Name: Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę DDM do kwantyfikacji dynamiki sieci cytoszkieletu w badaniach biologicznych. Technika ta umożliwia analizę ruchu subdyfuzyjnego i balistycznego w materiałach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część tych badań została sfinansowana przez National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award no. R15GM123420, przyznana R.M.R.-A. i R.J.M.), Cottrell Scholar Award od Research Corporation for Science Advancement (nagroda nr 27459, przyznana R.J.M.) oraz William M. Keck Foundation Research Grant (przyznana R.M.R-A.). GHK dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Holenderskiej Rady ds. Badań Naukowych (NWO; numer projektu VI.C.182.004 Programu Talentów NWO).

UWAGA: Plik Jupyter Notebook zawierający kod do każdego etapu poniższego protokołu znajduje się w następnym repozytorium GitHub: https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Plik PDF tego dokumentu jest zawarty w &#160;Pliku uzupełniającym 1. Ponadto szczegółowy opis kodu oraz dokumentacja każdej funkcji i klasy są dostępne na stronie internetowej &#160;https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.
1. Instalacja oprogramowania
<ol>
	<li>Aby móc korzystać z przykładowych plików analizy DDM, należy zainstalować Jupyter Notebook do uruchamiania kodu. Należy również zainstalować inne wymagane popularne pakiety Pythona, w tym NumPy oraz Matplotlib. Wszystkie te pakiety są dołączone do dystrybucji Anaconda (patrz: &#160;https://www.anaconda.com/products/individual).&#160;</li>
	<li>Zainstaluj pakiet Pythona xarray63. Pakiet ten jest niezbędny do organizacji i przechowywania metadanych oraz parametrów analizy. W przypadku korzystania z dystrybucji Anaconda, zainstaluj xarray (wraz z zalecanymi zależnościami) za pomocą polecenia: 
	conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck</li>
	<li>Zainstaluj pakiet PyYAML za pomocą polecenia: 
	conda install -c anaconda yaml 
	Pakiet ten jest niezbędny do odczytywania metadanych dotyczących obrazów do analizy oraz parametrów ustawionych przez użytkownika dla procesu analizy i dopasowania.</li>
	<li>Zainstaluj pakiet PyDDM, pobierając go z repozytorium GitHub lub korzystając z polecenia git: 
	git clone&#160;https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git</li>
</ol>
2. Planowanie sesji obrazowania
<ol>
	<li>Wybierz optymalną dostępną metodę obrazowania oraz ustawienia optyczne. Jak wspomniano, DDM można stosować w połączeniu z wieloma metodami mikroskopii.</li>
	<li>Aby pomóc w zaplanowaniu odpowiedniego obiektywu i rozmiaru obrazu, wyznacz zakres liczb falowych, q, które będą badane, w zależności od rozmiaru piksela i całkowitego rozmiaru obrazu. Na podstawie tych obliczeń potwierdź, czy wybrany powiększenie i pole widzenia są optymalne dla danego eksperymentu. W przypadku obrazów analizowanych w niniejszej pracy, dla aktywnej kompozytowej sieci aktyna-mikrotubule zastosowano obiektyw 60x 1.4 NA oraz rozmiar obrazu 256 x 256 pikseli przy rozmiarze piksela 0.83 µm. W przypadku obrazów kulek osadzonych w sieci vimentyny zastosowano obiektyw 100x 1.4 NA oraz rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli przy rozmiarze piksela 0.13 µm. 
	UWAGA: Minimalna wartość q jest określona wzorem 2π/NΔx, gdzie rozmiar obrazu (zakładając, że jest kwadratowy) wynosi N&#160;× N pikseli przy rozmiarze piksela Δx. Maksymalna wartość q to mniejsza z wartości&#160;π/Δx oraz 2π NA/λ, gdzie NA to apertura numeryczna obiektywu obrazującego, a λ to długość fali światła (w przypadku obrazowania w polu jasnym NA można zastąpić wartością (NAobiektywu + NAkondensora)/2).</li>
	<li>Następnie rozważ zakres skal czasowych do zbadania. Zazwyczaj analiza DDM jest przeprowadzana na sekwencjach składających się z co najmniej 1000 klatek.
	<ol>
		<li>Aby wyznaczyć odpowiednią częstotliwość klatek, weź pod uwagę przewidywany czas, w jakim elementy próbki przemieszczą się o dystans rzędu minimalnej rozdzielczej skali długości (odpowiadającej maksymalnemu&#160;q).</li>
		<li>Biorąc pod uwagę górną granicę badanych skal czasowych, należy pamiętać, że zazwyczaj uśrednia się widma mocy z setek&#160;różnic obrazów dla danego czasu opóźnienia&#160;Δt, aby uzyskać wystarczającą statystykę w celu redukcji szumu. Zatem należy pozyskać sekwencje obrazów dłuższe niż badana maksymalna skala czasowa. 
		&#8203;UWAGA: Jeśli znany jest przewidywany współczynnik dyfuzji, D, lub prędkość, v, można oszacować przewidywane charakterystyczne czasy zaniku, korzystając ze wzorów&#160;τ = 1/Dq2&#160;lub&#160;τ = 1/vq wraz z zakresem q, który został wyznaczony na podstawie pola widzenia i rozmiaru piksela. Zakres oczekiwanych wartości τ w dostępnym zakresie q może pomóc w wyborze częstotliwości klatek oraz liczby klatek do pozyskania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek i akwizycja obrazów
UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przygotowania próbek i ustawień obrazowania zastosowanych dla danych przedstawionych w sekcji wyników reprezentatywnych znajdują się w poprzednich publikacjach autorów11,51,64 oraz w Pliku uzupełniającym 2.
<ol>
	<li>Biorąc pod uwagę skale czasu i długości, które mają zostać zbadane, należy pozyskać sekwencje obrazów składające się idealnie z ponad 1000 klatek. 
