Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Śledzenie pojedynczych cząsteczek 3D może określić lokalizacje subkomórkowe i zachowania ruchowe poszczególnych białek. Obserwacja ruchu białka w żywej komórce dostarcza ważnych informacji na temat jego interakcji z partnerami wiążącymi w jego naturalnym środowisku. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia ogólne ramy do analizy danych śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu rozwiązania stanów dyfuzyjnych cząsteczek biologicznych.

Można go zastosować zarówno do trajektorii 2D, jak i 3D, które są ograniczone do dowolnie ukształtowanych objętości komórek. Po umieszczeniu kulki fluorescencyjnej we wstępnie przygotowanej waciku agarozowym, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, umieść ją na szkiełku nakrywkowym mikroskopu i przymocuj szkiełko nakrywkowe do uchwytu na próbkę mikroskopu. Uchwyt próbki jest następnie montowany na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.

Następnie zainicjuj graficzny interfejs użytkownika mikroskopu; tutaj do sterowania przyrządami używane jest niestandardowe oprogramowanie w MATLAB. Zainicjuj oprogramowanie kamery HCImage Live. Na karcie Przechwytywanie w sekcji Sterowanie kamerą ustaw czas ekspozycji na 0,03 sekundy, a następnie kliknij przycisk Na żywo, aby rozpocząć transmisję na żywo z kamery.

Kliknij odpowiedni przycisk Otwórz laser w interfejsie GUI, aby odblokować laser i wzbudzić koraliki fluorescencyjne na podkładce agarozowej. View emisja fluorescencji w aparacie w trybie transmisji na żywo. Dostosuj pozycje X i Y stolika mikroskopu, klikając strzałki Pozycja XY w sekcji Stolik mikropozycjonowania interfejsu użytkownika, aby umieścić co najmniej jeden koralik fluorescencyjny w środku pola view.

W razie potrzeby zmień rozmiar kroku, klikając listę rozwijaną poniżej strzałek. Następnie dostosuj pozycję Z stolika mikroskopu, klikając strzałki Z-Position pod Nano-Positioning Stage sekcja. Ustaw orientację funkcji rozrzutu punktowego podwójnej helisy koralika fluorescencyjnego na pionową.

Ta orientacja pionowa jest zdefiniowana jako punkt początkowy kalibracji Z. Skanuj 30 kroków powyżej i poniżej początkowej pozycji Z w krokach co 50 nanometrów. Nagrywaj 10 klatek na każdym kroku, używając czasu naświetlania wynoszącego 0,03 sekundy.

Aby rozpocząć automatyczne pobieranie danych, kliknij Idź w obszarze Z-Calibration. Odwirować jeden mililitr kultury Yersinia enterocolitica poddanej szokowi cieplnemu przy 5 000 razy większej grawitacji przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć kulturę i odrzucić supernatant. Umyj granulat trzy razy jednym mililitrem pożywki M2G.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś granulowane bakterie w 250 mikrolitrach pożywki M2G. Następnie dodaj koraliki fluorescencyjne, które będą używane jako znaczniki odniesienia. Roztwór kulek fluorescencyjnych należy dodać tak, aby w polu widzenia podczas oglądania pod mikroskopem przypadało tylko jeden do dwóch koralików.

Delikatnie wymieszaj zawiesinę przez wirowanie, aby oddzielić wszelkie zagregowane komórki i umieść 1,5 mikrolitra zawiesiny na 1,5 do 2% waciku agarozowym wykonanym z M2G, a następnie odwróć podkładkę i umieść ją na szkiełku nakrywkowym oczyszczonym z ozonu mikroskopu. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na obiektyw mikroskopu i umieść uchwyt próbki na stoliku mikroskopu i zabezpiecz go na miejscu. Zainicjuj graficzny interfejs użytkownika, aby sterować kamerą mikroskopu, stolikiem próbki i laserami wzbudzenia, a następnie zainicjuj oprogramowanie kamery.

Na karcie Przechwytywanie w sekcji Sterowanie kamerą ustaw czas ekspozycji na 0,025 sekundy, a następnie kliknij przycisk Na żywo, aby rozpocząć transmisję na żywo z kamery. Dostosuj pozycje X i Y stolika mikroskopu, klikając strzałki pozycji XY w sekcji stolika mikropozycjonowania, aby przeskanować wokół próbki i znaleźć pole widzenia z odpowiednio gęstą populacją komórek bakteryjnych. Aby zmaksymalizować przepustowość danych, gęstość komórek na szkiełku nakrywkowym powinna być jak największa, bez nakładania się komórek lub stykania się ze sobą.

Pole widzenia powinno również obejmować co najmniej jeden koralik fluorescencyjny jako znacznik odniesienia, tak aby można było zmierzyć przesunięcie stopnia podczas pozyskiwania danych. Następnie dostosuj położenie Z stolika mikroskopu, klikając strzałki Z-Position pod sekcją Nano-Positioning Stage tak, aby płaty z funkcją rozrzutu punktowego podwójnej helisy koralików fluorescencyjnych były pionowe. Następnie przejdź do Sekwencja i wybierz Ustawienia skanowania.

Zmień liczbę klatek na 20 000. Następnie wybierz folder docelowy zapisu, klikając przycisk oznaczony trzema kropkami. Na koniec kliknij Start, aby zebrać do 20 000 klatek z kamery przy krótkim czasie naświetlania wynoszącym 0,025 sekundy.

