Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej
June 15th, 2022
Dynamiczna mikroskopia różnicowa (DDM) łączy w sobie cechy dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii. W tym artykule przedstawiono proces wykorzystania DDM do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez ilościowe określenie subdyfuzyjnej i zamkniętej w klatce dynamiki cząstek w sieciach wimentynowych oraz ruchu balistycznego aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych miozyną.
Nasz protokół może określić ilościowo dynamikę w wielu systemach przy użyciu szeregu technik mikroskopii optycznej. Podkreślamy, w jaki sposób metoda ta może w szczególności pomóc w scharakteryzowaniu dynamiki odtworzonych sieci cytoszkieletów. Główną zaletą korzystania z naszego pakietu oprogramowania do różnicowej mikroskopii dynamicznej jest to, że jest on dobrze udokumentowany, zawiera wiele przykładowych plików analitycznych i można go łatwo dostosować do badania różnych typów dynamiki.
Nasz pakiet oprogramowania może być wykorzystany do ilościowego określenia dynamiki nie tylko w odtworzonych sieciach cytoszkieletów, ale także w innych miękkich i biologicznie istotnych materiałach. Na podstawie skal czasu i długości do sondowania można uzyskać sekwencje obrazów obejmujące ponad 1 000 klatek za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem, takiego jak Micro-Manager. W folderze przykładów znajdującym się w repozytorium kodu PyDDM utwórz kopię pliku parametrów o nazwie example_parameter_file.yml.
Otwórz ten plik EML za pomocą edytora tekstu, takiego jak Notatnik + lub edytora tekstu w JupyterLab. W skopiowanym pliku EML podaj katalog danych i nazwę pliku odpowiadającą sekwencji obrazów, która ma być analizowana. W sekcji metadanych podaj rozmiar w pikselach i liczbę klatek na sekundę.
W sekcji parametru analizy wybierz parametry do obliczenia macierzy DDM, takie jak liczba różnych czasów opóźnienia i najdłuższy czas opóźnienia. Podaj szczegółowe informacje na temat dopasowania macierzy DDM lub funkcji rozpraszania pośredniego w sekcji parametrów dopasowania, takie jak nazwa modelu i parametr modelu, początkowe przypuszczenie, dolna granica i górna granica. Zainicjuj instancję klasy analizy DDM, podając metadane w parametrach analizy, przekazując nazwę pliku EML z pełną ścieżką do pliku do analizy DDM.
Alternatywnie przekaż metadane i parametry jako strukturę danych słownika języka Python. Uruchom funkcję, aby obliczyć macierz DDM. Sprawdź zwrócone dane ze skojarzonymi zmiennymi i metadanymi, które są przechowywane jako zestaw danych w pakiecie Xarray.
Następnie należy sprawdzić wykresy i rysunki, które są zapisane jako plik PDF i katalog danych. Jeden z tych wykresów przedstawia domyślną metodę szacowania tła. W razie potrzeby zmień metodę, w której tło jest szacowane, przy użyciu metody parametru background w pliku EML lub jako opcjonalny argument słowa kluczowego do funkcji calculate DDM matrix.
Zainicjuj instancję klasy dopasowania DDM, przekazując nazwę pliku EML zawierającego metadane obrazu i parametry dopasowania. Wymień dostępne modele, wykonując funkcję drukuj modele dopasowań. Określ model, który ma być używany w pliku parametrów EML lub za pomocą funkcji przeładuj model dopasowania według nazwy.
Dla każdego parametru w wybranym modelu ustaw początkowe domysły i granice, jeśli różnią się od wartości określonych w pliku EML, przy użyciu funkcji ustaw początkowe odgadnięcie parametru i ustaw granice parametru. Wykonaj dopasowanie za pomocą dopasowania funkcyjnego. Generuj wykresy do sprawdzania pasowań w zależności q parametrów dopasowania za pomocą raportu dopasowania funkcji.
Sprawdź dane wyjściowe, w tym rysunek z wykresami podrzędnymi dwa na dwa, pokazującymi macierz DDM lub ISF przy czterech wartościach q wraz z dopasowaniem. Użyj klas browse DDM fits w środowisku Jupyter Notebook, aby wykreślić macierz DDM lub ISF wraz z najlepszym dopasowaniem w interaktywny sposób. Kliknięcie punktu na wykresie czasu zaniku w funkcji liczby falowej spowoduje wyświetlenie danych i dopasowania.
Sprawdź wyniki dopasowania zapisane w zestawie danych Xarray i użyj funkcji two netCDF lub wbudowanego modułu pickle Pythona, aby zapisać tę strukturę danych na dysku. Analizę DDM przeprowadzono na serii obrazów w jasnym polu kulek o wielkości 0,6 mikrona w sieci wimentyny oraz na obrazach mikroskopu konfokalnego z aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula z widmowo odrębnymi znacznikami fluorescencyjnymi. Pośrednie funkcje rozpraszania wykreślono jako funkcję czasu opóźnienia przy różnych liczbach falowych i sieci o stężeniu wimentyny wynoszącym 19 mikromolowych i 34 mikromolowych.
Długi plateau czasowy opóźnienia funkcji przy wartości znacznie powyżej zera wskazuje na nieergodyczność. Czas rozpadu tau wykreślony jako funkcja q dla dwóch sieci o różnych stężeniach wimentyny wykazuje ruch subdyfuzyjny lub ograniczony. Parametry nieergodyczności c wykreślone jako funkcja q do kwadratu dla sieci z 34 i 49 mikromolową wimentyną wykazały, że logarytm c był proporcjonalny do q do kwadratu, zgodnie z oczekiwaniami dla ruchu ograniczonego.
