Name: Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: Poznaj mikroskopię śledzenia pojedynczych cząsteczek w 3D do badania dynamiki białek cytozolowych w żywych komórkach bakteryjnych. Ta metoda pozwala określić stany dyfuzyjne i lokalizacje subkomórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alecii Achimovich i Ting Yan za krytyczną lekturę rękopisu. Dziękujemy Edowi Hallowi, starszemu pracownikowi naukowemu w grupie Advanced Research Computing Services na Uniwersytecie Wirginii, za pomoc w skonfigurowaniu procedur optymalizacyjnych wykorzystywanych w tej pracy. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez Uniwersytet Wirginii.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Czynnikiem krytycznym dla pomyślnego zastosowania przedstawionego protokołu jest zapewnienie, że sygnały jednocząsteczkowe są dobrze oddzielone od siebie (tj. muszą być rzadkie w przestrzeni i czasie (Ruch uzupełniający 1)). Jeśli w komórce znajduje się więcej niż jedna cząsteczka fluoryzująca w tym samym czasie, lokalizacja może być nieprawidłowo przypisana do trajektorii innej cząsteczki. Nazywa się to problemem z linkowaniem30. Warunki eksperymentalne, takie jak poziomy ekspres...

Badanie dyfuzyjnego zachowania biomolekuł dostarcza wglądu w ich biologiczne funkcje. Techniki oparte na mikroskopii fluorescencyjnej stały się cennymi narzędziami do obserwacji biomolekuł w ich natywnym środowisku komórkowym. Odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) i spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)1 zapewniają uśrednione zachowania dyfuzyjne. I odwrotnie, mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek umożliwia obserwację pojedynczych fluorescencyjnie oznaczonych cząsteczek z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową2,3,4. Obserwacja pojedynczych cząsteczek jest korzystna, ponieważ białko będące przedmiotem zainteresowania może występować w różnych stanach dyfuzyjnych. Na przykład dwa łatwe do odróżnienia stany dyfuzyjne powstają, gdy regulator transkrypcji, taki jak CueR w Escherichia coli, swobodnie dyfunduje w cytozolu lub wiąże się z sekwencją DNA i zostaje unieruchomiony na skali czasu pomiaru5. Śledzenie pojedynczych cząsteczek zapewnia narzędzie do bezpośredniej obserwacji tych różnych stanów, a do ich rozwiązania nie są wymagane zaawansowane analizy. Jednak coraz trudniej jest rozwiązać wiele stanów dyfuzyjnych i ich frakcji populacji w przypadkach, gdy ich współczynniki dyfuzji są bardziej podobne. Na przykład, ze względu na zależność wielkości współczynnika dyfuzji, różne stany oligomeryzacji białka objawiają się jako różne stany dyfuzyjne6,7,8,9,10. Takie przypadki wymagają zintegrowanego podejścia w zakresie pozyskiwania, przetwarzania i analizy danych.
Krytycznym czynnikiem wpływającym na szybkość dyfuzyjnej cząsteczek cytozolowych jest efekt uwięzienia przez granicę komórki. Ograniczenia nałożone na ruch molekularny przez granicę komórki bakteryjnej powodują, że zmierzona szybkość dyfuzji cząsteczek cytozolowych wydaje się wolniejsza, niż gdyby ten sam ruch zaszedł w nieograniczonej przestrzeni. W przypadku bardzo wolno dyfuzujących cząsteczek efekt uwięzienia komórek jest znikomy ze względu na brak kolizji z granicą. W takich przypadkach możliwe jest dokładne określenie stanów dyfuzyjnych poprzez dopasowanie rozkładów przemieszczeń molekularnych, r lub współczynników dyfuzji pozornej, D*, przy użyciu modeli analitycznych opartych na równaniach ruchu Browna (dyfuzja losowa)11,12,13. Jednak w przypadku szybko dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych rozkłady eksperymentalne nie przypominają już tych uzyskanych dla nieograniczonego ruchu Browna z powodu zderzeń dyfuzyjnych cząsteczek z granicami komórek. Należy uwzględnić efekty uwięzienia, aby dokładnie określić nieograniczone współczynniki dyfuzji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. Ostatnio opracowano kilka podejść do uwzględniania efektów uwięzienia albo (pół)analitycznie 5,14,15,16 lub numerycznie za pomocą symulacji Monte Carlo dyfuzji Browna6,10,16,17,18,19.
