Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Jest to nieinwazyjna metoda hydroponiczna do pomiaru architektury systemu korzeniowego przy użyciu rutynowych urządzeń laboratoryjnych. Protokół ten pozwala na pełną wizualizację całego systemu korzeniowego rośliny poprzez jego ręczne rozprowadzanie. Jedną z głównych zalet analizy RSA jest to, że pozwala ona na badanie systemu korzeniowego roślin bez konieczności wprowadzania niepożądanych zanieczyszczeń pierwiastkowych.

Metoda ta może rejestrować bezpośrednią interakcję środowiskową, w tym hormonalną, składników odżywczych i warunków klimatycznych, z RSA systemów roślinnych. Rozpocznij powierzchniową sterylizację nasion Arabidopsis, mocząc maleńką miarkę około 100 nasion w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Po 30 minutach krótko odwirować nasiona w sile 500 G przez pięć sekund za pomocą wirówki stołowej.

Następnie zdekantuj wodę i dodaj 700 mikrolitrów 70% etanolu przed wirowaniem rurki przez kilka sekund. Ponownie odwiruj nasiona. W razie potrzeby powtórzyć wirowanie i odwirowanie, upewniając się, że obróbka 70% etanolem nie przekracza trzech minut.

Po trzech minutach natychmiast spłucz nasiona sterylną wodą. Następnie potraktuj nasiona rozcieńczonym komercyjnym wybielaczem zawierającym kroplę TWEEN 20 przez siedem minut. Wymieszaj nasiona z roztworem wybielacza, szybko odwracając rurki od ośmiu do 12 razy.

Po krótkim odwirowaniu zdekantować supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i przepłukać nasiona co najmniej pięć razy sterylną wodą, postępując zgodnie z tą samą procedurą wirowania. Pozostaw wysterylizowane nasiona na powierzchni w wodzie i inkubuj je przez dwa do trzech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu rozwarstwienia. Autoklaw standardowe purpurowe pudełko wypełnione do połowy wodą destylowaną.

Pokrój autoklawowany arkusz poliwęglanu na prostokąty o wymiarach cztery na osiem centymetrów z punktem środkowym naciętym więcej niż w połowie prostokąta, tak aby dwa prostokąty mogły się ze sobą zesnąć, tworząc kształt litery X. Użyj tej konfiguracji, aby przytrzymać siatkę polipropylenową o wielkości porów 250 mikrometrów, pociętą na kwadraty o wymiarach sześć na sześć centymetrów. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodaj sterylną połowę podłoża podstawowego MS z witaminami oraz 1,5% sacharozy do każdego pudełka, aby dotrzeć do dolnej krawędzi siatki polipropylenowej.

Wysterylizowane nasiona wysterylizowane na powierzchni siej hydroponicznie na siatce i hoduj je przez trzy dni. Po trzech dniach przenieś sadzonki na siatkę o wielkości porów 500 mikrometrów i pozwól im rosnąć przez dwa dni. Następnie przenieś sadzonki na pożywkę kontrolną i na pożywkę eksperymentalną i pozwól nasionom rosnąć przez siedem dni.

Dodaj 10 do 20 mililitrów autoklawowanej przefiltrowanej wody z kranu do płytki Petriego. Delikatnie wyciągnij sadzonki z siatki o grubości 500 mikrometrów. Za pomocą okrągłego pędzla artystycznego rozłóż korzenie przypominające rośliny w wypełnionej wodą płytce i zanurz je w wodzie.

Lekko przechyl talerz, aby usunąć wodę. Zeskanuj lub sfotografuj te płytki Petriego w odpowiedni sposób. Zmierz architekturę systemu root lub cechy RSA za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ, a następnie otwórz plik, który chcesz przeanalizować.

Po ustawieniu skali użyj narzędzia Linia prosta, aby utworzyć zaznaczenie linii, która obrysuje pasek podziałki. Zakończ tworzenie konspektu, klikając prawym przyciskiem myszy, klikając dwukrotnie lub klikając pole na początku. Aby zmierzyć długość znanej skali w pikselach, kliknij Analizuj, a następnie Zmierz na pasku narzędzi.

Zanotuj długość w pikselach. Otwórz okno dialogowe Ustawianie skali, klikając kartę Ustawianie skali na karcie analizy. Sprawdź długość piksela w polu odległości w pikselach.

Następnie wprowadź wartość podziałki liniowej w polu znanej odległości i ustaw jednostkę długości w milimetrach. Zablokuj skalę dla tego konkretnego obrazu, klikając OK. Użyj narzędzia Linia segmentowa, aby wybrać linię, która wyznacza długość korzenia.

Po zakończeniu tworzenia konturu dostosuj wybór linii, klikając i przeciągając małe czarno-białe uchwyty wzdłuż konturu. Na karcie analizy ImageJ wybierz polecenie zmierz i określ ilościowo długość pierwiastka. Przenieś zmierzone dane do arkusza kalkulacyjnego, klikając prawym przyciskiem myszy okno wyników, wybierając kopiuj wszystko z menu podręcznego, przełączając się do arkusza kalkulacyjnego i wklejając dane.

