Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie ustandaryzowanych warunków do skutecznej sterylizacji nasion dużej liczby genotypów Arabidopsis przy jednoczesnym zapobieganiu rozwojowi drobnoustrojów. Metoda ta pozwala na sterylizację setek próbek nasion jednocześnie, upraszczając w ten sposób krytyczny etap przygotowania materiału roślinnego w dziedzinie genomiki, proteomiki, metabolomiki i innych badań o wysokiej przepustowości. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia warunki, w których skuteczna sterylizacja łączy się z wysoką zdolnością kiełkowania dla dużej liczby próbek nasion.

Na początek przygotuj 50% roztwór wybielacza z wodą destylowaną. Na każde 200 mililitrów roztworu wybielacza dodaj 50 mikrolitrów detergentu TWEEN 20. Roztwór wybielacza może być przechowywany do miesiąca, o ile jest otwierany tylko w sterylnych warunkach.

Następnie podwielokrotność nasion do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Można to zrobić ręcznie lub za pomocą specjalnie wykonanego robota nasiennego. Teraz w okapie z przepływem laminarnym dodaj 500 mikrolitrów 50% roztworu wybielacza do nasion.

Następnie przenieś probówki do rotatora i inkubuj nasiona w wybielaczu z łagodnym mieszaniem przez 10 minut. Po 10 minutach odessaj roztwór wybielacza z probówek, usuwając jak najwięcej. Następnie dodaj z powrotem 500 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej i odwróć probówki do wymieszania.

Pozwól nasionom osiąść, a następnie zasychaj wodę i zastąp ją inną porcją, aby ponownie umyć nasiona. Wykonaj w sumie sześć takich prań wysterylizowaną wodą destylowaną. Po dokładnym umyciu nasion wodą, przed poszyciem zawieś je w jednym mililitrze wody.

Przed rozpoczęciem procesu sterylizacji należy obliczyć objętości wybielacza i kwasu solnego potrzebne do wytworzenia chloru gazowego. Skorzystaj z podanego równania, aby uzyskać zalecaną 6% chloru gazowego. Upewnij się, że dokładnie obliczyłeś objętość HCl wymaganą do zapewnienia pomyślnej sterylizacji i zapobieżenia rozpryskiwaniu.

Pamiętaj, aby nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny podczas tego protokołu i zmieniać rękawice za każdym razem, gdy są zwilżone kwasem lub wybielaczem. Pod wyciągiem przełóż fiolki z nasionami do stojaka z otwartymi pokrywkami. Następnie umieść stojak w plastikowym pojemniku, w którym może odbyć się sterylizacja i przygotuj paski folii parafinowej, aby uszczelnić pokrywkę do pojemnika.

Teraz załaduj zlewkę 100 mililitrami wybielacza, a następnie umieść w niej 250-mililitrową zlewkę. Stosowanie nadmiaru wybielacza jest zabezpieczeniem, a zlewka powinna mieć co najmniej dwukrotność całkowitej objętości zawartego w niej roztworu. Ponadto zawsze należy obchodzić się z wybielaczem i kwasami oddzielnie.

Następnie dodaj trzy mililitry kwasu solnego do zlewki, a następnie natychmiast zamknij pojemnik i zamknij go parafilmem. Monitoruj pojemnik przez godzinę, aby upewnić się, że gaz gromadzi się podczas sterylizacji. Chlor gazowy powinien być widoczny jako słaba żółta mgiełka wewnątrz pojemnika lub można sprawdzić, czy roztwór nie żółknie.

Okresowo sprawdzaj uszczelkę na pojemniku. Jeśli pokrywka zostanie odczepiona lub uszczelka parafinowa zacznie się luzować, szczelnie ponownie zamknij pokrywę dodatkową warstwą folii parafinowej. Po godzinnej sterylizacji otwórz róg pojemnika, aby odpuścić gaz przez trzy godziny.

Po trzech godzinach wentylacji zakryj wszystkie probówki i przechowuj wysterylizowane nasiona w suchych warunkach, aż zostaną platerowane. Teraz zneutralizuj reakcję, powoli dodając 1,5 grama wodorowęglanu sodu w proszku, mieszając szklaną pałeczką, aby rozpuścić ciała stałe. Dodawaj wodorowęglan sodu, aż pęcherzyki dwutlenku węgla przestaną się tworzyć.

Następnie zmierz pH roztworu i w razie potrzeby dodaj dodatkowy wodorowęglan sodu, aż pH będzie neutralne. Pod warunkiem, że roztwór nie śmierdzi, można go wyrzucić. W przeciwnym razie poczekaj, aż wszystkie zapachy znikną.

Dodaj 500 mikrolitrów wysterylizowanej wody destylowanej do każdej probówki nasion sterylizowanych gazem. Następnie wylej nasiona na płytkę MS i rozprowadź je równomiernie za pomocą sterylnej jednorazowej pętli do zaszczepiania lub sterylnej końcówki do pipet. Po trzech dniach stratyfikacji nasion w temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś płytki do 23 stopni Celsjusza z 16 godzinami dziennej ekspozycji na światło.

Trzymaj pokrywki na górze, aby korzenie wrastały w podłoże. Po ośmiu dniach wzrostu naciąć frakcję nasion, które wykiełkowały. Kiełkowanie liczy się, gdy rodnik wystaje poza okrywę nasienną i widoczne są dwa liścienie.

Policz również liczbę nasion dotkniętych pleśnią, aby określić skuteczność warunków sterylizacji. Cztery różne stężenia wybielacza w pięciu różnych czasach ekspozycji zostały przetestowane na nasionach Columbia typu dzikiego. Wysokie stężenia wybielacza niekorzystnie wpływały na kiełkowanie przy zbyt dużej ekspozycji.

Jednak wysokie wskaźniki kiełkowania zaobserwowano przy 40 i 50% wybielaczu we wszystkich okresach ekspozycji. Nasiona sterylizowane wysokimi stężeniami wybielacza miały wysoką śmiertelność i często wykazywały wady wzrostu, ale zwykle były całkowicie wolne od pleśni. Stwierdzono, że sterylizacja 50% wybielaczem przez 10 minut zapewnia optymalną równowagę między hamowaniem pleśni a zdrowym kiełkowaniem.

Aby zoptymalizować warunki sterylizacji chlorem gazowym, do sterylizacji nasion Columbia typu dzikiego przez dwa różne okresy czasu użyto trzech różnych stężeń chloru gazowego. Stwierdzono istotną interakcję między czasem a stężeniem gazu. Po jednej godzinie nie stwierdzono wpływu na kiełkowanie, podczas gdy najwyższe stężenie gazu było szkodliwe po trzech godzinach.

W związku z tym zdecydowano się na jednogodzinny okres sterylizacji. Rozwój pleśni był skutecznie hamowany przez trzygodzinną ekspozycję na gaz lub przez jednogodzinną ekspozycję przy użyciu sześciu lub 17% gazu. W ten sposób określono stężenie 6% gazu przez jedną godzinę jako optymalne dla kiełkowania i hamowania pleśni.

Po opanowaniu technika ta może być z powodzeniem stosowana do sterylizacji setek linii nasion dziennie, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Nasiona sterylizowane gazem mogą być również przechowywane przez dłuższy czas w suchych warunkach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu dostarczonych równań do obliczenia wymaganych objętości HCl i wybielacza.

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak badania asocjacyjne całego genomu, w celu powiązania różnych genotypów i fenotypów będących przedmiotem zainteresowania. Powodzenia w eksperymentach.