Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Protokół ten usprawnia sterylizację powierzchni nasion, co jest podstawowym krokiem w funkcjonalnej genomice modelowego gatunku Arabidopsisthaliana. Głównymi zaletami tej techniki są łatwość i wysoka przepustowość, pozwalająca na przetwarzanie setek próbek dziennie. Dzięki kilku prostym modyfikacjom metoda ta może być stosowana do wielu innych modelowych i niemodelowych gatunków roślin.

Początkujący użytkownicy powinni zwrócić uwagę na temperaturę podłoża i prędkość wirowania, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla przetrwania nasion. Na początek przygotuj 70% etanol, dodając 95% etanolu technicznego do wody destylowanej i dokładnie mieszając. Następnie przygotuj 5% roztwór wybielacza, dodając pięć mililitrów wybielacza domowego do 95 mililitrów sterylnej wody destylowanej.

Następnie dodaj kilka kropli niejonowego detergentu do roztworu wybielacza i dokładnie wymieszaj. Następnie przygotuj pożywkę Murashige i Skoog o połowie mocy, dodając 2,2 grama pożywki MS w proszku, w tym witamin i 10 gramów sacharozy w 800 mililitrach wody destylowanej. Dostosuj pH pożywki do 5,7 za pomocą jednego molowego wodorotlenku potasu, a następnie zwiększ objętość do jednego litra za pomocą wody destylowanej.

Porcję 500 mililitrów pożywki przelać do litrowej butelki i dodać cztery gramy agaru, aby przygotować stałe podłoże. Po sterylizacji w autoklawie pozwól pożywce ostygnąć do 50 do 53 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Następnie wlej go do szalek Petriego pod okapem z przepływem laminarnym.

Aby przygotować pożywkę selektywną, dodaj kanamycynę do pożywki i wlej ją do szalek Petriego, jak pokazano wcześniej. Aby skonfigurować aspirator, podłącz wlot pompy próżniowej do jednego końca rurki polietylenowej o odpowiednim rozmiarze. Następnie podłącz drugi koniec rurki do wylotu dwukierunkowej pokrywy butelki dekantacyjnej.

Owiń szczelnie złącze rurki folią uszczelniającą, aby zapewnić hermetyczne połączenie. Następnie podłącz drugą rurkę polietylenową do wlotu zakrętki na butelce dekantacyjnej. Następnie podłącz drugą stronę rurki do wylotu zaworu akwariowego wyposażonego w cienką rurkę polietylenową.

W razie potrzeby owiń złącze folią uszczelniającą, aby wyeliminować wyciek powietrza. Po oznaczeniu dwóch partii 48 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek numerami progresywnymi, dodaj od 100 do 200 nasion Arabidopsis do każdej z 96 sterylnych probówek do mikrowirówek, mniej więcej jeden do dwóch milimetrów powyżej dna stożkowego końca probówki. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej sterylnej pipety serologicznej, dodaj około jednego mililitra 70% etanolu do każdej probówki i ostrożnie zamknij pokrywki.

Potrząsaj probówkami z częstotliwością oscylacji ośmiu herców przez trzy minuty w shakerze. Następnie wyjmij adaptery z wytrząsarki i przenieś je do kosza mikrowirówki stołowej w celu odwirowania nasion za pomocą funkcji pulsacyjnej. Po przeniesieniu probówek do stojaka otwórz wszystkie rurki pod pokrywą z przepływem laminarnym.

Nie dotykaj części pokrywek pasujących do rurek, aby uniknąć zanieczyszczenia. Następnie pod okapem z przepływem laminarnym zamontuj sterylną żółtą końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów na wlocie zaworu akwariowego domowego aspiratora i włącz pompę. Włóż końcówkę tuż nad poziom nasion, aby uniknąć dotykania nasion podczas zasysania płynu.

Następnie, za pomocą 10-mililitrowej sterylnej pipety serologicznej, wlej po jednym mililitrze 5% roztworu wybielacza do każdej probówki. Zamknij pokrywki przed ponownym włożeniem probówek do adapterów wytrząsarki, a następnie potrząśnij probówkami, jak pokazano wcześniej. Po odwirowaniu nasion za pomocą funkcji pulsacyjnej wirówki stołowej, załóż nową sterylną żółtą końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów na zaworze akwariowym i włącz pompę.

Włóż końcówkę powyżej poziomu nasion, aby uniknąć dotykania nasion podczas zasysania roztworu wybielacza. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej sterylnej pipety serologicznej, wlej po jednym mililitrze wysterylizowanej wody do każdej probówki. Po zamontowaniu nowej sterylnej żółtej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów na zaworze akwariowym, włącz pompę.

Włóż końcówkę tuż nad poziom nasion, aby uniknąć dotykania nasion podczas zasysania wody. Na koniec wlej 500 mikrolitrów wysterylizowanej wody do każdej probówki i zamknij wszystkie pokrywki w okapie z przepływem laminarnym. Nasiona są teraz gotowe do wysiewu.

W razie potrzeby trzymaj probówki w temperaturze pokojowej do kilku godzin lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś nasiona z 300 do 400 mikrolitrami sterylnej wody na szalkę Petriego. Po przeniesieniu 10 probówek wlej do każdej płytki od 1,5 do dwóch mililitrów stopionej pożywki o połowie mocy Murashige i Skoog bez antybiotyków.

Szybko zakręć talerzem, aby rozprowadzić nasiona, i przyklej talerze po przeciwnych stronach. Zawiń talerze w folię plastikową lub aluminiową i umieść je w lodówce na trzy dni w ciemności, aby uzyskać równomierne kiełkowanie. Analizy kiełkowania przeprowadzone w drugim, trzecim, czwartym i siódmym dniu nie wykazały istotnych różnic między 10 a 40 minutami czasu sterylizacji 70% etanolem.

Jednak gdy czas sterylizacji przekroczył 40 minut, tempo kiełkowania spadło. W związku z tym zmniejszyły się również wskaźniki pojawiania się zielonych liścieni. Na podstawie badania wybrano trzy minuty dla 70% etanolu i trzy minuty dla 5% wybielacza jako minimalny czas sterylizacji nasion.

Aby wykazać, że pierwotnie użyte nasiona były zanieczyszczone mikroorganizmami, nasiona niesterylne wysiano bezpośrednio na talerze. W porównaniu z nasionami sterylnymi, nasiona niesterylne po dwóch dniach wykazywały wygląd grzyba, który po siedmiodniowym kiełkowaniu rozprzestrzenił się po całej płytce. Test zanieczyszczenia krzyżowego przeprowadzony przy użyciu pojedynczej sterylnej końcówki pipety do przetwarzania różnych próbek nasion wykazał, że nie zaobserwowano zielonych liścieni w nasionach genotypu Columbia-0 wysianych na płytkach z kanamycyną.

Równolegle w nasionach Columbia-0 wysianych na talerzach bez kanamycyny wszystkie liścienie po wykiełkowaniu wydawały się zielone. Wyniki te wskazują na brak przenoszenia zanieczyszczeń między próbkami pomimo użycia jednej końcówki pipety do usunięcia sterylnego roztworu. Procedura ta jest podstawą wielu innych metod genomiki funkcjonalnej, takich jak nadekspresja genów, edycja genomu, lokalizacja subkomórkowa, aktywność promotora oraz interakcje białko-białko i białko-DNA.