Name: Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj standaryzowaną metodę sterylizacji nasion Arabidopsis wysokoprzepustową, wykorzystującą roztwór wybielacza lub gaz chloru. Technika zapewnia skuteczną eliminację mikrobów przy zachowaniu wysokiej zdolności kiełkowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Gauri Datta za pomoc w przygotowaniu materiałów eksperymentalnych. Jesteśmy również wdzięczni Bettinie Wittler i Jamesowi Mannowi za krytyczną recenzję rękopisu. Prace te były wspierane przez granty NSF DBI-1049341 i MCB-1143813.

1. Przygotowanie pożywki Murashige i Skooga (MS) 1x
<ol>
	<li>Do zlewki zawierającej 0,8 L wody destylowanej dodać 4,31 g mieszaniny soli bazowych MS, 10 g sacharozy oraz 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i wymieszać do rozpuszczenia. Sprawdzić i skorygować pH do wartości 5,7 przy użyciu 1 M wodorotlenku potasu (KOH). Dopełnić wodą destylowaną do objętości 1 L.</li>
	<li>Podzielić pożywkę do dwóch butelek o pojemności 1 L, po 500 mL do każdej. Do każdej butelki dodać 5 g agaru. Pozostawić korki lekko poluzowane.</li>
	<li>Autoklawować przez 20 min w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi, umieszczając w butelce mieszadło magnetyczne.</li>
	<li>Po autoklawowaniu umieścić butelki na mieszadle magnetycznym przy niskich obrotach i pozwolić pożywce MS ostygnąć do 45-50 °C (do momentu, aż butelkę będzie można trzymać gołymi rękami).</li>
	<li>Od tego kroku wszystkie kolejne czynności należy wykonywać w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do każdej butelki dodać 500 µL roztworu witamin Gamborg'a i wymieszać pożywkę MS, aby równomiernie rozprowadzić roztwór witamin.</li>
	<li>Wlać do szalek tyle pożywki, aby pokryła około połowę głębokości szalki.</li>
	<li>Pozostawić szalki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 1 h, aby agar mógł stężeć. 
	Uwaga: Jeśli szalki nie będą użyte natychmiast, należy je owinąć folią i przechowywać w temperaturze 4 °C (w lodówce). Przykryte szalki, pudełka lub probówki ze stężałym agarem można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C w szczelnym pojemniku.</li>
</ol>
2. Sterylizacja nasion Arabidopsis za pomocą wybielacza
<ol>
	<li>Przygotować płytki MS zgodnie z sekcją 1 protokołu. W tym samym czasie co pożywkę MS, wysterylizować w autoklawie 100 mL wody destylowanej. Wykorzystać ją później jako wodę do płukania oraz do zawieszenia nasion w celu ułatwienia ich wysiewu. 
	Uwaga: Jeśli jest to pożądane, w tym kroku można również wysterylizować w autoklawie mieszaninę agaru 0,8% (w/v) (np. phytagar). Podczas wysiewu (Krok 2.5.3.) mieszaninę agaru można zastosować zamiast wody destylowanej. Wyższa lepkość mieszaniny agaru ułatwia rozmieszczenie nasion na płytce lub sadzenie ich w rzędach, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Przygotować 50% (v/v) roztwór wybielacza do sterylizacji nasion. Aby rozcieńczyć wybielacz, dodać 100 mL wybielacza do 100 mL wody destylowanej. Do roztworu wybielacza dodać 50 µL detergentu Tween 20. 
	Uwaga: Przygotowany roztwór wybielacza można przechowywać do miesiąca, pod warunkiem, że jest otwierany wyłącznie w warunkach sterylnych.</li>
	<li>Odważyć 100 nasion do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Zsterylizować nasiona za pomocą 50% roztworu wybielacza.
	<ol>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 500 µL 50% roztworu wybielacza do probówki do mikrocentryfugi zawierającej nasiona. Opukać dno probówki, aby zawiesić nasiona w roztworze wybielacza. 
		Uwaga: Alternatywnie można użyć rotatora lub wytrząsarki platformowej, aby utrzymać nasiona w zawiesinie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypłukać roztwór wybielacza z probówki.
	<ol>
		<li>Po 10 min usunąć roztwór wybielacza z probówki do mikrocentryfugi za pomocą pipety lub aspiratora z założonym końcówką do pipety.</li>
		<li>Dodać do probówki 500 µL sterylnej wody destylowanej. Zamknąć probówkę i odwrócić w celu wymieszania. Pozostawić nasiona do osadzenia się na dnie probówki. Gdy nasiona opadną na dno, ostrożnie usunąć roztwór wybielacza za pomocą pipety. Powtórzyć ten proces płukania 6 razy.</li>
		<li>Dodać do probówki 1 mL wysterylizowanej w autoklawie wody destylowanej, aby zawiesić nasiona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiać zsterylizowane nasiona na płytki MS.
	<ol>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza opisać dno płytki MS, podając nazwę materiału i bieżącą datę.</li>
		<li>Przenieść nasiona z probówki do mikrocentryfugi na płytkę MS. Rozłożyć nasiona na płytce MS za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli do szczepień lub sterylnej końcówki do pipety. 
