Name: Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Poznaj ilościową mikroskopię optyczną do pomiaru masy, objętości i gęstości komórek żywych bez konieczności ich utrwalania lub barwienia. Ta technika wykorzystuje standardowy mikroskop optyczny z obrazowaniem brightfield i DIC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (U54CA143906 dla K.G.P., O.J.T.M. i R01HL101972 dla O.J.T.M.) oraz Oregon Medical Research Foundation Early Clinical Investigator Award (K.G.P.). O.J.T.M. jest badaczem ustanowionym przez American Heart Association (13EIA12630000). Dziękujemy dr Ericowi Andersonowi z Knight Cancer Institute za przygotowanie próbek komórek wykorzystywanych w tej pracy.

1. Specyfikacja mikroskopu
Aby prawidłowo przeprowadzić obrazowanie, mikroskop powinien mieć następujące specyfikacje:
<ol>
	<li>Posiadają zarówno różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), jak i kontrast jasnego pola (BF).</li>
	<li>Mają sterowany komputerowo ruch osi z.</li>
	<li>Mają regulowany ogranicznik przysłony, aby zmieniać przysłonę numeryczną obiektywu kondensora. Przysłona z stopniowaną liniałą lub odczytem elektronicznym jest wymagana, aby znać wartość otworu numerycznego. Apertura numeryczna powinna wynosić od 0,1 dla NIQPM do 0,9 (lub więcej) dla HTDIC.</li>
	<li>Mikroskop powinien być wyposażony w wąskopasmowy filtr barwny, który ma być używany do obrazowania w jasnym polu. Filtr ten jest wymagany do ustalenia przyrostu refrakcji, tekstury zależnej od długości fali, używanej do konwersji gęstości fazy na masę dla NIQP.</li>
</ol>
2. Akwizycja różnicowego kontrastu zakłóceń (DIC) Z-stack
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie SlideBook i utwórz nowy slajd do kolekcji obrazów.</li>
	<li>Następnie otwórz okno ostrości. W sekcji Filter Set (Zestaw filtrów) wybierz pozycję DIC. Na karcie Zakres, w sekcji Kondensator, ustaw suwak Przysłona w najdalszej prawej pozycji (otwarty do końca). Zapewnia to wysokie oświetlenie apertury numerycznej i poprawia przekrój optyczny próbki.</li>
	<li>Skoncentruj się na próbie, korzystając z obiektywu DIC. Dostosuj intensywność lampy halogenowej, aż próbka będzie dobrze widoczna. Aby upewnić się, że aparat nie jest nasycony, wybierz kartę Kamera w oknie ostrości i sprawdź, czy histogram intensywności pikseli mieści się w zakresie dynamicznym kamery.</li>
	<li>Otwórz okno Przechwytywanie obrazu. W sekcji Typ przechwytywania zaznacz pole 3D. W sekcji Przechwytywanie 3D zaznacz pola Zakres wokół środka i Wróć do bieżącego położenia, a następnie określ zakres kierunku Z, liczbę płaszczyzn i rozmiar kroku. Zakres kierunku Z powinien obejmować całą próbkę.</li>
	<li>W sekcji Filter Set (Zestaw filtrów) w oknie Image Capture (Przechwytywanie obrazu) zaznacz pole DIC (DIC) i określ czas ekspozycji. W sekcji Informacje o obrazie nazwij obraz (opcjonalnie) i wybierz opcję Uruchom, aby zainicjować obrazowanie.</li>
</ol>
3. Akwizycja stosu Z jasnym polem (BF)
<ol>
	<li>Gdy mikroskop zakończy zbieranie stosu DIC Z próbki, otwórz okno ostrości i wybierz Otwórz w sekcji Zestaw filtrów. Ustaw suwak przysłony w najdalszej lewej pozycji (całkowicie zamknięty), aby zapewnić słabe oświetlenie NA.</li>
	<li>Zmień filtr ścieżki światła mikroskopu na zielony. Dostosuj intensywność lampy halogenowej, aż próbka będzie widoczna. Upewnij się, że nie ma nasycenia aparatu, wybierając kartę Kamera w oknie ostrości i sprawdzając, czy histogram intensywności pikseli mieści się w określonym zakresie.</li>
	<li>Otwórz okno Przechwytywanie obrazu. Zostaną wyświetlone ustawienia przechwytywania 3D z akwizycji DIC Z-stack.</li>
	<li>W sekcji Filter Set (Zestaw filtrów) w oknie Image Capture (Przechwytywanie obrazu) zaznacz pole OPEN (OTWÓRZ) i określ czas ekspozycji. W sekcji Informacje o obrazie nazwij obraz (opcjonalnie) i wybierz pozycję Uruchom, aby zainicjować pobieranie obrazu stosu Z.</li>
</ol>
4. Eksportowanie obrazów Z-stack
<ol>
	<li>Otwórz ujęcie stosu Z. Zmień widok na 100%. Dostosuj histogram wartości pikseli, które mają być wyświetlane, w zakresie od 0 do maksymalnej wartości piksela kamery (4 095 dla kamer 12-bitowych, 65 535 dla 16 bitów).</li>
	<li>Wybierz opcję Widok > Eksportuj > serii TIFF. Spowoduje to wyeksportowanie stosu Z jako serii obrazów TIFF (po jednym dla każdej płaszczyzny Z). Zapisz serię TIFF w osobnym folderze o nazwie ze znakiem podkreślenia na końcu (np. "DIC Stack 1_"). Powtórz to z każdym stosem DIC lub BF Z.</li>
</ol>
5. Pomiary objętości
<ol>
	<li>Otwórz program HTDIC MATLAB o nazwie "JoVE_HTDIC_v1.m".</li>
	<li>W sekcji 0 programu HTDIC zaktualizuj zmienną katalogu zależności. Skopiuj i wklej katalog zawierający pliki hilbert_transform_dic.m i sobel_edge_detect.m z eksploratora (PC) pomiędzy pojedynczymi cudzysłowami po "dependencies_directory =". WykonajSekcja 0 programu JoVE_HTDIC_v1.m.</li>