Tutaj udostępniamy zintegrowany protokół do zbierania i analizowania danych z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek, ze szczególnym naciskiem na śledzenie pojedynczych molekuł. Ostatecznym celem protokołu jest rozwiązanie stanów dyfuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie białek cytozolowych wewnątrz, w tym przypadku, komórek bakteryjnych w kształcie pręcików. Nasza praca opiera się na poprzednim protokole śledzenia pojedynczych cząsteczek, w którym wykazano, że polimeraza DNA, PolI, istnieje w stanie związanym i niezwiązanym DNA przez analizę dyfuzji20. W tym miejscu rozszerzamy analizę śledzenia pojedynczych cząsteczek do pomiarów 3D i wykonujemy bardziej realistyczne symulacje obliczeniowe w celu rozwiązania i ilościowego określenia wielu stanów dyfuzyjnych jednocześnie obecnych w komórkach. Dane są pozyskiwane za pomocą domowego mikroskopu fluorescencyjnego 3D o superrozdzielczości, który jest w stanie określić pozycję 3D emiterów fluorescencyjnych poprzez obrazowanie za pomocą funkcji rozrzutu punktu podwójnej helisy (DHPSF)21,22. Surowe obrazy pojedynczych cząsteczek są przetwarzane przy użyciu specjalnie napisanego oprogramowania w celu wyodrębnienia lokalizacji 3D pojedynczych cząsteczek, które są następnie łączone w trajektorie pojedynczych cząsteczek. Tysiące trajektorii są łączone w celu wygenerowania rozkładów pozornych współczynników dyfuzji. W ostatnim kroku rozkłady eksperymentalne są dopasowywane do rozkładów generowanych numerycznie uzyskanych za pomocą symulacji ruchu Browna w ograniczonej objętości w Monte Carlo. Stosujemy ten protokół do rozwiązania stanów dyfuzyjnych białka systemu wydzielania typu 3 YscQ u żywej Yersinia enterocolitica. Ze względu na swój modułowy charakter, nasz protokół ma ogólne zastosowanie do każdego rodzaju eksperymentu śledzenia pojedynczej cząsteczki lub pojedynczej cząstki w dowolnej geometrii komórki.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2,6-diaminomeliczny</td><td>Chem Impex International</td><td>5411</td><td>Niezbędny do wzrostu komórek Y. enterocolitica zastosowanych.</td></tr><tr><td>Soczewki 4f</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-080-A</td><td>f=80mm, laser 2"</td></tr><tr><td>514 nm</td><td>Coherent</td><td>Genesis MX514 MTM</td><td>Służy do wzbudzania fluorescencji</td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Inivtrogen</td><td>16520100</td><td>Służy do wytwarzania podkładek żelowych do montażu płynnej próbki bakteryjnej na mikroskopie.</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Składnik M2G.</td></tr><tr><td>filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma</td><td>ET510/bp</td><td>Ścieżka wzbudzenia.</td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53286</td><td>Pożywka wzrostowa dla Y. enterocolitica.</td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td>składnik M2G.</td></tr><tr><td>kamera</td><td>Źródło obrazowania</td><td>DMK 23UP031</td><td>Kamera do obrazowania kontrastu fazowego.</td></tr><tr><td>dielektryczna maska fazowa</td><td>Double Helix, LLC</td><td>N/A</td><td>Wytwarza sygnał DHPSF.</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795410</td><td>Składnik M2G.</td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>Chelaty Ca2+. Indukuje wydzielanie w T3SS.</td></tr><tr><td>lustro uchylne</td><td>Newport</td><td>8892-K</td><td>Umożliwia przełączanie między ścieżkami fluorescencji i kontrastu fazowego.</td></tr><tr><td>fluosfery</td><td>Invitrogen</td><td>F8792</td><td>Koraliki fluorescencyjne. 540/560 długości fal ekscytacji i emisji. Średnica 40 nm.</td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td>#1.5, 22mmx22mm</td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Chem Impex International</td><td>811</td><td>M2G składnik.</td></tr><tr><td>olejek immersyjny</td><td>Olympus</td><td>Z-81025</td><td>Umieszczony na soczewce obiektywu.