Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie podstawowych cech fizycznych preparatów komórkowych, w tym masy i objętości, przy użyciu standardowego mikroskopu optycznego oraz przetwarzania obrazu. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie zamocowanie preparatów komórkowych hodowanych na szklanych zakrytkach na przedmiotstwach mikroskopowych. Następnie pozyskuje się obrazy w jasnym polu oraz w kontraście fazowym (DIC) poprzez skanowanie wzdłuż osi ostrości (tzw. focus through).

Następnie każdy stos obrazów Z jest wprowadzany do oddzielnych programów przetwarzania obrazu w środowisku MATLAB, które wydobywają dane fizyczne. Ostatecznie podstawowe właściwości fizyczne preparatów komórkowych są uzyskiwane za pomocą pomiarów intensywności wzdłuż osi ostrości, przy zastosowaniu mikroskopii w kontraście jasnego pola oraz mikroskopii kontrastowej interferencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest brak konieczności utrwalania, permeabilizacji lub barwienia preparatów komórkowych.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórki, takie jak organizacja gęstości subkomórkowej podczas cyklu komórkowego lub pomiędzy różnymi populacjami komórek przyczyniającymi się do stanu chorobowego. Korzystając z mikroskopu z funkcjami DIC oraz jasnego pola i dodatkowymi specyfikacjami zgodnie z protokołem tekstowym, należy rozpocząć od uruchomienia oprogramowania slide book i utworzenia nowego slajdu do kolekcji obrazów. Następnie należy otworzyć okno ostrości i w sekcji ustawień filtra wybrać DIC. W zakładce zakresu, w sekcji kondensora, należy przesunąć suwak apertury do skrajnej prawej pozycji. Zapewnia to oświetlenie o wysokiej aperturze numerycznej i poprawia sekcjonowanie optyczne preparatu.

Po zarejestrowaniu stosu obrazów DIC próbki, otwórz okno ustawiania ostrości i wybierz opcję otwórz. W sekcji zestawu filtrów przesuń suwak apertury do skrajnej lewej pozycji, całkowicie go zamykając, aby zapewnić oświetlenie o niskiej wartości NA. Po dostosowaniu intensywności sygnału otwórz okno przechwytywania obrazu.

Ustawienia przechwytywania 3D z akwizycji stosu DICZ zostaną wyświetlone w sekcji zestawu filtrów okna przechwytywania obrazu. Zaznacz pole wyboru i określ czas ekspozycji. W sekcji informacji o obrazie nazwij obraz i wybierz start, aby rozpocząć akwizycję obrazu Zack.

Następnie wyeksportuj stosy Z zgodnie z protokołem tekstowym, aby przeprowadzić pomiary objętości w programie MATLAB H-T-D-I-C o nazwie JoVE HT DCO V one M. W sekcji zero zaktualizuj zmienną katalogu zależności, kopiując i wklejając z eksploratora katalog zawierający pliki hilbert. Transform DM oraz sobel edge Detect M pomiędzy pojedynczymi cudzysłowiami następującymi po dependencies directory =. Wykonaj sekcję zero programu joco HT DCO V one M.

W sekcji pierwszej zaktualizuj katalog obrazów, kopiując i wklejając katalog zawierający obrazy z przejściem przez ostrość w formacie .TIF. Pomiędzy pojedynczymi cudzysłowami uruchom tę sekcję tylko raz, aby wyrównać i obrócić obrazy. Aby wykonać transformację Hilberta, uruchom sekcję drugą kodu. Pojawi się okno dialogowe zatytułowane Define HT DIC parameters.

Następnie wprowadź numer płaszczyzny ogniskowej, w której obraz DIC próbki jest ostry, rozdzielczość boczną, rozdzielczość osiową, kąt obrotu obrazu DIC niezbędny do wykonania transformaty Hilberta, a na koniec rozmiar obszaru zainteresowania. Następnie kliknij OK. Pojawi się obraz płaszczyzny ogniskowej DIC określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej, z zaznaczonym niebieskim prostokątem.

Ustaw ramkę nad interesującym elementem, np. nad komórką. Po umieszczeniu ramki nad pożądanym obszarem, kliknij dwukrotnie wewnątrz B. Kontrast obrazu powinien być taki, aby ciemne elementy znajdowały się po lewej stronie, a jasne po prawej. Przeciągnij niebieską ramkę nad obszar zainteresowania i w razie potrzeby zmień jej kształt.

Następnie, w sekcji trzeciej, aby wygenerować maskę prostokątną, odkomentuj linię 167 i zakomentuj linię 170, a następnie uruchom sekcję trzecią programu, klikając w obraz i przeciągając myszą, aby zacząć definiować maskę prostokątną. Następnie dwukrotnie kliknij w ramkę, aby ją zatwierdzić. Aby wygenerować maskę rysowaną ręcznie, zakomentuj linię 167 i odkomentuj linię 170 przed uruchomieniem sekcji trzeciej; klikając i rysując żądaną maskę myszą, dwukrotnie kliknij na masce, aby ją zatwierdzić. Po uruchomieniu sekcji czwartej, aby skonstruować stosy obrazów z transformatą Hilberta zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom sekcję piątą.

Aby zoptymalizować segmentację obrazu przekrojów xz obszaru zainteresowania, Rycina 500 wygenerowana przez program wyświetla trzy różne typy kontrastu. Skuteczność algorytmu w wyznaczaniu granic komórki zależy od kombinacji zastosowanej maski oraz wartości progu w linii 2, 2, 9 programu; należy zacząć od wartości 0,5, a następnie korygować wartość progu i ponownie uruchamiać tę sekcję programu, aż do uzyskania właściwego obrysu w jednej z kolumn.