	<li>W sekcji 1 zaktualizuj "images_directory". Ponownie skopiuj i wklej katalog zawierający obrazy z fokusem w .tif formie między pojedynczymi cudzysłowami. URUCHOM SEKCJĘ 1 TYLKO RAZ.</li>
	<li>Wyrównanie i obrót obrazów dla transformacji Hilberta Uruchom sekcję 2 kodu. Pojawi się okno dialogowe zatytułowane "Definiuj parametry HTDIC". Od użytkownika wymagane jest pięć liczb: numer płaszczyzny ogniskowej, w której obraz DIC próbki jest ostry, rozdzielczość boczna (μm/piksel na obrazie), rozdzielczość osiowa (wynosi 0,1 dla akwizycji obrazu w krokach osiowych 0,1 μm), kąt obrotu obrazu DIC potrzebny do wykonania transformaty Hilberta, Typowe wartości to 45 i -135. Na koniec wprowadź rozmiar obszaru zainteresowania, ten parametr określa długość boku pola, które następnie się pojawi - typowa wartość to 400. Kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Obraz płaszczyzny ogniskowej DIC określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej zostanie wyświetlony z niebieskim polem. Umieść pole nad interesującym Cię obiektem, np. komórką. Pudełko nie musi być kwadratowe. Po umieszczeniu pola w żądanym regionie kliknij dwukrotnie wewnątrz pola.</li>
	<li>Pojawi się teraz kolejna figura: ta figura zawiera przycięty i obrócony obraz obszaru zainteresowania wybranego w poprzednim kroku. Kontrast obrazu powinien być taki, aby ciemne rysy pojawiały się po lewej stronie, a jasne po prawej. Przeciągnij niebieskie pole na obszar zainteresowania i zmień kształt w razie potrzeby.</li>
	<li>Sekcja 3 generuje maskę dla kostki z-stack. Dostępne są dwa rodzaje masek: maska prostokątna do tworzenia prostokąta wokół komórki oraz narzędzie odręczne do ręcznego obrysowywania interesującej komórki przez obrys</li>.
	<li>Aby wygenerować maskę prostokątną, usuń komentarz z wiersza 167 i wiersza komentarza 170 (skomentuj wiersz, umieszczając znak "%" na początku tego wiersza). Wykonaj sekcję 3 programu. Kliknij na obrazie i przeciągnij myszą, aby rozpocząć definiowanie maski prostokątnej. Kliknij dwukrotnie pole, aby je zaakceptować.</li>
	<li>Aby wygenerować ręcznie rysowaną maskę, skomentuj wiersz 167 i odkomentuj wiersz 170, a następnie wykonaj polecenie Sekcja 3. Kliknij i narysuj żądaną maskę za pomocą myszy. Kliknij dwukrotnie maskę, aby ją zaakceptować.</li>
	<li>Uruchom sekcję 4, aby skonstruować stos obrazów DIC przekształcony przez Hilberta i odpowiadający mu stos obrazów DIC obszaru zainteresowania. Maska skonstruowana w sekcji 3 zostanie zastosowana do stosu DIC transformaty Hilberta i zwykłego stosu DIC, gdy "maskON" jest ustawione na 1 w wierszu 179. Ustawienie "maskON" na 0 spowoduje utworzenie stosów obrazów bez stosowania maski.</li>
	<li>Uruchom sekcję 5, aby zoptymalizować segmentację obrazów przekroju poprzecznego xz obszaru zainteresowania. Pojawi się rysunek 500 utworzony przez program, na którym wyświetlane są trzy różne typy kontrastu. Powodzenie algorytmu w znajdowaniu granic komórki zależy od kombinacji użytej maski i wartości "progu" w wierszu 229 programu. Zacznij od wartości 0,5. Dostosuj wartość progu i uruchom ponownie tę sekcję programu, aż zostanie osiągnięty prawidłowy konspekt w jednej z kolumn.</li>
	<li>Jeśli kontur był najlepszy w kolumnie 1, użyj sekcji 6, aby określić objętość za pomocą segmentacji obrazu DIC. Jeśli kolumna 2 dała optymalne wyniki, uruchom sekcję 7, aby określić objętość komórki na podstawie obrazów DIC przekształconych przez Hilberta. Jeśli kolumna 3 dała optymalne wyniki, uruchom sekcję 8, aby określić objętość przy użyciu przefiltrowanych przez Fouriera obrazów DIC z transformacją Hilberta.</li>
	<li>Zmierzona objętość próbki, podana w μm sześciennym (fl), jest przedstawiona w tytule rysunku 600, 700 lub 800 utworzonego przez program w zależności od wybranego pomiaru objętości.</li>
</ol>
6. Pomiary masy
<ol>
	<li>Otwórz program NIQPM MATLAB zatytułowany "JoVE_NIQPM_v1.m".</li>
	<li>W sekcji 0 programu NIQPM zaktualizuj lokalizację trzech katalogów potrzebnych do uruchomienia programu. Są to "dependencies_directory", "brightfield_directory" i "dic_directory".</li>
	<li>Następnie uruchom polecenie Sekcja 1. Ta sekcja kodu generuje kostkę obrazu z jasnym polem pełnego pola całego zestawu obrazów. URUCHOM SEKCJĘ 1 TYLKO RAZ.</li>
	<li>Następnie uruchom Sekcja 2. Pojawi się okno dialogowe zatytułowane "Definiowanie parametrów NIQPM". Od użytkownika wymagane są cztery liczby: numer płaszczyzny ogniskowej, w której wyostrzony jest obraz w jasnym polu próbki, rozdzielczość boczna (μm/piksel na obrazie), rozdzielczość osiowa (jest to 0,1 dla akwizycji obrazu w krokach osiowych 0,1 μm) oraz rozmiar obszaru zainteresowania, ten parametr określa długość boku pola, które następnie się pojawi - typowa wartość to 200. Kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Obraz płaszczyzny ogniskowej jasnego pola określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej zostanie wyświetlony z niebieskim polem.