		Uwaga: Jeśli nasiona mają być wysiane w rzędach, można użyć pipety z końcówką 200 µL, aby indywidualnie umieszczać nasiona w pożądanych pozycjach. Aby poprawić przepływ nasion, koniec końcówki pipety można przyciąć o 3-5 mm za pomocą nożyczek. Źle rozmieszczone nasiona lub ich skupiska można następnie przesunąć lub rozdzielić za pomocą sterylnej jednorazowej pętli do szczepień.</li>
		<li>Umieścić płytkę MS z tyłu komory z laminarnym przepływem powietrza z częściowo zamkniętą pokrywką. Pozostawić nadmiar wody do odparowania z płytki MS.</li>
		<li>Nałożyć pokrywkę na płytkę MS. Uszczelnić płytkę MS, owijając ją mikroporową chirurgiczną taśmą papierową (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sterylizacja nasion Arabidopsis za pomocą chloru w postaci gazowej
<ol>
	<li>Przygotować płytki MS zgodnie z sekcją 1 protokołu. Jednocześnie z pożywką MS wysterylizować w autoklawie 100 mL wody destylowanej; zostanie ona wykorzystana później do zawieszenia nasion w celu ułatwienia wysiewu. 
	Uwaga: W razie potrzeby w tym kroku można również wysterylizować w autoklawie mieszankę agaru 0,8% (w/v) (np. phytagar). Mieszankę agaru można zastosować zamiast wody destylowanej podczas wysiewu (Krok 3.6.2.). Większa lepkość mieszanki agaru ułatwia rozmieszczenie nasion na płytce lub sadzenie ich w rzędach, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem sterylizacji obliczyć ilości wybielacza i kwasu solnego (HCl) niezbędne do wytworzenia chloru gazowego.
	<ol>
		<li>Obliczyć ilość HCl potrzebną do wytworzenia 6,1% Cl2 wymaganego do sterylizacji.</li>
		<li>Użyć następującego wzoru: 
		<img alt="Wzór obliczeniowy dla HCl, mL, równanie chemiczne, przedstawione na schemacie do wyznaczania objętości w roztworach." src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		przyjmując 7 000 mL jako objętość pojemnika do sterylizacji oraz 6,1 jako %Cl2; obliczona objętość HCl wynosi 3 mL. 
		Uwaga: Arkusz kalkulacyjny zaprogramowany do wykonywania obliczeń dla różnych objętości pojemnika i %Cl2 dostępny jest jako Tabela uzupełniająca 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odważyć 100 nasion do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL. Zamknąć nakrętki każdej probówki, umieścić probówki w plastikowym statywie i odstawić. 
	Uwaga: Nasiona można w tym momencie przechowywać przez dłuższy czas, pod warunkiem zachowania odpowiednich warunków. Warunki przechowywania opisano w sekcji 3.3.2 protokołu Rivero i współpracowników4. Można również zastosować format płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Przygotować materiały niezbędne do przeprowadzenia sterylizacji chlorem gazowym.
	<ol>
		<li>Pobrać wybielacz i HCl z miejsc ich przechowywania.</li>
		<li>Odciąć pas szerokiej folii parafinowej (patrz Tabela materiałów), aby w kroku 3.5.3. uszczelnić pojemnik do sterylizacji.</li>
		<li>Umieścić plastikowy pojemnik z pokrywką, w którym odbędzie się sterylizacja, wewnątrz dygestorium. Otworzyć nakrętki wszystkich probówek z nasionami i umieścić cały statyw z nasionami w plastikowym pojemniku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić sterylizację chlorem gazowym w temperaturze pokojowej. 
	Ostrzeżenie: Pracować z wybielaczem i kwasem osobno. Nie zostawiać otwartych butelek, aby zminimalizować ryzyko rozlania. Stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI), w tym rękawice i fartuch laboratoryjny. Jeśli wybielacz lub kwas pryśnie na rękawice, należy je zmienić przed kontaktem z innymi materiałami. Zawsze zdejmować rękawice w dygestorium w przypadku zanieczyszczenia wybielaczem lub kwasem.
	<ol>
		<li>Umieścić zlew 250 mL wewnątrz pojemnika i dodać 100 mL wybielacza. 
		Uwaga: Reakcja między HCl a wybielaczem wymaga co najmniej 22-krotnego nadmiaru wybielacza. W wyniku reakcji HCl i wybielacz zostaną zużyte, uwalniając gaz Cl2, a produktami ubocznymi będą chlorek sodu (NaCl) i woda. Zastosowanie dużego nadmiaru wybielacza pozwala na zużycie dodatkowego HCl podczas okresu wietrzenia, co zmniejsza ilość wodorowęglanu sodu (NaHCO3) potrzebnego do neutralizacji roztworu przed utylizacją. 
		Ostrzeżenie: Pojemność zlewu powinna być co najmniej dwukrotnie większa niż całkowita objętość cieczy (wybielacz + HCl). Zapobiega to rozpryskom poza zlew w następnym kroku, które mogłyby uszkodzić nasiona, odbarwić ubrania lub poparzyć odsłoniętą skórę.</li>
		<li>Dodać 3 mL HCl do zlewu zawierającego wybielacz. 
		Ostrzeżenie: Początkowa reakcja spowoduje powstawanie pęcherzyków, szczególnie przy stężeniach gazu wyższych niż 6,1%. W tym kroku niezbędny jest fartuch laboratoryjny z długimi rękawami.</li>
		<li>Zamknąć pojemnik do sterylizacji i natychmiast uszczelnić go folią parafinową.</li>
		<li>Monitorować pojemnik podczas sterylizacji, aby upewnić się, że gaz się gromadzi; akumulacja chloru gazowego powinna być widoczna jako słaba żółta mgiełka wewnątrz pojemnika. 
		Ostrzeżenie: Okresowo sprawdzać pojemnik, aby upewnić się, że ciśnienie wewnątrz nie spowodowało odskoczenia pokrywki lub poluzowania folii parafinowej. Jeśli pokrywka odskoczyła lub folia parafinowa się poluzowała, zamknąć pokrywkę i ostrożnie owinąć pojemnik dodatkową warstwą folii parafinowej.</li>
		<li>Po 1-godzinnym okresie sterylizacji otworzyć pojemnik, usuwając folię parafinową i lekko uchylając pokrywkę w jednym rogu. Pozostawić pojemnik do wietrzenia przez 3 h, aby reakcja dobiegła końca i gazowy chlor został usunięty.</li>
		<li>Zamknąć nakrętki wszystkich probówek do mikrocentryfugi w statywie. 