Po zakończeniu zablokuj podświetlenie lasera, klikając odpowiedni przycisk Zamknij laser w graficznym interfejsie użytkownika. Następnie zbierz 200 klatek ciemnych obrazów przy użyciu tego samego czasu ekspozycji. Zaznacz pole obok Thorlabs LED, a następnie kliknij Przełącz lustro w górę.Spowoduje to włączenie światła LED nad próbką i przełączenie mikroskopu ze ścieżki fluorescencji na ścieżkę kontrastu fazowego.

Zainicjuj oprogramowanie do akwizycji danych na ścieżce kontrastu fazowego i naciśnij przycisk Start/Stop Live Display, aby view obraz na żywo z kamery. Następnie kliknij Przechwyć i przejdź, aby zapisać obraz w celu zebrania obrazu kontrastu fazowego komórek w bieżącym polu view. Dopasuj koralik fluorescencyjny do użycia jako znacznik odniesienia.

Znajdź i dopasuj wszystkie lokalizacje i wszystkie klatki kamery, korzystając z progów szablonu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W sekcji Localize DHPSF SM (Lokalizacja DHPSF SM) graficznego interfejsu użytkownika Easy-DHPSF kliknij opcję Uruchom, aby dopasować sygnały jednocząsteczkowe, a następnie kliknij przycisk OK w następujących wyskakujących okienkach, aby zachować ustawienia domyślne. Oprogramowanie znajdzie jednocząsteczkowe sygnały fluorescencyjne, które przypominają funkcję rozrzutu punktowego podwójnej helisy, a następnie spróbuje je dopasować za pomocą modelu podwójnie gaussowskiego.

Po uruchomieniu skryptu użytkownik zobaczy wyświetlanie surowych danych obrazu, a także zrekonstruowany obraz pomyślnie dopasowanych sygnałów jednocząsteczkowych. Korzystając z niestandardowego oprogramowania w MATLAB, zacznij od ręcznego wybrania pięciu par punktów kontrolnych w wyskakującym okienku, z grubsza szacując i klikając bieguny komórek tych samych pięciu komórek zarówno w danych lokalizacyjnych pojedynczych cząsteczek, jak i konturach komórek. Usuń komórki zawierające mniej niż 10 lokalizacji i usuń komórki, które znajdują się częściowo poza polem widzenia, a następnie usuń wszelkie dodatkowe niechciane komórki w wyskakującym okienku, klikając wewnątrz ich konturu komórki.

Na koniec przypisz do tej komórki lokalizacje, które znajdują się w granicach konturu komórki. Odrzuć wszystkie lokalizacje, które nie znajdują się w żadnym konspekcie komórki. Kluczowym czynnikiem dla pomyślnego zastosowania tego protokołu jest zapewnienie, że sygnały jednocząsteczkowe są dobrze oddzielone od siebie.

Jeśli w komórce znajduje się więcej niż jedna cząsteczka fluoryzująca w tym samym czasie, lokalizacja może być nieprawidłowo przypisana do trajektorii innej cząsteczki. Ten protokół działa w celu wyeliminowania problemu z łączeniem, odrzucając wszelkie trajektorie, dla których dwie lub więcej lokalizacji jest jednocześnie obecnych w tej samej komórce. Tak więc, jeśli sygnały jednocząsteczkowe są zbyt gęste, duża ilość tych danych jest automatycznie odrzucana podczas przetwarzania.

W zależności od poziomów ekspresji znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych, na komórkę może zostać wygenerowanych około 200 do 3 000 lokalizacji. Te lokalizacje mogą dawać od 10 do 150 trajektorii. Duża liczba trajektorii jest niezbędna do uzyskania dobrze dobranych rozkładów.

Pokazano tutaj histogram pozornych współczynników dyfuzji dla blisko 80 000 trajektorii pojedynczych cząsteczek białka sekrecji Yersinia enterocolitica typu 3 YscQ znakowanego białkiem fluorescencyjnym eYFP. YscQ wiąże się z iniekcjami osadzonymi w błonie, w wyniku czego powstaje frakcja cząsteczek, około 24%, które nie dyfundują, na co wskazuje rozkład pokazany na czarno. Pozostałe cząsteczki YscQ swobodnie dyfundują w cytozolu.

Podczas opisanej tutaj metody określa się, że niezwiązane cząsteczki YscQ występują w co najmniej trzech odrębnych stanach dyfuzyjnych. Do takiego wniosku doszliśmy poprzez dopasowanie rozkładu pozornych współczynników dyfuzji do biblioteki symulowanych rozkładów ze znanymi współczynnikami dyfuzji. Próbując rozdzielić wiele stanów dyfuzyjnych, należy zebrać kilka tysięcy trajektorii pojedynczych cząsteczek, aby zapewnić bardzo dokładne próbkowanie rozkładów pozornych współczynników dyfuzji.

Śledzenie pojedynczych cząsteczek można przeprowadzić w komórkach typu dzikiego lub w mutantach delecji genetycznej w celu określenia, czy określone stany dyfuzyjne manifestują się tylko wtedy, gdy obecny jest molekularny partner wiążący. Rozwiązując stany dyfuzyjne białek cytozolowych i kompleksów białkowych za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek 3D, naukowcy mogą określić, gdzie, kiedy i jak tworzą się oligomeryczne kompleksy białkowe w żywych komórkach. Praca ze źródłami laserowymi o dużej mocy i żywymi ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna.

Należy zawsze przestrzegać odpowiednich protokołów bezpieczeństwa laserowego i bezpieczeństwa biologicznego.