	<ol>
		<li>Jeśli obraz nie jest ostry, kliknij dwukrotnie niebieskie pole i ponownie uruchom sekcję 2, pamiętaj o dostosowaniu numeru płaszczyzny ogniskowej w oknie dialogowym.</li>
		<li>Jeśli obraz jest ostry, przeciągnij niebieskie pole wokół obrazu i zmień jego rozmiar, zaznaczając węzły pola i przeciągając je w razie potrzeby. Umieść ramkę wokół interesującego Cię obiektu, np. komórki. Pudełko nie musi być kwadratowe. Kliknij dwukrotnie wewnątrz pola, aby je zaakceptować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie uruchom sekcję 3, aby skonstruować stos obrazów w jasnym polu przyciętych do obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Aby wygenerować mapę fazową, obraz pseudo DIC i porównania ze zobrazowaniem w jasnym polu i prawdziwym obrazem DIC, uruchom sekcję 4.</li>
	<li>Gdy obrazy pseudo DIC i true DIC są tak podobne, jak to tylko możliwe, mapę gęstości masy, masę całkowitą i histogram gęstości komórek można wyznaczyć, uruchamiając sekcję 5a lub 5b. Sekcja 5a przeprowadza automatyczne wykrywanie granicy pola - optymalizuj "próg" na linii 300 - typowe wartości wahają się w granicach 0,1-1. Uruchom ponownie tę sekcję zgodnie z potrzebami, aby zoptymalizować wartość progu. Sekcja 5b przeprowadza określenie masy itd. po tym, jak użytkownik nakreśli komórkę zainteresowania.</li>
</ol>

<ol><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Technische+Physik%22%5BJournal%5D)">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li>
<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+contrast%2C+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Physica%22%5BJournal%5D)">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li>
<li>Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li>
<li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinterf%C3%A9rom%C3%A8tre+diff%C3%A9rentiel+%C3%A0+ondes+polaris%C3%A9es%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Radium%22%5BJournal%5D)">Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li>
<li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Zeiss+Inform%22%5BJournal%5D)">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li>
<li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-enhanced+contrast%2C+differential+interference+contrast+%28VEC-DIC%29+microscopy%3A+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+processing+greatly+enhances+contrast%2C+quality%2C+and+speed+in+polarization-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li>
<li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+shape+change+and+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+microscopy+and+mass+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li>
<li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractometry+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li>
<li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li>
<li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li>
<li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide%E2%80%90field+differential+interference+contrast+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li>
<li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+%28TI-DIC%29+microscopy+for+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering-phase+theorem%3A+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li>
<li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Carr%C3%A9+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li>
<li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li>
<li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li>
<li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((non-iterative+phase+retrieval+by+Green%E2%80%99s+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">non-iterative phase retrieval by Green’s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li>
<li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quantification+of+cellular+mass%2C+volume%2C+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li>
<li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single+cell+refractive+index%2C+dry+mass%2C+volume%2C+and+density+using+a+transillumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li>
<li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li>
<li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cell+membrane+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li>
<li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li>
<li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22SLIM%29.+Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li>
<li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li>
<li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li>
<li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li>
<li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych w prezentowanej pracy.