Jeśli obrysowanie było najlepsze w kolumnie pierwszej, w segmentacji DIC należy użyć sekcji szóstej do wyznaczenia objętości. Jeśli optymalne wyniki uzyskano w kolumnie drugiej, należy uruchomić sekcję siódmą, aby wyznaczyć objętość komórki z transformaty Hilberta; jeśli optymalne wyniki uzyskano w kolumnie trzeciej, należy użyć obrazowania DIC z filtrowaną transformatą Hilberta Forera podczas uruchamiania sekcji ósmej w celu wyznaczenia objętości do pomiarów masy w programie NIQ PM MATLAB o nazwie JO VCO NI qpm V1 M w sekcji zero. Zaktualizuj lokalizację trzech zależności katalogów: katalog BRIGHTFIELD i DIC; po uruchomieniu sekcji pierwszej uruchom sekcję drugą; w oknie dialogowym zatytułowanym „define N-I-Q-P-M parameters” wprowadź numer płaszczyzny ogniskowania, w której obraz w jasnym polu próbki jest ostry, rozdzielczość boczną, rozdzielczość osiową oraz rozmiar obszaru zainteresowania (ROI).

Następnie kliknij OK. Pojawi się obraz płaszczyzny ogniskowej w jasnym polu, określonej przez numer płaszczyzny ogniskowej, z niebieskim prostokątem. Po ewentualnej korekcie ostrości poprzez ponowne wykonanie sekcji drugiej, przesuń prostokąt po obrazie, a następnie zaznacz jego węzły i przeciągnij je, aby zmienić jego rozmiar, po czym dwukrotnie kliknij wewnątrz prostokąta, aby go zatwierdzić.

Po utworzeniu stosu obrazów w jasnym polu za pomocą sekcji trzeciej, uruchom sekcję czwartą, aby wygenerować mapę fazy, obrazy pseudo-DIC oraz porównania z obrazowaniem w jasnym polu i prawdziwym obrazem DIC. Gdy obrazy pseudo-DIC i prawdziwego DIC są do siebie jak najbardziej zbliżone, uruchom sekcję pięć A lub pięć B, która pozwala użytkownikowi obrysować komórkę w celu poprawnego wygenerowania mapy gęstości masy, całkowitej masy oraz histogramu gęstości komórki. Odpowiednie oświetlenie próbki podczas akwizycji obrazów w różnych płaszczyznach ostrości (through focus) jest kluczowe dla pomyślnej implementacji algorytmu N-I-Q-P-M i H-T-D-I-C. Rysunek ten przedstawia oświetlenie o niskiej i wysokiej aperturze numerycznej (NA) przy kontraście DIC oraz w jasnym polu dla sfery polistyrenowej i ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego SW six 20.

Te panele prezentują optymalne obrazowanie dla N-I-Q-P-M, a te przedstawiają optymalne obrazowanie dla HT DIC. Obrazy te demonstrują zależność parametrów algorytmu NIQ PM, wskazując zarówno udane, jak i nieudane implementacje. Tutaj badamy profil fazowy sfery polistyrenowej o średnicy 4,8 µm.

Oczekiwany profil jest znany teoretycznie i może zatem zostać bezpośrednio porównany z rekonstrukcją NIQ PM. Panele te prezentują najlepszą możliwą rekonstrukcję efektów dyfrakcyjnych sfery; zarówno na granicach sfery, jak i wewnątrz niej, uniemożliwiają one stabilną rekonstrukcję we wszystkich punktach sfery. Centralny obszar sfery może zostać zarejestrowany za pomocą N-I-Q-P-M z błędem procentowym od 1 do 5%, co widać na Panelu L w przypadku preparatów komórkowych, których właściwości fazowe nie są znane.

Wartości a priori mogą zostać zrekonstruowane przy użyciu NIQ PMM w połączeniu z procedurą porównania obrazu pseudo-DIC z rzeczywistym obrazem DIC. N-I-Q-P-M posiada jeden parametr wolny: płaszczyznę w stosie obrazów pola prawego, wokół której centrowane jest obliczenie.

Tę centralną płaszczyznę ogniskową należy dostosować tak, aby obrazy pseudo DIC oraz rzeczywiste obrazy DIC były jak najbardziej podobne. Przedstawiono tutaj obraz pseudo DIC poza ogniskowaniem, optymalny obraz pseudo DIC oraz odpowiadający mu obraz DIC komórki, wykonany przy aperturze numerycznej (NA) oświetlenia wynoszącej 0.9. Co ciekawe, najlepsza mapa fazowa i odpowiadający jej obraz pseudo DIC niekoniecznie muszą odpowiadać obrazowi w jasnym polu znajdującemu się w ogniskowaniu, co pokazano na tych panelach.

Na koniec przedstawiono etapy algorytmu przetwarzania obrazów H-T-D-I-C, opracowanego na podstawie obrazów DIC z różnymi płaszczyznami ostrości przy podświetleniu z NA równym 0,9. Wykonano transformację Hilberta, aby usunąć efekt reliefu z obrazów DIC. Powoduje to pewne rozmycie wzdłuż osi optycznej, które można wyeliminować za pomocą filtracji pasmowo-wysokoprzejściowej. Te końcowe obrazy są łatwo poddawane segmentacji w celu wyznaczenia powierzchni w każdej płaszczyźnie przekroju poprzecznego preparatu, co pozwala na oszacowanie całkowitej objętości komórki.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiedniego oświetlenia dla obrazowania w jasnym polu lub w kontraście różnicowym po zakończeniu procedury. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, wykorzystując kolokalizację siły podłoża z mapami gęstości preparatu.