	UWAGA: Kod analizuje obrazy kwadratowe lub kwadratowe obszary zainteresowania (ROI) w obrębie obrazu, dlatego należy odpowiednio dostosować rozmiar klatki.</li>
	<li>Sekwencje obrazów należy zapisać jako trójwymiarowy stos TIFF w skali szarości. Alternatywnie, zainstalowany pakiet może odczytywać format ND2 stosowany w systemach Nikon Instruments. Jeśli obrazy zostały zapisane w innym formacie, należy użyć programu ImageJ lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazów, aby przekonwertować je na stos TIFF. 
	&#8203;UWAGA: W przypadku korzystania z plików ND2 konieczna jest instalacja pakietu nd2reader z adresu &#160;https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader.</li>
</ol>
4. Konfiguracja parametrów
<ol>
	<li>Utwórz kopię przykładowego pliku parametrów example_parameter_file.yml, który znajduje się w repozytorium kodu PyDDM w folderze examples. Otwórz ten plik YAML za pomocą edytora tekstu, takiego jak NotePad++ lub edytora tekstu w JupyterLab. Przykład pliku parametrów YAML użytego w analizie danych przedstawionych w sekcji wyników reprezentatywnych znajduje się w Pliku uzupełniającym 2.</li>
	<li>W skopiowanym pliku YAML podaj katalog danych oraz nazwę pliku odpowiadającą sekwencji obrazów do analizy. W sekcji metadanych podaj rozmiar piksela oraz częstotliwość klatek.</li>
	<li>W sekcji Analysis_parameters podaj szczegóły dotyczące sposobu obliczania macierzy DDM. Niektóre z tych parametrów są opcjonalne.
	<ol>
		<li>W minimalnym zakresie podaj wartości dla parametrów number_lag_times oraz last_lag_time. Odpowiadają one odpowiednio do liczby różnych czasów opóźnienia, dla których ma zostać obliczona macierz DDM, oraz do najdłuższego czasu opóźnienia (w klatkach), który należy zastosować. Dla danych kulek znacznikowych w sieciach vimentyny użytych w tej pracy, parametry number_lag_times i last_lag_time wynosiły odpowiednio 60 i 1000. Kod obliczy macierz DDM dla czasów opóźnienia od 1 klatki (lub innego minimalnego czasu opóźnienia, jeśli określono opcjonalny parametr first_lag_time) do last_lag_time z rozmieszczeniem logarytmicznym. 
		UWAGA: Jeśli pozyskano M klatek, można obliczyć macierz DDM dla czasu opóźnienia aż do M-1. Jednak ze względu na słabą statystykę przy tak dużym czasie opóźnienia, dane będą prawdopodobnie zaszumione. Najdłuższy czas opóźnienia, dla którego obliczana jest macierz DDM, zależy od szczegółów danych, ale sugerujemy wypróbowanie wartości wynoszącej około jednej trzeciej całkowitego czasu trwania serii obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sekcji Fitting_parameters podaj szczegóły dotyczące dopasowania macierzy DDM lub pośredniej funkcji rozproszenia (ISF). Podaj nazwę modelu w parametrze model. Określ wartość początkową, dolną oraz górną granicę dla każdego z parametrów dopasowania w wybranym modelu. 
	&#8203;UWAGA: Aby wyświetlić listę możliwych modeli dopasowania, uruchom funkcję print_fitting_models. Modele można również znaleźć w dokumentacji online na stronie internetowej PyDDM.</li>
</ol>
5. Obliczanie macierzy DDM
<ol>
	<li>Inicjalizuj instancję klasy DDM_Analysis. W tym celu przekaż metadane i parametry analizy omówione powyżej, podając do DDM_Analysis nazwę pliku YAML wraz z pełną ścieżką dostępu. Alternatywnie można przekazać metadane i parametry w formie struktury danych słownika Pythona.</li>
	<li>Uruchom funkcję calculate_DDM_matrix, aby obliczyć macierz DDM. Obliczenia te mogą zająć kilka minut lub więcej, w zależności od rozmiaru klatki i liczby czasów opóźnienia. Typowe czasy wykonania przedstawiono na Rysunku 2.</li>
	<li>Przejrzyj zwrócone dane, które będą znajdować się w strukturze danych z pakietu xarray znanej jako Dataset. Struktura ta jest przechowywana pod atrybutem ddm_dataset. 
	UWAGA: W tej strukturze danych przechowywana będzie nie tylko macierz DDM, ale także powiązane zmienne i metadane. Zostanie ona również zapisana na dysku w formacie Network Common Data Form (netCDF).</li>
	<li>Przejrzyj wygenerowane i wyświetlone wykresy oraz rysunki. Rysunki te są również zapisywane jako plik PDF w katalogu danych.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że jeden z wygenerowanych wykresów przedstawia uśredniony dla zespołu kwadrat modułu obrazów po transformacji Fouriera, <img alt="Równanie031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;" />&#160;jako funkcję q. Domyślnie kod wykorzystuje tę wartość do oszacowania parametru tła B. Oszacuj tło z <img alt="Równanie031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;" />, zakładając, że w granicy dużych wartości q dąży ona do B/2, gdzie B oznacza tło.</li>
		<li>Jeśli <img alt="Równanie031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;" /> nie osiąga plateau przy dużych wartościach q, zastosuj inną metodę szacowania B. Aby to zrobić, ustaw parametr background_method w pliku YAML lub jako opcjonalny argument słownikowy funkcji calculate_DDM_matrix. Więcej szczegółów na temat metod szacowania B znajduje się w sekcji wyników reprezentatywnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2.jpg" /> 