		Uwaga: Sterylne nasiona można przechowywać do czasu wysiewu, pod warunkiem przechowywania ich w suchych warunkach.</li>
		<li>Wyjąć statyw z nasionami i umieścić go w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
		<li>Zneutralizować produkty reakcji chloru gazowego
		<ol>
			<li>Powoli dodawać 1,5 g proszku NaHCO3 do zlewu zawierającego roztwór wybielacza/HCl i mieszać szklaną rurką, aby rozpuścić NaHCO3 w roztworze. Kontynuować dodawanie NaHCO3, aż przestaną tworzyć się pęcherzyki gazu dwutlenku węgla (CO2). 
			Ostrzeżenie: Dodawać powoli, aby zapobiec rozpryskom. Stosować odpowiednie ŚOI, w tym rękawice i fartuch laboratoryjny.</li>
			<li>Sprawdzić pH roztworu za pomocą pasków wskaźnikowych pH lub pH-metru. W razie potrzeby dodać więcej NaHCO3, aż pH roztworu stanie się neutralne (pH 7,0). W tym momencie roztwór można wyjąć z dygestorium i zutylizować zgodnie z obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi utylizacji. 
			Ostrzeżenie: Jeśli podczas utylizacji pojawi się JAKIKOLWIEK zapach, roztwór należy natychmiast zwrócić do dygestorium.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiać sterylne nasiona na płytki MS.
	<ol>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza opisać dno płytki MS, podając nazwę linii i aktualną datę.</li>
		<li>Do każdej probówki do mikrocentryfugi dodać 500 µL sterylnej wody destylowanej, aby zawiesić nasiona. Wylać nasiona na płytkę MS i rozprowadzić je równomiernie po całej płytce za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli do szczepień lub sterylnego końcówki do pipety.</li>
		<li>Umieścić płytkę MS z tyłu komory z laminarnym przepływem powietrza z częściowo przymkniętą pokrywką. Pozostawić nadmiar wody do odparowania z płytki MS.</li>
		<li>Nałożyć pokrywkę na płytkę MS. Uszczelnić płytkę MS, owijając ją mikroporową chirurgiczną taśmą papierową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wzrost Arabidopsis na płytkach MS
<ol>
	<li>Przechowywać płytki z zamkniętymi pokrywami przez trzy dni w temperaturze 4 ˚C i przy wilgotności otoczenia. 
	Uwaga: Proces ten nazywa się stratyfikacją i służy do synchronizacji kiełkowania poszczególnych nasion.</li>
	<li>Przenieść płytki do środowiska wzrostu.
	<ol>
		<li>Utrzymywać temperaturę na poziomie 23 °C i natężenie światła w zakresie 120 - 150 µmol/m2s przy fotoperiodzie 16 h światła/ 8 h ciemności. Umieścić płytki płasko w środowisku wzrostu z pokrywą na górze, tak aby korzenie rosły w głąb podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić siewki na płytkach do wzrostu na 8 dni. 
	Uwaga: Ośmiodniowy okres wzrostu pozwala na wykiełkowanie nasion kiełkujących później. Płytki można ocenić wcześniej niż po 8 dniach, jeśli wszystkie nasiona już wykiełkowały.</li>
	<li>Ocenić wskaźniki kiełkowania.
	<ol>
		<li>Zarejestrować liczbę nasion, które wykiełkowały oraz tych, które nie wykiełkowały. Obliczyć wskaźnik kiełkowania, dzieląc liczbę nasion, które wykiełkowały, przez całkowitą liczbę nasion na płytce. 
		Uwaga: Kiełkowanie uznaje się za dokonane, gdy korzeń zakiełkowy przebił się przez łupinę nasiona i widoczne są dwie liście pierwsze.</li>
		<li>Należy również policzyć liczbę nasion zainfekowanych pleśnią, aby określić skuteczność warunków sterylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)"> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+Arabidopsis+plants%3A+growth%2C+preservation+of+seeds%2C+transformation%2C+and+genetic+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li>
<li>Alonso, J. M., Stepanova, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+transformation+with+large+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes.</a> Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).</li>
<li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291(2013).</li>
<li>Podar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth+and+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant growth and cultivation.</a> Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+agar-plate+method+for+studying+root+growth+and+response+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana.</a> Sci Rep. 3, 1273(2013).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16, (1998).</li>
<li>Cederholm, H. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sensitivities+to+phosphate+deprivation+suggest+that+RGF+peptides+play+disparate+roles+in+Arabidopsis+thaliana+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development.</a> New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).</li>
<li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li>
<li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li>
<li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+14-amino+acid+CLV3%2C+CLE19%2C+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li>
<li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+screening+for+insertional+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li>
<li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li>
<li>López-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas uprawy nasion Arabidopsis na sterylnych podłożach należy zastosować jakąś formę sterylizacji. Zarówno zabiegi sterylizacji wybielaczem, jak i chlorem gazowym skutkują podobną szybkością kiełkowania i zahamowaniem rozwoju pleśni. Żadna z metod sterylizacji nie powoduje znacznego zmniejszenia zdolności kiełkowania nasion o wysokim potencjale kiełkowania; jednak sterylizacja wybielaczem jest zalecana dla linii o niższym potencjale kiełkowania (20-70%), ze względu na niewielką, choć nieistotną, poprawę szybkości kiełkowania w porównaniu ze sterylizacją gazową (ryc. 3A).