Ogólnie rzecz biorąc, NIQPM jest techniką ograniczoną dyfrakcją, zwalidowaną na długościach ścieżek optycznych w zakresie od 0,25 do 44,7. Walidację przeprowadzono na kulkach polistyrenowych n = 1,596 o średnicy od 0,11 do 9,8 μm zawieszonych w Fluoromount G (dane nie pokazane). Komórki mają długości ścieżek optycznych, które wahają się od prawie 0 do 7.
Podczas pomiaru rozkładu gęstości próbki może się okazać, że obraz pseudo DIC wygląda dobrze, podczas gdy mapa gęstości zawiera niepożądane w...

Użycie mikroskopii optycznej jest obecnie wszechobecne w badaniu organizmów komórkowych. Ze względu na ich niską endogenną absorbancję i słabe właściwości rozpraszania w widzialnym widmie optycznym, komórki nie wpływają silnie na amplitudę przechodzących przez nie fal optycznych, a tym samym wydają się półprzezroczyste podczas obrazowania za pomocą standardowych mikroskopów jasnego pola. Próbki komórkowe spowalniają jednak fale optyczne przechodzące przez nie w sposób, który jest liniowo związany z ilością lokalnej gęstości masy w określonym obszarze przestrzeni, przez który przechodzi światło. Wykorzystanie tego heterogenicznego opóźnienia czasowego lub profilu "fazowego" fal optycznych przesyłanych przez mikroskopijne próbki zostało po raz pierwszy opisane w 1935 roku przez Fritsa Zernike'a 1 i eksperymentalnie zrealizowane przez Zernike'a w 1942roku. Za to osiągnięcie Zernike otrzymał Nagrodę Nobla w 1953 roku. Zeiss skomercjalizował tę modalność w 1945 roku3. W 1955 roku Smith i Nomarski przedstawili swoje wstępne prace nad zastosowaniem4 i teorią5 mikroskopii z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC), modalności, która wykorzystuje przestrzenny gradient fazy jako mechanizm kontrastu. DIC został skomercjalizowany przez firmę Zeiss w 1965 roku w ścisłej współpracy z Nomarski6. W 1981 r. dwa laboratoria zademonstrowały pierwsze zarejestrowane obrazy DIC na żywo z komórek po włączeniu kamer wideo do układu optycznego mikroskopu DIC 7,8. Narodziła się era obrazowania żywych komórek.
Od tego czasu wykonywanie zarówno kontrastu fazowego, jak i DIC w komercyjnych mikroskopach pozostało w dużej mierze niezmienione. Metody te są głównie wykorzystywane przez biologów do tworzenia obrazów komórek do celów jakościowych: monitorowania morfologii, śledzenia struktur subkomórkowych i badania dynamiki błon9. Techniki te są jakościowe w swojej "gotowej" konfiguracji, ponieważ zarówno obrazy fazowe, jak i DIC są arbitralnymi funkcjami natężenia źródła światła, ustawień optyki oświetlenia oraz ustawień wzmocnienia, gamma i ekspozycji kamery CCD.
Mały legion fizyków i inżynierów optycznych starał się, aby komercyjne metody obrazowania były ilościowe. Jednym z pierwszych wysiłków były dwa listy do Nature z 1952 i 1953 roku, w których lekarz, który stał się biofizykiem, Robert Barer, zademonstrował zastosowanie mikroskopii fazowej do określenia suchej masy komórkowej komórek poprzez oszacowanie przesunięć fazowych przez te typy komórek za pomocą komercyjnie dostępnego mikroskopu fazowego10,11. W ciągu następnych lat w tej dziedzinie opracowano wiele technik opartych na trzech podstawowych mechanizmach kontrastu bez znaczników: mikroskopia fazowa10,11, mikroskopia DIC12-17 i jasne pole18-22 w celu określenia długości ścieżki optycznej, fazy, gęstości masy, indeksu załamania światła i objętości komórkowej.
Równolegle, od lat 50. rozwijana jest również duża kolekcja niestandardowych instrumentów optycznych, które dokonały daleko idących pomiarów optycznych, począwszy od zastosowań w rozwoju pasożytów23, poprzez dokumentowanie cyklu komórkowego24, aż po badanie dynamiki błony czerwonych krwinek25. W szczególności, ostatnie dziesięć lat przyniosło obfitość bezznacznikowej mikroskopii ilościowej w postaci mikroskopii fazy dyfrakcyjnej26, tomograficzna mikroskopia fazowa27, cyfrowa mikroskopia holograficzna28, fazowa optyczna mikroskopia koherentna29, przestrzenna mikroskopia interferencyjnaświatła 30, mikroskopia fazowa Hilberta31 i ilościowa mikroskopia fazowa32. Pomimo ich zbiorowych sukcesów, instrumenty te nie zostały rozpowszechnione wśród szerszego grona badaczy biologii, głównie ze względu na ich złożone oprzyrządowanie i wymagania obliczeniowe.