Rycina 2: Czas obliczeń potrzebny do wyznaczenia macierzy DDM. Na wykresach (A) i (B) przedstawiono czas obliczania macierzy DDM, <img alt="Równanie009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;" />. We wszystkich przypadkach wykorzystano film składający się z 5000 klatek o rozmiarze obrazu 512 x 512 pikseli. Macierz DDM obliczono dla 30 czasów opóźnienia, rozmieszczonych logarytmicznie między 1 klatką (0,01 s) a 1000 klatkami (10 s). Kod uruchomiono na komputerze stacjonarnym Intel i7-10700 2,90 GHz z 32 GB RAM. Na wykresie (A) pokazano wpływ zmiany liczby różnic obrazów wykorzystywanych do obliczenia macierzy DDM dla każdego czasu opóźnienia. W tym celu obrazy poddano binowaniu, aby uzyskać rozmiar obrazu 256 x 256. Dla każdego czasu opóźnienia Δt odejmowano obrazy oddzielone o tę wartość&#160;Δt, a otrzymaną macierz poddawano transformacie Fouriera. Dla danego Δt można było wykorzystać wszystkie pary obrazów oddzielone o&#160;tę wartość&#160;Δt (kolor niebieski), tylko niezakładające się pary obrazów (np. klatki 1 i 10, 10 i 19 itd.; kolor brązowy) lub maksymalnie 300 par obrazów dla każdego Δt. Na wykresie (B) pokazano wpływ zmiany rozmiaru obrazu na czas obliczeń. Obrazy binowano poprzez grupowanie pikseli 2 x 2, 4 x 4 lub 8 x 8, co skutkowało odpowiednio rozmiarami obrazu 256 x 256, 128 x 128 lub 64 x 64. W każdym przypadku do obliczenia macierzy DDM dla każdego Δt wykorzystano około 300 par obrazów. (C) Z macierzy DDM można wyznaczyć pośrednią funkcję rozpraszania (ISF). Przedstawiono to dla trzech przypadków z wykresu (A). Niebieskie punkty danych (bez przesunięcia) odpowiadają ISF przy zastosowaniu maksymalnej liczby par obrazów dla każdego Δt; brązowe punkty danych (z przesunięciem 0,1) odpowiadają ISF przy zastosowaniu niezakładających się par obrazów dla każdego Δt; a różowe punkty danych (z przesunięciem 0,2) odpowiadają ISF przy zastosowaniu maksymalnie 300 par obrazów dla każdego Δt. ISF wyznaczona przy użyciu niezakładających się par obrazów wykazuje większy szum przy długich Δt. W tym przypadku przy długich&#160;Δt wykorzystano niewiele par obrazów (np. dla&#160;Δt wynoszącego 1000 klatek wykorzystano tylko 4 pary obrazów). (D) Poprzez dopasowanie ISF do funkcji wykładniczej wyznaczono charakterystyczny czas zaniku, τ, dla każdej liczby falowej, q. Kolorem różowym zaznaczono wyniki po binowaniu oryginalnych obrazów 2 x 2, co dało rozmiar obrazu 256 x 256. Kolorem szarym zaznaczono wyniki po binowaniu 8 x 8, co dało rozmiar obrazu 64 x 64. Dzięki binowaniu danych tracone są informacje o dynamice przy wyższych liczbach falowych, ale obliczanie macierzy DDM dla obrazów 64 x 64 jest około 16x szybsze niż dla obrazów 256 x 256. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
6. Dopasowanie macierzy DDM lub ISF
<ol>
	<li>Zainicjuj instancję klasy DDM_Fit. W tym celu przekaż do DDM_Fit nazwę pliku YAML zawierającego metadane obrazów oraz parametry dopasowania.</li>
	<li>Zdecyduj, który model macierzy DDM lub ISF należy zastosować do dopasowania danych. Wylistuj dostępne modele, wykonując funkcję print_fitting_models. Określ model do użycia w pliku parametrów YAML lub korzystając z funkcji reload_fit_model_by_name.</li>
	<li>Ustaw wartości początkowe oraz granice dla każdego parametru w wybranym modelu w dostarczonym pliku parametrów YAML. Aby zmienić wartość początkową dowolnego parametru, użyj funkcji set_parameter_initial_guess. Ustaw granice parametrów za pomocą funkcji set_parameter_bounds. Na przykład, jak pokazano w Supplementary File 2, dla danych dotyczących kulek znacznikowych w sieci wimentyny, wartość początkowa czasu zaniku wynosiła 1 s, a granice tego parametru wynosiły 0.01 s i 2000 s.</li>
	<li>Wykonaj dopasowanie za pomocą funkcji fit. Przypisz zmienną do wyniku tej funkcji, aby łatwo uzyskać dostęp do rezultatów. 
	&#8203;UWAGA: Funkcja ta może przyjmować wiele opcjonalnych argumentów. Zobacz dokumentację kodu i dostarczone przykłady, aby zapoznać się z listą takich argumentów oraz sytuacjami, w których należy rozważyć ustawienie ich na wartości inne niż domyślne.</li>
</ol>
7. Interpretacja wyników dopasowania
<ol>
	<li>Wygeneruj wykresy w celu sprawdzenia dopasowania oraz qzależność parametrów dopasowania za pomocą funkcji fit_report. 
	UWAGA: Funkcja ta wygeneruje serię wykresów, które zostaną również zapisane w formacie PDF. Opcjonalne argumenty tej funkcji mogą zostać wykorzystane do zmodyfikowania generowanych wykresów.</li>
	<li>Wśród wygenerowanych wykresów znajdzie się rycina z czterema podwykresami (układ 2 x 2), przedstawiająca macierz DDM lub ISF (w zależności od wybranego modelu dopasowania) w czterech qwartości (określone jako opcjonalny argument funkcji fit_report), wraz z obliczoną macierzą DDM lub ISF przy użyciu modelu i parametrów najlepszego dopasowania. Aby w sposób interaktywny wykreślić macierz DDM lub ISF wraz z najlepszym dopasowaniem, należy użyć klasy Browse_DDM_Fits, zgodnie z przykładami zamieszczonymi w przypadku korzystania ze środowiska Jupyter Notebook.</li>
	<li>Z wykresu charakterystycznego czasu zaniku&#160;&#964; w zależności od liczby falowej q, należy określić, czy dynamika odpowiada ruchowi dyfuzyjnemu, subdyfuzyjnemu, balistycznemu, czy też innemu rodzajowi ruchu. Można to zrobić, analizując zależność potęgową między&#160;&#964; i q. 