</td></tr><tr><td>siarczan żelaza(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0518</td><td>M2G.</td></tr><tr><td>filtr długoprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>LP02-514RU-25</td><td>Ścieżka emisji.</td></tr><tr><td>siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25414A</td><td>składnik M2G.</td></tr><tr><td>platforma mikroskopowa</td><td>Mad City Labs</td><td>niestandardowa</td><td>platforma do mikroskopu odwróconego.</td></tr><tr><td>Zastosowane komórki kwasu nalidyksowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4382</td><td>Y. enterocolitica są odporne na kwas nalidyksowy.</td></tr><tr><td>soczewka obiektywu</td><td>Olympus</td><td>1-U2B991</td><td>60X, 1.4 NA</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia ozonu</td><td>Novascan</td><td>PSD-UV4</td><td>Służy do eliminowania fluorescencji tła na szkiełkach nakrywkowych.</td></tr><tr><td>fosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795488</td><td>składnik M2G.</td></tr><tr><td>Czerwona dioda LED</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>Oświetla próbkę do obrazowania kontrastu fazowego. 625nm.</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-Flash 4.0 V2</td><td>Kamera do obrazowania fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>filtr krótkoprzepustowy</td><td>Chroma</td><td>ET700SP-2P8</td><td>Ścieżka emisji.</td></tr><tr><td>Soczewka tubusu</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-180-A</td><td>f=180 mm, 2"</td></tr><tr><td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Szczep AD4442, eYFP-YscQ</td></tr> płytka <tr><td>ćwierćfalowa zerowego rzędu</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-514</td><td>Ścieżka wzbudzenia.</td></tr></tbody></table>

mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek bada położenie i ruchy pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach z kilkudziesięcionanometrową rozdzielczością przestrzenną i milisekundową czasową. Możliwości te sprawiają, że mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek idealnie nadaje się do badania funkcji biologicznych na poziomie molekularnym w fizjologicznie istotnych środowiskach. W tym miejscu demonstrujemy zintegrowany protokół zarówno do pozyskiwania, jak i przetwarzania/analizy danych śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu wyodrębnienia różnych stanów dyfuzyjnych, jakie może wykazywać białko będące przedmiotem zainteresowania. Informacje te można wykorzystać do ilościowego określenia tworzenia się kompleksów molekularnych w żywych komórkach. Przedstawiamy szczegółowy opis eksperymentu lokalizacji pojedynczej cząsteczki 3D opartego na kamerze, a także kolejnych etapów przetwarzania danych, które pozwalają uzyskać trajektorie poszczególnych cząsteczek. Trajektorie te są następnie analizowane przy użyciu ramy analizy numerycznej w celu wyodrębnienia dominujących stanów dyfuzyjnych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek i względnej obfitości tych stanów. Ramy analizy opierają się na stochastycznych symulacjach wewnątrzkomórkowych trajektorii dyfuzji Browna, które są przestrzennie ograniczone przez dowolną geometrię komórki. Na podstawie symulowanych trajektorii generowane i analizowane są surowe obrazy pojedynczych cząsteczek w taki sam sposób, jak obrazy eksperymentalne. W ten sposób eksperymentalne ograniczenia precyzji i dokładności, które są trudne do skalibrowania eksperymentalnie, są wyraźnie uwzględniane w przepływie pracy analizy. Współczynnik dyfuzji i względne frakcje populacji dominujących stanów dyfuzyjnych są wyznaczane przez dopasowanie rozkładów wartości eksperymentalnych za pomocą liniowych kombinacji symulowanych rozkładów. Pokazujemy użyteczność naszego protokołu, rozwiązując stany dyfuzyjne białka, które wykazuje różne stany dyfuzyjne po utworzeniu kompleksów homo- i heterooligomerycznych w cytozolu patogenu bakteryjnego.