Tutaj opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości na próbkach komórkowych poprzez kombinację jasnego pola i obrazów DIC. Przedstawiono dwa podstawowe podejścia: nieinterferometryczną ilościową mikroskopię fazową (NIQPM) do wykonywania pomiarów całkowitej masy komórki i rozkładu gęstości subkomórkowej oraz mikroskopię kontrastową z różnicową interferencją Hilberta (HTDIC) do określania objętości. Podstawowe zalety NIQPM i HTDIC polegały na ich dostępności technologicznej. Warunki obrazowania wymagane do ich pomyślnego wykonania mieszczą się w zakresie normalnej pracy większości dostępnych na rynku mikroskopów. Ponadto algorytmy przetwarzania końcowego są stabilne, szybkie i niezawodne - zostały zaimplementowane w MATLAB przy użyciu algorytmów opartych na szybkiej transformacji Fouriera (FFT), gdy tylko jest to możliwe.
NIQPM to metoda rekonstrukcji fazy i osiowo zintegrowanej gęstości masy próbek komórkowych na podstawie obrazów jasnego pola. Zsumowanie tej osiowo zintegrowanej gęstości masy na powierzchni próbki daje całkowitą zawartość suchej masy próbki. Protokół NIQPM opiera się na podstawach eksperymentalnych położonych przez Paganina i Nugenta 18,19 – w których wykazano, że profil fazowy komórki można zrekonstruować na podstawie obrazów jasnego pola próbki za pomocą ogniskowania – oraz pracach teoretycznych Franka, Altmeyera i Wernickego20 – na rozwiązywaniu modeli fal przyosiowych w efektywny sposób oparty na FFT. Związek fazy z gęstością suchej masy opiera się na pracy Barera 10,11 i Popescu 33.
Informacje wolumetryczne można uzyskać z obrazowania DIC przez ognisko w warunkach wysokiego oświetlenia NA, które umożliwiają optyczne przecięcie próbki wzdłuż osi optycznej. Przetwarzanie transformacji Hilberta na stosach obrazów DIC znacznie usprawnia algorytmy wykrywania krawędzi do lokalizacji granic próbki w trzech wymiarach, oddzielając wartości szarości intensywności próbki od wartości tła. Praca ta pochodzi od Arinsona i wsp. 34 Chociaż wprowadziliśmy zarówno metody filtrowania Fouriera w celu zwiększenia kontrastu, jak i metodę wykrywania krawędzi opartą na Sobelu do automatycznej analizy wolumetrycznej próbki. Wcześniej przeprowadziliśmy również walidację HTDIC na kulkach polistyrenowych o rozmiarach od granicy dyfrakcji do 20 μm o średnicy36.
Chociaż zarówno NIQPM, jak i HTDIC są technologicznie dostępne dzięki ich rozwojowi na komercyjnych mikroskopach, metody te są zasadniczo ograniczone przez konfigurację sprzętową samych mikroskopów. Podstawowe ograniczenia tych technik są dwojakie: powolny czas akwizycji z-stack na zakresach komercyjnych, ze względu na translację całego etapu próbki, a nie tylko soczewki obiektywu, obecnie ogranicza badanie zjawisk szybszych niż około 1 klatka na minutę, a po drugie, efekty dyfrakcyjne ograniczają użyteczność NIQPM i HTDIC do obiektów o rozmiarach od 0,2 do 10 i 20 μm średnicy, odpowiednio. W związku z tym próbka i związana z nią dynamika czasowa muszą spełniać pewne ograniczenia rozmiarowe i czasowe, aby umożliwić zastosowanie tych metod na typowych instrumentach "z półki". Co ciekawe, większość utrwalonych próbek komórkowych jest łatwo badana za pomocą tych metod.