Wykresy przemieszczenia średniokwadratowego w funkcji czasu opóźnienia wykazały, że wartości wyznaczone na podstawie DDM dobrze zgadzały się z wartościami uzyskanymi za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek. W przypadku bardziej skoncentrowanej sieci wartość stabilizuje się przy dłuższych czasach opóźnienia. Macierz DDM w funkcji czasu opóźnienia dla aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula wykazała, że macierz DDM dla określonej wartości q miała plateau przy niskich czasach opóźnienia, a następnie wzrastała w dalszym plateau przy dużych czasach opóźnienia.
Charakterystyczne czasy rozpadu tau od dopasowań do matrycy DDM pokazują, że zależność między tau a q wskazuje na ruch balistyczny. Po opracowaniu tego pakietu oprogramowania PyDDM wykorzystaliśmy go do zbadania anizotropowej i zmiennej w czasie dynamiki aktywnych sieci cytoszkieletowych i innych systemów.
Przegląd
Ten artykuł prezentuje protokół wykorzystujący Różnicową Dynamiczną Mikroskopię (RDM) do analizy dynamiki rekonstruowanych sieci cytoszkieletu. Metoda ilościowo określa subdyfuzyjne i uwięzione dynamiki w sieciach wimentyny oraz bada balistyczny ruch aktywnych kompozytów aktyna-mikrotubuli napędzanych miozyną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia komórki
Tło
- Różnicowa Dynamiczna Mikroskopia łączy techniki dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii.
- Jest skuteczna w charakteryzowaniu dynamiki miękkich i biologicznie istotnych materiałów.
- Pakiet oprogramowania jest dobrze udokumentowany i przystosowany do różnych badań dynamicznych.
- Sekwencje obrazów ponad 1000 klatek mogą być analizowane za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem.
Cel badania
- Ilościowa analiza dynamiki rekonstruowanych sieci cytoszkieletu.
- Dostarczenie szczegółowej metodologii zastosowania RDM w różnych systemach.
- Badanie anizotropowych i czasowo zmiennej dynamiki aktywnych sieci cytoszkieletu.
Stosowane metody
- Wykorzystanie pakietu oprogramowania PyRDM do analizy RDM.
- Metadane obrazu i parametry dopasowania są określone w pliku EML.
- Analiza obejmuje obliczanie macierzy RDM i dopasowanie średniej funkcji rozpraszania.
- Wyniki są wizualizawane poprzez wykresy i figury zapisywane jako pliki PDF.
Główne wyniki
- Analiza RDM ujawniła nieergodykę w sieciach wimentyny w różnych stężeniach.
- Wyniki wykresów czasu rozpadu wskazywały na ruch subdyfuzyjny w sieciach o różnych stężeniach wimentyny.
- Ruch balistyczny został zaobserwowany w aktywnych kompozytach aktyna-mikrotubuli.
- Wyniki z RDM dobrze zgadzały się z danymi pojedynczego śledzenia cząstek.
Wnioski
- RDM jest potężnym narzędziem do analizy dynamiki cytoszkieletu.
- Metoda dostarcza wglądu w zachowanie złożonych materiałów biologicznych.
- Oprogramowanie PyRDM ułatwia kompleksową analizę i wizualizacje procesów dynamicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of cytoskeleton dynamics is critical for de-risking early-stage discovery and engineering of biomaterials with tunable mechanical properties. Differential Dynamic Microscopy (DDM) enables robust, reproducible measurement of network dynamics across diverse cytoskeletal systems, supporting predictive confidence in target validation and material design. This capability strengthens portfolio decisions by providing standardized, scalable dynamic readouts for both fundamental research and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cytoskeletal network dynamics for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of biopolymer targets by measuring dynamic responses to composition changes.
- Facilitates predictive confidence in material behavior for downstream engineering or therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated dynamic readouts for high-content screening of cytoskeletal modulators.
- Standardizes assay outputs through reproducible, quantitative DDM analysis across imaging modalities.
- Enables scalable evaluation of compound effects on network mechanics and dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns dynamic measurements with disease-relevant cytoskeletal phenotypes when modeling pathophysiology.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling direct comparison of network dynamics across systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying dynamic biomarkers in engineered or native networks.
Pipeline & Workflow Integration
DDM-based quantification integrates from early discovery through assay development and preclinical research, providing a reusable analytical capability for cytoskeletal and soft material systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying dynamic responses to perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening campaigns targeting cytoskeletal function.
- Analytics: Provides robust statistical measurements such as decay times, nonergodicity parameters, and mean squared displacement for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro dynamic phenotypes with disease models when supported by system relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a documented, open-source software package adaptable across diverse imaging platforms and biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal target validation.
- Operational Value: Standardizes dynamic measurements and enhances reproducibility across teams and platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, scalable dynamic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biomaterial and cytoskeletal modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy and basic familiarity with Python-based analysis workflows.
- Needs access to imaging infrastructure capable of acquiring high-frame-count time series.
- Demands cross-team standardization of metadata and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to a range of cytoskeletal and soft material systems with appropriate labeling or tracer strategies.
- Dependent on image quality and acquisition parameters for optimal dynamic resolution.