Sterylizacja nasion Arabidopsis stężeniami wybielacza od 40-100% przez okres do 10 minut zapewnia zadowalający procent kiełkowania i skuteczne tłumienie pleśni. Chociaż stężenie wybielacza mniejsze niż 40% zapewnia odpowiednią sterylizację większości partii nasion, użycie stężenia 40% lub wyższego gwarantuje skuteczną sterylizację nawet mocno zanieczyszczonych partii nasion. Ważne jest, aby nie przekraczać 10 minut sterylizacji w przypadku stosowania wybielacza o stężeniu równym lub wyższym niż 80%, aby uniknąć wysokiej śmiertelności nasion i wad w rozwoju sadzonek.
Traktowanie nasion rzodkiewnika chlorem gazowym o stężeniu 6,1% lub 16,5% przez 1 godzinę skutkuje wysoką zdolnością kiełkowania i odpowiednią eliminacją pleśni. Niskie stężenie chloru gazowego (2,1%) może być z powodzeniem stosowane poprzez wydłużenie czasu sterylizacji do 3 godzin.
Gdy kilka linii wymaga sterylizacji, zaleca się sterylizację płynem w roztworze 50% wybielacza przez 10 minut. W przypadku większej liczby linii lepszym rozwiązaniem jest sterylizacja gazowa o stężeniu gazu 6,1% przez 1 godzinę, ponieważ wiele linii można szybko i łatwo sterylizować przy mniejszym nakładzie pracy.
Nasze wyniki zapewniają ustandaryzowane warunki sterylizacji zarówno dużej liczby nasion o różnych genotypach, jak i nasion o niższym potencjale kiełkowania. Jedynym ograniczeniem tych technik sterylizacji jest to, że nie można ich stosować do nasion, których zdolność kiełkowania jest mniejsza niż 20% ze względu na dużą śmiertelność nasion. Alternatywne metody, takie jak sonikacja17, w celu zwiększenia szybkości kiełkowania przy braku sterylizacji, mogą być korzystne w takich przypadkach.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) jest głównym organizmem modelowym do podstawowych i stosowanych badań w biologii roślin1,2,3. Chociaż standardowe warunki wzrostu rzodkiewnika są dobrze znane4, wpływ sterylizacji nasion na żywotność nasion nie został rygorystycznie przetestowany. Pożywka stała w płytkach lub pudełkach jest rutynowo stosowana w celu ułatwienia wzrostu siewek rzodkiewnika w wielu zastosowaniach eksperymentalnych, takich jak identyfikacja homozygotycznych mutantów letalnych w segregującej populacji, obserwacja fenotypów pędów i korzeni we wczesnych stadiach, izolacja tkanki wolnej od patogenów, pobieranie dużych ilości tkanki siewki, wybór transformantów lub roślin odpornych na leki oraz ocena kiełkowania1, 2,3,4. Nasiona zebrane z roślin uprawianych w szklarni lub komorze wzrostowej są czasami zanieczyszczone mikroorganizmami i kurzem. Wzrost siewek rzodkiewnika na różnych rodzajach sterylnych pożywek wymaga wcześniejszej sterylizacji nasion w celu usunięcia zanieczyszczeń mikrobiologicznych, takich jak grzyby i bakterie obecne na powierzchni nasion. Stosowanie skutecznego reżimu sterylizacji nasion ma kluczowe znaczenie dla równowagi między wysokim kiełkowaniem, minimalnym zanieczyszczeniem i energicznym wzrostem roślin.
Dwie najczęstsze metody sterylizacji nasion Arabidopsis opierają się na komercyjnym wybielaczu (faza ciekła) i chlorze gazowym (faza parowa). Zastosowano różne procedury zarówno do sterylizacji w fazie ciekłej1,4,5,6,7,8,9,10 oraz sterylizacja nasion Arabidopsis w fazie gazowej8,10,11,12,13,14,15,16. Jednakże, chociaż procedury te były skuteczne w przeprowadzaniu sterylizacji nasion wykorzystanych genotypów, nie zgłoszono szczegółowej analizy wpływu różnych zabiegów sterylizacji na nasiona o różnych genotypach. W związku z tym konieczna jest optymalizacja tych procedur sterylizacji w celu określenia warunków, w których skuteczna sterylizacja łączy się z wysoką zdolnością kiełkowania.
Centrum Zasobów Biologicznych Arabidopsis (ABRC) ma wyjątkową pozycję, aby a) testować żywotność nasion różnych genotypów w kolekcji i b) korzystać z procedur kontroli jakości stosowanych wewnętrznie i w odpowiedzi na opinie użytkowników na temat kiełkowania nasion. Celem przedstawionych eksperymentów było określenie wpływu różnych metod sterylizacji na kiełkowanie nasion szeregu genotypów rzodkiewnika. Zoptymalizowane procedury sterylizacji, które skutkują wysoką zdolnością kiełkowania nasion przy zachowaniu minimalnego zanieczyszczenia patogenami, są prezentowane zarówno w przypadku sterylizacji wybielaczem, jak i chlorem gazowym.

standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Siewki Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) często muszą być uprawiane na sterylnych podłożach. Wymaga to wcześniejszej sterylizacji nasion, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych obecnych na powierzchni nasion. Obecnie nasiona rzodkiewnika są sterylizowane przy użyciu dwóch różnych technik sterylizacji w warunkach, które różnią się nieznacznie w zależności od laboratoriów i nie zostały ustandaryzowane, co często skutkuje tylko częściowo skuteczną sterylizacją lub nadmierną śmiertelnością nasion. Większość z tych metod nie jest również łatwo skalowalna do dużej liczby linii nasiennych o różnych genotypach. Wraz z dalszym rozprzestrzenianiem się technologii wysokoprzepustowej analizy rzodkiewnika, standaryzowane techniki sterylizacji dużej liczby nasion o różnych genotypach stają się niezbędne do przeprowadzania tego typu eksperymentów. Odpowiedź wielu linii Arabidopsis na dwie różne techniki sterylizacji oceniono na podstawie szybkości kiełkowania nasion i poziomu zanieczyszczenia nasion drobnoustrojami i innymi patogenami. Zabiegi obejmowały różne stężenia środków sterylizujących i czasy ekspozycji, połączone w celu określenia optymalnych warunków sterylizacji nasion rzodkiewnika. Opracowano zoptymalizowane protokoły dla dwóch różnych metod sterylizacji: wybielacza (faza ciekła) i chloru (Cl2) w gazie (faza gazowa), co skutkuje wysoką szybkością kiełkowania nasion i minimalnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym. Użyteczność tych protokołów została zilustrowana poprzez testowanie zarówno nasion typu dzikiego, jak i zmutowanych o różnym potencjale kiełkowania. Nasze wyniki pokazują, że nasiona mogą być skutecznie sterylizowane przy użyciu obu metod bez nadmiernej śmiertelności nasion, chociaż szkodliwe skutki sterylizacji zaobserwowano w przypadku nasion o niższym niż optymalny potencjale kiełkowania. Ponadto opracowano równanie, aby umożliwić naukowcom zastosowanie znormalizowanych warunków sterylizacji chlorem gazowym do hermetycznych pojemników o różnych rozmiarach. Opisane tutaj protokoły pozwalają na łatwą, wydajną i niedrogą sterylizację nasion dla dużej liczby linii Arabidopsis.

Nasiona Arabidopsis pobierane z otwartego pola, szklarni lub komory wzrostowej są czasami zanieczyszczone różnymi mikroorganizmami, takimi jak grzyby i bakterie1,4. W związku z tym kiełkowanie nasion na sterylnych pożywkach może być szczególnie trudne ze względu na zanieczyszczenie płytek, zwłaszcza gdy zasoby nasion są ograniczone. Zoptymalizowany protokół sterylizacji zarówno podchlorynem sodu, jak i chlorem w postaci gazowej, którego wyniki przedstawiono poniżej, minimalizuje ten problem i zachowuje żywotność nasion niezbędną do zastosowań wysokoprzepustowych.
Wpływ sterylizacji wybielaczem na kiełkowanie nasion Arabidopsis Col-0
Wybielacz jest najczęściej stosowanym środkiem do sterylizacji nasion u wielu gatunków roślin. Optymalne stężenie środka sterylizującego oraz czas ekspozycji różnią się w zależności od gatunku. W celu sterylizacji nasion Arabidopsis zastosowano szereg protokołów z użyciem wybielacza1,4,5,6,7,8,9,10. Przetestowano cztery różne stężenia wybielacza przy pięciu różnych okresach ekspozycji, a wyniki przedstawiono na Rysunku 1. Zabiegi zastosowano na nasionach typu dzikiego Columbia (Col-0). Wpływ stężenia wybielacza na kiełkowanie nasion Col-0 różnił się w zależności od czasu sterylizacji, co wykazała istotna interakcja między stężeniem wybielacza a czasem sterylizacji (Rysunek 1, P &lt; 0,001, ANOVA – analiza wariancji).
W eksperymentach z czasem sterylizacji od 5 do 10 min, zabiegi ze wszystkimi stężeniami wybielacza doprowadziły do równie wysokiego wskaźnika kiełkowania nasion Col-0 (Rysunek 1). Wysokie wskaźniki kiełkowania zaobserwowano również dla stężeń wybielacza domowego 40% i 50% dla wszystkich czasów sterylizacji. Zabiegi z użyciem 80% i 100% wybielacza przez okres dłuższy niż 10 min spowodowały znaczny spadek wskaźnika kiełkowania w porównaniu z krótszymi czasami moczenia (P &lt; 0,01, ANOVA). Ponadto, w przypadku obu zabiegów wybielaczem 80% i 100% przez 20 min, kiełkowanie było znacznie zmniejszone w porównaniu z odpowiadającymi im zabiegami wybielaczem 40% i 50% (P &lt; 0,001, ANOVA).
Nasiona wykazywały różny stopień wybielenia i pomarszczenia przy zastosowaniu wysokich stężeń wybielacza przez 15 min lub dłużej. Oprócz stosunkowo wysokiej śmiertelności nasion (do 32%), nasiona wykiełkowane po sterylizacji w tych warunkach często wykazywały wady wzrostu, objawiające się brakiem rozprostowania i wydłużenia liścic oraz podkotyledonów, co prowadziło do zahamowania rozwoju. Większość prób (14 z 20) była całkowicie wolna od pleśni, co przełożyło się na średni ogólny poziom pleśni wynoszący 0,21% ± 0,003 (Tabela 1).
Obóbkę z zastosowaniem 50% wybielacza i czasem namaczania wynoszącym 10 min wybrano jako optymalny reżim sterylizacji, ponieważ łączył on wysoki procent kiełkowania z dobrą inhibicją wzrostu patogenów powierzchniowych. Wybrano tę metodę w celu przetestowania wpływu sterylizacji wybielaczem na różne linie mutantów, zgodnie z opisem poniżej.
