Mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) - proste i niezawodne protokoły przetwarzania i wizualizacji materiałów organicznych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie cyfrowych danych objętościowych materiałów organicznych. Przykładami są zarodki i tkanki zarodkowe modelowych organizmów biomedycznych, bloki tkanek pobrane od dorosłych zwierząt i ludzi, w tym biopsje skóry lub mięśni oraz materiały takie jak papier niepowlekany i substytuty skóry. HREM pomaga odpowiedzieć na fundamentalne pytania z dziedziny medycyny i badań biomedycznych.

Pozwala na trójwymiarową analizę i wizualizację narządów i tkanek np. genetycznie zmodyfikowanych zarodków myszy lub zmanipulowanych zarodków piskląt. Umożliwia również analizę modeli nowotworowych, a także biopsji pobranych z tkanek ludzkich lub zwierzęcych. Główną zaletą HREM jest to, że zapewnia prosty sposób generowania stosów obrazów, które są o jakości zbliżonej do histologicznej.

Implikacje tej techniki rozciągają się na badania nad gojeniem się ran przy użyciu modeli zwierzęcych, a także przędzenie i naprawianie patologii tkanek u ludzi. Procedurę zademonstrują BMR Marlene Rodler i Johannes Gunther. Oba z Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu, Wydział Anatomii.

Zacznij od utrwalonych zarodków lub tkanki embrionalnej o wymiarach nie większych niż 5 x 5 x 5 mililitrów sześciennych. Usuń utrwalacz. I dodaj PBS.

Prać w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze stałym kołysaniem przez 24 godziny. Dodaj 70% etanolu do probówek zawierających tkankę i umieść próbki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch do trzech godzinach kontynuuj odwadnianie próbek w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu przez dwie do trzech godzin za każdym razem.

Podczas gdy próbki się odwadniają, przygotuj roztwór infiltracyjny, dodając 0,3125 grama nadtlenku benzoilu i 0,1 grama ESN do 25 mililitrów roztworu A w zlewce. Mieszaj na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin, aż ESN i katalizator całkowicie się rozpuszczą. Umieścić próbki w roztworze infiltracyjnym.

I kołysz lub obracaj próbki przez 12 do 24 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zacznij od przygotowania roztworu do osadzania. Dodaj jeden mililitr lub roztwór B do 25 mililitrów świeżego roztworu infiltracyjnego.

Po przygotowaniu tacek na kubki do formowania wypełnij głęboką wnękę form roztworem do zatapiania. Przenieś próbki do foremek za pomocą łyżki. Upewnij się, że próbka jest całkowicie pokryta roztworem do zatapiania, aby uniknąć uwięzienia powietrza.

Zorientuj próbkę wewnątrz formy za pomocą igieł lub kleszczy. Bardzo ważne jest, aby zoptymalizować orientację próbki podczas zatapiania i oznaczyć jej dokładne położenie na powierzchni bloku. W ten sposób obszar zainteresowania może być mały i można użyć obiektywu o największym możliwym powiększeniu.

Gdy tylko roztwór do zatapiania zacznie stawać się lepki, umieść uchwyt bloku na wierzchu formy i dodaj roztwór do zatapiania przez środkowy otwór uchwytu bloku, aż roztwór do zatapiania wzrośnie do jednego do dwóch milimetrów powyżej podstawy uchwytu bloku. Uszczelnij tackę na kubki do formowania, przykrywając ją płynnym woskiem parafinowym i poczekaj, aż stwardnieje przed przeniesieniem. Pozwól blokom zakończyć polimeryzację, przechowując szczelne tacki na kubki do formowania przez jeden do dwóch dni w temperaturze pokojowej.

W celu obróbki po polimeryzacji umieść tacki na kubki formierskie ze spolimeryzowanymi blokami w standardowym piecu laboratoryjnym i piecz w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jeden do dwóch dni. Usuń bloki z foremek. Następnie zidentyfikuj pole widzenia, kierując białe światło ukośnie na powierzchnię bloku.

Obrysuj cień próbki czarnym markerem na powierzchni bloku. Zamontuj blok żywicy ze wskazanym polem view na mikrotomie i przesuń uchwyt bloku do pozycji zatrzymania. Uruchom aparat cyfrowy i oprogramowanie do generowania danych, a następnie uzyskaj obraz na żywo.

Wybierz obiektyw o odpowiednim powiększeniu, aby pokryć obszar zainteresowania. Przesuwaj optykę w górę i w dół, a mikrotom na boki, aż obszar zainteresowania zrówna się z polem widzenia wyświetlanym na ekranie komputera. Dziel blok na sekcje, aż pierwsze struktury próbki staną się widoczne.

Przesuń mikrotom, aby ułożyć powierzchnię bloku w płaszczyźnie ogniskowej optyki. Wybierz grubość przekroju od 0,5 do pięciu mikronów. Następnie, po skonfigurowaniu oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta, uruchom oprogramowanie i rozpocznij przechwytywanie danych.

To zdjęcie przekroju HREM przedstawia przekrój strzałkowy przez zarodek myszy pobrany w 9,5 dniu embrionalnym. Ten model 3D renderowany objętościowo pokazuje powierzchnię tego zarodka. Obraz ten pokazuje wirtualny przekrój strzałkowy przez wyrenderowany objętościowo model szyi zarodka myszy pobranego w 15,5 dniu embrionalnym

Model powierzchniowy uwydatnia światło układu sercowo-naczyniowego w renderowaniu objętościowym wszystkich tkanek zarodka pisklęcia, rozwojowego hamburgera Hamiltona w stadium 18. To zdjęcie przedstawia przekrój HREM przez ludzki nerw. Wkładka powiększa przekrój tego obrazu.

Na tym zdjęciu przedstawiono fragment przekroju HREM przez wątrobę świni. Ten obraz przedstawia model 3D biopsji pobranej z ludzkiej opuszki kciuka. Ten obraz przedstawia renderowane powierzchniowo modele tętnic skórnych, żył i nerwów przed wirtualną resekcją za pomocą danych HREM.

Animacja ta pokazuje wyrenderowany objętościowo model grubej skóry ludzkiej poduszki kciuka. Różne progi, a co za tym idzie różne struktury skórne, takie jak naczynia krwionośne, włókna nerwowe, gruczoły potowe i przewody gruczołów potowych. HREM pozwala na szybką wizualizację architektury materiału włóknistego.

Ten obraz przedstawia model renderowany objętościowo natywnego materiału zastępczego skóry. Ta animacja pokazuje model renderowanego objętościowo materiału zastępczego skóry. Zwróć uwagę na inny kształt i kaliber włókien.

Próbki muszą być odwodnione, infiltrowane i zatopione w żywicy, więc cała procedura może trwać do kilku dni, ale obejmuje tylko dwie do trzech godzin pracy operacyjnej w celu przygotowania roztworów, zmiany roztworów i tak dalej. Samo generowanie danych jest w pełni zautomatyzowane w aparacie HREM, a w ciągu dwóch do trzech godzin można wygenerować 1000 obrazów. Po jego opracowaniu, projekt HREM utorował drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do precyzyjnej oceny fenotypu zmutowanych zarodków myszy.

Jednym z przykładów jest projekt DMDD, w którym wykorzystuje się fenotypowanie HREM, czyli embrionalnie śmiertelne zarodki myszy w nieznanych jeszcze szczegółach. Okazało się, że HREM jest również doskonałą alternatywą dla pozycyjnej mikroskopii świetlnej do badania naczyń krwionośnych, nerwów czy architektury włókien w próbkach tkanek ludzkich.