów masy w programie NIQ PM MATLAB i zatytułować JO VCO NI qpm V1 M W sekcji zero. Zaktualizuj lokalizację trzech zależności katalogów, katalogu BRIGHTFIELD i DIC po uruchomieniu sekcji pierwszej, uruchom sekcję drugą w oknie dialogowym zatytułowanym definiuj parametry N-I-Q-P-M, wprowadź numer płaszczyzny ogniskowej, w której obraz jasnego pola próbki jest ostry, rozdzielczość poprzeczną, rozdzielczość osiową i rozmiar obszaru zainteresowania.

Następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się obraz płaszczyzny ogniskowej jasnego pola określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej z niebieskim polem. Po dostosowaniu ostrości, jeśli to konieczne, poprzez ponowne uruchomienie sekcji drugiej, przeciągnij ramkę wokół obrazu i wybierz węzły pola, a następnie przeciągnij je, aby zmienić jego rozmiar, a następnie kliknij dwukrotnie wewnątrz pola, aby je zaakceptować.

Po skonstruowaniu stosu obrazów jasnego pola poprzez uruchomienie sekcji trzeciej, uruchom sekcję czwartą, aby wygenerować mapę faz, obrazy pseudo DIC i porównania ze obrazami jasnego pola i prawdziwym obrazem DIC, gdy pseudo DIC i prawdziwe obrazy DIC są tak podobne, jak to możliwe, uruchom sekcję piątą A lub piątą B, która pozwala użytkownikowi obrysować komórkę w celu wygenerowania mapy gęstości masy, Całkowita masa i histogram gęstości komórek są prawidłowe. Oświetlenie próbki podczas akwizycji obrazu przez ogniskowanie ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej implementacji algorytmu N-I-Q-P-M i H-T-D-I-C. Rysunek ten ilustruje niskie i wysokie oświetlenie NA zarówno przy DIC jak i kontraście jasnego pola dla kuli polistyrenowej i ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego SW six 20.

Panele te demonstrują optymalne obrazowanie dla N-I-Q-P-M, a te z kolei wyświetlają optymalne obrazowanie dla HT DIC. Obrazy te pokazują zależność od parametrów algorytmu NIQ PM, podkreślając zarówno udane, jak i nieudane implementacje. Tutaj badamy profil fazowy kuli z polistyrenu o średnicy 4,8 mikrometra.

Oczekiwany profil jest znany teoretycznie, a zatem może być bezpośrednio porównany z rekonstrukcją NIQ PM. Panele te prezentują najlepszą możliwą do uzyskania rekonstrukcję dla efektów dyfrakcji sfery zarówno na granicach kuli, jak i wewnątrz, uniemożliwiając stabilną rekonstrukcję we wszystkich punktach kuli. Centralny obszar kuli można uchwycić za pomocą N-I-Q-P-M z błędem procentowym od jednego do 5%, jak widać w próbkach komórkowych Panelu L, których właściwości fazowe nie są znane.

A priori można zrekonstruować za pomocą NIQ PMM w połączeniu z procedurą porównywania obrazu pseudo DIC z rzeczywistym obrazem DIC. N-I-Q-P-M posiada jeden wolny parametr. Płaszczyzna stosu obrazów w prawym polu, na której jest wyśrodkowane obliczenie.

Ta centralna płaszczyzna ogniskowej powinna być dostosowywana do momentu, gdy obrazy pseudo DIC i prawdziwe DIC będą wyglądać tak podobnie, jak to tylko możliwe. Przedstawiono tutaj nieostry obraz pseudo DIC, optymalny obraz pseudo DIC i odpowiadający mu obraz DIC komórki wykonany przy oświetleniu NA 0,9. Co ciekawe, najlepsza mapa fazowa i odpowiadający jej obraz pseudo DIC niekoniecznie odpowiadają ostremu obrazowi w jasnym polu, jak pokazano na tych panelach.

Na koniec, pokazano tutaj kroki związane z algorytmem przetwarzania obrazu H-T-D-I-C od DIC przez obrazowanie ostrości pod oświetleniem NA równym 0,9, transformacja Hilberta jest wykonywana w celu usunięcia reliefu podstawy obrazów DIC. Wiąże się to z pewnym rozmyciem wzdłuż osi optycznej, które można usunąć z filtrowania górnoprzepustowego. Te końcowe obrazy można łatwo podzielić na segmenty w celu określenia obszaru w każdej płaszczyźnie przekroju poprzecznego próbki, aby wywnioskować całkowitą objętość komórkową.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym oświetleniu dla obrazowania różnicowego w świetle jasnego pola lub kontrastu po tej procedurze. Inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, mogą być wykonane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania za pomocą kolokalizacji siły podłogi z mapami gęstości próbki.