Wpływ sterylizacji chlorem gazowym na kiełkowanie nasion Col-0
Aby zoptymalizować warunki sterylizacji chlorem gazowym, użyto trzech różnych stężeń chloru gazowego do sterylizacji nasion Col-0 przez dwa okresy czasu (Tabela 2). Stężenie gazu obliczono na podstawie objętości stężonego HCl oraz objętości pojemnika do sterylizacji, korzystając z następującego równania:
<img alt="Wzór na procentową zawartość chloru dla analizy wolumetrycznej; równanie chemiczne w kontekście edukacyjnym." src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
Równanie to zostało wyprowadzone przy użyciu prawa gazów doskonałych, przy założeniu stężenia 12,3 M HCl, temperatury 23 °C oraz standardowego ciśnienia atmosferycznego wynoszącego 101,3 kPa.
Wykazano, że wpływ stężenia chloru w fazie gazowej na kiełkowanie nasion Col-0 zależy od czasu sterylizacji, co wskazuje istotna interakcja między czynnikami czasu i stężenia (Rycina 2A, P &lt; 0,01, ANOVA). Stężenie gazowego chloru nie miało istotnego wpływu na kiełkowanie nasion Col-0 poddanych 1-godzinnej sterylizacji. Przy tym czasie sterylizacji wszystkie stężenia chloru w fazie gazowej promowały podobnie wysokie poziomy kiełkowania, powyżej 85% (P &gt; 0,05, ANOVA). Z drugiej strony, 3-godzinna sterylizacja spowodowała istotny spadek wskaźnika kiełkowania dla najwyższego stężenia chloru w fazie gazowej w porównaniu do dwóch niższych stężeń gazu (P &lt; 0,05, ANOVA). Wyniki te wskazują, że traktowanie nasion Arabidopsis dowolnym z badanych stężeń chloru w fazie gazowej przez 1 h lub stężeniami gazu poniżej 16,5% przez 3 h jest równie skuteczne w zachowaniu żywotności nasion, ponieważ wskaźniki kiełkowania zawsze przekraczały 82%. Jednakże sterylizacja nasion przez 3 h przy stężeniu gazu 16,5% była szkodliwa dla kiełkowania nasion.
Występowanie pleśni zależało również od stężenia gazu i czasu ekspozycji. Wzrost pleśni został skutecznie zahamowany przy stosunkowo wysokich stężeniach chloru 6,1% i 16,5% podczas 1-godzinnej obróbki oraz przy wszystkich stężeniach gazu w przypadku 3 h (Rysunek 2B).
Na podstawie tych wyników wybrano stężenie gazu 6,1% przez 1 h (Tabela 2) jako optymalny warunek sterylizacji w fazie gazowej do zbadania wpływu sterylizacji gazowej na różne linie mutantów, ponieważ pozwalało ono na uzyskanie wysokiego wskaźnika kiełkowania (85%) przy bardzo niskim poziomie zanieczyszczenia pleśnią (0,02%).
Wpływ sterylizacji podchlorynem sodu i chlorem gazowym na nasiona o różnym potencjale kiełkowania
Analiza statystyczna wykazała, że reakcja kiełkowania na metody sterylizacji była zależna od potencjału kiełkowania linii (Rycina 3A, P &lt; 0,01, ANOVA). Ani sterylizacja wybielaczem, ani gazem chlorowym nie obniżyły wskaźnika kiełkowania nasion o wysokim potencjale kiełkowania (Grupy 4 i 5). Żadna z metod nie wpłynęła na i tak niską zdolność kiełkowania w grupie o najniższym potencjale kiełkowania (Grupa 1). W przeciwieństwie do tego, sterylizacja gazem chlorowym spowodowała istotne zmniejszenie o około 12-18% (P &lt; 0,01, ANOVA) kiełkowania nasion o pośrednim potencjale kiełkowania (Grupy 2 i 3). Sterylizacja wybielaczem również obniżyła wskaźnik kiełkowania o 13% w Grupie 2, ale nie wpłynęła na wskaźnik kiełkowania w Grupie 3. Chociaż w żadnej grupie kiełkowania nie stwierdzono istotnej różnicy we wskaźniku kiełkowania między sterylizacją wybielaczem a gazem chlorowym (Rycina 3A, P &gt; 0,442, ANOVA), nasiona sterylizowane wybielaczem wykazywały nieco wyższy wskaźnik kiełkowania niż nasiona sterylizowane gazowo we wszystkich grupach kiełkowania.
Zabiegi sterylizacyjne znacząco zmieniły (P &lt; 0,001, ANOVA) odsetek nasion dotkniętych pleśnią (Rysunek 3B). Zarówno sterylizacja chlorem gazowym, jak i wybielaczem, skutkowała mniejszym wzrostem pleśni (P &lt; 0,05, ANOVA) w porównaniu do braku sterylizacji. W żadnej z grup nie stwierdzono różnic w poziomie pleśni między sterylizacją gazową a wybielaczem (Rysunek 3B, P &gt; 0,4, ANOVA).
