Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Nasz protokół może określić ilościowo dynamikę w wielu systemach przy użyciu szeregu technik mikroskopii optycznej. Podkreślamy, w jaki sposób metoda ta może w szczególności pomóc w scharakteryzowaniu dynamiki odtworzonych sieci cytoszkieletów. Główną zaletą korzystania z naszego pakietu oprogramowania do różnicowej mikroskopii dynamicznej jest to, że jest on dobrze udokumentowany, zawiera wiele przykładowych plików analitycznych i można go łatwo dostosować do badania różnych typów dynamiki.

Nasz pakiet oprogramowania może być wykorzystany do ilościowego określenia dynamiki nie tylko w odtworzonych sieciach cytoszkieletów, ale także w innych miękkich i biologicznie istotnych materiałach. Na podstawie skal czasu i długości do sondowania można uzyskać sekwencje obrazów obejmujące ponad 1 000 klatek za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem, takiego jak Micro-Manager. W folderze przykładów znajdującym się w repozytorium kodu PyDDM utwórz kopię pliku parametrów o nazwie example_parameter_file.yml.

Otwórz ten plik EML za pomocą edytora tekstu, takiego jak Notatnik + lub edytora tekstu w JupyterLab. W skopiowanym pliku EML podaj katalog danych i nazwę pliku odpowiadającą sekwencji obrazów, która ma być analizowana. W sekcji metadanych podaj rozmiar w pikselach i liczbę klatek na sekundę.

W sekcji parametru analizy wybierz parametry do obliczenia macierzy DDM, takie jak liczba różnych czasów opóźnienia i najdłuższy czas opóźnienia. Podaj szczegółowe informacje na temat dopasowania macierzy DDM lub funkcji rozpraszania pośredniego w sekcji parametrów dopasowania, takie jak nazwa modelu i parametr modelu, początkowe przypuszczenie, dolna granica i górna granica. Zainicjuj instancję klasy analizy DDM, podając metadane w parametrach analizy, przekazując nazwę pliku EML z pełną ścieżką do pliku do analizy DDM.

Alternatywnie przekaż metadane i parametry jako strukturę danych słownika języka Python. Uruchom funkcję, aby obliczyć macierz DDM. Sprawdź zwrócone dane ze skojarzonymi zmiennymi i metadanymi, które są przechowywane jako zestaw danych w pakiecie Xarray.

Następnie należy sprawdzić wykresy i rysunki, które są zapisane jako plik PDF i katalog danych. Jeden z tych wykresów przedstawia domyślną metodę szacowania tła. W razie potrzeby zmień metodę, w której tło jest szacowane, przy użyciu metody parametru background w pliku EML lub jako opcjonalny argument słowa kluczowego do funkcji calculate DDM matrix.

Zainicjuj instancję klasy dopasowania DDM, przekazując nazwę pliku EML zawierającego metadane obrazu i parametry dopasowania. Wymień dostępne modele, wykonując funkcję drukuj modele dopasowań. Określ model, który ma być używany w pliku parametrów EML lub za pomocą funkcji przeładuj model dopasowania według nazwy.

Dla każdego parametru w wybranym modelu ustaw początkowe domysły i granice, jeśli różnią się od wartości określonych w pliku EML, przy użyciu funkcji ustaw początkowe odgadnięcie parametru i ustaw granice parametru. Wykonaj dopasowanie za pomocą dopasowania funkcyjnego. Generuj wykresy do sprawdzania pasowań w zależności q parametrów dopasowania za pomocą raportu dopasowania funkcji.

Sprawdź dane wyjściowe, w tym rysunek z wykresami podrzędnymi dwa na dwa, pokazującymi macierz DDM lub ISF przy czterech wartościach q wraz z dopasowaniem. Użyj klas browse DDM fits w środowisku Jupyter Notebook, aby wykreślić macierz DDM lub ISF wraz z najlepszym dopasowaniem w interaktywny sposób. Kliknięcie punktu na wykresie czasu zaniku w funkcji liczby falowej spowoduje wyświetlenie danych i dopasowania.

Sprawdź wyniki dopasowania zapisane w zestawie danych Xarray i użyj funkcji two netCDF lub wbudowanego modułu pickle Pythona, aby zapisać tę strukturę danych na dysku. Analizę DDM przeprowadzono na serii obrazów w jasnym polu kulek o wielkości 0,6 mikrona w sieci wimentyny oraz na obrazach mikroskopu konfokalnego z aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula z widmowo odrębnymi znacznikami fluorescencyjnymi. Pośrednie funkcje rozpraszania wykreślono jako funkcję czasu opóźnienia przy różnych liczbach falowych i sieci o stężeniu wimentyny wynoszącym 19 mikromolowych i 34 mikromolowych.

Długi plateau czasowy opóźnienia funkcji przy wartości znacznie powyżej zera wskazuje na nieergodyczność. Czas rozpadu tau wykreślony jako funkcja q dla dwóch sieci o różnych stężeniach wimentyny wykazuje ruch subdyfuzyjny lub ograniczony. Parametry nieergodyczności c wykreślone jako funkcja q do kwadratu dla sieci z 34 i 49 mikromolową wimentyną wykazały, że logarytm c był proporcjonalny do q do kwadratu, zgodnie z oczekiwaniami dla ruchu ograniczonego.

Wykresy przemieszczenia średniokwadratowego w funkcji czasu opóźnienia wykazały, że wartości wyznaczone na podstawie DDM dobrze zgadzały się z wartościami uzyskanymi za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek. W przypadku bardziej skoncentrowanej sieci wartość stabilizuje się przy dłuższych czasach opóźnienia. Macierz DDM w funkcji czasu opóźnienia dla aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula wykazała, że macierz DDM dla określonej wartości q miała plateau przy niskich czasach opóźnienia, a następnie wzrastała w dalszym plateau przy dużych czasach opóźnienia.

Charakterystyczne czasy rozpadu tau od dopasowań do matrycy DDM pokazują, że zależność między tau a q wskazuje na ruch balistyczny. Po opracowaniu tego pakietu oprogramowania PyDDM wykorzystaliśmy go do zbadania anizotropowej i zmiennej w czasie dynamiki aktywnych sieci cytoszkieletowych i innych systemów.