W opisanych tutaj warunkach eksperymentalnych (20 000 klatek, minimalna długość trajektorii wynosząca 4 lokalizacje), a w zależności od poziomu ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek fuzyjnych, na komórkę można uzyskać około 200-3 000 lokalizacji, dających 10-150 trajektorii (Rycyna 2a,b). Duża liczba trajektorii jest niezbędna do uzyskania dobrze reprezentatywnego rozkładu pozornych współczynników dyfuzji. Wielkość pola widzenia (FOV)...

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Śledzenie pojedynczych cząsteczek 3D może określić lokalizacje subkomórkowe i zachowania ruchowe poszczególnych białek. Obserwacja ruchu białka w żywej komórce dostarcza ważnych informacji na temat jego interakcji z partnerami wiążącymi w jego naturalnym środowisku. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia ogólne ramy do analizy danych śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu rozwiązania stanów dyfuzyjnych cząsteczek biologicznych.Można go zastosować zarówno do trajektorii 2D, jak i 3D, które są ograniczone do dowolnie ukształtowanych objętości komórek. Po umieszczeniu kulki fluorescencyjnej we wstępnie przygotowanej waciku agarozowym, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, umieść ją na szkiełku nakrywkowym mikroskopu i przymocuj szkiełko nakrywkowe do uchwytu na próbkę mikroskopu. Uchwyt próbki jest następnie montowany na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.Następnie zainicjuj graficzny interfejs użytkownika mikroskopu; tutaj do sterowania przyrządami używane jest niestandardowe oprogramowanie w MATLAB. Zainicjuj oprogramowanie kamery HCImage Live. Na karcie Przechwytywanie w sekcji Sterowanie kamerą ustaw czas ekspozycji na 0,03 sekundy, a następnie kliknij przycisk Na żywo, aby rozpocząć transmisję na żywo z kamery.Kliknij odpowiedni przycisk Otwórz laser w interfejsie GUI, aby odblokować laser i wzbudzić koraliki fluorescencyjne na podkładce agarozowej. View emisja fluorescencji w aparacie w trybie transmisji na żywo. Dostosuj pozycje X i Y stolika mikroskopu, klikając strzałki Pozycja XY w sekcji Stolik mikropozycjonowania interfejsu użytkownika, aby umieścić co najmniej jeden koralik fluorescencyjny w środku pola view.W razie potrzeby zmień rozmiar kroku, klikając listę rozwijaną poniżej strzałek. Następnie dostosuj pozycję Z stolika mikroskopu, klikając strzałki Z-Position pod Nano-Positioning Stage sekcja. Ustaw orientację funkcji rozrzutu punktowego podwójnej helisy koralika fluorescencyjnego na pionową.Ta orientacja pionowa jest zdefiniowana jako punkt początkowy kalibracji Z. Skanuj 30 kroków powyżej i poniżej początkowej pozycji Z w krokach co 50 nanometrów. Nagrywaj 10 klatek na każdym kroku, używając czasu naświetlania wynoszącego 0,03 sekundy.Aby rozpocząć automatyczne pobieranie danych, kliknij Idź w obszarze Z-Calibration. Odwirować jeden mililitr kultury Yersinia enterocolitica poddanej szokowi cieplnemu przy 5 000 razy większej grawitacji przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć kulturę i odrzucić supernatant. Umyj granulat trzy razy jednym mililitrem pożywki M2G.Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś granulowane bakterie w 250 mikrolitrach pożywki M2G. Następnie dodaj koraliki fluorescencyjne, które będą używane jako znaczniki odniesienia. Roztwór kulek fluorescencyjnych należy dodać tak, aby w polu widzenia podczas oglądania pod mikroskopem przypadało tylko jeden do dwóch koralików.Delikatnie wymieszaj zawiesinę przez wirowanie, aby oddzielić wszelkie zagregowane komórki i umieść 1,5 mikrolitra zawiesiny na 1,5 do 2% waciku agarozowym wykonanym z M2G, a następnie odwróć podkładkę i umieść ją na szkiełku nakrywkowym oczyszczonym z ozonu mikroskopu. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na obiektyw mikroskopu i umieść uchwyt próbki na stoliku mikroskopu i zabezpiecz go na miejscu. Zainicjuj graficzny interfejs użytkownika, aby sterować kamerą mikroskopu, stolikiem próbki i laserami wzbudzenia, a następnie zainicjuj oprogramowanie kamery.Na karcie Przechwytywanie w sekcji Sterowanie kamerą ustaw czas ekspozycji na 0,025 sekundy, a następnie kliknij przycisk Na żywo, aby rozpocząć transmisję na żywo z kamery. Dostosuj pozycje X i Y stolika mikroskopu, klikając strzałki pozycji XY w sekcji stolika mikropozycjonowania, aby przeskanować wokół próbki i znaleźć pole widzenia z odpowiednio gęstą populacją komórek bakteryjnych. Aby zmaksymalizować przepustowość danych, gęstość komórek na szkiełku nakrywkowym powinna być jak największa, bez nakładania się komórek lub stykania się ze sobą.Pole widzenia powinno również obejmować co najmniej jeden koralik fluorescencyjny jako znacznik odniesienia, tak aby można było zmierzyć przesunięcie stopnia podczas pozyskiwania danych. Następnie dostosuj położenie Z stolika mikroskopu, klikając strzałki Z-Position pod sekcją Nano-Positioning Stage tak, aby płaty z funkcją rozrzutu punktowego podwójnej helisy koralików fluorescencyjnych były pionowe. Następnie przejdź do Sekwencja i wybierz Ustawienia skanowania.Zmień liczbę klatek na 20 000. Następnie wybierz folder docelowy zapisu, klikając przycisk oznaczony trzema kropkami. Na koniec kliknij Start, aby zebrać do 20 000 klatek z kamery przy krótkim czasie naświetlania wynoszącym 0,025 sekundy.Po zakończeniu zablokuj podświetlenie lasera, klikając odpowiedni przycisk Zamknij laser w graficznym interfejsie użytkownika. Następnie zbierz 200 klatek ciemnych obrazów przy użyciu tego samego czasu ekspozycji. Zaznacz pole obok Thorlabs LED, a następnie kliknij Przełącz lustro w górę.Spowoduje to włączenie światła LED nad próbką i przełączenie mikroskopu ze ścieżki fluorescencji na ścieżkę kontrastu fazowego.Zainicjuj oprogramowanie do akwizycji danych na ścieżce kontrastu fazowego i naciśnij przycisk Start/Stop Live Display, aby view obraz na żywo z kamery. Następnie kliknij Przechwyć i przejdź, aby zapisać obraz w celu zebrania obrazu kontrastu fazowego komórek w bieżącym polu view. Dopasuj koralik fluorescencyjny do użycia jako znacznik odniesienia.Znajdź i dopasuj wszystkie lokalizacje i wszystkie klatki kamery, korzystając z progów szablonu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W sekcji Localize DHPSF SM (Lokalizacja DHPSF SM) graficznego interfejsu użytkownika Easy-DHPSF kliknij opcję Uruchom, aby dopasować sygnały jednocząsteczkowe, a następnie kliknij przycisk OK w następujących wyskakujących okienkach, aby zachować ustawienia domyślne. Oprogramowanie znajdzie jednocząsteczkowe sygnały fluorescencyjne, które przypominają funkcję rozrzutu punktowego podwójnej helisy, a następnie spróbuje je dopasować za pomocą modelu podwójnie gaussowskiego.Po uruchomieniu skryptu użytkownik zobaczy wyświetlanie surowych danych obrazu, a także zrekonstruowany obraz pomyślnie dopasowanych sygnałów jednocząsteczkowych. Korzystając z niestandardowego oprogramowania w MATLAB, zacznij od ręcznego wybrania pięciu par punktów kontrolnych w wyskakującym okienku, z grubsza