Przegląd protokołów NIQPM i HTDIC znajduje się na rysunku 1. Na rysunku 2 ilustrujemy optymalne i nieoptymalne obrazowanie przez ogniskową zarówno w warunkach słabego, jak i wysokiego oświetlenia NA, zarówno dla obrazów jasnego pola, jak i DIC. Rysunki 3 i 4 pokazują zależność od parametrów algorytmu NIQPM, podkreślając udane i nieudane implementacje. Rysunek 5 ilustruje etapy procesu przetwarzania obrazu HTDIC i demonstruje optymalną implementację algorytmu do określania objętości komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Zeiss Axio Imager 2</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy</td><td>Mikroskop Axio Imager D2</td><td></td></tr><tr><td>Zielony filtr (&lambda; = 540 &plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Zielony filtr</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SlideBook 5.5</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Kolorado</td><td></td><td>Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów</td></tr><tr><td>Polistyren mikrosfery</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Kule polistyrenowe</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Nośniki montażowe</td></tr></tbody></table>

ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości na próbkach komórkowych poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego. Przedstawiono dwa podstawowe podejścia: nieinterferometryczną ilościową mikroskopię fazową (NIQPM) do wykonywania pomiarów całkowitej masy komórki i rozkładu gęstości subkomórkowej oraz mikroskopię kontrastową z interferencją różnicową Hilberta (HTDIC) do określania objętości. NIQPM opiera się na uproszczonym modelu rozchodzenia się fal, zwanym przybliżeniem paraosiowym, z trzema podstawowymi założeniami: niskim oświetleniem apertury numerycznej (NA), słabym rozpraszaniem i słabą absorpcją światła przez próbkę. Na szczęście niebarwione próbki komórkowe spełniają te założenia, a niskie oświetlenie NA można łatwo osiągnąć w komercyjnych mikroskopach. HTDIC służy do uzyskiwania informacji wolumetrycznych ze zobrazowań DIC w warunkach silnego oświetlenia NA. Wysokie oświetlenie NA umożliwia lepsze przekrojenie próbki wzdłuż osi optycznej. Przetwarzanie transformacji Hilberta na stosach obrazów DIC znacznie usprawnia algorytmy wykrywania krawędzi do lokalizacji granic próbki w trzech wymiarach, oddzielając wartości szarości intensywności próbki od wartości tła. Podstawowe zalety NIQPM i HTDIC polegały na ich dostępności technologicznej przy użyciu "dostępnych" mikroskopów. Istnieją dwa podstawowe ograniczenia tych metod: powolny czas akwizycji z-stack na komercyjnych zakresach obecnie znosi badanie zjawisk szybszych niż 1 klatka/minutę, a po drugie, efekty dyfrakcyjne ograniczają użyteczność NIQPM i HTDIC do obiektów o średnicy odpowiednio od 0,2 do 10 (NIQPM) i 20 (HTDIC) μm. W związku z tym próbka i związana z nią dynamika czasowa będąca przedmiotem zainteresowania muszą spełniać pewne ograniczenia rozmiarowe i czasowe, aby umożliwić zastosowanie tych metod. Co ciekawe, większość utrwalonych próbek komórkowych jest łatwo badana za pomocą tych metod.

Prawidłowe oświetlenie próbki podczas akwizycji obrazów w serii przezogniskowej jest kluczowe dla skutecznego wdrożenia algorytmów NIQPM i HTDIC. Na Rysunku 2 przedstawiamy oświetlenie z niską i wysoką NA przy zastosowaniu kontrastu DIC oraz pola jasnego dla sfery polistyrenowej oraz linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego człowieka SW620. Rysunki 2A, 2C, 2I oraz 2K obrazują optymalne warunki obrazowania dla NIQPM. Rysunki 2F, 2H, 2N </str...

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie podstawowych cech fizycznych preparatów komórkowych, w tym masy i objętości, przy użyciu standardowego mikroskopu optycznego oraz przetwarzania obrazu. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie zamocowanie preparatów komórkowych hodowanych na szklanych zakrytkach na przedmiotstwach mikroskopowych. Następnie pozyskuje się obrazy w jasnym polu oraz w kontraście fazowym (DIC) poprzez skanowanie wzdłuż osi ostrości (tzw. focus through).Następnie każdy stos obrazów Z jest wprowadzany do oddzielnych programów przetwarzania obrazu w środowisku MATLAB, które wydobywają dane fizyczne. Ostatecznie podstawowe właściwości fizyczne preparatów komórkowych są uzyskiwane za pomocą pomiarów intensywności wzdłuż osi ostrości, przy zastosowaniu mikroskopii w kontraście jasnego pola oraz mikroskopii kontrastowej interferencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest brak konieczności utrwalania, permeabilizacji lub barwienia preparatów komórkowych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórki, takie jak organizacja gęstości subkomórkowej podczas cyklu komórkowego lub pomiędzy różnymi populacjami komórek przyczyniającymi się do stanu chorobowego. Korzystając z mikroskopu z funkcjami DIC oraz jasnego pola i dodatkowymi specyfikacjami zgodnie