	&#8203;UWAGA: Na wykresie w skali logarytmicznej dla&#160;&#964; kontra q wygenerowane przez funkcję fit_report, wyświetlone zostaną trzy linie odpowiadające dopasowaniom do prawa potęgowego w określonym zakresie&#160;q wartości. Ciągła czarna linia odpowiada dopasowaniu &#964; kontra q do prawa potęgowego, &#964; = 1 / Kq&#946;, gdzie K i&#160;&#946; są parametrami wolnymi. Pomarańczowa przerywana linia odpowiada dopasowaniu do prostej dyfuzji, &#964; = 1 / Dq2, gdzie D jest współczynnikiem dyfuzji. Niebieska linia kropka-kreska odpowiada dopasowaniu do &#964; = 1 / vq, gdzie v jest prędkością.</li>
</ol>
8. Zapisywanie wyników
<ol>
	<li>Wyniki dopasowania zostaną zapisane w zbiorze danych xarray. Aby zapisać tę strukturę danych na dysku, należy użyć funkcji to_netcdf biblioteki xarray lub wbudowanego w język Python modułu pickle. Do ładowania tych plików netCDF należy użyć funkcji open_dataset biblioteki xarray.</li>
	<li>Aby zapisać wyniki dopasowania wraz z danymi w pliku arkusza kalkulacyjnego, należy użyć funkcji save_fit_results_to_excel.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
	<li>Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).</li>
	<li>Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).</li>
	<li>Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
	<li>Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).</li>
	<li>Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).</li>
	<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
	<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
	<li>Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).</li>
	<li>Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).</li>
	<li>Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).</li>
	<li>Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).</li>
	<li>K&#246;ster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).</li>
	<li>Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).</li>
	<li>Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).</li>
	<li>Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li>
	<li>Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).</li>
	<li>Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).</li>
	<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).</li>
	<li>Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., N&#233;d&#233;lec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).</li>
	<li>Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).</li>
	<li>Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).</li>
	<li>Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).</li>
	<li>He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).</li>
	<li>Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).</li>
	<li>Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).</li>
	<li>Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).</li>
	<li>Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).</li>
	<li>Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).</li>
	<li>Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).</li>
	<li>He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).</li>
	<li>Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).</li>
	<li>Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).</li>
	<li>Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).</li>
	<li>Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).</li>
	<li>Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).</li>
	<li>Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).</li>
	<li>Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).</li>
	<li>Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).</li>
	<li>Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).</li>
	<li>Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).</li>
	<li>Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).</li>
	<li>Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).</li>
	<li>Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).</li>
	<li>Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).</li>
	<li>Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).</li>
	<li>Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).</li>
	<li>Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).</li>
	<li>Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F., Haro-P&#233;rez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).</li>
	<li>Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).</li>
	<li>Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).</li>
	<li>Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).</li>
	<li>Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).</li>
	<li>Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li>
	<li>Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., L&#246;wen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).</li>
	<li>Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).</li>
	<li>Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).</li>
	<li>Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).</li>
	<li>Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).</li>
	<li>Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).</li>
	<li>Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).</li>
	<li>Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).</li>
	<li>Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).</li>
	<li>Pawelzyk, P., M&#252;cke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).</li>
	<li>Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).</li>
	<li>Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).</li>
	<li>Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).</li>
	<li>Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).</li>
	<li>Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).</li>
	<li>Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).</li>
	<li>Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).</li>
	<li>Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).</li>
	<li>soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.&#160;Zenodo&#160;(2021).</li>
	<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
	<li>Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj pakiet oprogramowania wykorzystuje DDM do analizy fluktuacji gęstości obserwowanych w obrazach uzyskanych za pomocą mikroskopu optycznego. W pierwszej kolejności przedstawiono reprezentatywne wyniki z danych dotyczących cząstek znacznikowych osadzonych w sieciach wimentyny. Analiza takich danych może być wykorzystana do scharakteryzowania rozmiaru siatki i sztywności sieci, podobnie jak śledzenie pojedynczych cząstek było wykorzystywane w wielu wcześniejszych badaniach sieci cytoszkieletów 6,12,13. Zaletą stosowania DDM w porównaniu ze śledzeniem pojedynczych cząstek jest to, że DDM nie wymaga lokalizacji cząstek. Dlatego nawet na obrazach, na których gęstość cząstek jest zbyt wysoka lub cząstki są zbyt małe, aby można je było zlokalizować i śledzić, DDM może nadal określać dynamikę. Śledzenie pojedynczych cząstek byłoby korzystne w przypadku kontroli zmienności między cząstkami. W przypadku DDM można znaleźć uśrednioną dynamikę zespołu, podczas gdy przy śledzeniu pojedynczej cząstki można obliczyć zarówno MSD pojedynczej cząstki, jak i MSD uśrednione zespołowo. Jednak DDM może być używany do badania dynamiki heterogenicznej poprzez analizowanie wielu obszarów zainteresowania w dużym polu widzenia.
Następnie przedstawiono reprezentatywne wyniki z danych włókien znakowanych fluorescencyjnie w sieci aktywnej złożonej z dwóch różnie znakowanych typów włókien cytoszkieletu11. Na podstawie tych danych scharakteryzowano ruch balistyczny bez konieczności lokalizowania jakichkolwiek cech na obrazie. Ponieważ DDM ekstrahuje uśrednioną dynamikę zespołu przy niewielkiej liczbie danych wejściowych użytkownika, ułatwia to porównywanie serii obrazów uzyskanych w różnych warunkach (np. porównywanie próbek o różnych proporcjach aktyny do mikrotubul lub próbek o różnych stężeniach miozyny, jak to miało miejsce w50). Dodatkowo, korzystając z obrazowania fluorescencyjnego, możemy badać dynamikę różnych elementów sieci za pomocą wielokolorowego znakowania. Dokonano tego w 11,50, gdzie dynamika aktyny i mikrotubul była oddzielnie analizowana w aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula przy użyciu obrazowania wielokolorowego. W sekcji wyników reprezentatywnych pokazano tylko wyniki z kanału mikrotubul, ale w poprzedniej pracy porównaliśmy dynamikę włókien mikrotubuli i aktyny11.
Zauważamy, że te reprezentatywne wyniki pokazują albo pasywną subdyfuzję, albo aktywny ruch balistyczny. Co ważne, DDM może być wykorzystywany do analizy układów, w których występuje przecięcie w rodzaju dynamiki w pośrednich skalach czasowych lub długościowych. Jako przykłady, Kurzthaler i in. wykorzystali DDM z systemem aktywnych koloidów Janusa do zbadania aktywnego ruchu kierowanego w krótkich skalach czasowych i randomizacji orientacji w dłuższych skalach czasowych59; Giavazzi i wsp. użyli DDM z gruboziarnistą pianką i znaleźli skrzyżowanie w dynamice odpowiadającej skali długości pęcherzyka33; a Cho i in. użyli DDM z żelami koloidalnymi i znaleźli trzy rozróżnialne reżimy w różnych skalach długości, rozciągających się od klastrów fraktalnych do całej sieci32.