szacując i klikając bieguny komórek tych samych pięciu komórek zarówno w danych lokalizacyjnych pojedynczych cząsteczek, jak i konturach komórek. Usuń komórki zawierające mniej niż 10 lokalizacji i usuń komórki, które znajdują się częściowo poza polem widzenia, a następnie usuń wszelkie dodatkowe niechciane komórki w wyskakującym okienku, klikając wewnątrz ich konturu komórki.Na koniec przypisz do tej komórki lokalizacje, które znajdują się w granicach konturu komórki. Odrzuć wszystkie lokalizacje, które nie znajdują się w żadnym konspekcie komórki. Kluczowym czynnikiem dla pomyślnego zastosowania tego protokołu jest zapewnienie, że sygnały jednocząsteczkowe są dobrze oddzielone od siebie.Jeśli w komórce znajduje się więcej niż jedna cząsteczka fluoryzująca w tym samym czasie, lokalizacja może być nieprawidłowo przypisana do trajektorii innej cząsteczki. Ten protokół działa w celu wyeliminowania problemu z łączeniem, odrzucając wszelkie trajektorie, dla których dwie lub więcej lokalizacji jest jednocześnie obecnych w tej samej komórce. Tak więc, jeśli sygnały jednocząsteczkowe są zbyt gęste, duża ilość tych danych jest automatycznie odrzucana podczas przetwarzania.W zależności od poziomów ekspresji znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych, na komórkę może zostać wygenerowanych około 200 do 3 000 lokalizacji. Te lokalizacje mogą dawać od 10 do 150 trajektorii. Duża liczba trajektorii jest niezbędna do uzyskania dobrze dobranych rozkładów.Pokazano tutaj histogram pozornych współczynników dyfuzji dla blisko 80 000 trajektorii pojedynczych cząsteczek białka sekrecji Yersinia enterocolitica typu 3 YscQ znakowanego białkiem fluorescencyjnym eYFP. YscQ wiąże się z iniekcjami osadzonymi w błonie, w wyniku czego powstaje frakcja cząsteczek, około 24%, które nie dyfundują, na co wskazuje rozkład pokazany na czarno. Pozostałe cząsteczki YscQ swobodnie dyfundują w cytozolu.Podczas opisanej tutaj metody określa się, że niezwiązane cząsteczki YscQ występują w co najmniej trzech odrębnych stanach dyfuzyjnych. Do takiego wniosku doszliśmy poprzez dopasowanie rozkładu pozornych współczynników dyfuzji do biblioteki symulowanych rozkładów ze znanymi współczynnikami dyfuzji. Próbując rozdzielić wiele stanów dyfuzyjnych, należy zebrać kilka tysięcy trajektorii pojedynczych cząsteczek, aby zapewnić bardzo dokładne próbkowanie rozkładów pozornych współczynników dyfuzji.Śledzenie pojedynczych cząsteczek można przeprowadzić w komórkach typu dzikiego lub w mutantach delecji genetycznej w celu określenia, czy określone stany dyfuzyjne manifestują się tylko wtedy, gdy obecny jest molekularny partner wiążący. Rozwiązując stany dyfuzyjne białek cytozolowych i kompleksów białkowych za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek 3D, naukowcy mogą określić, gdzie, kiedy i jak tworzą się oligomeryczne kompleksy białkowe w żywych komórkach. Praca ze źródłami laserowymi o dużej mocy i żywymi ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna.Należy zawsze przestrzegać odpowiednich protokołów bezpieczeństwa laserowego i bezpieczeństwa biologicznego.

single-molecule-tracking-microscopy-tool-for-determining-diffusive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj mikroskopię śledzenia pojedynczych cząsteczek w 3D do badania dynamiki białek cytozolowych w żywych komórkach bakteryjnych. Ta metoda pozwala określić stany dyfuzyjne i lokalizacje subkomórkowe.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Przeglądaj więcej filmów