z protokołem tekstowym, należy rozpocząć od uruchomienia oprogramowania slide book i utworzenia nowego slajdu do kolekcji obrazów. Następnie należy otworzyć okno ostrości i w sekcji ustawień filtra wybrać DIC. W zakładce zakresu, w sekcji kondensora, należy przesunąć suwak apertury do skrajnej prawej pozycji. Zapewnia to oświetlenie o wysokiej aperturze numerycznej i poprawia sekcjonowanie optyczne preparatu.Po zarejestrowaniu stosu obrazów DIC próbki, otwórz okno ustawiania ostrości i wybierz opcję otwórz. W sekcji zestawu filtrów przesuń suwak apertury do skrajnej lewej pozycji, całkowicie go zamykając, aby zapewnić oświetlenie o niskiej wartości NA. Po dostosowaniu intensywności sygnału otwórz okno przechwytywania obrazu.Ustawienia przechwytywania 3D z akwizycji stosu DICZ zostaną wyświetlone w sekcji zestawu filtrów okna przechwytywania obrazu. Zaznacz pole wyboru i określ czas ekspozycji. W sekcji informacji o obrazie nazwij obraz i wybierz start, aby rozpocząć akwizycję obrazu Zack.Następnie wyeksportuj stosy Z zgodnie z protokołem tekstowym, aby przeprowadzić pomiary objętości w programie MATLAB H-T-D-I-C o nazwie JoVE HT DCO V one M. W sekcji zero zaktualizuj zmienną katalogu zależności, kopiując i wklejając z eksploratora katalog zawierający pliki hilbert. Transform DM oraz sobel edge Detect M pomiędzy pojedynczymi cudzysłowiami następującymi po dependencies directory =. Wykonaj sekcję zero programu joco HT DCO V one M.W sekcji pierwszej zaktualizuj katalog obrazów, kopiując i wklejając katalog zawierający obrazy z przejściem przez ostrość w formacie .TIF. Pomiędzy pojedynczymi cudzysłowami uruchom tę sekcję tylko raz, aby wyrównać i obrócić obrazy. Aby wykonać transformację Hilberta, uruchom sekcję drugą kodu. Pojawi się okno dialogowe zatytułowane Define HT DIC parameters.Następnie wprowadź numer płaszczyzny ogniskowej, w której obraz DIC próbki jest ostry, rozdzielczość boczną, rozdzielczość osiową, kąt obrotu obrazu DIC niezbędny do wykonania transformaty Hilberta, a na koniec rozmiar obszaru zainteresowania. Następnie kliknij OK. Pojawi się obraz płaszczyzny ogniskowej DIC określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej, z zaznaczonym niebieskim prostokątem.Ustaw ramkę nad interesującym elementem, np. nad komórką. Po umieszczeniu ramki nad pożądanym obszarem, kliknij dwukrotnie wewnątrz B. Kontrast obrazu powinien być taki, aby ciemne elementy znajdowały się po lewej stronie, a jasne po prawej. Przeciągnij niebieską ramkę nad obszar zainteresowania i w razie potrzeby zmień jej kształt.Następnie, w sekcji trzeciej, aby wygenerować maskę prostokątną, odkomentuj linię 167 i zakomentuj linię 170, a następnie uruchom sekcję trzecią programu, klikając w obraz i przeciągając myszą, aby zacząć definiować maskę prostokątną. Następnie dwukrotnie kliknij w ramkę, aby ją zatwierdzić. Aby wygenerować maskę rysowaną ręcznie, zakomentuj linię 167 i odkomentuj linię 170 przed uruchomieniem sekcji trzeciej; klikając i rysując żądaną maskę myszą, dwukrotnie kliknij na masce, aby ją zatwierdzić. Po uruchomieniu sekcji czwartej, aby skonstruować stosy obrazów z transformatą Hilberta zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom sekcję piątą.Aby zoptymalizować segmentację obrazu przekrojów xz obszaru zainteresowania, Rycina 500 wygenerowana przez program wyświetla trzy różne typy kontrastu. Skuteczność algorytmu w wyznaczaniu granic komórki zależy od kombinacji zastosowanej maski oraz wartości progu w linii 2, 2, 9 programu; należy zacząć od wartości 0,5, a następnie korygować wartość progu i ponownie uruchamiać tę sekcję programu, aż do uzyskania właściwego obrysu w jednej z kolumn.Jeśli obrysowanie było najlepsze w kolumnie pierwszej, w segmentacji DIC należy użyć sekcji szóstej do wyznaczenia objętości. Jeśli optymalne wyniki uzyskano w kolumnie drugiej, należy uruchomić sekcję siódmą, aby wyznaczyć objętość komórki z transformaty Hilberta; jeśli optymalne wyniki uzyskano w kolumnie trzeciej, należy użyć obrazowania DIC z filtrowaną transformatą Hilberta Forera podczas uruchamiania sekcji ósmej w celu wyznaczenia objętości do pomiarów masy w programie NIQ PM MATLAB o nazwie JO VCO NI qpm V1 M w sekcji zero. Zaktualizuj lokalizację trzech zależności katalogów: katalog BRIGHTFIELD i DIC; po uruchomieniu sekcji pierwszej uruchom sekcję drugą; w oknie dialogowym zatytułowanym „define N-I-Q-P-M parameters” wprowadź numer płaszczyzny ogniskowania, w której obraz w jasnym polu próbki jest ostry, rozdzielczość boczną, rozdzielczość osiową oraz rozmiar obszaru zainteresowania (ROI).Następnie kliknij OK. Pojawi się obraz płaszczyzny ogniskowej w jasnym polu, określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej, z niebieskim prostokątem. Po ewentualnej korekcie ostrości poprzez ponowne wykonanie sekcji drugiej, przesuń prostokąt po obrazie, a następnie zaznacz jego węzły i przeciągnij je, aby zmienić jego