Dane zawarte w sekcji wyników reprezentatywnych uzyskano za pomocą mikroskopii jasnego pola i laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej. Jednak, jak wspomniano wcześniej, DDM może być stosowany z wieloma modalnościami obrazowania. W przypadku każdej metody obrazowania użytkownicy powinni wziąć pod uwagę ustawienia optyczne, takie jak stopień przekroju optycznego lub głębia ostrości. Wysoki stopień przekroju optycznego może zmniejszyć sygnał od nieostrych obiektów, ale nie będzie w stanie dokładnie zmierzyć dynamiki w skalach czasowych większych niż skala czasu, w której obiekty poruszają się poza głębią ostrości25,28. Bardziej szczegółowe omówienie tego, jak głębia ostrości zależna od q wpływa na analizę DDM, można znaleźć w22. W przypadku obrazowania w jasnym polu użytkownicy mogą być również zmuszeni do rozważenia grubości próbki. Podczas gdy w przypadku próbek słabo rozpraszających, grubsze próbki mogą dostarczyć więcej sygnału42, próbki mętne mogą wymagać modyfikacji analizy w celu uwzględnienia rozpraszania wielokrotnego81. Wreszcie, w przypadku metod obrazowania, które nie są niezmiennicze w przestrzeni liniowej (to znaczy, gdy intensywność zarejestrowana przez kamerę obiektu zależy od tego, gdzie ten obiekt znajduje się w płaszczyźnie próbki x-y), może być konieczne uwzględnienie liniowej wariancji przestrzeni, jak wykazano w przypadku DDM27 w ciemnym polu.
Dla tych, którzy rozpoczynają pracę z DDM, pragniemy podkreślić znaczenie rozważenia rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Podczas sprawdzania wyznaczonych czasów zaniku w funkcji liczby falowej ważne jest, aby zaznaczyć granice swojej rozdzielczości (tj. maksymalne i minimalne czasy opóźnienia oraz maksymalną liczbę falową, jak pokazano na rysunku 5). Przed zebraniem danych należy dokładnie przemyśleć te ograniczenia, aby można było wybrać optymalny obiektyw, rozmiar obrazu, liczbę klatek na sekundę i czas trwania filmu. Inną ważną kwestią jest sposób oszacowania parametru tła B. W literaturze przedmiotu stosowano wiele metod szacowania tła, a skutki przeszacowania lub niedoszacowania B opisano we wcześniejszych publikacjach62,77. Jak pokazano na rysunku 10, PyDDM umożliwia użytkownikom implementację różnych metod szacowania B i sugerujemy, aby nowi użytkownicy wypróbowali te metody i ocenili, które są odpowiednie do użycia.
Mocną stroną tego pakietu jest jego dokładna dokumentacja i przewodniki z przykładowymi danymi, przechowywanie i organizacja metadanych w celu śledzenia sposobu przeprowadzania analiz oraz elastyczność w sposobie analizy macierzy DDM (różne modele dopasowania, wiele metod szacowania parametru tła B, możliwość znalezienia MSD). Istnieje jednak wiele aspektów tego kodu, które można ulepszyć. Obecnie kod nie został zoptymalizowany pod kątem dużej szybkości obliczeń. Metody przyspieszające obliczenia zostały zgłoszone61,62 i zostaną zaimplementowane w przyszłych wersjach. Ponadto planujemy wdrożyć ostatnio zgłoszone metody, aby lepiej oszacować niepewności i wykorzystać symulacje do kierowania użytkowników do odpowiedniego modelu ISF62. Mamy nadzieję, że w przypadku innych ulepszeń użytkownicy skontaktują się z nami z sugestiami.

Cytooszkielet to sieć filamentów białkowych rozciągająca się przez cytoplazmę komórek eukariotycznych, łącząca powierzchnię komórki z jądrem. Posiada on unikalne właściwości materiałowe, zapewniając ochronę mechaniczną przed dużymi i powtarzającymi się obciążeniami mechanicznymi, a jednocześnie napędzając dynamiczne zmiany kształtu komórki1. Rekonstytuowane sieci cytooszkieletu mogą wykazywać szereg interesujących zachowań dynamicznych, od uwięzienia wbudowanych cząsteczek po ruch balistyczny napędzany przez motory molekularne2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Metody analizy dynamiki takich sieci obejmują śledzenie ruchu wbudowanych mikrosfer znacznikowych6,7,12,13,14, analizę obrazu w celu śledzenia wielkości gęstych skupisk białek w czasie8, dynamiczne rozpraszanie światła15, cyfrową welocymetrię obrazową cząstek (PIV)4,16,17,18,19, obliczanie gęstości widmowej mocy obrazów w czasie19 oraz analizę kymograficzną20. Wraz z prowadzeniem coraz większej liczby badań nad rekonstytuowanymi sieciami cytooszkieletu, niezależnie od tego, czy mają one na celu zrozumienie mechaniki komórkowej, czy materii aktywnej, coraz bardziej niezbędne stają się solidne, bezstronne i powtarzalne metody charakteryzowania dynamiki. Dyferencjalna mikroskopia dynamiczna (DDM)21,22, stosunkowo nowa technika wykorzystywana do badania dynamiki cytooszkieletu, jest właśnie taką metodą, która efektywnie kwantyfikuje dynamikę przy niewielkiej liczbie parametrów definiowanych przez użytkownika. Dzięki opisanemu tutaj pakietowi oprogramowania badacze z niewielkim doświadczeniem w programowaniu lub analizie obrazu będą mogli wykorzystać DDM we własnej pracy.