W celu pomiaru i obliczenia cech RSA zmierz pierwotną długość korzenia między połączeniem hipokotylowym a końcem wierzchołków korzeni. Następnie zmierz korzenie boczne pierwszego rzędu, czyli jeden stopień długości LR, i korzenie boczne drugiego rzędu, czyli dwa stopnie długości LR. Po zakończeniu skopiuj i wklej wszystkie pomiary do arkusza kalkulacyjnego.

Zmierz i zapisz strefę rozgałęzienia korzenia pierwotnego (BZPR), która rozciąga się od pierwszego punktu wyłaniającego się korzenia bocznego do ostatniego punktu wyłaniającego się korzenia bocznego. Podobnie zapisz liczbę korzeni bocznych wychodzących w obrębie granicy BZPR. Następnie zmierz średnią długość korzeni bocznych pierwszego i wyższego rzędu.

Wyznacz średnią długość pierwotnych korzeni bocznych, dzieląc całkowitą długość pierwotnych korzeni bocznych przez całkowitą liczbę pierwotnych korzeni bocznych. Następnie, aby zmierzyć średnią długość korzeni bocznych drugiego rzędu, oblicz średnią długość wtórnych korzeni bocznych, dzieląc całkowitą długość wtórnych korzeni bocznych przez całkowitą liczbę wtórnych korzeni bocznych. Zmierz pierwotną gęstość korzeni bocznych, dzieląc liczbę pierwotnych korzeni bocznych przez długość BZPR.

Następnie zmierz strefę rozgałęzień poszczególnych korzeni bocznych i oblicz wtórną gęstość korzeni bocznych, dzieląc liczbę wtórnych korzeni bocznych przez długość stref rozgałęzień o długości korzeni bocznych drugiego rzędu. Po zakończeniu zmierz całkowitą długość korzenia lub TRL. Jest to suma korzeni pierwotnych oraz pierwotnych i wtórnych długości korzeni bocznych.

System hydroponiczny użyty w tym eksperymencie działał dobrze, odzwierciedlając pozornie kontrastujący fenotyp w warunkach niedoboru nieorganicznych fosforanów i wystarczającej ilości. Różne cechy RSA analizowano w kontrastujących ze sobą nieorganicznych reżimach fosforanowych w warunkach hydroponicznych. Leczenie niedoborem fosforanów nieorganicznych wywołało fenotyp korzenia wykazujący krótszy, płytszy i mniej rozgałęziony RSA w porównaniu z wystarczającym stanem fosforanu nieorganicznego.

Pierwotna długość korzenia była znacznie osłabiona w warunkach niedoboru fosforanów nieorganicznych. Znaczny i szybki przyrost długości korzenia pierwotnego w obecności 1,25 milimolowego fosforanu nieorganicznego lub pożywki kontrolnej wskazywał na wydajność systemu hydroponicznego i odpowiednio odzwierciedlał zmiany fizjologiczne. Strefa rozgałęzień uległa znacznemu zmniejszeniu w warunkach niedoboru fosforanów nieorganicznych.

Średnia długość pierwotnego korzenia bocznego uległa znacznemu zmniejszeniu w stanie z niedoborem liczby pi. Średnia długość korzenia bocznego wtórnego była podobnie zmniejszona ze względu na niedobór fosforanów, jednak była ona mniejsza niż średnia długość korzenia bocznego pierwotnego. Liczba pierwotnych i wtórnych korzeni bocznych znacznie zmniejszyła się w stanie niedoboru fosforanów, w porównaniu z kontrolnym, 1,25 milimolowym nieorganicznym stanem fosforanowym.

Pierwotna gęstość korzeni bocznych nie uległa zmianie w warunkach niedoboru fosforanów, w stosunku do kontrolnych, 1,25 milimolowego fosforanu nieorganicznego. Wtórna boczna gęstość korzeni nie wykazała żadnej istotnej zmiany, co wskazuje na znaczenie bocznej gęstości korzeni dla uzyskania wglądu w plastyczność RSA. Delikatnie usunąłem sadzonki z siatki za pomocą pęsety.

Za pomocą okrągłej szczotki rozprowadzam korzenie w wypełnionej wodą płytce wszystkie korzenie pierwotne i rozprowadzam je prosto, symetrycznie rozprowadzam korzenie boczne, rozprowadzam korzenie boczne drugiego rzędu połączone z korzeniami bocznymi pierwszego rzędu. Podobną metodę można zastosować do obliczenia powierzchni sadzy końcówek roślin Arabidopsis. Liście Arabidopsis można rozłożyć na drugiej płytce, a następnie wykonać zdjęcie i przeprowadzić analizę za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ w celu określenia obszaru sadzy.

Protokół ten może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na wszelkie pytania dotyczące wpływu środowiska na plastyczność systemu korzeniowego.