rozmiar, po czym dwukrotnie kliknij wewnątrz prostokąta, aby go zatwierdzić.Po utworzeniu stosu obrazów w jasnym polu za pomocą sekcji trzeciej, uruchom sekcję czwartą, aby wygenerować mapę fazy, obrazy pseudo-DIC oraz porównania z obrazowaniem w jasnym polu i prawdziwym obrazem DIC. Gdy obrazy pseudo-DIC i prawdziwego DIC są do siebie jak najbardziej zbliżone, uruchom sekcję pięć A lub pięć B, która pozwala użytkownikowi obrysować komórkę w celu poprawnego wygenerowania mapy gęstości masy, całkowitej masy oraz histogramu gęstości komórki. Odpowiednie oświetlenie próbki podczas akwizycji obrazów w różnych płaszczyznach ostrości (through focus) jest kluczowe dla pomyślnej implementacji algorytmu N-I-Q-P-M i H-T-D-I-C. Rysunek ten przedstawia oświetlenie o niskiej i wysokiej aperturze numerycznej (NA) przy kontraście DIC oraz w jasnym polu dla sfery polistyrenowej i ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego SW six 20.Te panele prezentują optymalne obrazowanie dla N-I-Q-P-M, a te przedstawiają optymalne obrazowanie dla HT DIC. Obrazy te demonstrują zależność parametrów algorytmu NIQ PM, wskazując zarówno udane, jak i nieudane implementacje. Tutaj badamy profil fazowy sfery polistyrenowej o średnicy 4,8 µm.Oczekiwany profil jest znany teoretycznie i może zatem zostać bezpośrednio porównany z rekonstrukcją NIQ PM. Panele te prezentują najlepszą możliwą rekonstrukcję efektów dyfrakcyjnych sfery; zarówno na granicach sfery, jak i wewnątrz niej, uniemożliwiają one stabilną rekonstrukcję we wszystkich punktach sfery. Centralny obszar sfery może zostać zarejestrowany za pomocą N-I-Q-P-M z błędem procentowym od 1 do 5%, co widać na Panelu L w przypadku preparatów komórkowych, których właściwości fazowe nie są znane.Wartości a priori mogą zostać zrekonstruowane przy użyciu NIQ PMM w połączeniu z procedurą porównania obrazu pseudo-DIC z rzeczywistym obrazem DIC. N-I-Q-P-M posiada jeden parametr wolny: płaszczyznę w stosie obrazów pola prawego, wokół której centrowane jest obliczenie.Tę centralną płaszczyznę ogniskową należy dostosować tak, aby obrazy pseudo DIC oraz rzeczywiste obrazy DIC były jak najbardziej podobne. Przedstawiono tutaj obraz pseudo DIC poza ogniskowaniem, optymalny obraz pseudo DIC oraz odpowiadający mu obraz DIC komórki, wykonany przy aperturze numerycznej (NA) oświetlenia wynoszącej 0.9. Co ciekawe, najlepsza mapa fazowa i odpowiadający jej obraz pseudo DIC niekoniecznie muszą odpowiadać obrazowi w jasnym polu znajdującemu się w ogniskowaniu, co pokazano na tych panelach.Na koniec przedstawiono etapy algorytmu przetwarzania obrazów H-T-D-I-C, opracowanego na podstawie obrazów DIC z różnymi płaszczyznami ostrości przy podświetleniu z NA równym 0,9. Wykonano transformację Hilberta, aby usunąć efekt reliefu z obrazów DIC. Powoduje to pewne rozmycie wzdłuż osi optycznej, które można wyeliminować za pomocą filtracji pasmowo-wysokoprzejściowej. Te końcowe obrazy są łatwo poddawane segmentacji w celu wyznaczenia powierzchni w każdej płaszczyźnie przekroju poprzecznego preparatu, co pozwala na oszacowanie całkowitej objętości komórki.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiedniego oświetlenia dla obrazowania w jasnym polu lub w kontraście różnicowym po zakończeniu procedury. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, wykorzystując kolokalizację siły podłoża z mapami gęstości preparatu.

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia optyczna ilościowa: Pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Prezentujemy metodę mikroskopii w ciemnym polu opartą na filtrowaniu typu Gabora do pomiaru dynamiki subkomórkowej w pojedynczych żywych komórkach. Technika ta jest czuła na zmiany w strukturze organelli, takie jak fragmentacja mitochondriów.

Mikroskopia rozproszeniowa optyczna oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Tutaj opisany jest zintegrowany protokół oparty na pęsetach optycznych i mikroskopii defoksyjnej do pomiaru właściwości reologicznych komórek. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu właściwości lepkosprężystych erytrocytów w zmiennych warunkach fizjopatologicznych.

Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

Opisano metodę śledzenia fuzji komórek w żywych organizmach w czasie. Podejście to wykorzystuje rekombinację Cre-LoxP do indukcji ekspresji lucyferazy po fuzji komórek. Wygenerowany sygnał luminescencyjny może być wykrywany w żywych organizmach przy użyciu systemów obrazowania biofotonicznego z czułością detekcji na poziomie ˜1,000 komórek w tkankach obwodowych.

Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo

Poznaj ilościową mikroskopię optyczną do pomiaru masy, objętości i gęstości komórek żywych bez konieczności ich utrwalania lub barwienia. Ta technika wykorzystuje standardowy mikroskop optyczny z obrazowaniem brightfield i DIC.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Przeglądaj więcej filmów