DDM jest techniką analizy obrazu służącą do wyznaczania dynamiki próbki. Podobnie jak śledzenie cząstek (particle tracking) czy welocymetria obrazu cząstek (particle image velocimetry), DDM wymaga serii obrazów w czasie (często tysięcy obrazów), zazwyczaj rejestrowanych za pomocą mikroskopu. W przeciwieństwie do śledzenia cząstek, poszczególne cechy lub koraliki znacznikowe nie muszą być lokalizowane (ani nawet być lokalizowalne) na obrazie. W odróżnieniu zarówno od śledzenia cząstek, jak i welocymetrii obrazu cząstek, w metodzie DDM odzyskuje się dynamikę zespołu przy stosunkowo niewielkiej liczbie parametrów określonych przez użytkownika. W DDM obrazy są analizowane w przestrzeni Fouriera w celu określenia czasu zaniku fluktuacji gęstości&#160;dla zakresu liczb falowych, q, gdzie q = 2πu, a u jest wartością częstotliwości przestrzennych, <img alt="Równanie 004" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq004.png" />. Uzyskuje się informacje podobne do tych z rozpraszania, ale przy użyciu obrazów w przestrzeni rzeczywistej nabytych za pomocą mikroskopu21,22,23. Dzięki temu można wykorzystać różne metody generowania kontrastu w mikroskopii, takie jak mikroskopia fluorescencyjna w szerokim polu22,24, fluorescencyjna konfokalna25, polaryzacyjna26, ciemnopola27 lub fluorescencyjna z arkuszem światła (light-sheet)28. Co więcej, obrazy wykorzystane do analizy DDM mogą zostać użyte do śledzenia cząstek lub welocymetrii obrazu cząstek w celu uzyskania uzupełniających informacji.
Połączenie cech dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii optycznej sprawia, że DDM jest potężną i wszechstronną techniką. Od czasu pierwszego opisu autorstwa Cerbino i Trappe z 2008 roku21, w którym wykazano możliwość pomiaru dyfuzji koloidalnych cząstek o rozmiarze 73 nm za pomocą DDM, metoda ta była wykorzystywana do pomiaru płynących koloidów29, agregacji koloidalnej30,31, wiskoelastyczności nematycznych kryształów ciekłych26, dynamiki żeli koloidalnych32, grubienia pian33, nanocząstek w środowiskach ograniczonych34,35,36,37, ruchliwości bakterii38,39,40,41, dyfuzji słabo rozpraszających klastrów białkowych42, fal kapilarnych na granicach faz cieczy43 oraz innych układów. Osoby poszukujące pełniejszego zestawienia publikacji wykorzystujących DDM mogą odwołać się do szczegółowych artykułów przeglądowych na ten temat22,23,44,45.
Metoda DDM była również wykorzystywana do badania dynamiki sieci biologicznych. Drechsler i wsp. użyli DDM do pomiaru dynamiki aktyny w żywych oocytach Drosophila 46. Burla i wsp. ilościowo określili dynamikę cząsteczek znacznikowych w sieciach hialuronianu oraz kompozytach hialuronianu i kolagenu47. Udokumentowano również kilka zastosowań DDM do badania dynamiki cząsteczek znacznikowych w zrekonstruowanych sieciach cytoszkieletu9,10, transportu cząsteczek DNA w takich sieciach48,49 oraz dynamiki aktywnych sieci zrekonstruowanych11,50,51. Zaletą DDM w pomiarze dynamiki w takich układach jest fakt, że poszczególne cząsteczki lub molekuły nie muszą być lokalizowane ani śledzone. Dzięki temu, na przykład, dynamikę cząsteczek DNA w środowiskach zatłoczonych można mierzyć za pomocą DDM pomimo trudności w śledzeniu tak małych i niesferycznych molekuł. Ponadto, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, można zastosować znakowanie wielobarwne, aby selektywnie mierzyć dynamikę poszczególnych składników w złożonym kompozycie.
Aby przeprowadzić DDM, wykonuje się sekwencję obrazów w czasie, I(x,y,t). Dla określonego czasu opóźnienia, Δt, wyszukuje się wszystkie (lub podzbiór) par obrazów oddzielonych tym odstępem czasu. Kwadrat transformaty Fouriera różnicy każdej pary,
<img alt="Równanie007" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq007.png" style="margin-bottom: 0px;" />
zostaje obliczona i uśredniona. Wartość ta, <img alt="Równanie008" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq008.png" style="margin-bottom: 0px;" />, jest uśredniana radialnie, pod warunkiem że dynamika jest izotropowa. Pozwala to na wyznaczenie macierzy DDM (zwanej również funkcją struktury obrazu), <img alt="Równanie009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;" />. Proces ten przedstawiono graficznie na Rysunku 1. Aby określić dynamikę próbki na podstawie tej macierzy DDM, przyjmuje się, że macierz DDM ma postać
<img alt="Równanie010" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq010.png" style="margin-bottom: 0px;" />
gdzie A to amplituda, która zależy od parametrów mikroskopu i struktury próbki, B to tło, które zależy od szumu w obrazach, a f&#160;(q, Δt) to pośrednia funkcja rozprosania (ISF), która zawiera informacje o dynamice21,22. W prostych przypadkach,
<img alt="Równanie014" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq014.png" style="margin-bottom: 0px;" />
gdzie&#160;τ jest charakterystycznym czasem rozpadu lub dekorelacji. Taka ISF była wykorzystywana w kilku badaniach z zastosowaniem DDM w systemach ergodycznych, takich jak rozcieńczone zawiesiny koloidalne21,24,27,37,40,52. Jednak do modelowania różnych typów dynamiki można wykorzystać inne formy ISF. Na przykład, w celu zamodelowania ISF dla próbek polidyspersyjnych można zastosować rozwinięcie kumulantowe w postaci
<img alt="Równanie016" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq016.png" style="margin-bottom: 0px;" />
gdzie&#160;μ jest miarą polidyspersyjności42,53; jeśli fluktuacje gęstości zanikają w dwóch osobnych trybach, można zastosować ISF w postaci
<img alt="Równanie018" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq018.png" style="margin-bottom: 0px;" /> 26, 54, 55, 56, 57;