<img alt="Wykres kiełkowania w zależności od czasu sterylizacji przy stężeniach wybielacza: 40%, 50%, 80%, 100%." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wpływ stężenia wybielacza i czasu sterylizacji na kiełkowanie nasion Arabidopsis Col-0. Wartości przedstawiają średnie ± SD uzyskane z 5 niezależnych powtórzeń eksperymentu. *oznacza istotne różnice w stosunku do 5 min czasu moczenia dla zakresu stężeń wybielacza (P &lt; 0,01, ANOVA). #oznacza istotne różnice dla stężeń wybielacza 80% i 100% w stosunku do 40% i 50% dla czasu 20 min (P &lt; 0,01, ANOVA). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Kiełkowanie roślin, pleśń w porównaniu do ekspozycji na chlor w funkcji czasu; wykres liniowy; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wpływ stężenia chloru i czasu sterylizacji na nasiona Arabidopsis Col-0. (A) Wskaźnik kiełkowania oraz (B) Poziom pleśni. Słupki błędów reprezentują średnie ± SD uzyskane z 5 powtórzeń biologicznych i 5 powtórzeń technicznych eksperymentu. Średnie, które nie dzielą tej samej litery, różnią się istotnie (P &lt; 0,05, ANOVA). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza kiełkowania nasion i zapleśnienia; wykres słupkowy; metody sterylizacji: gaz, wybielacz, brak." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wpływ sterylizacji wybielaczem i chlorem w postaci gazowej na nasiona o różnym potencjale kiełkowania. (A) Odsetek kiełkowania i (B) Poziom zapleśnienia. 100 linii SALK T-DNA podzielono na pięć grup zgodnie z ich potencjałem kiełkowania, zdefiniowanym jako odsetek kiełkowania w przypadku braku jakiegokolwiek środka sterylizującego. Grupy oparte na odsetku kiełkowania były następujące: Grupa 1 (0-20%), Grupa 2 (21-50%), Grupa 3 (51-70%), Grupa 4 (71-90%) oraz Grupa 5 (91-100%). Linie wybrano losowo, a ich potencjał kiełkowania nie zależał od genotypu. Wartości stanowią średnie ± SD uzyskane z trzech niezależnych powtórzeń eksperymentu. Litery („a”, „ab”, „c” itd.) nad każdą wartością wskazują statystyczne zgrupowania średnich kategorii. Średnie, które nie dzielą wspólnej litery, różnią się istotnie (P &lt; 0,05, ANOVA). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Czas sterylizacji (min)</td>
			<td colspan="4">Stężenie wybielacza (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0.19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Poziom zapleśnienia nasion Col-0 sterylizowanych wybielaczem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wybielacz </td>
			<td>HCl</td>
			<td>Czas       </td>
			<td rowspan="2">% chloru w fazie gazowej (mol Cl2/mol całkowitej ilości gazu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(ml)</td>
			<td>(ml)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Sterylizacja nasion dzikiego typu Columbia gazem chlorem (Cl2) z wykorzystaniem pojemnika o pojemności 7 L.
Tabela uzupełniająca 1: Arkusz kalkulacyjny zaprogramowany do obliczeń dla różnych objętości pojemnika i %Cl2.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Celem tego badania było określenie wpływu sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na kiełkowanie nasion szeregu genotypów Arabidopsis uprawianych na sterylnych podłożach. Opracowano zoptymalizowane protokoły sterylizacji, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych, zapewniając jednocześnie zadowalającą przeżywalność nasion.

Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie ustandaryzowanych warunków do skutecznej sterylizacji nasion dużej liczby genotypów Arabidopsis przy jednoczesnym zapobieganiu rozwojowi drobnoustrojów. Metoda ta pozwala na sterylizację setek próbek nasion jednocześnie, upraszczając w ten sposób krytyczny etap przygotowania materiału roślinnego w dziedzinie genomiki, proteomiki, metabolomiki i innych badań o wysokiej przepustowości. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia warunki, w których skuteczna sterylizacja łączy się z wysoką zdolnością kiełkowania dla dużej liczby próbek nasion.Na początek przygotuj 50% roztwór wybielacza z wodą destylowaną. Na każde 200 mililitrów roztworu wybielacza dodaj 50 mikrolitrów detergentu TWEEN 20. Roztwór wybielacza może być przechowywany do miesiąca, o ile jest otwierany tylko w sterylnych warunkach.Następnie podwielokrotność nasion do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Można to zrobić ręcznie lub za pomocą specjalnie wykonanego robota nasiennego. Teraz w okapie z przepływem laminarnym dodaj 500 mikrolitrów 50% roztworu wybielacza do nasion.Następnie przenieś probówki do rotatora i inkubuj nasiona w wybielaczu z łagodnym mieszaniem przez 10 minut. Po 10 minutach odessaj roztwór wybielacza z probówek, usuwając jak najwięcej. Następnie dodaj z powrotem 500 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej i odwróć probówki do wymieszania.Pozwól nasionom osiąść, a następnie zasychaj wodę i zastąp ją inną porcją, aby ponownie umyć nasiona. Wykonaj w sumie sześć takich prań wysterylizowaną wodą destylowaną. Po dokładnym umyciu nasion wodą, przed poszyciem zawieś je w jednym mililitrze wody.Przed rozpoczęciem procesu sterylizacji należy obliczyć objętości wybielacza i kwasu solnego potrzebne do wytworzenia chloru gazowego. Skorzystaj z podanego równania, aby uzyskać zalecaną 6% chloru gazowego. Upewnij się, że dokładnie obliczyłeś objętość HCl wymaganą do zapewnienia pomyślnej sterylizacji i zapobieżenia rozpryskiwaniu.Pamiętaj, aby nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny podczas tego protokołu i zmieniać rękawice za każdym razem, gdy są zwilżone kwasem lub wybielaczem. Pod wyciągiem przełóż fiolki z nasionami do stojaka z otwartymi pokrywkami. Następnie umieść stojak w plastikowym pojemniku, w którym może odbyć się sterylizacja i przygotuj paski folii parafinowej, aby uszczelnić pokrywkę do pojemnika.Teraz załaduj zlewkę 100 mililitrami wybielacza, a następnie umieść w niej 250-mililitrową zlewkę. Stosowanie nadmiaru wybielacza jest zabezpieczeniem, a zlewka powinna mieć co najmniej dwukrotność całkowitej objętości zawartego w niej roztworu. Ponadto zawsze należy obchodzić się z wybielaczem i kwasami oddzielnie.Następnie dodaj trzy mililitry kwasu solnego do zlewki, a następnie natychmiast zamknij pojemnik i zamknij go parafilmem. Monitoruj pojemnik przez godzinę, aby upewnić się, że gaz gromadzi się podczas sterylizacji. Chlor gazowy powinien być widoczny jako słaba żółta mgiełka wewnątrz pojemnika lub można sprawdzić, czy roztwór nie żółknie.Okresowo sprawdzaj uszczelkę na pojemniku. Jeśli pokrywka zostanie odczepiona lub uszczelka parafinowa zacznie się luzować, szczelnie ponownie zamknij pokrywę dodatkową warstwą folii parafinowej. Po godzinnej sterylizacji otwórz róg pojemnika, aby odpuścić gaz przez trzy godziny.Po trzech godzinach wentylacji zakryj wszystkie probówki i przechowuj wysterylizowane nasiona w suchych warunkach, aż zostaną platerowane. Teraz zneutralizuj reakcję, powoli dodając 1,5 grama wodorowęglanu sodu w proszku, mieszając szklaną pałeczką, aby rozpuścić ciała stałe. Dodawaj wodorowęglan sodu, aż pęcherzyki dwutlenku węgla przestaną się tworzyć.Następnie zmierz pH roztworu i w razie potrzeby dodaj dodatkowy wodorowęglan sodu, aż pH będzie neutralne. Pod warunkiem, że roztwór nie śmierdzi, można go wyrzucić. W przeciwnym razie poczekaj, aż wszystkie zapachy znikną.Dodaj 500 mikrolitrów wysterylizowanej wody destylowanej do każdej probówki nasion sterylizowanych gazem. Następnie wylej nasiona na płytkę MS i rozprowadź je równomiernie za pomocą sterylnej jednorazowej pętli do zaszczepiania lub sterylnej końcówki do pipet. Po trzech dniach stratyfikacji nasion w temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś płytki do 23 stopni Celsjusza z 16 godzinami dziennej ekspozycji na światło.Trzymaj pokrywki na górze, aby korzenie wrastały w podłoże. Po ośmiu dniach wzrostu naciąć frakcję nasion, które wykiełkowały. Kiełkowanie liczy się, gdy rodnik wystaje poza okrywę nasienną i widoczne są dwa liścienie.Policz również liczbę nasion dotkniętych pleśnią, aby określić skuteczność warunków sterylizacji. Cztery różne stężenia wybielacza w pięciu różnych czasach ekspozycji zostały przetestowane na nasionach Columbia typu dzikiego. Wysokie stężenia wybielacza niekorzystnie wpływały na kiełkowanie przy zbyt dużej ekspozycji.Jednak wysokie wskaźniki kiełkowania zaobserwowano przy 40 i 50% wybielaczu we wszystkich okresach ekspozycji. Nasiona sterylizowane wysokimi stężeniami wybielacza miały wysoką śmiertelność i często wykazywały wady wzrostu, ale zwykle były całkowicie wolne od pleśni. Stwierdzono, że sterylizacja 50% wybielaczem przez 10 minut zapewnia optymalną równowagę między hamowaniem pleśni a zdrowym kiełkowaniem.Aby zoptymalizować warunki sterylizacji chlorem gazowym, do sterylizacji nasion Columbia typu dzikiego przez dwa różne okresy czasu użyto trzech różnych stężeń chloru gazowego. Stwierdzono istotną interakcję między czasem a stężeniem gazu. Po jednej godzinie nie stwierdzono wpływu na kiełkowanie, podczas gdy najwyższe stężenie gazu było szkodliwe po trzech godzinach.W związku z tym zdecydowano się na jednogodzinny okres sterylizacji. Rozwój pleśni był skutecznie hamowany przez trzygodzinną ekspozycję na gaz lub przez jednogodzinną ekspozycję przy użyciu sześciu lub 17% gazu. W ten sposób określono stężenie 6% gazu przez jedną godzinę jako optymalne dla kiełkowania i hamowania pleśni.Po opanowaniu technika ta może być z powodzeniem stosowana do sterylizacji setek linii nasion dziennie, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Nasiona sterylizowane gazem mogą być również przechowywane przez dłuższy czas w suchych warunkach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu dostarczonych równań do obliczenia wymaganych objętości HCl i wybielacza.Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak badania asocjacyjne całego genomu, w celu powiązania różnych genotypów i fenotypów będących przedmiotem zainteresowania. Powodzenia w eksperymentach.

standardized-method-for-high-throughput-sterilization-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Tutaj prezentujemy łatwy do naśladowania protokół, który pozwala stworzyć udany system hydroponiczny do badań nad odżywianiem roślin. Protokół ten został szeroko przetestowany na Arabidopsis i może być łatwo dostosowany do innych gatunków roślin w celu zbadania określonych wymagań żywieniowych lub wpływu nieistotnych składników na wzrost i rozwój roślin.

Hydroponika: wszechstronny system do badania alokacji składników odżywczych i reakcji roślin na dostępność składników odżywczych i narażenie na pierwiastki toksyczne

Prosta metoda pomiaru i charakteryzowania przyczepności bakterii do roślin, szczególnie korzeni i pędów, jest opisana w tym artykule.

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Prosty, wszechstronny i tani system hydroponiczny in vitro został pomyślnie zoptymalizowany, umożliwiając eksperymenty na dużą skalę w sterylnych warunkach. System ten ułatwia stosowanie substancji chemicznych w roztworze i ich efektywne wchłanianie przez korzenie do badań molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych.

Elastyczny, niedrogi system hydroponiczny do oceny reakcji roślin na małe cząsteczki w sterylnych warunkach

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Poznaj standaryzowaną metodę sterylizacji nasion Arabidopsis wysokoprzepustową, wykorzystującą roztwór wybielacza lub gaz chloru. Technika zapewnia skuteczną eliminację mikrobów przy zachowaniu wysokiej zdolności kiełkowania.

Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Przeglądaj więcej filmów