inne ISF mogą być wykorzystywane do badania pływających mikroorganizmów lub innych aktywnych cząstek38,39,40,41,58,59.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd analizy DDM. Na podstawie serii czasowej obrazów obliczana jest transformata Fouriera różnic obrazów w celu wyznaczenia macierzy DDM. Macierz DDM można dopasować do modelu, aby określić skalę czasową fluktuacji gęstości dla zakresu wartości q. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W niniejszym materiale opisano zastosowanie pakietu oprogramowania do analizy DDM opracowanego w języku Python, PyDDM. Pakiet ten opiera się na pracach wykonanych w naszych laboratoriach badawczych oraz w innych opublikowanych badaniach z ostatnich kilku lat. Głównymi motywacjami do stworzenia tego oprogramowania była potrzeba (1) śledzenia i przechowywania metadanych oraz parametrów wykorzystywanych w analizie; (2) zapewnienia dokładnej dokumentacji z szczegółowymi przykładami analizy od początku do końca; oraz (3) stworzenia prostego sposobu wdrażania różnych (lub tworzenia nowych) modeli matematycznych do dopasowania danych (np. dodanie modeli ISF, takich jak te opracowane niedawno dla filamentów aktywnych60, byłoby proste). Istnieją również inne pakiety oprogramowania do analizy DDM, choć nie wszystkie są dobrze udokumentowane i napisane w języku programowania o otwartym kodzie źródłowym. Przykładowo, dostępny jest kod w języku C++ z obliczeniami na procesorach GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, kod w języku C++ wykorzystujący transformaty Fouriera w czasie w celu przyspieszenia obliczeń (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, wersje w językach MATLAB i Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, kod w języku MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 oraz kod w języku MATLAB z kwantyfikacją niepewności (https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Ponieważ pakiet PyDDM jest dobrze udokumentowany i zapewnia dużą elastyczność w sposobie obliczania i analizowania macierzy DDM, mamy nadzieję, że okaże się on użyteczny dla badaczy chcących wdrożyć metodę DDM, niezależnie od ich doświadczenia w programowaniu czy analizie obrazu.&#160;
Protokół ten pokazuje, w jaki sposób ten pakiet oprogramowania może być wykorzystany do ilościowego określenia dynamiki sieci cytoszkieletu zrekonstruowanych in vitro. Jest to realizowane przy użyciu dwóch różnych zestawów danych obrazowych: (1) obrazów submikronowych cząsteczek znacznika osadzonych w sieci vimentyny, wykonanych za pomocą mikroskopii w polu jasnym oraz (2) obrazów fluorescencyjnie znakowanych filamentów aktyny i mikrotubul w splątanej sieci kompozytowej z aktywnością napędzaną przez miozynę, wykonanych za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Analizy tych dwóch zbiorów danych podkreślają istotne zalety DDM, w tym możliwość analizy obrazów wykonanych za pomocą różnych metod obrazowania (np. w polu jasnym lub fluorescencji konfokalnej), wyodrębniania dynamiki zarówno z osadzonych znaczników, jak i ze znakowanych filamentów oraz ilościowego określania różnych rodzajów dynamiki (np. subdyfuzyjnej, ograniczonej lub balistycznej).

<table><tbody><tr><td>Kamera CMOS, Orca-Flash 4.0</td>, <td>Hamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-127, Pluronic</td>, <td>Sigma, Aldrich</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>Jupyter, Notebook</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Nanodrop</td><td>, Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Nikon Ti-Eclipse, mikroskop</td>, <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>PLL-PEG-bio</td>, <td>SuSos AG, D&uuml; bendorf, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki polistyrenowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minikaseta do dializy białkowej</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyDDM</td><td>University of San Diego</td><td>N/A Oprogramowanie</td><td>open source dostępne w https://github.com/rmcgorty/PyDDM</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Komórki mogą pełzać, samoleczyć się i dostosowywać swoją sztywność dzięki niezwykle dynamicznemu cytoszkieletowi. W związku z tym odtworzenie sieci biopolimerów cytoszkieletu może prowadzić do powstania wielu aktywnych i elastycznych materiałów. Jednak inżynieria takich materiałów o precyzyjnie dostrojonych właściwościach wymaga zmierzenia, w jaki sposób dynamika zależy od składu sieci i metod syntezy. Kwantyfikacja takiej dynamiki jest wyzwaniem ze względu na różnice w czasie, przestrzeni i przestrzeni formułowania sieci złożonych. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób technika analizy Fouriera, różnicowa mikroskopia dynamiczna (DDM), może określić ilościowo dynamikę sieci biopolimerowych i jest szczególnie dobrze przystosowana do badań sieci cytoszkieletów. DDM pracuje nad sekwencjami czasowymi obrazów uzyskanych przy użyciu szeregu modalności mikroskopowych, w tym konfokalnego skanowania laserowego, fluorescencji szerokokątnej i obrazowania w jasnym polu. Z takich sekwencji obrazów można wyodrębnić charakterystyczne czasy dekoracji fluktuacji gęstości w rozpiętości wektorów falowych. Opracowano również przyjazny dla użytkownika pakiet Pythona o otwartym kodzie źródłowym do przeprowadzania analizy DDM. Dzięki temu pakietowi można mierzyć dynamikę znakowanych składników cytoszkieletu lub osadzonych cząstek znacznikowych, jak pokazano tutaj na podstawie danych dotyczących pośrednich sieci włókien (wimentyny) i aktywnych sieci aktyna-mikrotubule. Użytkownicy, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia w programowaniu lub przetwarzaniu obrazów, będą mogli wykonać DDM przy użyciu tego pakietu oprogramowania i powiązanej dokumentacji.

Dynamiczna mikroskopia różnicowa (DDM) łączy w sobie cechy dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii. W tym artykule przedstawiono proces wykorzystania DDM do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez ilościowe określenie subdyfuzyjnej i zamkniętej w klatce dynamiki cząstek w sieciach wimentynowych oraz ruchu balistycznego aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych miozyną.

Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

Nasz protokół może określić ilościowo dynamikę w wielu systemach przy użyciu szeregu technik mikroskopii optycznej. Podkreślamy, w jaki sposób metoda ta może w szczególności pomóc w scharakteryzowaniu dynamiki odtworzonych sieci cytoszkieletów. Główną zaletą korzystania z naszego pakietu oprogramowania do różnicowej mikroskopii dynamicznej jest to, że jest on dobrze udokumentowany, zawiera wiele przykładowych plików analitycznych i można go łatwo dostosować do badania różnych typów dynamiki.Nasz pakiet oprogramowania może być wykorzystany do ilościowego określenia dynamiki nie tylko w odtworzonych sieciach cytoszkieletów, ale także w innych miękkich i biologicznie istotnych materiałach. Na podstawie skal czasu i długości do sondowania można uzyskać sekwencje obrazów obejmujące ponad 1 000 klatek za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem, takiego jak Micro-Manager. W folderze przykładów znajdującym się w repozytorium kodu PyDDM utwórz kopię pliku parametrów o nazwie example_parameter_file.yml.Otwórz ten plik EML za pomocą edytora tekstu, takiego jak Notatnik + lub edytora tekstu w JupyterLab. W skopiowanym pliku EML podaj katalog danych i nazwę pliku odpowiadającą sekwencji obrazów, która ma być analizowana. W sekcji metadanych podaj rozmiar w pikselach i liczbę klatek na sekundę.W sekcji parametru analizy wybierz parametry do obliczenia macierzy DDM, takie jak liczba różnych czasów opóźnienia i najdłuższy czas opóźnienia. Podaj szczegółowe informacje na temat dopasowania macierzy DDM lub funkcji rozpraszania pośredniego w sekcji parametrów dopasowania, takie jak nazwa modelu i parametr modelu, początkowe przypuszczenie, dolna granica i górna granica. Zainicjuj instancję klasy analizy DDM, podając metadane w parametrach analizy, przekazując nazwę pliku EML z pełną ścieżką do pliku do analizy DDM.Alternatywnie przekaż metadane i parametry jako strukturę danych słownika języka Python. Uruchom funkcję, aby obliczyć macierz DDM. Sprawdź zwrócone dane ze skojarzonymi zmiennymi i metadanymi, które są przechowywane jako zestaw danych w pakiecie Xarray.Następnie należy sprawdzić wykresy i rysunki, które są zapisane jako plik PDF i katalog danych. Jeden z tych wykresów przedstawia domyślną metodę szacowania tła. W razie potrzeby zmień metodę, w której tło jest szacowane, przy użyciu metody parametru background w pliku EML lub jako opcjonalny argument słowa kluczowego do funkcji calculate DDM matrix.Zainicjuj instancję klasy dopasowania DDM, przekazując nazwę pliku EML zawierającego metadane obrazu i parametry dopasowania. Wymień dostępne modele, wykonując funkcję drukuj modele dopasowań. Określ model, który ma być używany w pliku parametrów EML lub za pomocą funkcji przeładuj model dopasowania według nazwy.Dla każdego parametru w wybranym modelu ustaw początkowe domysły i granice, jeśli różnią się od wartości określonych w pliku EML, przy użyciu funkcji ustaw początkowe odgadnięcie parametru i ustaw granice parametru. Wykonaj dopasowanie za pomocą dopasowania funkcyjnego. Generuj wykresy do sprawdzania pasowań w zależności q parametrów dopasowania za pomocą raportu dopasowania funkcji.Sprawdź dane wyjściowe, w tym rysunek z wykresami podrzędnymi dwa na dwa, pokazującymi macierz DDM lub ISF przy czterech wartościach q wraz z dopasowaniem. Użyj klas browse DDM fits w środowisku Jupyter Notebook, aby wykreślić macierz DDM lub ISF wraz z najlepszym dopasowaniem w interaktywny sposób. Kliknięcie punktu na wykresie czasu zaniku w funkcji liczby falowej spowoduje wyświetlenie danych i dopasowania.Sprawdź wyniki dopasowania zapisane w zestawie danych Xarray i użyj funkcji two netCDF lub wbudowanego modułu pickle Pythona, aby zapisać tę strukturę danych na dysku. Analizę DDM przeprowadzono na serii obrazów w jasnym polu kulek o wielkości 0,6 mikrona w sieci wimentyny oraz na obrazach mikroskopu konfokalnego z aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula z widmowo odrębnymi znacznikami fluorescencyjnymi. Pośrednie funkcje rozpraszania wykreślono jako funkcję czasu opóźnienia przy różnych liczbach falowych i sieci o stężeniu wimentyny wynoszącym 19 mikromolowych i 34 mikromolowych.Długi plateau czasowy opóźnienia funkcji przy wartości znacznie powyżej zera wskazuje na nieergodyczność. Czas rozpadu tau wykreślony jako funkcja q dla dwóch sieci o różnych stężeniach wimentyny wykazuje ruch subdyfuzyjny lub ograniczony. Parametry nieergodyczności c wykreślone jako funkcja q do kwadratu dla sieci z 34 i 49 mikromolową wimentyną wykazały, że logarytm c był proporcjonalny do q do kwadratu, zgodnie z oczekiwaniami dla ruchu ograniczonego.Wykresy przemieszczenia średniokwadratowego w funkcji czasu opóźnienia wykazały, że wartości wyznaczone na podstawie DDM dobrze zgadzały się z wartościami uzyskanymi za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek. W przypadku bardziej skoncentrowanej sieci wartość stabilizuje się przy dłuższych czasach opóźnienia. Macierz DDM w funkcji czasu opóźnienia dla aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula wykazała, że macierz DDM dla określonej wartości q miała plateau przy niskich czasach opóźnienia, a następnie wzrastała w dalszym plateau przy dużych czasach opóźnienia.Charakterystyczne czasy rozpadu tau od dopasowań do matrycy DDM pokazują, że zależność między tau a q wskazuje na ruch balistyczny. Po opracowaniu tego pakietu oprogramowania PyDDM wykorzystaliśmy go do zbadania anizotropowej i zmiennej w czasie dynamiki aktywnych sieci cytoszkieletowych i innych systemów.

quantifying-cytoskeleton-dynamics-using-differential-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Poznaj metodę DDM do kwantyfikacji dynamiki sieci cytoszkieletu w badaniach biologicznych. Technika ta umożliwia analizę ruchu subdyfuzyjnego i balistycznego w materiałach biologicznych.

Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Przeglądaj więcej filmów